Đề cương nuôi cấy mô tế bào pps

Khái niệm: nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo,

Câu 1: Nêu khái niệm về nuôi cấy mô, tế bào thực vật? Các kỹ thuật nuôi cấy chính và ứng dụng?

Khái niệm: nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả

các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm hoang loạt các kỹ thuật khác nhau và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực

Các kỹ thuật nuôi cấy chính và ứng dụng của nó:

Nuôi cấy hạt giống: tăng khả năng nảy mầm của các hạt khó nảy mầm trong điều kiện bình thường Thúc đẩy quá trình này mầm bằng cách bổ sung các chất điều tiêt sinh trưởng Tạo ra cây con dùng cho nuôi cấy merisrem hoặc các bộ phận khác

Hoa cái: thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ lai xa Tạo đơn bội và tạo đa phôi

Hoa đực: tạo mô sẹo và cây đơn bội Tạo đột biến ở mức đơn bội Tạo dòng đồng hợp tử

Phôi hợp tử: nuôi cấy cứu phôi khi lai xa Nhân các dòng lai xa Phá ngủ nghỉ của hạt

Mô sẹo: tạo phôi vô tính Nuôi cấy tế bào đơn và tách tế bào trần Tạo cây có biến

dị soma

Tế bào: tạo đột biến ở mức độ tế bào Tạo tế bào trần để lai vô tính Biến nạp gen Nuôi cấy tế bào đơn

Đỉnh chồi: tạo nhân nhanh dòng đồng nhất về di truyền Làm sạch virus Nguyên cứu -sinh lý phát triển

Phân hóa phôi vô tính: là đường hướng tái sinh chủ yếu ứng dụng: nhân nhanh, sản xuất hạt nhân tạo Cung cấp vật liệu để tạo các protoplast có khả năng sinh phôi Cho phép cơ khí hóa quá trình nuôi cấy và sử dụng bioreactor

Đột biến soma: phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý tưởng song còn thiếu một

số tính trạng mong muốn Phân lập các biến dị có tích để sản xuất các hợp chất chống chịu stress tốt hơn Tạo các biến dị di truyền không qua lại hữu tính ở những dòng ưu tú

Câu 2: Nêu những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật so với các phương pháp truyền thống khác?

 Thứ nhất: vi nhân giống (micropropagation)

- Thực hiện trong phòng thí nghiệm, không chịu ảnh hưởng của thời tiết, mùa

vụ Chủ động sản xuất cây giống

- Sinh sản vô tính tạo ra một lượng lớn cây giống giữ nguyên bản chất di truyền như cây mẹ

- Hệ số nhân cao, tốc độ tăng trưởng nhanh và rút ngắn thời gian ra hoa quả với những cây lâu năm

- Sản xuất hạt nhân tạo

 Thứ hai, chọn và tạo giống in vitro

- Chọn các dòng kháng vi rút, chịu lạnh, chịu hạn,

- Tạo dòng thuần nhanh bằng cách nuôi cấy bao phấn rồi đa bội hoá nhờ hoá chất

- Tạo cây trồng biến đổi gen mang nhiều tính trạng quý

- Dung hơp tế bào trần

 Thứ ba, sản xuất các hoá chất có hoạt tính sinh học

- Sản xuất chủ động và liên tục trong phòng thí nghiệm không phụ thuộc vào tự nhiên và mua vụ

- Nhiều hợp chất sinh học phức tạp nhân được từ tế bào nuôi cấy

- Chọn các dòng tế bào sản xuất các chất với năng suất cao hơn cây ngoài tự nhiên

- Thu nhân nhiều chất quý hiếm mà tổng hợp hoá học rất đắt Bản thân cây đó tăng trưởng chậm, sinh sản khó khăn thì nuôi cấy mô và khống chế tạo mô (mô rễ) sản sinh ra nhiều chất đó

-Câu 3: Trình bày cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào?

*Cấu trúc chung của tế bào thực vật

-Học thuyết tế bào:Schleiden và Schwann (1839) đã độc lập đưa ra kết luận:

- Cơ thể thực vật vầ động vật đều do các tế bào hợp thành và tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của tất cả mọi cơ thể sống

- Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của cơ thể thực vật bởi tế bào rất đa dạng nhưng tổ chức theo nguyên tác cấu trúc thống nhất và có tất cả các đặc tính của thệ thống sống:

- Trao đổi chất và năng lượng

- Sinh trưởng, phát triển và sinh sản

- Di truyền cho thế hệ sau đặc tính của mình

- Có khả năng tồn tại độc lập và phân chia trên môi trường dinh dưỡng Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp tế bào có thể tái sinh và phát triển thành cơ thể nguyên vẹn

* Tính toàn năng của tế bào (totipotency): Haberlandt (1902), lần đầu tiên quan niệm răng: Mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh

- Theo quan niệm của sinh học hiện đại: Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật

đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh

- Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sơ lý luận của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào

*Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy in vitro:

• Quá trình từ nguồn vật liệu ban đầu là tế bào hoặc mô thực vật nuôi cấy phân hóa thành cây hoàn chỉnh được gọi là sự biểu hiện về tính toàn năng của tế bào thực vật.

• Khả năng biểu hiện tớnh toàn năng của cỏc tế bào, mụ của cơ thể là khỏc nhau

• Tớnh toàn năng của tế bào nuụi cấy in vitro biểu hiện trải qua 3 giai đoạn:

+ Tế bào phản biệt húa với sự phỏt sinh tế bào khả biến

+ Định hướng phõn húa tế bào

+ Phỏt sinh hỡnh thỏi, phỏt sinh cơ quan

*Sự phõn húa, phản phõn húa tế bào và sự hỡnh thành tế bào khả biến: Sự phõn húa

tế bào :

– Tế bào phụi sinh ◊ tế bào mụ chuyờn húa, đảm bảo chức năng chuyờn biệt

– Vd: mụ dậu, mụ bỡ, mụ mềm, mụ dẫn

• Sự phản phõn húa:

- Sự phản phõn húa là quỏ trỡnh tế bào đó phõn húa (chuyờn húa) trong một điều kiện nhất định, khụi phục khả năng phõn chia chuyển thành tế bào phõn sinh và hỡnh thành mụ sẹo

Trong đú cú một bộ phận tế bào hỡnh thành tế bào cảm ứng phỏt sinh hỡnh thỏi, tức

là tế bào cú thể cảm thụ tớn hiệu kớch thớch phõn tử, từ đú xỏc định đường hướng mới của sự sinh trưởng và phỏt triển tế bào

• Điều khiển sự phõn húa và phản phõn húa tế bào thực vật dẫn đến sự phỏt sinh hỡnh thỏi trong nuụi cấy mụ tế bào thực vật

• Nuụi cấy mụ tế bào thực vật chớnh là điều khiển sự phỏt sinh hỡnh thỏi của tế bào, mụ nuụi cấy

Cõu 4 Nờu cỏc thành phần chớnh của mụi trường dinh dưỡng nuụi cấy mụ – tế bào thực vật in vitro

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan trong nuôi cấy Có nhiều loại môi trường nuôi cấy cho các loại thực vật khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau Môi trường thường bao gồm các thành phần chính sau đây:

• Nguyên tố đa lượng

• Nguyên tố vi lượng

• Nguồn các bon hữu cơ

• Các vitamin

• Chất điều tiết sinh trưởng thực vật

• Các hỗn hợp chất tự nhiên

• Chất làm đông môi trường

Các nguyên tố đa lượng:

Các nguyên tố khoáng chất mà thực vật cần thiết khi nồng độ lớn hơn 0,5 mM/l gọi là nguyên tố đại lượng

Các nguyên tố: N, P, K, S, Mg, Ca, là cần thiết vàthay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy Nói chung, nồng độ mỗi nguyên tố nói trên trong môi trường > 30ppm Chúng là nguyên liệu

để tế bào xây dựng nên thành phần cấu trúc của mình

Các nguyên tố vi lượng: Các nguyên tố khoáng m thực vật cần thiết có nồng độ nhỏ hơn 0,5à mM/l gọi l nguyên tố vi là ượng.Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Bo, I, Co l các nguyên tố vi là ượng thường được dùng trong môi trường nuôi cấy in vitro Các nguyên tố nμy đóng vai trò quan

trọng trong các hoạt động của enzym Chúng được dùng với nồng độ mỗi nguyên tố <30ppm

v tuỳ thuộc v o loại môi trà à ường m h m là à ượng v tỷ lệ của chúng sẽ thayđổià

Trong môi trường nuôi cấy, Fe thường được dùng dưới dạng muối phức (chelat): Fe-EDTA, Fe-citrate

Nguồn các bon hữu cơ:

Khi nuôi cấy in vitro tế b o, mô thực vật sống chủ yếu theo phà ương thức dị dưỡng Vì vậy, cần nguồn cac bon hữu cơ v thà ường dùng l đà ường saccaroza v với liều là ượng 20 -30g/lít Trong một số trường hợp đặc biệt, có thể sử dụng nguồn đường khác như glucoza, maltoza , galactoza v lactozaà

Các vitamin.

Mô, tế b o nuôi cấy in vitro có thể tự tổng hợp vitamin nhà ưng không đủ cho hoạt động sống của chúng nên cần bổ sung thêm vitamin v o môi trà ường nuôi cấy Đáng chú ý l các vitamin:à thiamin, axit nicotinic, pyridoxin v riboflavin Nồng độ thà ường dùng khoảng 1mg/lít Các vitamin n y đóng vai trò quan trọng trong tế b o vì chúng l các co-enzym Myo-inositol cầnà à à

được bổ xung vμo một lượng khá lớn 50 - 100mg/lít, chất n y tỏ ra có tác dụng khá rõ đến sựà phân chia của tế bμo

Các chất điều tiết sinh truởng.

Các chất điều tiết sinh trưởng l yếu tố quan trọng nhất trong môi trà ường quyết định kết quả nuôi cấy auxin v xytokinin đà ược sử dụng nhiều hơn cả trong nuôi cấy invitro

*Auxin kích thích sự hình th nh mô sẹo v tạo rễ bất định, kích thích sự d_n của tế b o Cácà à à auxin thường sử dụng l : 2,4 - Dicloro phenoxy axetic axit (2,4D), à α-naphtylaxetic axit (α - NAA), Indolaxetic axit (IAA) Nồng độ sử dụng:10-5-10-7 M/l *Xytokinin kích thích sự phân chia tế b o v quyết định sự phân hóa chồi Các xytokinin thà à ường được sử dụng là Benzyladenin (BA), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2 iP) v Zeatin (một chất tự nhiên) Nồngà

độ sử dụng: 10-5 - 10-7 M

*Tỷ lệ Auxin/Xytokinin quyết định sự phân hóa của mẫu cấy theo hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo

Các hỗn hợp chất tự nhiên

L th nh phần thà à ường đựoc sủ dụng nhưng không phải l th nh phần bắt buộc Chúng l mà à à gia tăng th nh phần dinh dà ưỡng v chất có hoạt tính sinh lý cho môi trà ường nên kích thích sự sinh trưởng v phân hoá của mẫu cây.Thà ường bao gồm:

* Nước dừa: thường chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, ARN, AND Đặc biệt trong

nước dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy invitro đó l : myoinositol, các hợpà chất có hoạt tính auxin, các glucosit của xytokinin

* Dịch nghiền của 1 số rau, quả tươi (khoai tây, c rốt, chuối, táo ): Th nh phần hóa họcà … à có: đường, axit nucleic, axit amin, vitamin, khoáng…

* Dịch thủy phân casein (casein hydrolysat) hay pepton : chủ yếu được sử dụng l m nguồn bổà xung axit amin

Chất l m đông cứng môi tr à ường - Agar

Agar l một loại polysaccarit của tảo ở 80 0Cà thạch ngậm nước chuyển sang trạng thái sol

còn ở 40 0C thì trở về trạng thái gel Khả năng ngậm nước của thạch khá cao: 6 - 12 gam/lít nước Thạch ở dạng gel nhưng vẫn để cho các ion vận chuyển dễ dung v có độ thoáng khíà cao Nồng độ trung bình 6 - 8g/lít

Câu 5 Có mấy nhóm chất điều hòa sinh trưởng? Nêu vai trò của chúng trong điều khiển sự phát sinh hình thái của mô, tế bào thực vật nuôi cấy in vitro?

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho

mô và các tổ chức Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây:

A Nhóm auxin

Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: 1H- indole-3-acetic acid (IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA)

Vai trò:

- Kích thích phân chia và kéo dài tế bào

- Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên Ưu thế chồi đỉnh làm ức chế sinh trưởng của chồi nách Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ dẫn đến sự phát chồi nách Nếu thay thế vai trò của chồi đỉnh (đã bị ngắt bỏ) bằng một lớp chất keo

có chứa IAA thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng Cơ chế ức chế của chồi đỉnh liên quan đến một chất điều hoà sinh trưởng khác là ethylene Auxin (IAA) kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh

- IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn (xylem and phloem)

- Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ trong nuôi cấy mô

- Auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự

ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường

- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus)

- Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp)

- Tạo phôi soma (2,4-D)

B Nhóm các cytokinin

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin) Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo

Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau:

1- Kích thích phân chia tế bào

2- Tạo và nhân callus

3- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

4- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh 5- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào

6- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài

7- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)

- Ức chế sự hình thành rễ

- Ức chế sự kéo dài chồi

8 - Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục

C Gibberellin có các chức năng cơ bản sau:

1- Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, các phôi non, tế bào đầu rễ, quả non, hạt chưa chín hoặc đang nảy mầm đều có chứa nhiều gibberellic axit

2- Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ kéo dài thân và đòng lúa sau khi phun GA3, kéo dài đốt thân Các cây lùn thường bị thiếu gibberellin

3- Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu hoạch

4- Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi Năm đầu thân mầm nằm in, sau mùa đông mầm hoa kéo dài đốt rất nhanh và phân hoá hoa

5- Ức chế sự hình thành rễ bất định

6- Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm, giúp tiêu hoá các chất dự trữ trong nội nhũ để nuôi mầm cây

7- Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ) 8- Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn

9- Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt

10 - Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi

D Abscisic axít (ABA)

- Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả

- ABA thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước

và nhiệt độ thấp đóng băng

- Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm của hạt

- Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm soát sự kéo dài thân cành

- Gây ra sự đóng khí khổng

E Ethylene

- Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả

1 - Làm chín quả

1 - Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hoá, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh

2- Điều khiển sự chín của một số loại quả

3- Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa, một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene

4 - Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá

5

Câu 6: Nêu khái niệm về nhân giống vô tính in vitro? Nêu các bước chính trong quy trình nhân giống vô tính in vitro

a Nhân giống vô tính in vitro

Khái niệm chung: Nhân giống vô tính in vitro là quá trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh, từ các bộ phận, cơ quan như: chồi, mắt ngủ, vảycủ, đoạn thân, lá, của cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Nhân nhanh in vitro được ứng dụng vào:

 Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí làm vật liệu cho công tác giống

 Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt

 Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa và cây trồng khác

 Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus

 Bảo quản nguồn gen in vitro

b Các bước chính:

Bước 1 Chọn lọc và chuẩn bị cấy mẹ

 Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy)

 Các cây này cần phải sạch bênh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh

 Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro

Bước 2 Nuôi cấy khởi động

 Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt

 Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non,

ít chuyên hoá (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ )

 Xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp:th-ờng dùng các chất: HgCl2 0,1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl, Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br



Bước 3 Nhân nhanh

 Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính

 Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoaị cảnh thích hợp để

có hiệu quả là cao nhất

 Theo nguyên tắc chung môi trường có hàm lượng cytokinin> auxin sẽ kích thích tạo chồi Chế độ nuôi cấy thường là: 25-270C, 16 giờ chiếu sáng/ ngày, cường độ ánh sáng 2000- 4000 lux

Bước 4 Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

 Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng

 Đối với các phôi vô tính thường chỉ cần gieo chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa nồng độ thấp của cytokinin

để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh

Bước 5 Huấn luyện và đưa cây ra trồng ở vườn ươm

 Để đ-a cây từ ống nghiệm ra v-ờn -ơm với tỷ lệ sống cao, cây sinh tr-ởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

 Cây trong ống nghiệm đ_ đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây)

 Có giá thể tiếp nhận cây invitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát n-ớc

 Phải chủ động điều chỉnh đ-ợc ẩm độ, sự chiếu sáng của v-ờn ươm cũng nh-

có chế độ dinh d-ỡng phù hợp

Câu7: Nêu nguyên lí làm sạch virus và các kỹ thuật làm sạch virus trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật in vitro?

Nguyên lý làm sạch virus qua nuôi cấy meristem

Virus tồn tại ở mọi tế bào sống Tuy nhiên, những nghiên cứu của White (1934), Limasset và Cornuet (1950), Morel và Martin (1952) cho thấy:

 Nồng độ virus trong tế bào các cây bị bệnh phụ thuộc và tốc độ phân chia tế bào và khả năng sinh trưởng của tế bào Tế bào càng phân chia mạnh thì nồng

độ virus càng thấp, nghĩa là những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứa ít virus hơn

 Từ đây các ông đã đề xuất kỹ thuật: nuôi cấy meristem (mô phân sinh đỉnh) để tạo ra cây hoàn toàn sạch virus từ cây đã bị nhiễm bệnh

 White (1934) đã sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo để nghiên cứu sự phân bố virus trong rễ cây cà chua bị bệnh virus Aucuba gây khảm lá Kết quả cho thấy 2 cm ở đầu rễ hầu như không phát hiện ra virus

 Limasset và Cornuet (1950) đã dùng phương pháp huyết thanh định lượng, chứng minh được sự tồn tại một gradient nồng độ virus từ các mô non đến các

mô già ở cây thuốc lá bị bệnh Nồng độ virus bằng không ở mô đỉnh và lá bao thứ nhất sau đó tăng dần, đạt cực đại ở lá thứ năm rồi giảm dần ở các lá già phía dưới

Các kỹ thuật làm sạch virus trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật in vitro

Nuôi cấy meristem

Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt

Nuôi cấy meristem kết hợp với bổ sung hóa chất

Vi gép trong ống nghiệm

Câu 8: Trình bày các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus ở thực vật?

Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus

1 Chuẩn đoán bằng mắt :Đây là phương pháp chuẩn đoán dựa trên các triệu

chứng bệnh của cây

 Phải có kinh nghiệm, dễ lẫn với triệu chứng khác

 Rất khó phát hiện khi cây bị nhiễm tổ hợp nhiều loài virus

 Phụ thuộc vào ngoại cảnh, tuổi cây, đặc điểm giống



2 Chuẩn đoán bằng cây chỉ thị : Cây chỉ thị là cây khi bị nhiễm virus sẽ xuất hiện

các triệu chứng đặc trưng Phương pháp này đã được tiến hành từ 1940

Ưu điểm:

- Nhạy, chính xác

- Có thể phát hiện ở nồng độ virus thấp

Hạn chế:

- Thời gian chuẩn đoán dài, cần quá trình ủ bệnh

- Phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm

- Phương pháp lây nhiễm phức tạp

- Tốn công chăm sóc cây chỉ thị, môi giới truyền bệnh

- Một số bệnh virus không tiến hành được (bệnh cuốn lá)

3 Phương pháp huyết thanh

Ưu điểm:

- Nhạy, đặc hiệu (kết quả thu được trong 48 giờ), chi phí thấp

- Không cần có nhà cách ly nuôi cây chỉ thị

Hạn chế:

- Có thể lẫn với một số dạng kết tủa khác

- Phản ứng khó xảy ra ở nồng độ virus trong dịch cây bệnh thấp

4 Phương pháp kính hiển vi điện tử

Ưu điểm

 Thao tác đơn giản, nhanh

 Khá chính xác

Hạn chế:

 Chỉ phỏt hiện được cỏc loại hỡnh đũa, hỡnh sợi

 Nhiều loài virus cú cựng hỡnh dạng, kớch thước

5 Phương phỏp ELISA

Dựa vào phản ứng khỏng nguyờn – khỏng thể nhưng ở đõy khỏng thể được liờn kết với một enzyme (enzyme linked) Phức khỏng nguyờn – khỏng thể – enzyme dễ dàng nhận biết qua phản ứng tạo mầu do chớnh enzyme đú xỳc tỏc

6 Phương phỏp lai AND

 Xỏc định trực tiếp sự cú mặt của ARN lừi của virus

 Chớnh xỏc, đắt tiền

Sơ đồ nguyờn lý:

 ARN virus lai với mẫu dũ >>> Phản ứng lai nhận biết khi mẫu dũ gắn đồng vị

phúng xạ hoặc chất phỏt huỳnh quang.

Cõu 9 Trỡnh bày kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro?

Đây là giải pháp công nghệ có triển vọng trong việc bảo quản nguồn gen thực vật nhất là với các cây nhân giốngvô tínhvà có hạt mất sức nảy mầm ở nhiệt độ và ẩm độ thấp (recalcitrant) Trong vòng 20 năm gần đây công nghệ này đã được phát triển rộng và áp dụng với hơn 1000 loài th c vật khác nhau (F Engelmann,1997)ự

Quá trình chuẩn bị mẫu bảo quản:

- Thu thập nguồn gen trong tự nhiên hoặc thông qua quá trình trao đổi giống

- Chẩn đoán bệnh, khử bệnh

- Nuôi cấy in vitro v nhân nhanh cho đủ số là ượng mẫu để bảo quản

Sau đó tuỳ thuộc v o đối tà ượng với mục đích m lựa chọn cách bảo quản in vitro thích hợp.à

Có 2 cách bảo quản nguồn gen thực vật in vitro :

1 Bảo quản sinh truởng chậm

Đặc điểm của phuơng pháp n y l kéo d i thời gian giữa 2 lần cấy chuyển nhờ ức chế sự sinhà à à truởng của mẫu cấy nhằm giảm đến mức tối thiểu chi phi trong quá trình bảo

quản Trong thời gian bảo quản mô v tế b o thực vật vẫn tiếp tục sinh trà à ưởng nhưng với tốc

độ rất chậm (thường giảm từ 15 - 20 lần so với bình thường) Thời gian bảo quản sinh trưởng chậm có thể kéo d i một v i năm Phà à ương pháp n y thà ường áp d ng để bảo quản cây nonụ

ho n chỉnh, chồi mầm, phôi để ít gây các biến dị sinh dà ưỡng v các đặc tính di truyềnà không bị mất hay thay đổi trong thời gian bảo quản

Các nhân tố ức chế sinh trưởng(trong bảo quản sinh trưởng chậm)

- Nhiệt độ thấp: giảm nhiệt độ của phòng nuôi cây Chất ức chế sinh trưởng: bổ sung v o môià trường nuôi cấy axit abcisic(ABA), Clo cholin clorit (CCC)Các chất gây áp suất thẩm thấu: bổ sung v o môi trà ường nuôi cấy manitol, sorbitol, saccarose…

- Thay đổi điều kiện nuôi cấy như: giảm cuờng độ chiếu sáng, giảm nồng độ oxy…

Chú ý:

Khi kết thúc một giai đoạn bảo quản các mẫu bảo quản được chuyển sang môi trường tươi v

đặt một thời gian gắn trong điều kiện tối thích để kích thích sự tái sinh trưởng trước khi băt

đầu một chu kỳ bảo quản mới Xác định thời gian tối đa an toμn cho từng loại cây trồng trong quá trình bảo quản sinh trưởng chậm