KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT docx

KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định thành phần loài ký sinh trùng sốt rét KSTSR gây bệnh trên người tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước

KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI KÝ SINH

TRÙNG SỐT RÉT

TÓM TẮT

Mục tiêu: Xác định thành phần loài ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) gây

bệnh trên người tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước bằng sinh học phân tử

Phương pháp: Kỹ thuật Nested PCR được áp dụng trong nghiên cứu này Các cặp mồi được sử dụng là các cặp mồi đặc hiệu đối với từng loài Plasmodium

Kết quả và kết luận: phân tích 58 mẫu có KSTSR (+) tại xã Bù Gia Mập cho

ta thấy có 4 loài KSTSR gây bệnh ở người, trong đó P falciparum chiếm 60,9%; P vivax chiếm 34,8%; P malariae chiếm 2,9%; P ovale chiếm 1,4% Tỷ lệ nhiễm đơn

P falciparum chiếm 55,2%; nhiễm đơn P vivax chiếm 24,1%; nhiễm đơn P malariae chiếm 3,4%; nhiễm phối hợp 2 loài là 15,5%; nhiễm phối hợp 3 loài là 1,8%

ABSTRACT

Objectives: In this study, we use the Polymerase Chain Reaction (PCR) to

find out four human malaria parasite species

Methods: PCR is a highly sensitive method through which the presence of

a particular DNA sequence in a given sample can be established The oligonucleotide primer and original amplification conditions for Plasmodium species detection were developed and published by Snounou et al., 1995

Results and conclusions:Among 494 patient blood samples collected in Bu

Gia Map commune–Bu Đang district - Binh Phuoc province from August to December, 2005, there were 58 malarial cases with 32 cases of single P falciparum infection (55.2%), 14 cases of single P vivax infection (24.1%), 2 cases of single P malariae infection (3.4%) and 10 cases of mixed infection (P falciparum + P vivax + P ovale) (17.3%) The Giemsa stain revealed mixed infection rate of only 8.7%

Ngày nay, một vấn đề mà kỹ thuật viên xét nghiệm KSTSR cần biết là P faciparum kháng thuốc và sự biến đổi gen đã làm biến dạng hình thái các chủng

loại KST SR (Xét nghiệm kính hiển vi và sự nhầm chủng loại, Viện Sốt Rét

KST-CT Trung Ương, 1965) Do đó, việc xác định đúng loài KSTSR đóng vai trò quan trọng trong điều trị Hiện nay, đối với sốt rét, ngoài phương pháp nhuộm giêm sa phát hiện KST SR còn có nhiều kỹ thuật mới đã và đang được áp dụng như: nhuộm Acridine Orange (AO), Paracheck, Para-sight F .và đặc biệt là kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật có độ nhạy cao, có khả năng phát hiện được những trường hợp có nhiễm KST mật độ thấp (5-10 KST/ml máu), phát hiện được 4 loài KSTSR gây bệnh trên người hoặc nhiễm phối hợp 2 hay nhiều loài, trong đó chỉ có một loài trội hẳn về số lượng

mà kính hiển vi không thể phát hiện hay phân biệt được đầy đủ và chính xác(1,6) Trong chương trình sàng lọc KST SR để điều trị tiệt căn, sự ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định thành phần cơ cấu KST SR tại những vùng sốt rét lưu hành nặng là khả thi trong tình hình sốt rét hiện nay(5,7,8)

Mục tiêu

- Xác định thành phần loài và tỷ lệ nhiễm phối hợp KSTSR tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước bằng kỹ thuật PCR

- So sánh với phương pháp nhuộm Giemsa

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Địa điểm nghiên cứu

Xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước nằm trong vùng sốt rét lưu hành nặng Trong 6 tháng đầu năm 2004 có tỷ lệ lam dương tính/lam soi là: 25,04%, tỷ lệ mắc /1.000 dân là: 32,89 Vì vậy chúng tôi chọn địa điểm này để tiến hành nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

Tất cả những bệnh nhân đang sốt hay có sốt trong vòng 3 ngày trước đó

Thu thập mẫu

Thời gian thu thập mẫu:

Từ tháng 6/2005 đến tháng 12/2005

Phương pháp thu thập mẫu:

Điều tra cắt ngang được tiến hành 3 đợt trên 9 thôn của xã Bù Gia Mập: Bù Nga, Thôn 8, Bù La, Bù Dốt, Đắk á, Bù Lên, Bù Lư, Bù Rên, Đắk Côn Đợt 1 vào tháng 8/2005 được 416 lam, đợt 2 vào tháng 10/2005 được 720 lam và đợt 3 tháng 12/2005 được 141 lam Tổng cộng 1.277 lam Tất cả các lam đều được nhuộm giemsa Trong đó 494 người (theo đối tượng nghiên cứu và ngẫu nhiên về giới tính, tuổi, nghề nghiệp ) được lấy máu đầu ngón tay nhỏ lên giấy thấm Whatman 3MM để khô ở môi trường thực địa và cho vào các túi nhựa riêng biệt

có đánh số thứ tự Các mẫu này được tách chiết và phân tích bằng phương pháp PCR xác định thành phần KSTSR tại khoa SHPT của Viện

Phương pháp tách tinh khiết DNA

Ap dụng phương pháp của Kain K.C, Lannar và cộng sự (1995) tách tinh khiết DNA bằng Chelex100

Phản ứng PCR

(Khoa SHPT - Viện Sốt Rét KST-CT Trung Ương)

Vật liệu

Hóa chất dùng để tách chiết DNA của hãng Sigma

Hoá chất dung cho phản ứng PCR:

+ dATP, dTTP, dCTP, dGTP (Abgene)

+ Tag polymerase (Abgene)

+ Primer (mồi): PLU5, PLU6 (Poligo), FAL,VIV, MAL, OVA (Sigma)

Lam kính, thuốc nhuộm giêmsa

Giấy thấm Whatman 3MM

Nested 1: Phản ứng PCR để nhân bản gen đặc hiệu của Plasmodium

Mồi sử dụng là Plu5, Plu6

Trình tự mồi:

Plu5 5’-CCT GTT GTT GCC TTA AAC TTC -3’

Plu6 5’-TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG-3’

Điều kiện phản ứng:

95oC – 5 phút (1 chu kỳ)

94oC – 1 phút

58oC – 2 phút

72oC – 2 phút (25 chu kỳ)

72oC – 8 phút (1 chu kỳ)

Nested 2: Phản ứng PCR nhân bản gen đặc hiệu cho từng loài P

falciparum, P vivax, P malariae, P ovale Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho

từng loài Trình tự mồi:

FAL1 5’-TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3’

FAL2 5’-ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3’

VIV1 5’-CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC-3’

VIV2 5’-ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA-3’

MAL1 5’-ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC-3’

MAL2 5’-AAA ATT CCC ATG CAT AAA AAA TTA TAC AAA-3’

OVA1 5’-ATC TCT TTT GCT ATT TTT TAG TAT TGG AGA-3’

OVA2 5’-GGA AAA GGA CAC ATT AAT TGT ATC CTA GTG-3’

Thành phần phản ứng như Nested 1, chỉ khác DNA khuôn được lấy từ sản phẩm của Nested 1 Điều kiện phản ứng như Nested 1, chỉ khác từ bước 2 đến bước 4 được lặp lại 30 chu kỳ

Bảng 1: Kích thước sản phẩm PCR

Phản ứng

PCR (Nested 2)

Kích thước sản phẩm PCR

P falciparum 205 bp

P malariae 144 bp

Phương pháp phân tích kết quả

Sản phẩm PCR được phân tích kết quả bằng kỹ thuật chạy điện di trên gel agarose 2% có chứa ethidium bromide Kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu từng loài như bảng1

KẾT QUẢ

Tổng số mẫu thu thập được từ xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước là 494 mẫu Số mẫu phân tích bằng kỹ thuật Nested PCR là 494 mẫu Kết quả có 58 mẫu (+) Thành phần cơ cấu va tỉ lệ nhiễm phối hợp KST (xem

bảng 2) Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của những bệnh nhân nhiễm đơn P falciparum, nhiễm đơn P vivax, nhiễm đơn P malarie, nhiễm phối hợp 2 loài,

nhiễm phối hợp 3 loài được biểu hiện trên các hình 1, 2, 3, 4 và 5 Dựa vào Bảng

1, ta thấy trên hình ảnh điện di kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu cho từng loài

Plasmodium

Hình 1: Hình ảnh điện di nhiễm đơn P falciparum (Hoàng Thị Huệ, 5 tuổi,

Đắk á)

Hình 2: Hình ảnh điện di nhiễm phối hợp P falciparum, P vivax và P

ovale (Đa Thị Nhàn, 5 tuổi, Bù Nga)

Bảng 2: Thành phần loài KST tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh

Bình Phước

Tổ

ng số

P

f

P

v

P

m

P.f+

P.v

P.f+P.v +P.o

Nest

ed PCR

32

(55 ,2)

14

(24 ,1)

2

(3 ,4)

9

(15, 5)

1

(1,8)

58

Gie

msa

35

(60 ,3)

17

(29 ,3)

1

(1 ,7)

5

(8,7)

0

(0)

58

Bảng 2 cho thấy tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước

có sự tồn tại 4 loài KSTSR (P falciparum, P vivax, P malarie, P ovale) Trong

đó, tỷ lệ nhiễm đơn P falciparum là cao nhất (55,2%)

Bảng 3: Tỷ lệ thành phần loài KSTSR tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước

Long, tỉnh Bình Phước

P.f (%)

P.v (%)

P.m (%)

P.o (%)

Tổng cộng (%)

Nested

PCR

42 (60,9)

24 (34,8)

2 (2,9)

1 (1,4)

100

Giemsa

40 (63,5)

22 (34,9)

1 (1,6)

0 (0)

100

Theo bảng 3 so sánh giữa Nested PCR và Giemsa ta thấy không có sự khác biệt nhiều về tỷ lệ thành phần loài giữa 2 kỹ thuật này (p= 0,87 > 0,05)

Trong 58 ca (+) có 6 ca có sự khác biệt giữa Nested PCR và Giemsa (Bảng 4)

Bảng 4: Đối chiếu kết quả giữa 2 phương pháp nhuộm giêmsa và PCR

Mã số bệnh

nhân

Kết quả Giemsa

Kết quả

Nested PCR

1 (Thị Hạnh,

8 tuổi, Bù La)

Vtg+++

P f + P.v

55(105)(Điểu

Han, 7 tuổi, Đắk á)

Vt(+)

P

m

1095(Điểu

Hiệp, 8 tuổi, Bù La)

Vt(+)

P f + P.v

3524 (Phan

Thanh Tường, 25

tuổi, Bù Lư)

Ft+

P f + P.v

3561

(Nguyễn Văn

Khang, 18 tuổi, Bù

Rên)

Ft++

P f + P.v

75A(Đa Thị

Nhàn, 5 tuổi, Bù

Nga)

Ft+g(+)

P f + P v + P.o

NHẬN XÉT VÀ KẾT LUẬN

- Trong tổng số 58 ca KSTSR (+) lấy được tại xã Bù Gia Mập, huyện

Phước Long, tỉnh Bình Phước, chúng tôi thấy có tất cả 4 loài KSTSR (P falciparum, P.vivax, P.malarie, P.ovale) Tỷ lệ P.falciparum chiếm cao nhất 60,9%, kế đến là P.vivax 34,8%

- Về cơ cấu KSTSR, tỷ lệ nhiễm đơn P falciparum là 55,2%; tỷ lệ nhiễm đơn P vivax là 24,1% Tỷ lệ nhiễm phối hợp 2 loài P falciparum và P vivax là

15,5%

- Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy không có sự khác biệt nhiều giữa 2

kỹ thuật Giemsa và Nested PCR (p= 0,86 > 0,05) về cơ cấu KST SR Tuy nhiên trong số 58 ca KSTSR (+) có 6 ca có sự khác biệt giữa kết quả Giemsa và Nested

PCR Chỉ có 1 ca kết quả Giemsa là P vivax nhưng Nested PCR là P malariae

Còn lại 5 ca là thiếu loài trong nhiễm phối hợp (Bảng 4) Có thể là trong nhiễm phối hợp có 1 loài trội hơn còn loài kia mật độ quá thấp, dưới ngưỡng phát hiện của kính hiển vi Theo nghiên cứu “Áp dụng các kỹ thuật SHPT để nghiên cứu thành phần cơ cấu loài của KSTSR tại tỉnh Quảng Bình 2004-2005” của Lê Đức Đào và cộng sự cho thấy so với kỹ thuật nhuộm Giem sa, kỹ thuật PCR phát hiện được tỷ lệ nhiễm phối hợp cao hơn (30% so với 4,6%) Còn lại 436 mẫu Giemsa (-) thì Nested PCR cũng có kết quả (-(-)(5)

- Kỹ thuật PCR là kỹ thuật có tính chính xác nhưng đòi hỏi mức độ chuyên hóa cao và chi phí tốn kém tuy nhiên nó cũng góp phần vào việc tìm biện pháp phòng chống sốt rét có hiệu quả