Luận văn : Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn (Azadirachta indica A.Juss) trồng tại Việt Nam và Cypermethrine đối với sâu xanh (Heliothis armigera) part 2 ppt

9 thứ 5 ở trường Đại học Queensland Gatton College, Úc) và nhiều công trình nghiên cứu tổng thể cũng như các nghiên cứu có tính chuyên sâu về cây xoan chịu hạn như: Nghiên cứu về quá trình ra hoa, ra hạt của cây; nghiên cứu những biện pháp cải tiến di truyền ở xoan chịu hạn, kỹ thuật tạo dòng và các kỹ thuật công nghệ sinh học để thu hiệu suất cao về xoan chịu hạn; chuẩn hóa kỹ thuật nhân giống; nghiên cứu về những ứng dụng của xoan chịu hạn trong Nông nghiệp, Lâm nghiệp, Y - Dược; nghiên cứu chiến lược sản xuất và quản lý cây xoan chịu hạn .v.v. [31; 32; 33; 36; 37]. 2.2.2 Ở Việt Nam Năm 1981 GS. Lâm Công Định đã tiến hành những khảo nghiệm trồng thử cây xoan chịu hạn giống Senegal ở Bình Thuận. Bước đầu cho thấy cây xoan chịu hạn thích nghi tốt đối với vùng đất khô cằn này [5]. Bên cạnh đó, vịêc nghiên cứu hoạt chất tách chiết từ cây xoan chịu hạn và cây xoan ta cũng đã được nghiên cứu tại một số cơ sở nghiên cứu ở Hà Nội (công trình nghiên cứu của PGS. TS Nguyễn Đăng Diệp, PGS. TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn, Đại học quốc gia Hà nội, và TS. Nguyễn Trường Thành, Viện bảo vệ thực vật Hà Nội). Theo đánh giá chung, thuốc trừ sâu thảo mộc từ xoan chịu hạn tuy không mạnh bằng thuốc trừ sâu hóa học, nhưng có phổ tác động rộng, thời gian tác động chậm đặc trưng cho thuốc trừ sâu sinh học. Các nghiên cứu này còn bị hạn chế do nguồn nguyên liệu ít, không đáng kể về mặt số lượng, hơn nữa cây xoan chịu hạn tỏ ra không thích hợp đối với các tỉnh phía Bắc (không ra hoa, phát triển chậm …) [24]. Từ đầu những năm 1990, việc trồng xoan chịu hạn đã được đẩy mạnh ở 2 tỉnh khô hạn nhất của nước ta là Bình Thuận và đặc biệt là Ninh Thuận. Tỉnh Ninh Thuận tiến hành trồng thử xoan chịu hạn giống Senegal và Ấn Độ trên vùng đất cát hoang, chạy dọc theo biển có khí hậu rất khắc nghiệt, lượng mưa trung bình hằng năm nhỏ và chỉ tập trung trong 2 – 3 tháng. Hiện đã trồng được 380 ha trong đó có 70 ha xoan chịu hạn thuần loại. Một số diện tích trồng từ năm 1996 (7 ha) đã cho hoa và trái. Điều này chứng tỏ cây xoan chịu hạn thích hợp với vùng đất khô cằn này và việc trông xoan chịu hạn trước mắt là phục vụ cho mục đích phủ xanh đất trống, cải tạo môi trường sống và đồng thời tạo nguồn nghiên liệu có giá trị phục vụ cho nhiều mục đích sử dụng [24]. Năm 1991, Giáo sư Lâm Công Định đã viết một cuốn sách nói về loài cây xoan chịu hạn (Azadirachtin indica A.Juss) được nhập nội vào Việt Nam và công bố những 10 nghiên cứu về điều kiện khí hậu, canh tác để phát triển loài cây này trên vùng đất cát nóng Tuy Phong thuộc tỉnh Bình Thuận [5]. Năm 1999 – 2000, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành thử nghiệm dầu xoan Ấn Độ lên sự phát triển bọ hà khoai lang và nghiên cứu ảnh hưởng của dầu xoan chịu hạn lên sự ký sinh của bọ hà khoai lang, kết quả cho thấy dầu xoan chịu hạn có hiệu lực phòng trừ bọ hà khoai lang [18], có tác dụng làm giảm sự ký sinh, sự sinh sản của bọ hà đối với khoai lang ngay từ tuần đầu tiên và có tác dụng xua đuổi bọ hà đến ký sinh [19]. Bên cạnh đó, Viện cũng đã hoàn thành qui trình nhân giống cây xoan chịu hạn bằng nuôi cấy mô [19]. Năm 2001, Dương Anh Tuấn và cộng sự bước đầu nghiên cứu thành công việc chiết tách và tinh sạch Azadirachtin từ nhân hạt xoan chịu hạn trồng tại Việt Nam và thử nghiệm hoạt tính gây ngán ăn trên sâu khoang [26]. Năm 2001, Nguyễn Thị Minh Hà đã khảo sát thành phần hóa học của hạt và lá xoan chịu hạn thu hái từ các cây xoan chịu hạn trồng tại Việt Nam; chiết xuất thô hoạt chất sinh học từ nhân hạt xoan chịu hạn và thử tác dụng kháng nấm Fusarium oxysporum, Alternaria sp. của sản phẩm chiết xuất thô này [9]. Năm 2001, Nguyễn Thị Thủy đã khảo sát hoạt tính ức chế sinh trưởng rầy nâu và ngài gạo của sản phẩm chiết xuất từ nhân hạt xoan chịu hạn [25]. Năm 2003, Vũ Văn Độ, Nguyễn Tiến Thắng đã chiết xuất, tinh sạch và xác định được hàm lượng azadirachtin và salanin trong nhân hạt xoan chịu hạn. Năm 2003, Trần Thị Hồng Anh đã khảo sát hoạt tính ức chế sâu hại của sản phẩm chiếc xuất từ xoan chịu hạn [1]. Năm 2003, Vũ Đăng Khánh đã khảo sát hoạt tính kháng một số loài nấm gây bệnh và nấm Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin của sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn trồng tại Việt Nam [12]. Năm 2004, Lê Thị Thanh Phượng đã chiết xuất được các hoạt chất sinh học từ nhân hạt Neem (Azadirachta indica A.Juss) và khoả sát tác động của chúng đối với ngài gạo (Corcyra cephadonica St.) [18]. Năm 2005, Vũ Văn Độ, Vũ Đănh Khánh và Nguyễn Tiến Thắng đã đánh giá được độ độc của chế phẩm phối trộn giữa dầu neem và Bt (Baccillus thuringiensis) đối với sâu xanh (Heliothis armigara ), sâu tơ (Plutella xylostella) [6 ]. 11 Năm 2001, Viện Sinh học Nhiệt đới được Nhà nước giao thực hiện đề tài cấp nhà nước theo Nghị định thư giữa Việt Nam và Ấn Độ về “Nghiên cứu và sử dụng cây xoan chịu hạn (Azadirachtin indica A.Juss) trồng tại Việt Nam”. Kết quả: Đã xây dựng được bản đồ trồng xoan chịu hạn tại Ninh Thuận, nghiên cứu và hoàn thiện qui trình nhân giống cây xoan chịu hạn và đã tiến hành trồng thử nghiệm xoan chịu hạn cấy mô tại Ninh Phước, Ninh Thuận; xây dựng qui trình chiết xuất thô hoạt chất sinh học từ nhân hạt, qui trình chiết tách và tinh sạch azadirachtin, salanin; xác định hàm lượng azdirachtin, salanin và mimbin bằng kỹ thuật HPLC, khảo sát ảnh hưởng của sản phẩm chiết xuất lên sự sinh trưởng của một số loại nấm gây bệnh và rầy nâu hại lúa [22; 24]. 2.3 Các hoạt chất phòng trị côn trùng trích từ cây xoan chịu hạn 2.3.1 Các hoạt chất có trong xoan chịu hạn Trong cây xoan chịu hạn, trên 300 hợp chất tự nhiên đã được phân lập và mô tả. Tanin có nhiều trong vỏ cây (14%), lá cây ngoài các limonoid còn chứa tinh dầu và alkaloid. Theo Mitra (1963), lá cây chứa alkaloid “Parisian”, xoan chịu hạn tự bảo vệ nó khỏi nhiều loại côn trùng gây hại do nó chứa nhiều thành phần có hoạt tính kháng côn trùng. Xoan chịu hạn chứa hỗn hợp của 3 đến 4 hợp chất chính và khoảng hơn 20 các hợp chất phụ khác, các hợp chất phụ này có tác động theo phương cách này hay phương cách khác. Các hợp chất chính thuộc về nhóm các hợp chất tự nhiên triterpenoid; chuyên biêt hơn, đó là các limonoid (tetranotriterpenoid) [33]. Cho đến nay, 9 limonoid trong xoan chịu hạn đã được chứng minh là có khả năng ngăn cản sự phát triển của côn trùng, đặc biệt là những côn trùng gây dịch bệnh cho nông nghiệp và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Nhiều limonoid mới vẫn đang tiếp tục được phát hiện trong cây, các limonoid như azadirachtin, salannin, meliantriol, nimbin, nimbidin được xem là thành phần hoạt chất chính trong xoan chịu hạn. [33; 36] 2.3.2 Dầu xoan chịu hạn Theo Tewari (1992), nhân hạt xoan chịu hạn có chứa khoảng 40,0 – 48,9% dầu, dầu xoan chịu hạn có màu vàng nâu, mùi tỏi. Theo Ketkar (1976), nhân hạt xoan chịu hạn khi được chiết xuất bằng phương pháp ép thu được từ 30 – 40% dầu. Cặn dầu có thể được chiết xuất bằng một số dung môi khác. Theo Anon (1985), dầu xoan chịu hạn có thể được tách chiết bằng cách đun sôi nhân hạt xoan chịu hạn đã được xay nhỏ trong nước. 12 Một số đặc tính lý hoá của dầu xoan chịu hạn được trình bày ở Bảng 2.1 Bảng 2.1: Một số đặc tính lý hóa của dầu xoan chịu hạn [36] Chỉ số khúc xạ ở 40 o 1,4617 – 1,4627 Tỷ trọng ở 30 o 0,9087 – 0,9189 Độ chuẩn 35,8 Chỉ số iod 68,0 – 75,8 Chỉ số xà phòng hóa 193 – 204 % chất khô không bị xà phòng hóa 0,8 – 2,4 Thành phần chính Acid oleic 2.3.3 Azadirachtin và các limonoid khác 2.3.3.1 Azadirachtin Azadirachtin là hợp chất chính trong xoan chịu hạn, có công thức phân tử là C 35 H 44 O 16 , nhiệt độ nóng chảy 154 – 158 o C, có hoạt tính kháng côn trùng mạnh nhất, đặc biệt là tác động xua đuổi và ức chế sinh trưởng mạnh. Azadirachtin có cấu trúc tương tự như hormone “ecdysone”, hormone này có tác dụng kiểm soát tiến trình biến đổi nội hóa học của côn trùng khi côn trùng chuyển từ dạng ấu trùng sang dạng nhộng để sang dạng trưởng thành. Azadirachtin được xem như chất ngăn cản sự tổng hợp các hormone cần thiết cho cở thể côn trùng, do đó phá vỡ chu kỳ sống của côn trùng. Azadirachtin tập trung nhiếu nhất trong nhân hạt xoan chịu hạn. Trung bình 1 gram nhân hạt chứa từ 2 đến 4 mg azadirachtin, đặc biệt ở Senegal, 1g nhân hạt có thể chứa đến 9 mg azadirachtin [33]. Hàm lượng azadirachtin trong nhân hạt xoan chịu hạn cũng biến động tùy thuộc vào nguồn gốc, xuất xứ, điều kiện khí hậu ở nhiều vùng khác nhau, trong mỗi cây cũng có sự biến động về hàm lượng azadirachtin (Bảng 2.2), (Ermel và cộng sự, 1987; Singh, 1987) [36]. 13 Bảng 2.2: Sự biến động hàm lƣợng azadirachtin trong mẫu hạt từ nhiều nơi khác nhau [36; 37]. Xuất xứ Hàm lượng azadirachtin ( % trọng lượng khô) Theo tác giả Sri Lanka 0,2 – 0,65 Eeswara (1996) Ấn Độ 0,2 – 0,75 Anon (1985) Nicaragoa và Indonesia 0,48 Tewari (1992) Togo, Burma, Mauritius 0,3 – 0,39 Anon (1985) Sudan 0,19 Tewari (1992) Senegal 0,33 Ermel (1995) Kenya, Nigeria, Ghana 0,10 – 0,35 Morgan (1982) Hàm lượng azadirachtin cũng phụ thuộc vào tời điểm thu hái, quả xoan chịu hạn thu hoạch tốt nhất khi nó chuyển sang màu vàng hay vàng xanh, lúc này hàm lượng azadirachtin cao nhất. không nên để quả quá chín và rụng vì hạt thường bị giảm chất lượng khi bị rơi xuống đất [33; 36]. O O H OH H 3 CO O O H O OH 3 C O H 3 C O CH 3 O H H H 3 CO O OH CH 3 HO O CH 3 Hình 2.1: Công thức cấu tạo của Azadirachtin [36] 2.3.3.2 Meliantriol Meliantriol là một hợp chất thuộc triterpenoid alcohol, là tác nhân gây ngán ăn mạnh đối với côn trùng ngay cả khi xử lý với nồng độ rất thấp. Nhiều loại côn trùng đã không dám ăn trong khoảng 2 – 6 tuần sau khi tiếp xúc với chế phẩm từ xoan chịu hạn (hình 2.4) [36]. 14 Hình 2.2: Công thức cấu tạo của meliantriol [42] 2.3.3.3 Salannin Salannin cũng có hoạt tính gây ngán ăn mạnh và là chất chống lại sự lột xác của côn trùng. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng chất này tác động mạnh lên sự lột xác của con bọ cánh cứng trên dưa chuột – Acalymma vitta và bọ cánh cứng Nhật Bản – Popillia japonica. Trong hạt, hàm lượng salannin thường từ 15 – 1247 g/ g nhân hạt xoan chịu hạn (Eeswara và cộng sự, 1996), (hình 2.5) [36]. Hình 2.3: Công thức cấu tạo của Salannin [42] 2.3.3.4 Nimbin và Nimbidin Hai chất này được xem là có hoạt tính kháng virus mạnh. Chúng tỏ ra có hiệu quả đối với virus gây bệnh trên cây cà chua, bệnh đậu mùa và bệnh trên gia cầm. Eeswara và cộng sự (1996) báo cáo rằng nimbidin có trong hạt xoan chịu hạn từ 9 đến 619 g/ g nhân hạt (hình 2.6) [36]. 15 Nimbidin là thành phần chủ yếu gây ra vị đắng của dịch chiết từ hạt xoan chịu hạn với cồn. Nimbidin chiếm khoảng 2% trong nhân hạt xoan chịu hạn [33]. Hình 2.4: (a) Công thức cấu tạo của Nimbin [36] (b) Công thức cấu tạo của Nimbidin [42] 2.3.3.5 Các chất khác Những chất có bản chất limonoid mới được tìm thấy sau này: Diacetylazadirachtin được chiết từ quả tươi, hiệu lực tương tự azadirachtin. Hai chất tương tự salannin là 3 – diacetylsalannin và salannol gây ra sự ngán ăn ở côn trùng. 2.4 Phƣơng thức tác động và phổ tác động của các hoạt chất trong xoan chịu hạn 2.4.1 Đối với côn trùng 2.4.1.1 Phƣơng thức tác động [23] Azadirachtin và các hoạt chất sinh học khác ở cây xoan chịu hạn có hình dạng và cấu trúc tương tự nhiều loại hormone quan trọng trong cơ thể côn trùng, nên chúng dễ dàng xâm nhập và dần dần ức chế hệ nội tiết, gây ra những rối loạn về hormone ở côn trùng (Parma, 1987; Murray và ctv, 1997). Các hoạt chất này thường tác động lên côn trùng theo các phương thức chủ yếu sau đây: Gây ngán ăn: Là một trong những phương thức tác động đặc trưng của các hoạt chất trong cây xoan chịu hạn đối với côn trùng, trong đó azadirachtin là hoạt chất gây ngán ăn mạnh nhất đối với nhiều loại côn trùng. Salannin và meliantriol cũng có khả năng này. Dịch chiết từ hạt xoan chịu hạn chiết xuất trong nước ở nồng độ 0,5 – 1,0% gây ngán ăn hiệu quả đối với Spodoptera litura F. trên đồng ruộng thuốc lá mà không ảnh hưởng xấu lên chất lượng thuốc lá (Johshi và ctv, 1984). (a) (b) 16 Xua đuổi: Các chất xua đuổi dễ bay hơi nên có khả năng tác động đến côn trùng từ xa thông qua cơ quan thụ cảm hóa học khứu giác, gây bất lợi trong đời sống sinh học của côn trùng, khiến chúng di chuyển ra xa vùng gây nhiễm. (Lê Trường và Nguyễn Trần Oánh, 1975) Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiều loại côn trùng dễ dàng bị xua đuổi bởi các hoạt chất trích từ cây xoan chịu hạn, nhất là châu chấu và các loại bọ rầy. Năm 1980, ngoài việc chứng minh hoạt chất gây ngán ăn, Saxena và ctv cũng đã theo dõi tác động xua đuổi của dầu xoan chịu hạn đối với rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal.). Khả năng diệt côn trùng: Các hoạt chất từ xoan chịu hạn ở nồng độ thích hợp có khả năng diệt côn trùng (đặc biệt là ấu trùng muỗi, ruồi đục quả, bọ rầy) ở các tỷ lệ khác nhau, tuy nhiên hiệu lực cần có thời gian nhất định chứ không nhanh và mạnh như thuốc trừ sâu hóa học tổng hợp. Ảnh hưởng đến phát triển và biến thái: Theo Koul (1984), tác động của xoan chịu hạn đối sự phát triển và biến thái của côn trùng thường biểu hiện qua các biến đổi như: giảm kích thước, giảm trọng lượng, kéo dài thời gian phát triển, tạo ra những trưởng thành dị dạng như cụt râu, cụt cánh hoặc râu, cánh, chân bị biến dạng. Làm giảm sức sinh sản và gây vô sinh: Các hoạt chất sinh học từ cây xoan chịu hạn có khả năng ức chế sinh sản của nhiều loại côn trùng như ngăn chặn sự đẻ trứng và làm trứng không nở. Ngoài ra, các hoạt chất từ cây xoan chịu hạn còn tác động lên côn trùng theo phương thức khác như làm giảm khả năng nuốt thức ăn, hoặc ức chế sự hình thành kitin (polyacetyl glycoamine), thành phần cơ bản nhất của vỏ côn trùng, làm côn trùng không lột xác được. 2.4.1.2 Phổ tác động [23] Có khoảng 200 loài côn trùng thuộc nhiều bộ khác nhau chịu tác động của hoạt chất chiết xuất từ xoan chịu hạn, chủ yếu ở các bộ sau: - Bộ cánh thẳng (Orthoptera): phương thức tác động chủ yếu là gây ngán ăn. - Bộ cánh cứng (Coleoptera): ngoài hiệu quả gây ngán ăn, còn có thể giết chết ấu trùng khi tiếp xúc với nguồn thuốc. - Bộ cánh đều (Homoptera) và bộ cánh vảy (Lepidoptera): Hiệu quả gây ngán ăn, ức chế tăng trưởng, quá trình lột xác; biến thái và sinh sản của chúng bị rối loạn. - Bộ hai cánh (Diptera): tác động lên nhiều loài ruồi quả, ruồi nhà, muỗi,… . nước giao thực hiện đề tài cấp nhà nước theo Nghị định thư gi a Việt Nam và Ấn Độ về “Nghiên cứu và sử dụng cây xoan chịu hạn (Azadirachtin indica A. Juss) trồng tại Việt Nam . Kết qu : Đã xây. trong xoan chịu hạn. [33; 36] 2. 3 .2 Dầu xoan chịu hạn Theo Tewari (19 92) , nhân hạt xoan chịu hạn có ch a khoảng 40,0 – 48,9% dầu, dầu xoan chịu hạn có màu vàng nâu, mùi tỏi. Theo Ketkar (1976),. trùng. Azadirachtin tập trung nhiếu nhất trong nhân hạt xoan chịu hạn. Trung bình 1 gram nhân hạt ch a từ 2 đến 4 mg azadirachtin, đặc biệt ở Senegal, 1g nhân hạt có thể ch a đến 9 mg azadirachtin