Luận văn : Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn (Azadirachta indica A.Juss) trồng tại Việt Nam và Cypermethrine đối với sâu xanh (Heliothis armigera) part 6 pptx

41 Sau đó, sấy giấy lọc có chứa cặn ở 105 0 C đến khối lượng không đổi rồi đốt cháy, Để nguội trong bình hút ẩm, đem cân và tính kết quả. Tính kết quả Hàm lượng xơ thô trong nguyên liệu được tính theo công thức: % xơ thô = (m 1 – m 2 ) x 100/ m Trong đó: m 1 : Khối lượng mẫu và bì trước khi nung (g) m 2 : Khối lượng mẫu và bì sau khi nung (g) m : Khối lượng mẫu (g) 3.2.1.7 Định lƣợng đạm tổng số [10] Định lượng nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl. Nguyên tắc Nitơ có trong thành phần của chất hữu cơ, dưới tác dụng của H 2 SO 4 đậm đặc ở nhiệt độ cao sẽ biến đổi thành amoniac (NH 3 ), định lượng NH 3 bằng dung dịch acid có nồng độ xác định. Phương pháp Kjeldahl dựa trên nguyên lý chuyển toàn bộ nitơ trong hợp chất hữu cơ thành muối amon bằng cách công phá với H 2 SO 4 đậm đặc. Xác định hàm lượng NH 4 + bằng máy Kjeldahl khi cho muối amon tác dụng với kiềm. Thu NH 3 bằng dung dịch acid Boric và chuẩn độ muối amon borat bằng dung dịch HCl 0,25 N Quá trình được thực hiện theo các bước sau Bước 1: Vô cơ hóa mẫu Bước 2: Cất đạm Phản ứng xảy ra trong máy cất đạm (NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH = Na 2 SO 4 + 2NH 3 + 2H 2 O Phản ứng xảy ra trong bình hứng NH 3 + HBO 2 NH 4 + + BO 2 - Bước 3: Chuẩn độ lượng BO 2 - sinh ra trong bình hứng bằng HCl 0,25 N. R – CH - COOH NH 2 H 2 SO 4 + Chất xúc tác t 0 CO 2 + H 2 O + (NH 4 ) 2 SO 4 42 Acid Boric là một acid yếu (Ka = 5,8 x 10 -20 ). Khi chuẩn độ bằng HCl loãng tại điểm đổi màu pH từ 4,4 đến 6,2 thì dung dịch chuyển từ vàng sang đỏ. Sử dụng hỗn hợp chất chỉ thị Methyl đỏ với Bromocresol xanh. Hàm lượng đạm tổng số của nguyên liệu có thể được tính gián tiếp bằng cách xác định hàm lượng nitơ tổng số, sau đó nhân với hệ số 6,25. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị, dụng cụ - Hệ thống Micro - Kjeldahl bán tự động. - Burrette bán tự động - Bộ vô cơ hóa mẫu - Tủ hốt - Pipet, giấy lọc, phiểu lọc, giấy quì tím - Cân phân tích có độ chính xác ± 0,002g - Bình tam giác + Hóa chất - Hỗn hợp xúc tác K 2 SO 4 /CuSO 4 (9:1) - H 3 BO 3 4% - NaOH N/100 - Thuốc thử Methyl đỏ và Bromocresol xanh. Cách thực hiện + Vô cơ hóa mẫu Cân chính xác 100 mg bột mẫu đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi, cho vào bình tam giác. Sau đó thêm 1g chất xúc tác + 5 ml acid H 2 SO 4 đậm đặc vào mỗi bình, lắc nhẹ, để yên 30 phút. sau đó đem vô cơ hóa mẫu. Vô cơ hóa mẫu được tiến hành trong tủ hốt để tránh khí độc SO 2 , CO 2 . Trong quá trình đun, dung dịch chuyển từ nâu sẫm đến nâu, đến vàng nhạt cho đến khi dung dịch trắng trong thì quá trình vô cơ hóa mẫu kế thúc. + Tiến hành cất đạm Cất đạm được tiến hành trên máy Micro – Kjeldahl Sử dụng hệ chuẩn HCl 0,25 N để xác định hàm lượng nitơ tiện lợi và tránh những sai số về sự thay đổi nồng độ đượng lượng của kiềm trong không khí. 43 Cho vào bình hứng khoảng 2 ml acid H 3 BO 3 4%, thêm một ít nước cất sao cho dung dịch acid ngập đầu mút sinh hàn. Trong bình hứng dung dịch H 3 BO 3 tự phân ly theo phản ứng: H 3 BO 3 HBO 2 + H 2 O Khi cất đạm, NH 3 bị kiềm đẩy khỏi (NH) 2 SO 4 theo hệ thống ống sinh hàn vào bình hứng. Trong bình hứng, NH 3 phản ứng với HBO 2 như sau: NH 4 OH + HBO 2 NH 4 + + BO 2 - + H 2 O BO 2 - là một bazơ mạnh, nên dung dịch của bình hứng chuyển từ màu xanh sang vàng. Quá trình kết thúc khi dịch hứng ở đầu ra có pH = 7,0. Lượng BO 2 - được tạo thành tương đương với lượng NH 3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định lượng BO 2 - bằng chuẩn độ ngược với HCl 0,25 N. Tính kết quả Thông qua chỉ số HCl 0,25 N, người ta biết được lượng acid Boric kết hợp với NH 3 và từ đó biết lượng NH 3 giải phóng ra từ mẫu. 1ml HCl tương ứng với 0,0035g nitơ hữu cơ. Hàm lượng nitơ tổng số được tính theo công thức: % Nitơ tổng số = (V HCl x 0,0035 x 100%)/ m Trong đó: V HCl : Thể tích HCl 0,25 N dùng để chuẩn độ 0,0035: Khối lượng N hữu cơ tương ứng với 1 ml HCl 0,25 N. m: Trọng lượng mẫu (g) Hàm lƣợng đạm tổng số = % Nitơ tổng số x 6,25 3.2.1.8 Định lƣợng đƣờng tổng số [10] Định lượng đường tổng số bằng phương pháp so màu. Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng màu đặc trưng của đường với sụ hiện diện của H 2 SO 4 . Sự chính xác của kết quả phụ thuộc vào: - Độ sạch của dụng cụ - Độ tinh khiết của thuốc thử, nhất là H 2 SO 4 - Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian đun Để tạo phản ứng màu, có thể dùng nhiều loại thuốc thử khác nhau như: Phenol, antron hay orcinol. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng thuốc thử là Phenol. 44 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị và dụng cụ - Bình định mức 50 ml, 100 ml, 500 ml - Cốc hay bình tam giác 50 ml, 100 ml - Pipet, giấy lọc, phiểu lọc - Ống nghiệm - Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến (UV – Vis). + Hóa chất - Cồn 80 0 , 96 0 - H 2 SO 4 đậm đặc - Thuốc thử phenol 60%: 6 thể tích H 2 SO 4 đậm đặc và 4 thể tích nước cất. - Các dung dịch đường chuẩn gồm: saccharose 0,1%; glucose 0,01%. Cách thực hiện Gồm 2 bước + Bước 1: Ly trích đường Nghiền nguyên liệu cần định lượng đường, sau đó cân chính xác 1 – 2 g nguyên liệu đã nghiền nhuyễn có chứa khoảng 5 – 50 mg đường cho vào cốc thủy tinh 50 ml và thêm 10 ml cồn 96 0 vào. Đun cốc trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần (mỗi lần sôi, lấy cốc ra cho nguội bớt rồi đặt trở lại). Khuấy đều bằng que thủy tinh, để nguội, lọc qua giấy lọc (giữ cặn, không đổ cặn lên giấy lọc) Sau đó thêm 10 ml cồn 80 0 vào cốc chứa cặn, khuấy đều, đun sôi hai lần trên nồi cách thủy. Để nguội, lọc. Tiếp tục làm như vậy khoảng hai lần. Sau đó đưa cặn lên giấy lọc và tráng cốc 2 – 3 lần bằng cồn 80 0 nóng (nước tráng cũng cho cả lên lọc). Dịch lọc cho bay hơi ở nhiệt độ phòng hoặc đun nhẹ trên nồi cách thủy để còn bay hơi hết. Pha loãng cặn thu được với nước cất thành 50 ml. Để lắng, dung dịch này được dùng để xác định hàm lượng đường, có thể pha loãng dung dịch 5 – 10 lần tùy theo nồng độ đường có trong dung dịch nhiều hay ít. + Bước 2: Thực hiện phản ứng màu bằng cách sử dụng thuốc thử là phenol Hút 1 ml dung dịch đường cần định lượng cho vào ống nghiệm rồi cho thêm vào 1 ml dung dịch phenol 5%. Sau đó, cho chính xác 5 ml acid H 2 SO 4 đậm đặc vào 45 ống nghiệm (không để dính acid vào thành ống nghiệm). Để 10 phút rồi lắc, giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30 0 C để hiện màu. + Xây dựng đồ thị chuẩn Lấy 7 bình định mức 100 ml cho vào đó theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch saccharose 0,1%, cho thêm nước đến vạch mức. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml đã pha loãng cho vào ống nghiệm rồi nhuộm màu bằng phenol và H 2 SO 4 như đã nói ở trên. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương ứng là 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 g saccharose. Phải làm ống thử không với 1 ml nước cất thay thế dung dịch đường. Màu bền vững trong vài giờ. Xác định cường độ màu bằng máy so màu ở bước sóng 490 nm. Tính kết quả Trị số mật độ quang của những ống mẫu phải trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không. Từ đó ta xây dựng một đường cong chuẩn. Mặt khác, trị số mật độ quang của dung dịch đường cần định lượng cũng phải trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không rồi dựa vào đường cong chuẩn để suy ra nồng độ x, từ đó tính ra % lượng đường trong mẫu. 3.2.2 Phƣơng pháp chiết xuất thô hoạt chất sinh học từ nhân hạt xoan chịu hạn Nguyên liệu Quả xoan chịu hạn được thu hái từ cây 4 – 5 tuổi trồng tại Ninh Thuận, làm sạch vỏ và thịt hạt, sau đó phơi khô hạt trong bóng râm hoặc sấy khô ở nhiệt độ 50 0 C. Hạt được tách vỏ lấy nhân hạt để ép dầu. Thiết bị và hoá chất Máy ép dầu thực vật chuyên dụng KOMET Model D 85 – 1G (Đức). Máy cô quay chân không. Dung môi Êtanol. Cách tiến hành [9; 24] Nhân hạt xoan chịu hạn được ép lạnh trên máy ép dầu chuyên dụng Komet (Đức) ở nhiệt độ được khống chế từ 35 0 C đến 45 0 C, thu được dầu và bánh dầu. Bánh dầu (bã còn lại sau khi ép dầu) được cho ngấm kiệt và chiết xuất với ethanol nhằm tận thu các hoạt chất còn lại trong bánh dầu, đặc biệt là azadirachtin. Dịch chiết bánh dầu 46 được loại hết ethanol bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 50 0 C và trộn với dầu, thu được dầu xoan chịu hạn đã làm giàu azadirachtin. (Hình 3.1) Hình 3.1: Qui trình chiết xuất thô hoạt chất sinh học từ nhân hạt xoan chịu hạn Hạt xoan chịu hạn Nhân hạt Tách vỏ Ép lạnh Bánh dầu Dầu Chiết bánh dầu với êtanol Dịch chiết Bỏ bã Cao chiết Cô quay chân không o Định lượng azadirachtin bằng HPLC o Tạo chế phẩm thử nghiệm trên sâu xanh Dầu xoan chịu hạn đã làm giàu azadirachtin 47 Hình 3.2: Máy Micro – Kjeldahl Hình 3.3: Máy cô quay chân không Hình 3.4: Lọc chân không Hình 3.5: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Hình 3.6: Hệ thống Soxhlet Hình 3.7: Máy ép dầu chuyên dụng KOMET (Đức) 48 3.2.3 Phƣơng pháp định lƣợng azadirachtin bằng sắc ký lỏng cao áp (Hight Performance Lipuid Chromatography - HPLC) [24; 39; 45] Xử lý mẫu Cân 20 g hạt xoan chịu hạn, nghiền nhỏ thành bột mịn và chiết rút với 200 ml êtanol từ 1,5 – 2,0 giờ, lặp lại qui trình này 5 lần. Các dịch chiết được gom lại, cô trên máy cô quay chân không ở 50 0 C còn 10 ml và được loại mở bằng n – hexan. Dịch sau khi loại mở được lọc qua màng lọc 0,45 m và xác định hàm lượng các hoạt chất trong dịch lọc trên HPLC. Cách tiến hành + Dựng đường chuẩn azadirachtin: Dựng đường chuẩn 5 điểm với chất chuẩn azadirachtin của hãng Sigma (loại 0,5 mg/ lọ). Xác định hệ số tương quan R. + Phân tích HPLC: Xác định hàm lượng azadirachtin, salanin và mimbin trong dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn trên máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Hewlett Packard 1090, series 1 – liquid chromatography với các thông số sau (Hình 3.5): o Cột phân tích: Bondapak C 18 , 125 Å, 10 m, 3,9 mm x 300 mm. o Cột bảo vệ: Bondapak TM C 18 , 125 Å, 10 m, 3,9 mm x 20 mm o Detector DAD: = 220 nm o Lượng mẫu bơm vào cột: 5 l o Tốc độ rửa cột: 0,5 ml/ phút o Dung môi rửa cột: Axêtonitril / H 2 O, (tỷ lệ 55 / 45) o Chất chuẩn: mimbin, salanin của hãng Trifolio – GmbH (Đức) và azadirachtin của hãng Sigma 3.2.4 Phƣơng pháp nuôi sâu xanh (H. armigera) trong phòng thí nghiệm Sâu xanh (Heliothis armigera) được nuôi trên môi trường nhân tạo ở điều kiện nhiệt độ phòng và độ ẩm là 75 – 85%. Bướm sâu xanh được nuôi trong lồng để kiểm tra khả năng đẻ trứng. Nắp lồng được bịt bằng một lớp vải màn để cho bướm sâu xanh đẻ trứng. Hằng ngày tiến hành thu trứng và thay thức ăn cho bướm. Một hoặc hai ngày sau khi đẻ, trứng đổi thành màu nâu sẫm. Lúc này vải màn chứa trứng được cắt và xếp vào đĩa petri có sẵn thức ăn cho sâu non. Sâu tuổi 1 và đầu tuổi 2 được nuôi tập thể trong đĩa petri. Ở tuổi 2 sâu được tách ra nuôi cá thể. Thức ăn cần thay thường xuyên để đảm bảo sâu đủ khả năng vào nhộng [1]. . 3. 1: Qui trình chiết xuất thô hoạt chất sinh học từ nhân hạt xoan chịu hạn Hạt xoan chịu hạn Nhân hạt Tách vỏ Ép lạnh Bánh dầu Dầu Chiết bánh dầu với êtanol Dịch chiết Bỏ bã Cao chiết. Trifolio – GmbH (Đức) và azadirachtin c a hãng Sigma 3.2.4 Phƣơng pháp nuôi sâu xanh (H. armigera) trong phòng thí nghiệm Sâu xanh (Heliothis armigera) được nuôi trên môi trường nhân tạo ở điều. Sigma (loại 0,5 mg/ lọ). Xác định hệ số tương quan R. + Phân tích HPLC: Xác định hàm lượng azadirachtin, salanin và mimbin trong dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn trên máy sắc ký lỏng cao