41 bị ức chế bởi các vi sinh vật đất? Nguyên nhân này cũng xảy ra nhưng không đáng kể. Một nguyên nhân nữa cũng có thể xảy ra là lớp da của sùng quá dày khiến cho nấm không thể xâm nhập qua da để ký sinh và diệt sùng, trong trường hợp này thì cần hỗ trợ thêm chất làm bào mòn da của sùng thậm chí có thể gây vết thương nhẹ giúp nấm dễ dàng xâm nhập vào cơ thể sùng, ký sinh và diệt sùng. Với nhiều giả thuyết đưa ra trên, chúng tôi chú ý đến 2 nguyên nhân: một là các dòng trên không có độc tính; hai là nguyên nhân do lớp da sùng quá dày, nấm không thể xâm nhập qua lớp da để ký sinh và diệt sùng. Do đó chúng tôi tiến hành gây nhiễm tiếp tục theo phương pháp 2 và phương pháp 3. Thử nghiệm phương pháp gây nhiễm 2 đối với 2 dòng nấm MA 11, CP MA và theo đó 2 nghiệm thức đối chứng là môi trường bã bia + mật rỉ + nước và nước. Bảng 4.3 Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 2 Nghiệm thức Tỷ lệ sùng chết (%) Thời gian chết(ngày) MA 2 0 _ CP MA 0 _ Đối chứng 1 0 _ Đối chứng 2 0 _ Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae theo phương pháp 2 cũng không khác gì so với phương pháp 1, tỷ lệ sùng chết vẫn là 0% (Hình 4.3). Với phương pháp 2 trên hai dòng nấm MA 2 và CP MA từ Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, kết quả vẫn không khác biệt. Từ các kết quả trên, chúng tôi tiếp tục đặt ra giả thuyết các dòng nấm M.anisopliae này có khả năng gây độc trên sùng trắng? Phương pháp gây nhiễm có phù hợp? Và chúng tôi bắt đầu tiến hành gây nhiễm theo phương pháp gây nhiễm 3 (tạo vết thương nhẹ trước khi cho sùng tiếp xúc nấm). 42 Hình 4.3 Nghiệm thức đối chứng sùng phun nước và phun môi trường bã bia + mật rỉ + nước a.Nghiệm thức đối chứng sùng phun nước: 5 mẫu sùng đều sống sau khi phun nước 21 ngày ; b. Nghiệm thức đối chứng sùng phun môi trường bã bia + mật rỉ + nước: 5 mẫu sùng đều sống sau khi phun môi trường bã bia + mật rỉ + nước 21 ngày. Kết quả từ nghiệm thức đối chứng (hình 4.3) chứng tỏ sùng vẫn sinh trưởng bình thường khi phun nước và môi trường bã bia + mật rỉ + nước. Điều này cho ta thấy rằng sự sinh trưởng và phát triển của sùng không bị ảnh hưởng bởi nước và môi trường. Từ đây, cho ta lựa chọn nhiều hơn trong quá trình nhân nấm tạo chế phẩm diệt sùng thí dụ ta có thể lựa chọn những môi trường xốp khác cho số lượng bào tử nhiều hơn như môi trường chứa cám, bột ngô, đậu nành và trấu… Kết quả này cũng chứng minh cho kết quả thí nghiệm của chúng tôi là hoàn toàn chính xác. Theo đó, khi gây nhiễm sùng với các dòng MA 2 và CP MA bằng phương pháp 2, sùng vẫn sinh trưởng bình thường. Có nghĩa là theo phương pháp gây nhiễm 2, các dòng này không có thể hiện độc tính trên sùng trắng. Tương tự như vậy, gây nhiễm các dòng BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3 và BXĐLA 8 theo phương pháp 1 cũng không có hiệu quả. Do đó, các dòng BDTN 15, BDLA 8,BXĐTV 3 và BXĐLA 8 cũng không thể hiện độc tính. a b 43 Hình 4.4 Kết quả gây nhiễm sùng với các dòng nấm M.anisopliae BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8 theo phương pháp 1 và MA 11 và CP MA theo phương pháp 2 1. Sùng được gây nhiễm với dòng nấm M.anisopliae BDTN 15 theo phương pháp 1 cho tỷ lệ sùng chết là 0%; 2. Sùng được gây nhiễm với dòng nấm BDLA 8 theo phương pháp 1, tỷ lệ sùng chết là 0%; 3. Sùng được gây nhiễm với dòng nấm BXĐLA 8 theo phương pháp 1, tỷ lệ sùng chết là 0%; 4. Sùng được gây nhiễm với dòng nấm MA 2 theo phương pháp 2, tỷ lệ sùng chết là 0%; 5. Sùng được gây nhiễm với dòng nấm CP MA theo phương pháp 2, tỷ lệ sùng chết là 0%. 1 2 3 4 5 44 4.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm 3 Sau khi tiến hành gây nhiễm trên phương pháp 1 và phương pháp 2 không có kết quả. Chúng tôi tiến hành gây nhiễm theo phương pháp 3 được kết quả như sau: Bảng 4.4 Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 3. Nghiệm thức Tỷ lệ sùng chết (%) Thời gian chết (ngày) BDTN 15 0 _ BDLA 8 0 _ BXĐTV 3 20 7 BXĐLA 8 0 _ SCLLLA 4 20 17 RBC – Q9 – 3 0 _ MA 11 80 5 – 17 MA 13 0 _ Đối chứng 0 _ Từ bảng 4.3, nghiệm thức BXĐTV 3, SCLLLA 4, MA 11 cho tỷ lệ sùng chết lần lượt là 20%, 20% và 80%. Kết quả này chứng tỏ loài nấm này có khả năng ký sinh và diệt sùng. Đặc biệt các dòng có độc tính cao có khả năng diệt sùng rất hiệu quả (dòng MA 11 cho tỷ lệ sùng chết là 80%). Như vậy ta hoàn toàn có thể khẳng định nấm Metarhizium anisopliae có độc tính diệt sùng và có thể sản xuất được chế phẩm nấm diệt sùng tuy nhiên cần phải nghiên cứu nhiều hơn nữa về các dòng nấm M.anisopliae để tìm được dòng có độc tính cao hơn. Các dòng BDTN 15, BXĐLA 8, BDLA 8, RBC – Q9 – 3, MA 13 đều cho tỷ lệ sùng chết là 0%. Đặc biệt, đối chứng gây vết thương trong nghiệm thức đối chứng (Hình 4.5) vẫn sinh trưởng bình thường trong thời gian theo dõi (7 ngày, 14 ngày, 21 ngày) nên kết quả thí nghiệm của chúng tôi là chính xác. Thêm vào đó kết quả này cũng giúp chúng tôi chắc chắn hơn trong giả thuyết lớp da sùng quá dày khiến nấm không thể xâm nhập để ký sinh và diệt sùng. Như vậy trong phương pháp gây nhiễm 3 này các dòng BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8 cũng không thể hiện độc tính của nấm trên sùng trắng. 45 Hình 4.5 Kết quả nghiệm thức đối chứng gây vết thương Sùng được gây vết thương sau 21 ngày theo dõi, tỷ lệ sùng chết là 0%. Kết quả phân lập nấm từ sùng nhiễm bệnh. Các dòng có tính độc trên sùng trắng MA 11, BXĐTV 3, SCLLLA 4 được chúng tôi phân lập lại để khẳng định chính xác kết quả thí nghiệm của chúng tôi (Hình 4.8). So với nấm Metarhizium anisopliae mà chúng tôi lấy tù ống nghiệm gốc đem cấy trên đĩa petri, các nấm M.anisopliae mà chúng tôi phân lập từ sùng nhiễm bệnh có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn biểu hiện ở thời gian gia tăng kích thước đường kính khuẩn lạc: thời gian đường kính khuẩn lạc nấm phân lập từ sùng nhiễm bệnh trên môi trường PGA tăng đến 3 cm là 3 ngày trong khi thời gian là 5 ngày với nấm lấy từ ống gốc. Trong khi đó, hình thái nấm vẫn không hề thay đổi. 46 Hình 4.6 Kết quả gây nhiễm sùng với các dòng nấm M.anisopliae BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11 theo phương pháp 3. 1. 1/5 Sùng chết sau 7 ngày gây nhiễm với dòng nấm BXĐTV 3; 2. 1/5 Sùng chết sau 17 ngày gây nhiễm với dòng nấm SCLLLA 4; 3,4,5,6. 4/5 sùng chết khi gây nhiễm với nấm MA 11 N. Vùng nấm ký sinh trên sùng trắng. Vùng có màu xanh là bào tử nấm đã hình thành. Vùng có màu trắng là vùng sợi nấm đang phát triển. 4 N 3 N 5 N N 1 N 2 N 6 47 Hình 4.7 Kết quả gây nhiễm sùng với các dòng nấm BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8, MA 13, RBC – Q9 – 3 theo phương pháp 3. BDTN 15. Nghiệm thức BDTN 15, 5/5 Sùng không chết khi gây nhiễm với dòng nấm BDTN 15 theo phương pháp 3; BDLA 8. Nghiệm thức BDLA 8, 5/5 sùng không chết khi gây nhiễm với dòng nấm BDLA 8 theo phương pháp 3; BXĐLA 8. Nghiệm thức BXDLA 8, 5/5 sùng không chết khi gây nhiễm với dòng nấm BXĐLA 8 theo phương pháp 3; MA 13. Nghiệm thức MA 13, 5/5 sùng nhiễm không chết khi gây nhiễm với dòng nấm MA 13; RBC – Q9 – 3. Nghiệm thức RBC – Q9 – 3, 5/5 sùng không chết khi gây nhiễm dòng nấm RBC – Q9 – 3 theo phương pháp 3. 48 Hình 4.8 Kết quả phân lập nấm M.anisopliae từ sùng nhiễm a. Nấm M. anisopliae sau 5 ngày cấy trên môi trường PGA, được phân lập từ sùng nhiễm MA 11; b. Nấm M.anisopliae sau 6 ngày cấy trên môi trường PGA, được phân lập từ sùng nhiễm BXĐTV 3; c. Nấm M.anisopliae sau 6 ngày cấy trên môi trường PGA, được phân lập từ sùng nhiễm SCLLLA 4. 4.3.3 Ảnh hƣởng của phƣơng pháp gây nhiễm nấm So sánh nghiệm thức BXĐTV 3 khi tiến hành gây nhiễm theo phương pháp 1và 2 với chính dòng nấm này theo phương pháp 3 và kiểm tra với 2 nghiệm thức đối chứng (sùng để nguyên và sùng tạo vết thương): Từ dòng MA 11 Từ dòng BXĐTV 3 Từ dòng SCLLLA 4 a b c 49 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của phương pháp gây nhiễm 1,2 và 3 trên dòng nấm M.anisopliae BXĐTV 3 Nghiệm thức Tỷ lệ gây chết (%) BXĐTV 3 (không gây vết thương) 0 Đối chứng (để nguyên) 0 BXĐTV 3 (gây vết thương) 20 Đối chứng (gây vết thương) 0 Kết quả cho ta thấy phương pháp 3 có hiệu quả hơn khi gây nhiễm nấm M.anisopliae dòng BXĐTV 3 trên sùng trắng. Phương pháp 1 không khác biệt so với phương pháp 2, các dòng BDTN 15, BXĐLA 8, BDLA 8 cho kết tương tự khi tiến hành gây nhiễm theo phương pháp 1 và phương pháp 2. 4.3.4 Hiệu quả của các dòng với các phƣơng pháp xử lý Qua thí nghiệm, ba dòng BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11 có hiệu quả với phương pháp gây nhiễm 3 (phương pháp tạo vết thương nhẹ trước khi gây nhiễm). Hiệu quả của các dòng nấm thể hiện ở tỷ lệ sùng chết khi gây nhiễm từng dòng trên sùng trắng, lần lượt là 20%, 20% và 80%. Còn tất cả các dòng còn lại không hiệu quả với cả 3 phương pháp gây nhiễm (tỷ lệ sùng chết là 0%). Kết quả này cũng đặt ra trước chúng tôi những câu hỏi: các dòng nấm này phải chăng không thể hiện độc tính của chúng khi gây nhiễm theo 3 phương pháp trên? Hay chúng không thể thể hiện độc tính trước giai đoạn sùng trắng trong vòng đời của các con bọ cánh cứng? Hay chúng hoàn toàn không có độc tính với tất cả các giai đoạn sống của bọ cánh cứng? 50 Bảng 4.6 Hiệu quả của các dòng nấm với 3 phương pháp gây nhiễm Hiệu quả gây nhiễm (%) Dòng nấm Phương pháp 1 Phương pháp 2 Phương pháp 3 BDTN 15 0 0 BDLA 8 0 0 BXĐTV 3 0 20 BXĐLA 8 0 0 MA 2 0 CP MA 0 SCLLLA 8 20 RBC – Q9 – 3 0 MA 11 80 MA 13 0 . dòng nấm SCLLLA 4; 3,4 ,5, 6. 4 /5 sùng chết khi gây nhiễm với nấm MA 11 N. Vùng nấm ký sinh trên sùng trắng. Vùng có màu xanh là bào tử nấm đã hình thành. Vùng có màu trắng là vùng sợi nấm đang. này các dòng BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8 cũng không thể hiện độc tính của nấm trên sùng trắng. 45 Hình 4 .5 Kết quả nghiệm thức đối chứng gây vết thương Sùng được gây vết. 3. BDTN 15. Nghiệm thức BDTN 15, 5/ 5 Sùng không chết khi gây nhiễm với dòng nấm BDTN 15 theo phương pháp 3; BDLA 8. Nghiệm thức BDLA 8, 5/ 5 sùng không chết khi gây nhiễm với dòng nấm BDLA 8