- Acetobacter ascendens: trực khuẩn không di động, các khuẩn lạc trên glucose, gelatin khô trắng, với vầng sáng chói. Trên các môi trường lỏng tạo màng dày, chắc, hướng lên theo thành bình, thích hợp phát triển ở 25 o C. - Acetobacter plicatum: trực khuẩn kích thước 0,4 - 0,6 x 1,4 -1,6 m. Trên một vài môi trường chúng được nhuộm màu như nhau. Ở 28 - 32 o C tạo thành những dạng phình to kéo dài, không di động. Khuẩn lạc trên gelatin, rượu vang: tròn tròa hơi nhô lên, sáng, ẩm, ướt, nhớt. Thích hợp phát triển ở 25 - 30 o C. - Acetobacter oxydans: trực khuẩn, kích thước 0,8 - 1,2 x 2,4 - 2,7 m. Các tế bào rời nhau và xếp thành từng chuỗi, quan sát thấy trong chuỗi tạo thành các tế bào phồng to lên, di động. Khuẩn lạc trên gelatin tròn, sau đó trở thành những dạng không cân đối với sự phân nhánh đặc trưng, nhiệt độ thích hợp 18 - 21 o C. - Acetobacter orleanense: Trực khuẩn dài trung bình, không di động, gặp nhiệt độ cao có thể tạo các tế bào dò hình kéo dài hoặc phình to ra, tạo váng vi khuẩn rất dày trên môi trường lỏng, có thể phát triển được trên môi trường có nồng độ rượu cao 10 - 20% và tích lũy được 9,5% acid acetic. Loại này thường được dùng để chuyển hóa rượu vang thành giấm theo phương pháp Pháp, thích hợp phát triển ở 25 - 30 o C. Đối với mỗi phương pháp khác nhau cần phải chọn những loại vi khuẩn có đặc tính thích hợp để quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhất, nhưng nhìn chung chúng phải thỏa mãn một số điều kiện sau: - Phải oxy hóa rượu tốt nhất và oxy hóa giấm tạo thành ít nhất - Phải tạo ra giấm có chất lượng tốt (thơm, có độ acid acetic cao) - Chòu được độ rượu và độ acid cao - Các tính chất ban đầu của chúng phải được giữ nguyên trong suốt quá trình - Điều kiện nuôi cấy, phân lập và bảo quản giấm đơn giản, không tốn kém 21 Với phương pháp nhanh, do cần bám dính cao nên yêu cầu vi khuẩn tạo màng mỏng tơi xốp, tích lũy và chòu được độ acid cao thì những giống hay dùng nhất là acetobacter aceti, acetobacter schiitzenbachii,…. Một số loài vi khuẩn có khả năng gây ra sự “quá oxy hóa” ngay cả khi môi trường lên men còn nồng độ rượu khá cao như acetobacter xylinum, cần hết sức loại trừ chúng trong quá trình sản xuất giấm. 2.3.6 Nguồn nguyên liệu sản xuất acid acetic Theo quá trình lên men cho thấy bất cứ một sản phẩm nào có thể lên men rượu được điều có thể là nguyên liệu lên men giấm. Nguyên liệu trong sản xuất giấm thường là các loại quả có đường, các loại xiro chứa đường, sản phẩm thủy phân của các nguyên liệu chứa tinh bột, bia, rượu vang, mật ong hoặc bất cứ sản phẩm nào có thể lên men được. Trong công nghiệp sản xuất giấm, thường dùng rượu pha loãng để lên men, yêu cầu không có lẫn dầu fuzel vì nó tác dụng ức chế hoạt động sống của vi sinh vật. Nếu dùng các sản phẩm tinh bột thì phải qua hai khâu trung gian là chuyển hóa tinh bột thành đường nhờ enzyme amylase của nấm mốc, rồi tiếp tục lên men rượu nhờ enzym deareloxylase của vi sinh vật, sau đó mới lên men giấm từ rượu. Hiện nay, thường dùng nước ép trái cây (nho) để lên men giấm, sản phẩm có mùi thơm ngon và đặc trưng. Nhìn chung, nguồn nguyên liệu để sản xuất giấm là rất đa dạng và phong phú. 2.4 Sản xuất acid acetic theo phương pháp nhanh 2.4.1 Các phương pháp sản xuất acid acetic theo phương pháp nhanh 2.4.1.1 Phương pháp trống quay Gồm có một thùng bên trong có cấu trúc sao cho nhận được một lượng không khí lớn nhất đối với vật liệu đệm chứa trong đó. Trống được bao bọc trong 22 một thùng hình trụ lớn và kín, có chứa những lỗ hút không khí. Một nửa trống được tiếp xúc không khí, phần còn lại ngập trong khối dòch lên men (hình 2.1). Vật Liệu Đệm Trục Quay Dòch lên Men Hình 2.1: Thiết bò lên men nhanh bằng phương pháp trống quay 2.4.1.2 Phương pháp nhúng Thiết bò lên men là thùng thẳng đứng, bên trong có một hay nhiều giỏ bằng gỗ sồi hoặc chứa phôi gỗ sồi có thể nâng lên hạ xuống được (hình 2.2). Vật Liệu Đệm Thùng Lên Men Dòch lên Men Hình 2.2: Thiết bò lên men bằng phương pháp nhúng Ưu điểm : đơn giản, dễ làm, gọn Nhược điểm : năng suất thấp, dễ bò nhiễm khuẩn do không khí chưa được khử trùng. 2.4.1.3 Phương pháp dòch chuyển Thiết bò lên men của phương pháp này gồm một thùng, bên trong có một cái phao và bên ngoài lắp với hai thùng phản ứng đặt bên cạnh thùng chính. 23 Khi phao chứa đầy nước và các vật nặng khác, khối dòch lên men chứa trong thùng chính bò ép phải dòch chuyển sang hai thùng phản ứng bên cạnh có chứa đầy vỏ bào có vi khuẩn giấm bám trên bề mặt. Khi những đệm trong thùng phản ứng đã bảo hòa dòch lên men phao được lấy ra và dòch lên men lại tràn về thùng chính. Phương pháp này đơn giản nhưng cồng kềnh, năng suất thấp, khó điều chỉnh quá trình nén đẩy chất lỏng từ thùng chính sang thùng phản ứng, không khí dễ bò nhiễm bẩn. 2.4.1.4 Phương pháp cố đònh (phương pháp germentor) Trong phương pháp này, thùng phản ứng là một thùng hình trụ thẳng đứng bằng gỗ (hoặc bằng vật liệu chống ăn mòn). Đồng thời có đổ đầy những vật liệu bám có màng vi khuẩn giấm che phủ (hình 2.3) Thân Tháp Đệm Thông Khí Hình 2.3: Thiết bò lên men nhanh bằng phương pháp cố đònh Hai pha khí và lỏng đi ngược chiều nhau tiếp xúc trong generator sẽ được vi khuẩn chuyển hóa thành giấm. Nếu chiều cao generator đủ lớn thì dòch lên men chỉ cần đi qua một lần là được giấm hóa toàn bộ. Nếu quá trình lên men tốt, nhiệt độ ở phần làm việc của generator sẽ cao hơn nhiệt độ bên ngoài từ 10-12 o C tạo điều kiện cho sự thông khí tự nhiên. Nhìn chung 3 phương pháp đầu không được sử dụng rộng rãi trong sản xuất, phương pháp cuối phổ biến nhất và được cải tiến không ngừng do nó có những ưu điểm: năng suất tương đối lớn, thiết bò tương đối gọn nhẹ, có thể tiến hành sản xuất 24 trong mọi điều kiện vì có sự thông khí tự nhiên nên không phụ thuộc vào nguồn điện. 2.4.2 Chất mang vi khuẩn acid acetic 2.4.2.1 Yêu cầu đối với chất mang vi khuẩn acid acetic Đây là yếu tố quyết đònh tính hơn hẳn của phương pháp nhanh so với phương pháp chậm. Vấn đề này đã được nghiên cứu và sử dụng với nhiều loại vật liệu bám khác nhau, khi chọn vật liệu bám cần căn cứ vào các yêu cầu sau: - Có độ bền cơ học cao, diện tích bề mặt riêng lớn, độ xốp cao - Khối lượng riêng tương đối nhỏ - Có tính trơ, tức không phản ứng với dòch lên men, không khí và sản phẩm lên men, cũng như không tiết ra những hợp chất hóa học gây độc hại đối với vi sinh vật và mùi khó chòu cho giấm - Đủ độ nhám và độ xốp để màng vi khuẩn có thể bám chặt ở một chế độ thủy động lực học nhất đònh - Rẻ tiền, dễ kiếm và ổn đònh 2.4.2.2 Lựa chọn chất mang Trong các loại chất mang có nguồn gốc cellulose có những ưu điểm phù hợp với điều kiện Việc Nam hiện nay như công nghệ gia công không phức tạp, rẻ tiền, dễ kiếm (tre, bã mía, gỗ,…). Trước đây, nhiều công trình đã nghiên cứu thử nghiệm với nhiều loại vật liệu bám chứa cellulose khác nhau như phoi gỗ (sồi, dẻ, bạch dương,…), lõi ngô, tre nứa,…. Trong đó, gỗ sồi được đánh giá rất cao vì nó có độ cứng tốt và trong các thớ gỗ có nhiều mao quản xốp. Riêng đối với Việt Nam không có gỗ sồi. Vì vậy việc tìm kiếm thăm dò các loại vật liệu bám khác có sẵn, dễ kiếm, rẻ tiền để thay thế cho gỗ sồi, đồng thời vẫn 25 đảm bảo được những yêu cầu của vật liệu bám là một trong những vấn đề mấu chốt trong việc thăm dò phương pháp nhanh để sản xuất giấm ở Việt Nam. Vấn đề xử lý vật liệu bám cũng khá quan trọng nhằm tách những chất độc hại như: tanin, lignin, các loại tinh dầu,…thường hay có trong các loại vật liệu có nguồn gốc thực vật. Vì vậy, cần xử lý cẩn thận vật liệu bám trước khi sử dụng, một trong những phương pháp hay làm trong công nghiệp là trích ly sơ bộ bằng nước nóng. Sau đó ngâm chúng trong dung dòch acid hay kiềm để ly trích triệt để hơn các chất đã nêu trên. Trên tinh thần đó, chất mang được chọn nghiên cứu trong luận văn là thân cây tre vì ở Việt Nam tre là một loại cây dễ kiếm, rẻ tiền và rất dễ gia công. 2.4.3 Sự hình thành và phát triển của màng sinh học trên chất mang trong fermenter sử dụng màng sinh học cố đònh để lên men acid acetic 2.4.3.1 Trạng thái vi khuẩn acid acetic trong fermenter Trong fermenter sử dụng màng sinh học cố đònh để lên men giấm, các vi khuẩn giấm tham gia vào quá trình biến đổi sinh hóa có dạng màng bám trên bề mặt các vật rắn trơ. Trong các thiết bò dạng ống, màng sinh học bám trên bề mặt các vật rắn trơ có thể tồn tại 2 trạng thái: cố đònh (tónh) hay linh động (các vật rắn trơ có màng sinh học che phủ lơ lửng trên môi trường lên men). Trong một mức độ nào đó, việc lựa chọn một trong hai trạng thái của màng sinh học là tùy thuộc màng vi khuẩn đã phát triển được tách ra khỏi thiết bò như thế nào (trong trường hợp muốn khống chế bề dày màng). Nếu thiết bò đòi hỏi phải làm việc trong điều kiện vô khuẩn, để đảm bảo điều này chỉ có thể lấy màng vi khuẩn ra khỏi thiết bò bằng các phương pháp lực cắt thủy lực, tức là nhờ chuyển động của lỏng và khí để tách màng vi sinh vật ra khỏi bề mặt bám và lôi cuốn chúng ra ngoài cùng dòng chảy, muốn vậy các phần tử 26 đệm phải được làm lơ lửng trong môi trường chuyển động mạnh. Còn các vi khuẩn giấm thì có khả năng lắng xuống đáy thiết bò và tách ra ngoài, lúc này lớp đệm nằm ở trạng thái tónh và lỏng chảy qua thiết bò ở dạng màng mỏng che phủ vùng hoạt động sinh học. 2.4.3.2 Cấu tạo màng vi khuẩn acid acetic Màng vi khuẩn giấm được tạo thành nhờ các biến đổi sinh hóa diễn ra trong các thiết bò và bám được vào vật rắn là nhờ khả năng bám dính của màng nhầy (khối gel giữa các tế bào, hình 2.4) của vi khuẩn. Một bề mặt bám bất kỳ tiếp xúc với môi trường chứa các vi khuẩn giấm lơ lửng sau một thời gian nhất đònh sẽ trở nên hoạt động sinh học do vi khuẩn giấm bám vào và phát triển thành lớp màng liên tục. Cơ chế quá trình bám dính này có liên quan đến bề mặt vật rắn (độ nhám, độ xốp,…) và chính bản thân vi khuẩn. Hình 2.4: Biểu diễn màng sinh học bám trên các vật rắn trơ 2.4.3.3 Sự phát triển của màng vi khuẩn acid acetic Sự tạo thành màng vi khuẩn sẽ kèm theo sự hoạt động của thiết bò. Độ “hoạt động bề mặt” phụ thuộc vào diện tích bề mặt che phủ bởi lớp màng, bề dày màng và nồng độ rượu trong môi trường dinh dưỡng. 2 3 1 Ghi chú: 1. Bề mặt bám 2. Khối gel giữa các tế bào 3. Tế bào của vi sinh vật 27 Sự phát triển của màng vi khuẩn giấm, khi giữ nguyên các thông số đầu vào, tạo nên sự phụ thuộc của sản phẩm chính vào thời gian, điều đó là do sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào bề dày màng. Nếu sau một quá trình tích lũy nhất đònh bề dày màng không thay đổi nữa thì ta có thể coi các thông số đầu ra đạt được trạng thái ổn đònh. Điều đó có thể đạt được khi tải trọng vi khuẩn giấm đối với không gian tự do trên một đơn vò thể tích lớp đệm là nhỏ. Khi đó dạng hình học trong lớp đệm thay đổi không đáng kể. Nhưng nếu tải trọng của vi khuẩn đủ lớn thì sẽ làm dạng hình học bên trong lớp biến đổi liên tục do tác động của quá trình phát triển vi sinh vật và sự thoát đi một phần vi khuẩn ra khỏi bề mặt bám dưới tác dụng của lực trọng trường, kết quả là đường đi của dòng lỏng và bề mặt tiếp xúc pha rắn – lỏng biến đổi. 2.4.3.4 Bề dày màng vi khuẩn acid acetic Trong thực tế, tùy theo cách nuôi màng, nồng độ các sản phẩm dạng khí khi hô hấp trong chiều sâu nhỏ của màng tăng đến mức các sản phẩm này sẽ thoát ra từ dung dòch và tạo thành những túi khí. Khí này làm cho sự bám dính giữa khối màng và bề mặt bám sẽ kém đi, cuối cùng màng rơi ra khỏi bề mặt bám dưới tác dụng của trọng lực và còn lại một lớp vi khuẩn giấm đã giảm khả năng sống. Sau đó, lớp màng lại bắt đầu tăng, tuy nhiên không thể nào tạo bề dày màng như ban đầu vì lực bám dính giữa màng và bề mặt bám đã bò yếu đi do có mặt các vi khuẩn chết trong màng. Từ đó, người ta nhận thấy rằng ở một mức độ nhất đònh màng vi khuẩn giấm có khả năng điều chỉnh được. Tuy nhiên, không nên mong đợi nhiều vào cơ chế này để đảm bảo độ dày không đổi của màng vì những nguyên nhân sau: - Các sản phẩm tạo thành trong bề dày màng có thể gây độc hại cho vi khuẩn, ức chế sự phát triển của chúng cũng như gây nhiễm bẩn cho môi trường lỏng. 28 - Màng vi khuẩn giấm bò tách ra khỏi bề mặt bám có thể gây tắc lưu thông cho dòng lỏng và gây rối loạn chế độ làm việc trong thiết bò. - Dao động về bề dày ở các phần riêng biệt của màng có thể lớn đáng kể. - Các màng khác nhau của màng vi khuẩn tách ra khỏi bề mặt bám ở những thời điểm khác nhau. Các thiết bò có bề dày màng không đổi (có thể khống chế được) được sử dụng làm thiết bò thực nghiệm để nghiên cứu động học vi sinh. Các thiết bò có bề dày màng thay đổi được dùng trong xử lý nước thải và sản xuất giấm theo phương pháp nhanh. Trong các thiết bò dạng không khống chế được bề dày màng, quần thể vi sinh vật lộn xộn ở mức độ cao và ở những thời điểm khác nhau là khác nhau, chất lỏng chảy qua thiết bò ở dạng màng dưới tác dụng của lực trọng trường. 2.5. Khái quát về nguồn nguyên liệu điều 2.5.1 Cây điều – đặc điểm thực vật học của cây điều 2.5.1.1 Nguồn gốc và tên gọi Cây điều là cây hoang dại, mọc tự nhiên ở các bãi cát ven biển và trong rừng tự nhiên ở quần đảo Anti, Brasil và lưu vực sông Amazon thuộc Nam Mỹ. Cây điều có tên khoa học là Anacardium occidentale Linne thuộc họ Anacardiacedae bộ Rutates. Ngoài ra, ở mỗi nước cây điều còn có tên gọi riêng ví dụ như: - Anh gọi là: Cashew - Pháp gọi là: Anacardier/ Pommier de cajou/ Acajou… - Trung Quốc gọi là: Giànhù/ Yiaokuo - Brasil gọi là: cajoucu 29 - Bồ Đào Nha gọi là: Caju/ cajueiro - Tây Ban Nha gọi là: Maranon - Ấn Độ gọi là: Kaju - Thái Lan gọi là: Yakoi -Việt Nam gọi là: Cây điều/ đào lộn hột 2.5.1.2 Đặc điểm thực vật học Cây điều là loại cây vùng nhiệt đới, thường xanh, sống lâu năm và có nguồn gốc từ cây hoang dại nên có nhiều tác giả gọi đây là cây bán hoang dã. Cây điều là cây nhỡ, chiều cao trung bình khoảng 6 - 10 m và có các đặc điểm sau: - Lá: phiến lá dài, gân lá nổi rõ ở mặt dưới lá, gân lá màu xanh đậm dài 10 - 20 cm, rộng 5 -10 cm, cuống lá mọc thành từng chùm. - Hoa: hoa điều trổ bông từ tháng 1 đến tháng 4, có khi cả năm. Hoa mẫu 5, đài hợp, tràng 5, nhò 8 - 10, bầu không có cuống chứa một noãn không điều mọc thành chùm hình chuông, gồm nhiều hoa nhỏ màu vàng hoặc trắng có gân hồng hay đỏ là tùy giống. Trong chùm hoa có khoảng 14% là hoa lưỡng tính còn lại là hoa đực. Thường hoa ra từ đông sang tây theo chiều kim đồng hồ, hoa nở dần kéo dài trung bình 32 ngày. Hoa thụ phấn được là nhờ côn trùng và gió (chủ yếu là nhờ vào côn trùng). - Trái và hạt: Sau khi thụ phấn, hạt phát triển rất nhanh. Khi hạt (quả thực) phát triển đến độ lớn nhất đònh thì cuống mới phát triển phình lên thành trái (trái giả). Hạt điều thô có hình quả thận, thông thường có chiều dài 2,5 - 3,5 cm, chiều rộng 1,8 - 2 cm, bề dày 1 - 1,5 cm, nặng 5 - 6 gram. Hạt khi tươi có màu xanh vỏ chai và khi khô có màu nâu xám. Quả điều có màu vàng nhạt, da cam đến hồng đỏ, quả điều có trọng lượng gấp 3 - 10 lần trọng lượng hạt, trung bình gấp 5 lần (khoảng 50 30 . trong khối dòch lên men (hình 2.1). Vật Liệu Đệm Trục Quay Dòch lên Men Hình 2. 1: Thiết bò lên men nhanh bằng phương pháp trống quay 2 .4. 1.2 Phương pháp nhúng Thiết bò lên men là thùng thẳng. nhiều giỏ bằng gỗ sồi hoặc chứa phôi gỗ sồi có thể nâng lên hạ xuống được (hình 2.2). Vật Liệu Đệm Thùng Lên Men Dòch lên Men Hình 2. 2: Thiết bò lên men bằng phương pháp nhúng Ưu điểm : đơn. 2 .4. 3 Sự hình thành và phát triển của màng sinh học trên chất mang trong fermenter sử dụng màng sinh học cố đònh để lên men acid acetic 2 .4. 3.1 Trạng thái vi khuẩn acid acetic trong fermenter