Luận văn : NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ part 1 ppt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: Vƣơng Hồ Vũ Thành phố Hồ Chí Minh tháng 9 / 2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ Thành phố Hồ Chí Minh tháng 9 / 2005 Sinh viên thực hiện: Vƣơng Hồ Vũ Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS Bùi Cách Tuyến iii LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ. Cha mẹ, các em và dòng họ luôn là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con. Em vô cùng biết ơn Thầy Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian làm đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập vừa qua. Ban giám đốc Trung Tâm Phân Tích - Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh cùng toàn thể các anh chị tại Trung Tâm đã tạo điều kiện thuận lợi tối đa cũng nhƣ tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Sơn cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Chi cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Lâm Đồng đã giúp đỡ em hoàn thành tốt đề tài này. TS. Bùi Minh Trí, ThS. Trần Nhật Phƣơng cùng Quý Thầy - Cô trong và ngoài trƣờng đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và trang bị cho em những kiến thức bổ ích. Em xin chân thành cảm ơn anh Toàn, chị Huệ, chị Phƣơng, chị Hƣng, chị Hà đã hết lòng giúp đỡ em để em có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Cảm ơn các bạn trong lớp Công Nghệ Sinh Học K27 đã luôn đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2005 Vƣơng Hồ Vũ iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN VƢƠNG HỒ VŨ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9 / 2005. “Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT- PCR và giải trình tự” đƣợc thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2005 tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Hội đồng hƣớng dẫn: PGS. TS Bùi Cách Tuyến Đề tài thực hiện các nội dung sau: 1. Xác định tỷ lệ nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV tại 5 phƣờng (5, 8, 9, 11 và 12) trên thành phố Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA. 2. Khuếch đại đoạn gene có kích thƣớc 336 bp mã hóa protein vỏ của virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. 3. Giải trình tự đoạn gene 336 bp của virus PLRV và so sánh với ngân hàng gene (NCBI) để đánh giá mức độ tƣơng đồng của đoạn gen này. Kết quả đạt đƣợc 1. Xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV tại các phƣờng nhƣ sau: - Phƣờng 5: PVX: 56,25%, PVY: 90,91%, PLRV: 96,97% - Phƣờng 8: PVX: 17,39%, PVY: 100%, PLRV: 100% - Phƣờng 9: PVX: 21,21%, PVY: 96,97%, PLRV: 96,97% - Phƣờng 11: PVX: 41,18%, PVY: 100%, PLRV: 100% - Phƣờng 12: PVX: 72,73%, PVY:100 %, PLRV: 100% 2. Phát hiện đƣợc virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. 3. Đã giải đƣợc trình tự đoạn gen 336 bp và cho kết quả tƣơng đồng 100% sau khi so sánh với trình tự gen của virus PLRV trên ngân hàng gen. v MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách các chữ viết tắt vii Danh sách các bảng viii Danh sách các hình và biểu đồ ix 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích 2 1.3 Yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Sơ lƣợc về khoai tây và bệnh trên khoai tây 3 2.2 Giới thiệu về virus PVX, PVY và PLRV gây bệnh trên khoai tây 4 2.2.1 Sơ lƣợc về virus PVX (Potato virus X) 4 2.2.2 Sơ lƣợc về virus PVY (Potato virus Y) 5 2.2.3 Sơ lƣợc về virus PLRV (Potato leafroll virus) 6 2.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây 8 2.3.1 Phƣơng pháp chẩn đoán bên ngoài 8 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học 8 2.3.3 Phƣơng pháp quang phổ 8 2.3.4 Phƣơng pháp so sánh độ đục của dịch cây 8 2.3.5 Phƣơng pháp chiết quang kép 9 2.3.6 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử 9 2.3.7 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) 9 2.3.7.1 Phƣơng pháp ELISA trực tiếp kiểu Sandwich 10 2.3.7.2 Phƣơng pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) 10 vi 2.3.8 Phƣơng pháp RT-PCR 10 2.3.9 Phƣơng pháp giải trình tự gen 11 2.4 Nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về PVX, PVY và PLRV trên khoai tây 12 2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc về virus PVX, PVY và PLRV 12 2.4.2 Nghiên cứu nƣớc ngoài về virus PVX, PVY, PLRV 13 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14 3.2 Vật liệu nghiên cứu 14 3.2.1 Vật liệu dùng trong kỹ thuật ELISA phát hiện PVX, PVY và PLRV 14 3.2.2 Vật liệu dùng trong kỹ thuật RT-PCR để phát hiện PLRV 15 3.2.2.1 Vật liệu dùng trong ly trích RNA 15 3.2.2.2 Vật liệu dùng trong phản ứng RT-PCR 15 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Nội dung nghiên cứu 16 3.3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu 16 3.3.3 Phƣơng pháp phát hiện PVX, PVY và PLRV 17 3.3.3.1 Phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kĩ thuật ELISA 17 3.3.3.2 Phát hiện virus PLRV bằng phƣơng pháp RT-PCR 20 3.3.3.3 Giải trình tự trực tiếp đoạn gen của virus PLRV 25 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Tình hình canh tác khoai tây tại Thành phố Đà Lạt 27 4.2 Kết quả phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kỹ thuật ELISA 27 4.2.1 Kết quả kiểm tra ELISA tại các phƣờng 27 4.2.2 Kết quả ELISA theo từng giống 29 4.2.3 Kết quả ELISA theo từng thế hệ 30 4.2.4 Kết quả ELISA theo tháng tuổi 30 4.3 Kết quả RT-PCR 31 4.4 Kết quả giải trình tự 34 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC 40 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT - cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid - ctv: Cộng tác viên -ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate - DEPC: Diethyl pyrocarbonate -dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate - M-MLV: Moloney murine leukemia virus - PBS-T: Phosphate – buffered saline with tween 20 - PLRV: Potato leafroll virus - p-NPP: p - nitrophenol phosphate - PVP: Polyvinylpyrrolidone - RNA: Ribonucleic acid - RT-PCR: Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction - PVX: Potato virus X - PVY: Potato virus Y - VPg: Protein linked genome viii DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Số mẫu thu thập từ 5 phƣờng thuộc TP.Đà Lạt 17 Bảng 3.2 Tỷ lệ pha loãng kháng thể 18 Bảng 3.3 Tỷ lệ pha loãng kháng thể gắn enzyme 19 Bảng 3.4 Tỷ lệ pha loãng cơ chất tạo màu 20 Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA 23 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA 24 Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm PVX ,PVY, PLRV tại các phƣờng 28 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm kép các virus PVX ,PVY, PLRV 29 Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo giống 29 Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng thế hệ 30 Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng tháng tuổi 30 Bảng 4.6 Kết qủa thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA 31 Bảng 4.7 Kết qủa thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA 32 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Hình 2.1 Hình thái của virus PVX 5 Hình 2.2 Khoai tây bị nhiễm virus PVX 5 Hình 2.3 Hình thái virus PVY 6 Hình 2.4 Khoai tây bị nhiễm virus PVY 6 Hình 2.5 Hình thái virus PLRV 7 Hình 2.6 Khoai tây bị bệnh cuốn lá 7 Hình 2.7 Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR 11 Hình 4.1 Kết quả điện di 33 Hình 4.2 Kết quả giải trình tự dạng peak bằng Sense primer 34 Hình 4.3 Kết quả giải trình tự dạng peak bằng Antisense primer 34 Hình 4.4 So sánh kết quả giải trình tự từ 2 primer 35 Hình 4.5 Trình tự sợi Sense của đoạn cDNA mã hóa cho protein vỏ của PLRV 36 Hình 4.6 Kết quả so sánh trình tự sản phẩm RT-PCR của PLRV trên ngân hàng gen 36 Biểu đồ 4.1 So sánh tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng phƣờng 28 Biểu đồ 4.2 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa hai giống 06 và 07 29 Biểu đồ 4.3 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các thế hệ 29 Biểu đồ 4.4 So sánh tỷ lệ nhiễm giữa các lứa tuổi 31 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong những nguồn thực phẩm quan trọng nhất của con ngƣời (xếp thứ năm trong các loại thực phẩm chính trên thế giới sau lúa mì, gạo, bắp và đại mạch ). Tuy nhiên trở ngại lớn nhất trong việc phát triển cây khoai tây là bệnh hại trong đó bệnh do virus là vô cùng nghiêm trọng. Khoai tây có thể bị nhiễm hơn 30 loại virus khác nhau, phổ biến nhất và nguy hại nhất là các loại virus PVX (Potato virus X), PVY (Potato virus Y) và PLRV (Potato leafroll virus) với các triệu chứng khảm, cuốn, đốm, nhăn nheo và hoại tử trên lá. Sản lƣợng khoai tây bị thiệt hại nghiêm trọng khi bị tạp nhiễm cùng lúc nhiều loại virus. Năng suất khoai tây có thể giảm tới 80% khi bị nhiễm tổ hợp PVX, PVS và PLRV (Salazar 1982). Ở nƣớc ta, khoai tây đƣợc trồng chủ yếu vào vụ đông ở đồng bằng Sông Hồng, các tỉnh phía Bắc (sản xuất 85% khoai tây của Việt Nam) và trồng quanh năm ở Đà Lạt (chiếm 15% sản lƣợng) với các loại giống chủ yếu nhƣ 06 và 07. Mặc dù vậy, nhận thức của nông dân cũng nhƣ những nghiên cứu về bệnh virus và thiệt hại do bệnh virus trên khoai tây còn rất hạn chế. Do đó việc chẩn đoán nhanh, chính xác nhằm đƣa ra những biện pháp phòng trừ thích hợp để hạn chế tối đa những thiệt hại do bệnh gây ra là hết sức cần thiết. Do đặc điểm phức tạp của bệnh virus nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn, đòi hỏi nhiều dụng cụ và trang thiết bị hiện đại mới thực hiện đƣợc. Ngày nay cùng với sự phát triển nhanh chóng và hỗ trợ đắc lực của công nghệ sinh học đặc biệt là sinh học phân tử với các kỹ thuật chẩn đoán nhƣ ELISA, RT-PCR, Sequencing, đã tạo điều kiện thuận lợi cho công tác nghiên cứu, chẩn đoán cũng nhƣ phòng trừ bệnh virus trên khoai tây. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT-PCR và giải trình tự” . Phƣờng 1 1: PVX: 41, 18%, PVY: 10 0%, PLRV: 10 0% - Phƣờng 1 2: PVX: 72,73%, PVY :1 0 0 %, PLRV: 10 0% 2. Phát hiện đƣợc virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. 3. Đã giải đƣợc trình tự đoạn gen 336 bp và cho. thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT-PCR và giải trình tự . KHÓA LUẬN VƢƠNG HỒ VŨ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9 / 2005. Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT- PCR và giải trình tự