31 Thời gian lên men: 8 ngày ở nhiệt độ phòng Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g) 3.4.6 Khảo sát ảnh hƣởng của các loại acid đến quá trình lên men tạo BC Mục đích thí nghiệm: đa dạng hóa các loại acid bổ sung để lên men tạo BC. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại Nghiệm thức NT 1 NT 2 NT 3 Trọng lƣợng BC thô (g) NT1: bổ sung HCl đến pH = 4,5 NT2: bổ sung H 2 SO 4 đến pH = 4,5 ĐC : bổ sung acid acetic đến pH = 4,5 Các thành phần khác cố định theo môi trường II. Tỷ lệ giống cấy vào môi trường là 10%, lên men 8 ngày ở nhiệt độ phòng. Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g) 3.4.7 Các phƣơng pháp đánh giá 3.4.7.1 Xử lí thống kê Từ trọng lượng BC thô thu hoạch được sau các thí nghiệm, tiến hành xử lí thống kê bằng phần mềm Stagraphic 7.0. 3.4.7.2 So sánh giá trị kinh tế giữa các môi trƣờng lên men sản xuất BC Sau khi tìm được công thức tối ưu để lên men sản xuất thạch dừa trên các môi trường thay thế, tiến hành so sánh giá trị kinh tế của các loại nguyên liệu làm môi trường lên men theo những tỷ lệ pha loãng thích hợp với môi trường lên men truyền thống là nước dừa già. Đơn vị tính là trên 100 lít môi trường. 32 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thuần khiết giống và nhân giống đã thuần khiết Từ giống chai A. xylinum ở phòng thí nghiệm, tiến hành phân lập lại trên môi trường thạch đĩa. Kết quả quan sát đại thể và vi thể như sau: 4.1.1 Quan sát đại thể Sau khi phân lập, mỗi tế bào tách riêng rẽ sẽ phát triển thành một khuẩn lạc. Các khuẩn lạc có dạng tròn lồi, nhầy và trơn bóng, rìa mép khuẩn lạc nhẵn, màu trắng trong hơi đục. Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc đạt 2-5 mm . 4.1.2 Quan sát vi thể Sau khi chọn khuẩn lạc điển hình, tiến hành nhuộm Gram, quan sát tế bào vi khuẩn ở vật kính X100 dưới giọt dầu cerde thu được kết quả như sau: Bảng 4.1: Kết quả quan sát vi thể Acetobacter xylinum Chỉ tiêu Kết quả Hình dạng Kích thước Nhuộm Gram Hình que, xếp riêng lẻ hoặc thành chuỗi dài 2– 4 m Gram âm (G - ) 33 Hình 4.1: Quan sát đại thể và vi thể vi khuẩn A. xylinum Hình 4.2: Giống A. xylinum cấp I và cấp II Như vậy từ giống chai sẵn có chúng tôi đã thuần khuyết được giống A. xylinum và tiến hành giữ giống trong môi trường lỏng (môi trường II) 4.2 So sánh hiệu quả hoạt hoá giống bằng môi trƣờng I và môi trƣờng I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright Giống giữ vai trò quyết định đến năng suất lên men. Vì vậy, hoạt hóa giống sau một thời gian dài bảo quản là công việc hết sức quan trọng. Môi trường hoạt hóa sao cho tiện dụng, rẻ, đem lại hiệu quả cao là vấn đề đặt ra. 34 Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.2 và hình 4.3 Bảng 4.2: So sánh sinh khối BC thô giữa môi trƣờng I và môi trƣờng I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright Môi trƣờng Môi trƣờng 1 Môi trƣờng I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright Trung bình trọng lượng BC thô (g) 111,4 114,2 Hình 4.3: Biểu đồ so sánh trọng lƣợng BC thô giữa 2 môi trƣờng Qua bảng kết quả 4.2 và hình 4.3 chúng tôi thấy sinh khối BC thô tạo ra bởi vi khuẩn A. xylinum sau quá trình hoạt hóa bởi 2 loại môi trường là tương đương nhau, không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê (trắc nghiệm F, độ tin cậy 95 % - phụ lục 1). Việc bổ sung thêm dung dịch Skeggs & Wright là nhằm cung cấp thêm các loại muối khoáng, các thành phần vô cơ để kích thích sự phát triển của A. xylinum. Nhưng kết quả cho thấy rằng không có sự gia tăng đáng kể về trọng lượng BC. Có nghĩa là lượng khoáng chất trong nước dừa (môi trường I) đã đủ cho sự sinh trưởng và phát triển của A. xylinum, không cần phải bổ sung thêm, giúp tiết kiệm chi phí sản xuất. 111.4 114.2 0 50 100 150 NT1 NT2 Nghiệm thức Trọng lượng BC (g) 35 4.3 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trƣờng nƣớc cốt dừa Bảng 4.3: Kết quả sinh khối BC thô thu đƣợc từ các môi trƣờng (g) Qua bảng kết quả 4.3 và qua xử lí thống kê bằng trắc nghiệm F, xác suất p << 0.05 (phụ lục 2), chúng tôi thấy rằng cả 4 yếu tố tỷ lệ pha loãng, DAP, SA và saccharose đều có tương tác với nhau. Công thức môi trường số 21, 24, 27 cho trọng lượng BC cao hơn hẳn so với các công thức môi trường khác, khác biệt này là rất có ý nghĩa về phương diện thống kê học. Tuy nhiên, khác biệt về trọng lượng BC thô giữa 3 môi trường 21, 24 và 27 không có ý nghĩa về mặt thống kê (độ tin cậy 95%). Tỷ lệ cơm dừa/nước = 1/10 cho trọng lượng BC cao nhất, khác biệt này có ý nghĩa thống kê so với các tỷ lệ pha loãng 1/20 và 1/30. MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB 1 81.7 97.1 89.4 28 72.2 70.5 71.4 55 63 62.6 62.8 2 89.5 95.1 92.3 29 78.9 79.2 79.1 56 72.2 68.2 70.2 3 90.1 91.3 90.7 30 77.3 75.3 76.3 57 65.4 64.5 65 4 91.2 90 90.6 31 88.4 85 86.7 58 82 85.6 83.8 5 93.5 95.3 94.4 32 86.5 85 85.8 59 83.1 78.5 80.8 6 91.0 91 91 33 77.5 80.4 79 60 70 68.4 69.2 7 100 97.8 98.9 34 88.2 90.1 89.2 61 63.6 62.2 62.9 8 92.6 93.2 92.9 35 81 82.3 81.7 62 70.1 69.5 69.8 9 90.8 90.1 90.5 36 83 82 82.5 63 80.2 80.5 80.4 10 88.8 85 86.9 37 74.4 75.2 74.8 64 62.3 60 61.2 11 97.1 88.9 93 38 81.2 85 83.1 65 66.6 65.2 65.9 12 98 90.5 94.3 39 88 90.1 89.1 66 80.1 83 81.6 13 101.3 90.1 95.7 40 70.7 80.7 75.7 67 85 91 88 14 98.1 88.9 93.5 41 88 80.2 84.1 68 75.4 78.5 77 15 96.3 86.9 91.6 42 91 90 90.5 69 79.9 87 83.4 16 95.2 90.7 93 43 78.5 82 80.3 70 87.5 90 89 17 96.1 92.4 94.3 44 93 90.3 91.7 71 90 92.3 91.1 18 97.4 95.6 96.5 45 92 95 93.5 72 93.1 95 94 19 97 94.6 95.8 46 88.8 90 89.4 73 73.5 79.1 76.3 20 96.7 97 96.8 47 86 90.1 88 74 75 75.4 75.2 21 126.4 117.8 122.1 48 86.6 88.2 87.4 75 75 77.7 76.4 22 95.6 96.2 95.9 49 78.9 80 79.5 76 80.9 80.6 80.8 23 92.1 90.5 91.3 50 85.6 86 85.8 77 90.2 91.9 91 24 117.8 120.4 119.1 51 97 95.1 96 78 83 86 84.5 25 95.5 95 95.3 52 108 98.8 103.4 79 88 89.2 88.6 26 109.8 100 104.9 53 101.1 100.2 100.7 80 90.7 96 93.3 27 116.4 115.6 116 54 100.2 99.8 100 81 84 85.4 84.7 36 Hàm lượng DAP = 0,6 % cho trọng lượng BC cao nhất, khác biệt này có ý nghĩa thống kê so với các tỷ lệ 0,2 và 0,4 %. Hàm lượng phosphate này là cần thiết để A. xylinum phát triển tạo cellulose. Nếu xét riêng từng yếu tố thì hàm lượng SA = 1% cho trọng lượng BC cao hơn hẳn so với hàm lượng SA = 0,6 % và 0,8 %. Nhưng do cả 4 yếu tố có tương tác với nhau nên hàm lượng SA = 0,6 % cũng tạo ra một lượng BC tương đương với khi dùng 0,8 % hay 1% SA. Như vậy, để có hiệu quả kinh tế trong sản xuất, chúng tôi đề nghị chọn SA = 0,6 % làm công thức lên men. Từ sự tương tác 4 yếu tố, chúng tôi nhận thấy rằng hàm lượng đường = 6 % cho trọng lượng BC cao nhất. Công thức tối ưu để sản xuất BC trên môi trường nước cốt dừa được trình bày trong bảng 4.4 Bảng 4.4: Công thức tối ƣu để sản xuất BC trên môi trƣờng nƣớc cốt dừa Yếu tố Tỷ lệ cơm dừa/nƣớc (g/ml) DAP (%) SA (%) Saccharose (%) Nồng độ 1/10 0,6 0,6 6 Như vậy, với công thức trên, ta có thể sản xuất BC từ môi trường nước cốt dừa thay cho môi trường nước dừa già truyền thống. Điều này sẽ hạn chế được những khó khăn, tốn kém của việc vận chuyển nước dừa khi sản xuất BC ở những vùng miền không có nguyên liệu là nước dừa già. 37 4.4 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trƣờng nƣớc dứa Bảng 4.5 : Kết quả trọng lƣợng BC thô thu đƣợc từ các môi trƣờng (g) MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB 1 89.5 75 82.3 28 103.3 100 101.7 55 86.3 85.3 85.8 2 98.8 109.3 104 29 65.4 65 65.2 56 70.1 69.1 69.6 3 78.7 86 82.3 30 70.5 62 66.3 57 96.5 95.1 95.8 4 89 92 90.5 31 75.6 72.6 74.1 58 104 95 99.5 5 77.7 92.5 85.1 32 72.1 72.1 72.1 59 74.2 74 74.1 6 94.5 99 97 33 82.5 82.5 82.5 60 77.8 77.8 77.8 7 84.5 88 86.3 34 98 100 99 61 87.5 70.3 78.9 8 80 99 89.5 35 70.5 70.2 70.35 62 78.6 87.5 83 9 91.5 103 97.3 36 75.2 65.6 70.4 63 74.5 75.2 75 10 68.2 77 72.6 37 70.1 70.1 70.1 64 69.1 65 67 11 64.5 74.5 69.5 38 69.5 66.6 68 65 75.6 74.5 75 12 79.7 81 80.3 39 67.7 74.5 71.1 66 80.5 72.6 76.5 13 86.2 116 101.1 40 90.7 79.4 85 67 78.5 73.2 76 14 90.3 99 95 41 88.9 95.1 92 68 89.1 89.9 89.5 15 80.1 92.2 86.2 42 93.2 90 91.6 69 86.2 90 88.1 16 91.7 76 84 43 102.4 72.3 87.4 70 84.4 84.5 84.5 17 85.5 80 82.8 44 74.5 60.1 67.3 71 94.6 104.6 99.6 18 84.2 71 77.6 45 82.5 72.8 77.7 72 77.6 73.7 75.7 19 95.2 92.6 93.9 46 93.1 78.8 86 73 93 76.1 84.6 20 104 103 103.5 47 86.6 79.4 83 74 91.1 91.1 91.1 21 88.4 91.2 89.8 48 81.2 81.2 81.2 75 91.2 71.2 81.2 22 118.6 115 116.8 49 108.2 77.5 93 76 112.3 108 110 23 92.1 91.5 91.8 50 97.7 84 91 77 101.5 103 102.3 24 98 104 101 51 97.1 97.1 97.1 78 116.2 106.2 111.2 25 100.3 88 94.2 52 107.4 96.8 102.1 79 104.3 104.3 104.3 26 99.2 88.2 93.7 53 99.1 97.8 98.5 80 103.7 103 103.7 27 109.8 92 100.9 54 93.7 93.7 93.7 81 100.7 95 98 Qua bảng kết quả 4.5 và qua xử lí thống kê bằng trắc nghiệm F, xác suất p < 0,05 (phụ lục 3), chúng tôi nhận thấy rằng cả 4 yếu tố tỷ lệ pha loãng, DAP, SA và saccharose có tương tác với nhau. Công thức môi trường số 22 và 78 cho trọng lượng BC cao hơn hẳn so với các công thức môi trường khác. Khác biệt này rất có ý nghĩa về phương diện thống kê học. Công thức tối ưu cho việc sản xuất thạch dừa trên môi trường nước dứa được trình bày trong bảng 4.6 38 Bảng 4.6 : Công thức tối ƣu để sản xuất thạch dừa trên môi trƣờng nƣớc dứa Công thức môi trƣờng Tỷ lệ dứa/nƣớc (g/ml) DAP (%) SA (%) Saccharose (%) 22 78 1/10 1/30 0,6 0,6 0,8 0,8 2 6 Ở công thức môi trường 22, khi ta pha loãng theo tỷ lệ dứa / nước = 1/10 thì lượng đường có trong nước dứa còn khá đủ để lên men tạo BC. Vì vậy ta chỉ cần bổ sung thêm 2 % saccharose để tạo công thức tối ưu cho lên men sản xuất BC. Đối với công thức môi trường 78, tỷ lệ dứa / nước = 1/30, nghĩa là pha loãng 30 lần, lượng saccharose có trong nước dứa sẽ giảm đi, vì thế cần phải bổ sung thêm đường. Lúc này hàm lượng saccharose phải là 6 % mới đảm bảo đủ cho quá trình lên men. Như vậy, ứng dụng vào thực tế, tùy thuộc tình hình, điều kiện và quy mô sản xuất mà ta chọn pha môi trường theo công thức 22 hay 78. 4.5 So sánh sinh khối BC thô thu hoạch từ môi trƣờng nƣớc dừa, nƣớc cốt dừa và nƣớc dứa Sinh khối BC thô thu hoạch từ các môi trường nước dừa (công thức môi trường II), nước cốt dừa (theo công thức tối ưu mục 4.3) và nước dứa (công thức tối ưu mục 4.4) được trình bày trong bảng 4.7 và hình 4.4 Bảng 4.7: Sinh khối BC thô thu hoạch từ các môi trƣờng sản xuất khác nhau Môi trƣờng Nƣớc dừa Nƣớc cốt dừa Nƣớc dứa Trung bình trọng lƣợng BC thô (g) 140 141 135 39 Hình 4.4: Biểu đồ so sánh sinh khối BC thô giữa 3 loại môi trƣờng Qua bảng kết quả 4.7 chúng tôi nhận thấy sinh khối BC tạo ra từ các loại môi trường là tương đương nhau. Và qua xử lí thống kê bằng trắc nghiệm F, độ tin cậy 95% (phụ lục 4) càng thấy rõ rằng không có sự khác biệt ý nghĩa về phương diện thống kê học giữa trọng lượng BC được tạo ra từ 3 loại môi trường. Như vậy, khả năng tạo sinh khối BC của 2 môi trường thay thế (môi trường nước cốt dừa và môi trường nước dứa) là tương đương với môi trường truyền thống (môi trường nước dừa già). Về mặt chất lượng, qua đánh giá cảm quan sơ bộ thấy kết quả như sau: Bảng 4.8: Kết quả cảm quan BC thô thu hoạch từ 3 loại môi trƣờng Các tính chất Môi trƣờng Nƣớc dừa già Nƣớc cốt dừa Nƣớc dứa Màu sắc Cấu trúc Trắng đục Chặt, mịn, không tách lớp Trắng ngà Hơi chặt, mịn, không tách lớp Trắng ngà Rất chặt, mịn, không tách lớp Qua bảng kết quả 4.8, chúng tôi thấy rằng màu sắc BC sản xuất từ nước dừa có màu trắng đẹp hơn, nhưng màu trắng ngà của BC thô có thể mất hoặc giảm đi rất nhiều 135 141 140 0 50 100 150 nước dừa nước cốt dừa nước dứa Môi trường Trọng lượng BC (g) 40 sau quá trình ngâm và rửa kĩ. Còn về cấu trúc, BC sản xuất từ nước dứa có cấu trúc chặt chẽ hơn, BC sản xuất từ môi trường nước cốt dừa thì kém chặt hơn, nhưng ở cả 2 môi trường thay thế không có sự khác biệt lắm so với BC sản xuất từ nước dừa. Nhìn chung, màu sắc và cấu trúc của BC thô không ảnh hưởng mạnh đến chất lượng cảm quan của sản phẩm sau này. Điều này được trình bày cụ thể trong phần ứng dụng của BC. Vì vậy, môi trường nước cốt dừa và nước dứa hoàn toàn có khả năng thay thế nước dừa già để sản xuất BC ở quy mô công nghiệp. Hình 4.5: Sản phẩm BC thô thu hoạch từ 3 môi trƣờng 4.6 Khảo sát ảnh hƣởng của các loại acid đến quá trình lên men tạo BC Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.9 và hình 4.6 Bảng 4.9: So sánh sinh khối BC thô tạo ra khi thay đổi acid bổ sung đến pH = 4,5 Loại acid bổ sung CH 3 COOH HCl H 2 SO 4 Trung bình trọng lƣợng BC thô (g) 139,3 135,7 136,3 . 72.3 87 .4 70 84. 4 84. 5 84. 5 17 85.5 80 82.8 44 74. 5 60.1 67.3 71 94. 6 1 04. 6 99.6 18 84. 2 71 77.6 45 82.5 72.8 77.7 72 77.6 73.7 75.7 19 95.2 92.6 93.9 46 93.1. tạo ra từ 3 loại môi trường. Như vậy, khả năng tạo sinh khối BC của 2 môi trường thay thế (môi trường nước cốt dừa và môi trường nước dứa) là tương đương với môi trường truyền thống (môi trường. các môi trường nước dừa (công thức môi trường II), nước cốt dừa (theo công thức tối ưu mục 4. 3) và nước dứa (công thức tối ưu mục 4. 4) được trình bày trong bảng 4. 7 và hình 4. 4 Bảng 4. 7: Sinh