luận văn đa dạng hóa các môi trường sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn acetobacter xylinum part 2

11 Trong môi trường lỏng, sau 24h nuôi cấy sẽ xuất hiện một lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36 – 48h, hình thành một lớp trong và ngày càng dày [Lê Thị Khánh Vân, 1985]. Hình 2.3: Vi khuẩn Acetobacter xylinum [24; 31] 2.2.2.2 Đặc điểm sinh lí – sinh hoá Acetobacter xylinum là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, cho phản ứng catalase dương tính; có khả năng oxy hoá tiếp tục ethanol thành acid acetic CH 3 COOH, CO 2 và H 2 O; chuyển hoá được glucose thành acid, glycerol thành dihydroxyaceton; tổng hợp được cellulose nhưng không có khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer và không tạo sắc tố nâu [Nguyễn Lân Dũng, 1978]. Theo Hestrin (1947), pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 4,5 và nó không phát triển ở 37 0 C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Bergey, nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là 25 – 30 0 C. Còn theo Marcormide (1996) thì A. xylinum có thể phát triển ở pH từ 3 – 8, nhiệt độ là 12 – 35 0 C và nồng độ ethanol lên đến 10% [Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]. Nguồn carbohydrate mà A. xylinum sử dụng cho khả năng tạo sinh khối cao là glucose, fructose, mannitol, sorbitol; hiệu suất sẽ thấp hơn khi sử dụng glycerol, lactose, sucrose, maltose; và hiệu suất bằng 0 nếu sử dụng sorbose, mannose, cellobiose, erythritol, ethanol và acetat [Julian a. Ba, 1990 - dẫn liệu của Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003]. 12 2.2.2.3 Chức năng sinh lí của cellulose đối với Acetobacter xylinum Theo Costeron (1999), trong môi trường tự nhiên, vi khuẩn có khả năng tổng hợp các polysaccharid ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bảo vệ bao quanh tế bào, và màng BC là một ví dụ như thế. Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và làm cho tế bào thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose. Một vài tác giả cho rằng cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum còn đóng vai trò tích trữ và có thể được sử dụng khi vi sinh vật này thiếu nguồn dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose đuợc xúc tác bởi enzyme exo – hay endo – glucanase, sự hiện diện cả hai loại enzyme này được phát hiện trong dịch nuôi cấy một vài chủng A. xylinum. Nhờ vào tính dẻo và tính thấm nước của lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc và các vi sinh vật gây bệnh. Có những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào A. xylinum được bao bọc bởi BC sống sót sau 1giờ xử lí bằng tia cực tím. Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống của chúng giảm đáng kể, chỉ còn 3% [theo Ross và ctv, 1993 - dẫn liệu của Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]. 2.3 Bacterial cellulose (BC) 2.3.1 Sơ lƣợc về lịch sử nghiên cứu sự hình thành BC Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum được nhà bác học Brown báo cáo lần đầu tiên vào năm 1886. Tuy nhiên đến nửa sau thế kỉ XX, các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu rộng rãi về BC. Năm 1943 – 1954, Hestrin và các cộng sự nghiên cứu về khả năng tổng hợp BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum, họ chứng minh rằng A. xylinum có thể sử dụng đường và O 2 để tạo nên cellulose. Năm 1957, Next và Colvin chứng minh rằng cellulose được A. xylinum tổng hợp trong môi trường có đường và ATP. Càng ngày, cấu trúc của BC càng được hiểu rõ theo tiến bộ của khoa học kĩ thuật. 13 Năm 1989, nhóm I.M. Saxena trường Đại học Texa thu nhận được enzyme cellulose synthase tinh sạch của A. xylinum. Enzyme này gồm 2 chuỗi polypeptid có trọng lượng phân tử là 83 và 93kD. Trong đó, tiểu phần 83kD liên quan đến quá trình sinh tổng hợp cellulose tinh khiết. Năm 1990, nhóm đã xác định được gen tổng hợp cellulose ở A. xylinum (dòng hoá và giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose). Ngày nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm về cấu trúc, cơ chế tổng hợp và ứng dụng của BC [Trương Thị Anh Đào, 2004]. 2.3.2 Cấu trúc của BC BC có cấu trúc hóa học tương tự như cấu trúc của cellulose thực vật (plant cellulose - PC), là chuỗi polymer của các nhóm glucose liên kết với nhau qua cầu nối - 1,4 – glucan. Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van der Waals. Qua nối hydro, các lớp đơn phân tử sẽ kết hợp với nhau tạo nên cấu trúc tiền sợi với chiều rộng 1,5 nm. Các tiền sợi này sẽ kết hợp với nhau tạo thành dải có kích thước từ 3 – 4 nm và chiều rộng 70 – 80 nm. Theo Zaaz (1977) thì kích thước của dải là 3,2 x 133 nm; còn theo Brown và cộng sự (1976) thì là 4,1 x 177 nm. So với PC thì BC có độ polymer hóa cao hơn và kích thước nhỏ hơn, BC có độ polymer hóa từ 2000 – 6000, có trường hợp lên đến 16000 hay 20000. Trong khi đó, khả năng polymer hóa của PC chỉ từ 13000 – 14000 [dẫn liệu của Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]. Hình 2.4: Cấu trúc BC và PC [26; 27] 14 Trong tự nhiên, cellulose kết tinh phổ biến ở dạng I và II. Cellulose I có thể chuyển thành cellulose II nhưng cellulose II thì không thể chuyển ngược lại thành cellulose I. Tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy mà cellulose dạng nào chiếm ưu thế. Thông thường, dạng cellulose I được tổng hợp phổ biến hơn. Cellulose I: dài 0,05 – 0,1 m; được tổng hợp bởi đa số thực vật và vi khuẩn A. xylinum trong môi trường lên men tĩnh. Các chuỗi - 1,4 – glucan xếp song song với nhau theo một trục. Năm 1984, Atalla và V. Hart đã xác định được cấu trúc của cellulose I và cellulose I cấu tạo bởi glucose dạng hay . Cellulose II: được tổng hợp ở một số nấm mốc và vi khuẩn như Sarcinaventriculi. Là dạng sợi cellulose ổn định nhất về nhiệt động lực học, các chuỗi glucan xếp đối song nhau hay phân bố tự do. Cellulose II thường được tổng hợp trong môi trường nuôi cấy lắc. Khi đó BC tạo ra ở dạng huyền phù phân tán, các sợi cellulose thường uốn cong, đường kính khoảng 0,1 – 0,2 m [Trương Thị Anh Đào, 2003; Fumihiro Y., 1997]. 2.3.3 Đặc điểm của BC A.J. Brown (1986), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuẩn A.xylinum tạo ra trên môi trường lên men và thấy có bản chất là hemicellulose. Hemicellulose là những polysaccharid không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm tính. Một số tính chất của BC: Độ tinh sạch: độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Độ bền cơ học: có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước và hướng (đặc biệt là cellulose I) Tính hút nước: có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%), có tính xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề mặt (lực bền cơ học cao). [Trần Thị Diễm Chi, 2000]; [25]; [32] 15 2.3.4 Quá trình sinh tổng hợp BC từ vi khuẩn A. xylinum Khi nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum trong môi trường có nguồn dinh dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B 1 , B 2 , B 12 … và các chất kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra môi trường. Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ đáy lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy [Đinh Thị Kim Nhung, 1996] Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo thành cellulose như sau: các tế bào A. xylinum khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào. Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose [J. A. Bazon, 1984 - dẫn liệu của Đinh Thị Kim Nhung, 1996]. Hình 2.5: Con đƣờng dự đoán quá trình sinh tổng hợp cellulose trong tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum [Trần Thị Ánh Tuyết, 2004] Tương tự như các thực vật thượng đẳng, vi sinh vật có khả năng tổng hợp các oligo và polysaccharid nội bào, lượng oligo và polysaccharid nội bào đạt tới 60% khối lượng khô tế bào, còn polysaccharid ngoại bào có thể vượt nhiều lần khối lượng của vi sinh vật. Thành tế bào cũng chứa một lượng lớn polysaccharid. Tất cả các oligo và 16 polysaccharid được tổng hợp bằng cách thêm một đơn vị monosaccharid vào chuỗi saccharid có trước. Đơn vị monosaccharid tham gia phản ứng dưới dạng nucleotid, monosaccharid được hoạt hóa thường là dẫn xuất của uridin – diphosphat (UDP – X) nhưng đôi khi là các nucleotid purin và pyrimidin khác. Sự tổng hợp diễn ra theo phản ứng chung sau: …X-X-X-X + UDP-X = …X-X-X-X-X + UDP n nhánh (n + 1) nhánh Trong trường hợp polysaccharid gồm 2 loại monosaccharid liên tiếp (X và Y) thì phản ứng chung xảy ra theo 2 bước sau: Bước 1: XYXYXYXY + UDP-X = XYXYXYXYX + UDP Bước 2: XYXYXYXYX + UDP-Y = XYXYXYXYXY + UDP Cơ chế của quá trình tổng hợp các loại polysaccharid phân nhánh hiện nay vẫn còn chưa rõ. Người ta cho rằng thứ tự các gốc đường và tính đặc trưng tham gia của chúng vào chuỗi polysaccharid phụ thuộc vào các loại enzyme transferase [Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến, 1980]. Cellulose UDPG Glc UGP GHK G6PD (NAD) G1P G6P PGA G6PD PGI (NADP) Chu trình Pentose Frc F6P phosphate PTS FBD F1P FDP EMP TCA Hình 2.6: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose của A.xylinum PGM FHK 1PFK 17 Glc: glucose UDPG: uridin diphosphate glucose GHK: glucose hexokinase UGP:uridin glucose pyrophosphorylase G6PD: glucose – 6 – phosphate PGM: phosphoglucomutas G1P: glucose – 1 – phosphate G6P: glucose – 6 – phosphate PGI: phosphoglucose isomerase FHK: fructose hexokinase Frc: fructose F6P: fructose – 6 – phosphate PGA: phosphogluconic acid PTS: phosphotransfer system F1P: fructose – 1 – phosphate 1PFK: fructose – 1 phosphate kinase FDP:fructose – 1,6 – diphosphate dehydrogenase 2.3.5 Ứng dụng của BC Dựa vào những đặc tính ưu việt mà BC có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực: Thực phẩm: - Thức ăn tráng miệng (thạch dừa, cocktail, Kombucha, trà Manchurian…) - Các loại bánh snack, kẹo có năng lượng thấp - Chất làm đặc để bổ sung trong kem, dầu trộn salad - Màng bao thực phẩm, màng bảo quản trái cây - Chất ổn định thực phẩm Y tế: - Chất thay thế da tạm thời (da nhân tạo) - Bột cellulose ứng dụng làm tá dược trong bào chế viên nén - Băng gạc, băng trị phỏng Mỹ phẩm: - Ổn định kem dưỡng da - Chất làm se (astringent) - Chất làm đặc và làm chắc trong thuốc sơn móng tay Môi trường: - Làm miếng bọt để xử lí sạch các vết dầu tràn - Hấp thu và loại bỏ những nguyên vật liệu độc 18 Xăng dầu và than đá: - Phát hiện và thu hồi các mỏ khoáng, dầu Công nghiệp dệt: - Sợi nhân tạo cao cấp - Các loại lều, bạt, tã lót có thể vứt đi hay tái sử dụng Công nghiệp giấy: - Làm giấy cao cấp (có độ dai, độ bền cao, vì vậy ứng dụng làm giấy lưu trữ tài liệu, làm tiền, giấy vẽ…) Công nghiệp gỗ: - Ván mỏng nhân tạo (plywood laminate) - Chất tạo độ dai cho giấy, container Công nghiệp máy: - Chế tạo thân xe hơi, các thành tố cấu trúc máy bay, tên lửa… - Màng siêu âm thanh - Thiết bị siêu lọc nước - Màng thẩm thấu 2 chiều [Trần Thị ÁnhTuyết, 2004]; [32] 2.4 Thành phần nguyên liệu sử dụng trong sản xuất BC 2.4.1 Nƣớc dừa già Hiện nay tại Việt Nam và một số quốc gia, nguồn nguyên liệu chính để sản xuất thạch dừa là nước dừa. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành phần hoá học trong nước dừa có khác nhau. Lượng đường khử tổng và protein trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín (cao nhất là vào tháng thứ 9, sau đó giảm dần). Đường ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay sorbitol. 19 Bảng 2.3: Lƣợng đƣờng khử và protein có trong nƣớc dừa vào các giai đoạn khác nhau [Angaido và ctv, 1985] Tuổi (tháng) Đƣờng khử tổng (g/100g) Protein (g/100ml) 4 5 6 7 8 9 10 2,20 2,25 2,39 2,56 2,63 2,89 2,79 0,140 0,210 0,262 0,356 0,504 0,512 0,512 Bergonia và ctv (1984) đã phân tích thành phần carbohydrate trong nước dừa bằng HPLC, thấy: Nồng độ tổng của sucrose, glucose, fructose 3,0 3 gr/100ml mannose, galactose 2.23gr/100ml mannitol 0.3gr/100ml  nồng độ đường tổng 5,15 gr/100ml Ngoài ra, trong nước dừa già còn chứa nhiều vitamin, acid amin, chất kích thích sinh trưởng… rất tốt đối với sự phát triển của A. xylinum. 20 Bảng 2.4: Thành phần hoá học của nƣớc dừa già [Anzaldo và ctv, 1985] Thành phần % khối lƣợng Tỷ trọng Chất rắn tổng số Đường tổng số Tro Dầu béo Protein Clorua pH Nước 1,02 4,71 2,56 0,46 0,74 0,55 0,17 5,60 90,81 Bảng 2.5: Hàm lƣợng vitamin và chất khoáng trong nƣớc dừa [ Vanderberlt, 1945; Trần Phú Hòa, 1996] Vitamin Hàm lƣợng ( g/ml) Khoáng vi lƣợng Hàm lƣợng ( g/ml) Acid ascorbic Acid nicotinic Acid pantothenic Acid folic Biotin Riboflavin Thiamine Pyridoxine 2200 – 3700 0,64 0,52 0,003 0,02 0,01 dạng vết (trace) dạng vết (trace) K Na Ca Mg Fe Cu S P 3,12 1,50 2,09 3,00 0,01 0,04 3,40 3,70 . dày [Lê Thị Khánh Vân, 1985]. Hình 2. 3: Vi khuẩn Acetobacter xylinum [24 ; 31] 2. 2 .2. 2 Đặc điểm sinh lí – sinh hoá Acetobacter xylinum là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, cho phản ứng. Kim Thủy, 20 03]. 12 2. 2 .2. 3 Chức năng sinh lí của cellulose đối với Acetobacter xylinum Theo Costeron (1999), trong môi trường tự nhiên, vi khuẩn có khả năng tổng hợp các polysaccharid. học cao). [Trần Thị Diễm Chi, 20 00]; [25 ]; [ 32] 15 2. 3.4 Quá trình sinh tổng hợp BC từ vi khuẩn A. xylinum Khi nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum trong môi trường có nguồn dinh dưỡng đầy