SẢN XUẤT VACXIN pptx

SẢN XUẤT VACXIN Ngay sau khi phân lập và nuôi cấy được vi khuẩn uốn ván. Năm 1890, Behring và Kitasato đã chứng minh rằng : độc tố uốn ván có tính kháng nguyên tốt, tạo được đáp ứng miễn dịch phòng bệnh uốn ván. Thời gian này họ đã điều chế được huyết thanh kháng độc tố uốn ván ở súc vật dùng điều trị và phòng bệnh uốn ván. Năm 1924, Descombey là người đầu tiên dùng formalin khử độc độc tố uốn ván, đặt nền móng cho việc sản xuất giải độc tố uốn ván làm vacxin phòng uốn ván. Quá trình điều chế vacxin uốn ván, việc đầu tiên là phát triển phương pháp nuôi cấy vi khuẩn uốn ván lấy độc tố, từ độc tố mới tiếp tục các bước tiếp theo như khử tính độc, tinh chế, hấp phụ kháng nguyên vào tá chất thích hợp tạo thành vacxin đơn giá hoặc phối hợp với nhiều vacxin khác. Từ 1944 đến những năm 1960, việc sản xuất độc tố uốn ván chủ yếu sử dụng phương pháp lên men tĩnh (Static culture) hay gọi là phương pháp cổ điển. Người ta nuôi cấy vi khuẩn uốn ván trong các bình thủy tinh miệng rộng với môi trường kỵ khí thích hợp. Các chai nuôi cấy được đặt trong tủ ấm hoặc phòng ấm 36oC - 37oC. Sau thời gian nhất định ( thường 4-5 ngày, có tác giả để 8-14 ngày đến lúc tế bào ly giải) độc tố giải phóng vào nước nổi môi trường nuôi cấy, thu nhận độc tố bằng các phương pháp lọc. Năm 1947, Raynaud đưa ra khái niệm "canh khuẩn non" (1-3 ngày nuôi cấy ) là canh khuẩn chủ yếu chứa các tế bào chưa bị ly giải, canh khuẩn như thế hầu hết lượng độc tố nằm trong tế bào. Năm 1951, cũng chính Raynaud đề xuất một phương pháp trích chiết độc tố trong tế bào uốn ván bằng cách cưỡng bức ly giải canh khuẩn non. Ông tập trung vi khuẩn bằng cách ly tâm " canh khuẩn non " và giữ chúng trong dung dịch muối ( NaCl 1M + Na2CO3 0,1M ) ở 4oC/4 ngày, sau đó để ở 35oC/2 ngày. Ly tâm lấy nước nổi xác định Lf/ml bằng phản ứng lên bông. Độc tố thu được theo phương pháp của Raynaud có tác dụng gây miễn dịch trên ngựa tạo kháng thể. Phương pháp này đã được một số phòng thí nghiệm ứng dụng sản xuất độc tố lúc bấy giờ. Thời gian gặt lấy vi khuẩn thường là 72 giờ. Về sau phương pháp này vừa dùng để xác định độc tố trong tế bào vừa so sánh lượng độc tố có trong nước nổi ( ngoài tế bào ) và dùng để tìm ra thời gian nuôi cấy tối ưu thu nhận được độc tố cao nhất. Năm 1955, ông xác định được lượng độc tố cực đại trong tế bào cũng như ở nước nổi tại thời gian nuôi cấy khác nhau tùy thuộc vào số lần cấy truyền chủng Sự thay đổi hàm lượng độc tố uốn ván trong và ngoài tế bào trong suốt quá trình nuôi cấy uốn ván ở thể tích 500ml, lượng độc tố tổng số bằng tổng độc tố trong và ngoài tế bào. Thí nghiệm A : cấy chuyền chủng 9 lần Thí nghiệm B : cấy chuyền chủng 66 lần. Việc sản sinh độc tố uốn ván không giống như việc sản sinh độc tố bạch hầu. Độc tố bạch hầu được phóng thích vào nước nổi song song với sự sinh trưởng của vi khuẩn, còn sản sinh độc tố uốn ván thì ngược lại. Độc tố uốn ván hình thành rất sớm trong pha phát triển nhưng lưu lại một lượng lớn nằm trong tế bào, một lượng nhỏ phóng thích vào môi trường nuôi cấy. Sản lượng độc tố tối đa phụ thuộc mật thiết vào mối liên quan giữa quá trình sinh trưởng phát triển của vi khuẩn và yếu tố tế bào vi khuẩn tự ly giải (autolys ). Sản lượng độc tố tối đa là tổng cộng của độc tố nằm trong tế bào và trong nước nổi canh khuẩn. Từ những năm 1970 trở lại đây cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, người ta đã nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi phương pháp sản xuất giải độc tố uốn ván trên các nồi lên men với các điều kiện kiểm soát được như dùng thiết bị rung tạo cho vi khuẩn phân tán đều trong môi trường lỏng, dùng khí nén thổi qua bề mặt canh cấy để loại khí H2S sinh ra trong quá trình nuôi cấy ( Phương pháp nuôi cấy đồng nhất hay còn gọi là phương pháp nuôi cấy động = homogeneous culture ). Sirks ( 1956 ) và Van Hemert (1962) là những người đầu tiên phát triển phương pháp nuôi cấy đồng nhất ( homogeneous ) trên nồi lên men 5 lít bằng thép không rỉ, thu nhận được một lượng độc tố đáng khích lệ. Đầu tiên người ta dùng khí thổi qua bề mặt, khuấy nhẹ để tạo sự phân tán đều của vi khuẩn cùng với sự cân nhắc không để oxy khuếch tán vào môi trường gây ức chế vi khuẩn phát triển. Về sau nhiều nghiên cứu tiếp tục phát triển trên các nồi lên men lớn hơn : nồi thủy tinh 50lít, nồi bằng thép không rỉ nhiều kích cỡ tới 1000 lít. Năm 1967, Van Wezel so sánh hiệu quả lên men của hai phương pháp trên thấy rằng : với phương pháp nuôi cấy đồng nhất (homogeneous) cho hiệu giá Lf/ml gấp đôi phương pháp nuôi cấy tĩnh (static culture). Các phương pháp sản xuất giải độc tố uốn ván nói chung, đặc biệt khi phát triển phương pháp sản xuất trên qui mô công nghệ sinh học ( nuôi cấy trên nồi lên men), người ta tập trung giải quyết những vấn đề chủ chốt sau đây trong mối liên quan mật thiết. 1 .Về chủng giống : ngay từ chiến tranh thế giới thứ hai, hầu hết các phòng thí nghiệm, sản xuất độc tố uốn ván trên khắp thế giới (Mueller và Miller, 1945; Pillimer, et al., 1948; Largier, 1956; C.latham, et al, 1962; Thomson, 1957; Dawson và Mauritzen, 1967; Murphy và Miller, 1967) đêu dùng chủng Harvard - 49205 để sản xuất độc tố. Năm 1965, TCYTTG chính thức khuyến cáo dùng chủng "Harvard train, 49205, code Y " và nhấn mạnh đây là chủng sản sinh độc tố có tính kháng nguyên cao. Ngày nay, hầu hết các nước có sản xuất vacxin uốn ván đều dùng chủng này ( Hà lan, Hungari, Ấn độ, Indonesia, Philipin, Thụy Điển ). 2. Nuôi cấy vi khuẩn trên nồi lên men bằng thép không rỉ. Phân tán đều vi khuẩn trong môi trường bằng thiết bị rung, không dùng cánh khuấy. 3. Dùng khí nén thổi qua bề mặt canh khuẩn để loại khí H2S sinh ra trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Năm 1967, Van Wezel đã chứng minh rằng nếu dùng khí Nitơ thay cho khí nén thì mặc dầu vi khuẩn vẫn phát triển tốt song cho độc tố thấp hơn so với dùng khí nén. 4. Môi trường nuôi cấy sản sinh độc tố : môi trường Tarozzi chứa các mảng thịt băm và glyceril là môi trường kỵ khí được dùng sớm nhất và rộng rãi nhất. Hiệu giá đạt 1-3 Lf/ml. Nhiều tác giả tiếp tục phát triển nhiều loại môi trường khác như môi trường Gluzmal, Latham, Prevot và Boorsma với kỳ vọng sản xuất được độc tố có hiệu giá cao . Thành công nhất là môi trường Mueller và Miller, năm 1945, cải tiến năm 1947 và 1945. Môi trường Mueller và Miller được ứng dụng có hiệu quả không những cho phương pháp sản xuất cổ điển ( nuôi cấy trên chai thủy tinh ) mà còn có tác dụng tốt cho đến ngày nay với phương pháp sản xuất bằng công nghệ sinh học ( nuôi cấy trên nồi lên men ). Môi trường này đạt hiệu giá 50 - 90 Lf/ml. Năm 1964, nhắc lại năm 1977, TCYTTG chính thức yêu cầu dùng môi trường Mueller và Miller cho sản xuất độc tố uốn ván. Thành phần Nz - Case TT trong môi trường Mueller và Miller ảnh hưởng nhiều đến việc sản sinh độc tố uốn ván. 5. Khử độc và tinh chế : kể từ năm 1924 ( lần đầu tiên phát hiện Formalin khử độc độc tố uốn ván ) đến nay, Formalin vẫn là một chất bất hoạt ổn định nhất với độc tố uốn ván. Không những thế mà ngày nay còn sử dụng rộng rãi Formalin khử tính độc của nhiều loại độc tố khác để điều chế vacxin vi khuẩn cũng như vacxin vi rút. Năm 1977, TCYTTG yêu cầu giai đoạn nuôi cấy phải gặt được độc tố có hiệu giá 40Lf/ml mới đạt tiêu chuẩn đưa vào giải độc làm vacxin. Năm 1946, Pillemer là người đầu tiên và duy nhất kết tinh được độc tố uốn ván. Phương pháp kết tinh của ông nhằm mục đích đạt được độc tố uốn ván tinh khiết . Ông dùng Methanol 20% tủa độc tố; kiểm soát pH = 6; nồng độ protein 1%; độ dẫn điện của dung dịch độc tố là 0,02; nhiệt độ -5oC. Sự kết tinh xảy ra sau một vài ngày và kết thúc sau vài tuần. Nhiều tác giả tiếp tục phát triển tinh khiết độc tố uốn ván trên ý tưởng và phương pháp của Pillemer như : Largier, 1956 dùng kỹ thuật siêu ly tâm; Dawson và Mauritzen, 1967 tủa độc tố ở - 15oC với Methanol 40% sau đó dùng cột DEAE -cellulose; Murphy và Miller, 1967, Murphy, 1968 dùng (NH4)2SO4 tủa độc tố hai lần với hàm lượng khác nhau, hòa tan tủa bằng dung dịch đệm, pH=7,5, loại muối bằng cột Sephadex 50, cuối cùng là tiến trình trên cột Sephadex G-100. Năm 1964, nhắc lại 1977, TCYTTG khuyến cáo tinh chế giải độc tố thô qua các giai đoạn chính: - Cô đặc và loại bớt tạp chất bằng máy siêu lọc. - Tủa phân đoạn bằng muối (NH4)2SO4, hoàn nguyên bằng dung dịch muối NaCl 0,85%. - Loại (-SO4) bằng máy siêu lọc. - Lọc vô trùng bằng thiết bị lọc thích hợp. - Yêu cầu độ sạch kháng nguyên ³ 1000 Lf/mg protein Nitơ. 6. Hỗn hợp thành các vacxin : giải độc tố uốn ván tinh chế được dùng để cấu tạo nên vacxin đơn giá như vacxin TT và các vacxin hỗn hợp như vacxin DTP; vacxin DT dùng để tiêm nhắc lại gây miễn dịch cho trẻ em ở trước 6 tuổi; vacxin Td dùng để miễn dịch nhắc lại cho trẻ em lứa tuổi lớn. Thông thường các vacxin trên được hấp phụ bởi tá chất chứa nhôm ( aluminium phosphate hoặc aluminium hydroxide ) để làm tăng tính công hiệu của kháng nguyên uốn ván. Lượng nhôm trong vacxin DTP và TT £ 1,25 mg Al3+ trong một liều tiêm người ( 1 liều = 0,5ml ). Khi kháng nguyên phối hợp với tá chất thí tính kháng nguyên cũng tăng lên, làm tăng khả năng sinh kháng thể của kháng nguyên . Vì tá chất có tác dụng giữ kháng nguyên tại chỗ, do đó tạo nên kho cung cấp và duy trì được kháng nguyên ở hàm lượng cao xung quanh vị trí tiêm, đồng thời lan tỏa ra dần dần, dẫn đến sự kích thích của kháng nguyên thường xuyên đối với cơ quan miễn dịch. Đại thực bào làm tiêu muối nhôm mang kháng nguyên và do đó tăng khả năng tạo miễn dịch vượt quá xa của bản thân kháng nguyên hòa tan. Tại Việt Nam từ năm 1986 trở về trước áp dụng sản xuất vacxin uốn ván theo phương pháp nuôi cấy cổ điển. Năm 1986 đến nay, Viện vacxin sản xuất theo phương pháp nuôi cấy trên nồi lên men: chủng sản xuất có nguồn gốc Harvard ( Mỹ ) mang số hiệu 49205; môi trường nuôi cấy lấy độc tố là FMM ( Fisek - Mueller - Miller ) thành phần chính của môi trường là các acide min từ nguồn Nz -Case TT ( thủy phân từ Cazein ), dung dịch đường glucose + muối NaCl, các vitamin và một số chất khoáng vi lượng. Nuôi cấy vi khuẩn trên nồi lên men 100 lít, thu nhận độc tố, tiến hành giải độc, tinh chế và cuối cùng hỗn hợp thành vacxin DTP và vacxin TT. Công hiệu vacxin TT ³ 80 đơn vị miễn dịch (IU/ml ). Công hiệu thành phần uốn ván trong vacxin DTP ³ 120 IU/ml. . trở về trước áp dụng sản xuất vacxin uốn ván theo phương pháp nuôi cấy cổ điển. Năm 1986 đến nay, Viện vacxin sản xuất theo phương pháp nuôi cấy trên nồi lên men: chủng sản xuất có nguồn gốc. protein Nitơ. 6. Hỗn hợp thành các vacxin : giải độc tố uốn ván tinh chế được dùng để cấu tạo nên vacxin đơn giá như vacxin TT và các vacxin hỗn hợp như vacxin DTP; vacxin DT dùng để tiêm nhắc lại. phương pháp nuôi cấy tĩnh (static culture). Các phương pháp sản xuất giải độc tố uốn ván nói chung, đặc biệt khi phát triển phương pháp sản xuất trên qui mô công nghệ sinh học ( nuôi cấy trên nồi