BÁO CÁO KHOA HỌC: "BULLERA NINHBINHENSIS SP. NOV., MỘT LOÀI NẤM MEN MỚI SINH BÀO TỬ BẮN ĐƯỢC PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM" docx

BULLERA NINHBINHENSIS SP. NOV., MỘT LOÀI NẤM MEN MỚI SINH BÀO TỬ BẮN ĐƯỢC PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty, Nguyễn Lân Dũng. Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Trung tâm Công nghệ Sinh học, ĐHQGHN Masako Takashima, Takashi Nakase Bảo tàng Vi sinh vật Nhật Bản, Viện nghiên cứu Hoá Lý, Saitama, Nhật Bản. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Từ 20 mẫu lá cây thu thập ở Vườn Quốc gia Cúc Phương, đã phân lập được 120 chủng nấm men sinh bào tử bắn. Năm chủng thuộc chi Kockovaella là đại diện của 4 loài mới là: Kockovaella calophylli, K. cucphuongensis, K. litsea và K. vietnamensis đã được công bố [6]. Trong bài báo này chúng tôi thông báo một trong số 17 các loài chưa biết của chi Bullera [1]. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP - Chủng nấm men sử dụng: Chủng nấm men VY-112 được phân lập từ bề mặt lá cây dong (Phrygnum parviflorum Gagnep), thuộc họ Marantaceae mọc ở Vườn Quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình, theo phương pháp của Nakase và Takashima [9]. - Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá: Theo mô tả của Yarrow [16]. Khả năng đồng hoá nitơ được xác định theo phương pháp của Nakase và Suzuki [8]. Vitamin đòi hỏi bắt buộc được xác định theo Komagata và Nakase [5]. - Các đặc điểm hoá phân loại (chemotaxonomy): Tách chiết, tinh sạch và xác định ubiquinone theo phương pháp của Nakase và Suzuki [8]. Xyloza trong tế bào được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng theo Nakase và cộng sự [7], sau khi thuỷ phân tế bào bằng axit trifluroaxetic theo Suzuki và Nakase [12]. - Phân tích trật tự và xây dựng cây phát sinh: Trật tự của rADN 18S và ITS bao gồm cả rADN 5,8S được xác định theo phương pháp của Takashima và Nakase [13], sử dụng chương trình computer CLUSTAL W ver 1.74 của Thompson và cộng sự [15]. Các trật tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, Gen Bank. Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura [4] sử dụng phương pháp của Saitou và Nei [10]. Các khoảng trống tồn tại trong các sequence được loại trừ. Các phân tích Bootstrap theo Felsenstein [2] được thực hiện từ 1000 mẫu. Để so sánh các sequence của vùng rADN ITS trong các loài có quan hệ họ hàng gần, các sequence được so sánh từng cặp bằng mắt thường. - Thí nghiệm lai ADN-ADN: Phân lập và tinh sạch ADN thực hiện theo phương pháp của Takashima và Nakase [14]. Thành phần của ADN được xác định bằng sắc ký lỏng cao áp. Các thí nghiệm lai ADN-ADN được thực hiện theo phương pháp lọc màng của Hamamoto và Nakase [3]. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bullera, một chi nấm men sinh bào tử bắn đã được mô tả từ năm 1930 bởi Derx [1]. Chi này được đặc trưng bởi bào tử dạng đối xứng; khuẩn lạc màu trắng đến ngà; sinh sản theo 2 cách: Bằng bào tử bắn và bằng tế bào nảy chồi; ubiquinone chủ yếu là Q-10 và chứa xyloza trong tế bào. Chủng nấm men VY-112, phân lập từ bề mặt lá cây dong (Phrygnum parviflorum Gagnep), thuộc họ Marantaceae ở Vườn Quốc gia Cúc Phương, có đầy đủ các đặc điểm đặc trưng trên và được xác định vào chi Bullera. Trật tự 1780 bazơ của rADN 18S của chủng VY-112 đã được xác định. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng giữa chủng VY-112 với 34 loài của các chi Bullera, Cryptococcus, Fellomyces, Kockovaella và các chi nấm men khác. Kết quả cho thấy chủng VY-112 nằm trên một nhánh tách rời và có quan hệ gần gũi với Cryptococcus podzolicus (Hình 1). Xác định thành phần ADN của G+C cho thấy chủng VY- 112 có tỷ lệ 59,9 G+C mol%, còn Cryptococcus podzolicus lại có tỷ lệ 56,8 G+C mol%. Trật tự 274 bazơ của các đoạn rADN ITS cũng đã được xác định (Hình 2) và tỷ lệ bazơ giống nhau đã được tính giữa VY-112 và Cryptococcus podzolicus. Ở đoạn ITS 1 có tỷ lệ 85,8 % ba zơ giống nhau và 81,5% giống nhau ở đoạn ITS 2. Kết quả này cho thấy chủng VY-112 khác biệt với Cryptococcus podzolicus [11]. Nghiên cứu về các đặc điểm sinh lý và sinh hoá cũng chỉ rõ chủng VY-112 khác hẳn Cryptococcus podzolicus (Bảng 1) Các kết quả trên khẳng định chắc chắn rằng chủng VY-112 là đại diện của một loài mới. Loài này được chúng tôi đặt tên là Bullera ninhbinhesis. Mô tả loài mới Bullera ninhbinhensis Luong, Takashima, Ty, Dung et Nakase, sp. nov. In liquido “YM” post dies 5 ad 17˚C, cellulae vegetativae sphaericae vel ovoideae aut elongatae, 2.0-6.0x3.0-8.0 m, singulae, binae aut in catenis. Post unum mensem ad 17˚C, pellicula et sedimentum formantur. Cultura in agaro “YM”, subflava, glabra, non-nitida, mollis,butyracea et margine glabra. Mycelium et pseudomycelium non formatur. Ballistoconidia rotundae vel napiformes, 2.0-2.5x1.5-2.0 m Fermentatio nulla. Glucosum, galactosum, L-sorbosum (exiguum), sucrosum, maltosum, cellobiosum, trehalosum, lactosum(exiguum), melibiosum(exiguum), raffinosum(exiguum), melezitosum, amylum solubile, D- xylosum, L-arabinosum, D-arabinosum, D- ribosum(exiguum), L-rhamnosum, ethanolum, glycerolum (exiguum), erythritolum (exiguum), galactitolum, D- mannitolum (lente), D-glucitolum (lente), -methyl-D- glucosidum, salicinum (exiguum), glucuno--lactonum, acidum 2-ketogluconicum, acidum 5-ketogluconicum, acidum D-glucuronicum, acidum D-galacturonicum, acidum DL-lacticum, acidum succinicum, acidum citricum (exiguum) et inositolum(exiguum) assimilantur at non ribitolum nec inulinum,. Ammonium sulfatum, cadaverinum, ethylaminum, kalium nitricum et L-lysinum assimilantur at non natrium nitrosum. Maxima temperatura crescentiae: 32-33˚C. Ad crescentiam thiaminum necessarium est. Materia amyloidea iodophila non formantur. Ureum hydrolysatur. Diazonium caeruleum B: Positivum. Proportio molaris guanini+cytosini in acido deoxyribonucleico: 59,9 mol% per HPLC. Systema ubiquini: Q-10. Xylosum in cellulis presens. Holotypus: Isolatus ex folio Phrygnum parviflorum, Vietnam, VTCC1 0184 (originaliter ut VY-112) conservatur in collectionibus culturarum quas “Vietnam Type Culture Collection”, Hanoi, Vietnam sustentat. Nuôi cấy trên môi trường YM dịch thể: Sau 5 ngày nuôi ở 17 0 C các tế bào dinh dưỡng có dạng cầu tới oval, một số tế bào dạng thuôn dài, kích thước 2,0-6,0x3,0-8,0 m, chúng thường đơn độc, thành cặp hoặc thành nhóm, sinh sản bằng nảy chồi. Sau một tháng nuôi ở 170C thấy xuất hiện một lớp cặn mỏng ở đáy và một lớp váng mỏng dễ tan ở thành ống nổi trên bề mặt môi trường. Nuôi cấy trên môi trường YM thạch nghiêng: Sau một tháng nuôi cấy vạch, khuẩn lạc màu vàng nhạt, nhẵn đục, mềm và có mép trơn. Nuôi cấy trên môi trường thạch-bột ngô ở đĩa Petri: Khuẩn ty thật và khuẩn ty giả đều không được tạo thành sau 2 tuần ở 250C. Bào tử bắn: Bào tử bắn được tạo thành nhiều trên môi trường thạch -bột ngô, sau 3 ngày nuôi ở nhiệt độ 17 0 C. Bào tử bắn có dạng cầu tới nhọn một đầu, kích thước 2,0- 2,5x1,5-2,0 m. Khả năng lên men: Không có khả năng lên men. Khả năng đồng hoá các nguồn cacbon: Khả năng đồng hoá các nguồn Nitơ: Nhiệt độ sinh trưởng cực đại: 32-33 0 C. Vitamin đòi hỏi bắt buộc: Tiamin. Cơ chất tạo thành giống tinh bột: Âm tính. Phản ứng mầu với Diazonium blue B: Dương tính. Phân giải ure: Dương tính. Tách axít béo: Âm tính. Hoá lỏng gelatin: Yếu Sinh trưởng trên môi trường chứa 50% glucoza: Âm tính. Sinh axít trên môi trường glucoza: Yếu Thành phần C+G của DNA: 59,9 mol % (bằng sắc ký lỏng cao áp). Hệ thống ubiquinon: Q-10. Xyloza trong tế bào: Có mặt Chủng kiểm tra: Chủng VY-112 do Đào Thị Lương phân lập năm 1999 từ lá cây dong (Phrygnum parviflorum Gagnep), mọc ở vườn Quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình. Chủng này đang được bảo quản tại Bảo tàng Giống Vi sinh vật, Đại học Quốc gia Hà Nội. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty, Nguyễn Lân Dũng(2001). Khảo sát các loài nấm men sinh bào tử bắn thuộc các chi Bullera và Kockovaella mới tìm thấy ở Việt [...]... results showed that VY-112 represent as a new species Bullera ninhbinhensis is proposed for this strain Hình 2 So sánh trật tự r ADN ITS của C podzolicus và Bullera ninhbinhensis VY-112 Bảng 1 So sánh các đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng VY-112 và Cryptococcus podzolicus* Hình 1 Cây phát sinh chủng loại của Bullera ninhbinhensis VY-112 và các loài có quan hệ gần ... multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680 17 Yarrow, D (1998) Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts In The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th ed., ed by Kurtzman, C P and Fell, J W., E lsevier, Amsterdam, pp 77-100 SUMMARY BULLERA NINHBINHENSIS SP NOV., A NEW BALLISTOCONIDIOGENOUS...Nam Hội thảo Quốc tế Sinh học Hà Nội – Việt Nam (2-5 tháng 7) Tr 140-145 2 Boekhout, T & Nakase, T (1998) Bullera Derx In The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th ed., ed By Kurtzman, C P and Fell, J W., Elsevier, Amsterdam, pp 731-741 3 . BULLERA NINHBINHENSIS SP. NOV. , MỘT LOÀI NẤM MEN MỚI SINH BÀO TỬ BẮN ĐƯỢC PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty, Nguyễn Lân Dũng. Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Trung tâm. ở 250C. Bào tử bắn: Bào tử bắn được tạo thành nhiều trên môi trường thạch -bột ng , sau 3 ngày nuôi ở nhiệt độ 17 0 C. Bào tử bắn có dạng cầu tới nhọn một đầu, kích thước 2,0 - 2,5 x 1,5 - 2,0 . men sinh bào tử bắn đã được mô tả từ năm 1930 bởi Derx [1]. Chi này được đặc trưng bởi bào tử dạng đối xứng; khuẩn lạc màu trắng đến ngà; sinh sản theo 2 cách: Bằng bào tử bắn và bằng tế bào