BÁO CÁO KHOA HỌC: "XÁC ĐỊNH PHÂN TỬ LƯỢNG CỦA PHÂN TỬ ADN MẠCH VÒNG" pps

Dựa trên nguyên tắc trên, điện di xung –PFGE không cân xứng đã được sử dụng để phân biết và phân giải các ADN có các cấu trúc khác nhau Hình 1- Các ADN mạch vòng có thể là một đơn phân a

XÁC ĐỊNH PHÂN TỬ LƯỢNG CỦA PHÂN TỬ ADN MẠCH VÒNG

Nguyễn Thị Hồng Hạnh

Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN&CNQG

I MỞ ĐẦU

Các ADN mạch vòng được phát hiện trong nhân của vi khuẩn, trong ty thể, trong các lục lạp của thực vật cũng như của động vật [1, 2, 3] Một ADN vòng có thể là một đơn thể (1a) hoặc một nhị thể với các cấu hình khác nhau Các ADN mạch vòng gồm hai phần hệt nhau có thể được sắp xếp đối xứng (1b) hoặc không đối xứng (1c)

Trong điện trường của điện di thông thường, các ADN

mạch thẳng và ADN mạch vòng dịch chuyển trên cùng một quĩ đạo Tuy nhiên, trong từ trường của điện di xung -

PFGE, dưới ảnh hưởng của các vector không cân xứng với hiệu điện thế và thời gian tác động khác nhau [4], các ADN

mạch thẳng và mạch vòng dịch chuyển trên các quĩ đạo hoàn toàn riêng biệt và vì vậy có thể xa rời nhau Dựa trên nguyên tắc trên, điện di xung –PFGE không cân xứng đã được sử dụng để phân biết và phân giải các ADN có các cấu trúc khác nhau

Hình 1- Các ADN mạch vòng có thể là một đơn phân (a), nhị phân đối xứng gồm hai nửa giống nhau sắp sếp theo kiểu đầu - chụm - đuôi (b) hoặc không đối xứng có cấu trúc

đầu - chụm - đầu (c)

Nguyên sinh động vật Leishmania sống ký sinh trong các

đại thực bào của người và động vật Các bệnh mà ký sinh

trùng gây nên thường khác nhau, do Leishmania có một hệ

genom rất mềm dẻo và luôn thay đổi Các yếu tố di truyền mạch vòng có nguồn gốc từ một nhiễm sắc thể mẹ thường được phát hiện trong nhân của chúng Các ADN mạch vòng

thường có cấu trúc khác nhau Mạch vòng CD1 trong L Major là một nhị phân có cấu trúc đặc biệt gồm hai nửa

giống nhau nhưng xếp đặt theo kiểu đầu chụm đầu, trong

khi đó mạch vòng CD1 của Leishmania mexicana M379 có

thể là một nhị phân [5]

Trong bài báo này, chúng tôi trình bầy các phương pháp được sử dụng để xác định phân tử lượng của yếu tố di

truyền ngoài nhiễm sắc thể CD1 của nguyên sinh động vật

Leishmania M379 nói riêng và của các ADN mạch vòng

nói chung Phương pháp đã được sử dụng có kết quả để xác định phân tử lượng của một mạch vòng mini trong hệ gen

ty thể của nguyên sinh động vật Leishmania [6]

II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Nguyên liệu

Nguyên sinh động vật Leishmania M379 thuộc chủng

Garnham (G1) được nuôi trên môi trường GLSH có bổ xung 10% huyết thanh bê [7] ở nhiệt độ 26o C và cấy

chuyển hai lần một tuần

2 Phương pháp

- Tách chiết ADN

Nguyên sinh động vật Leishmania được nuôi trong môi

trường GLSH đến giai đoạn log để tách chiết ADN Ký sinh trùng được ủ trong dung dịch tan (100 mM Tris pH 9 ,

200 mM EGTA, 2% EDTA và RNA-ase) trong 2 giờ ở

37oC Sau khi bổ xung proteinase K (20g / ml) mẫu được

ủ tiếp trong vài giờ ở 55oC ADN được làm sạch và tách chiết bằng phenol

- Cắt ADN của Leishmania

Các men ClaI và Xbal ( Promega) ở các nồng độ khác nhau

được dùng để cắt ADN của Leishmania Phản ứng cắt được tiến hành ở 37oC trong 2 giờ

- Chuẩn bị PFGE block

Nguyên sinh động vật Leismania nuôi ở giai đoạn log được

dùng để chuẩn bị PFGE block theo phương pháp của Van der Ploeg [8]

- Đánh dấu đồng vị phóng xạ

Phân tử mạch vòng CD1 được tách bằng phương pháp điện

di xung PFGE [9] Chúng được cắt với EcoRI trước khi

được đánh dấu phóng xạ với 32 P theo phương pháp đã được công bố [10]

- Kỹ thuật điện di xung

Các phân tích PFGE nhằm phân tách các nhiễm sẵc thể được tiến hành như đã được miêu tả [9]

- Lai Southern và các phép đo đồng vị phóng xạ

Lai Southern được tiến hành theo các phương pháp chuẩn [10] Các tín hiệu lai phóng xạ được phát hiện trên phim

Kodak X trong vòng 24 giờ

II KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Cắt hạn chế và lai Southern để xác định phân tử lượng của CD1

Nhằm xác định phân tử lượng của yếu tố di truyền ngoài

nhiễm sắc thể CD1, ADN genome của Leishmania, chủng G1 được cắt hoàn toàn với men ClaI Các đoạn cắt được

phân giải bởi điện di PFGE trong 7 giờ và lai Souther với CD1 đánh dấu đồng vị phóng xạ

Như đã thấy ở hình 2, mạch vòng CD1 dường như có phân

tử lượng khoảng 28 kb, vì khi cắt CD1 với ClaI, bốn đoạn ADN với phân tử lượng là 3, kb ; 5., 2 kb ; 6 kb và 13 kb

đã được phát hiện như mong đợi

Hình 2- Yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể CD1 có trọng lượng phân tử khoảng 28 kb Bốn đoạn ADN với kích thước thứ tự từ trên xuống dưới 1 (13 kb); 2 ( 6 kb); 3 (5, 2kb) và 4 (3, 7 kb) là sản phẩm cắt hoàn toàn của CD1 với

Cla I

Xác định cấu trúc của mạch vòng CD1

Việc xem xét phân tử lượng của CD1 được khởi xướng khi

rất ngẫu nhiên một đoạn ADN có phân tử lượng  56 kb

được phát hiện trong điện trường cuả điện di không cân xứng PFGE Đoạn ADN này lai đặc trưng với CD1 (hình 3)

và không lai với các ADN khác Chúng tôi giả thiết đoạn ADN mới phát hiện có thể có nguồn gốc từ CD1 với phân

tử lượng là 56 kb, nó là một nhị nguyên, cấu tạo từ hai nửa

giống nhau theo kiểu đầu – chụm - đuôi

Các kết quả thực nghiệm cho thấy, khi hàm lượng men ClaI cao (1g ADN / 1 đơn vị men), CD1 bị cắt hoàn toàn và cho bốn mảnh ADN với kích thước 13kb ; 6kb ; 5, 2 kb và 3,7 kb (hình 4, hàng 1), còn khi lượng men ClaI bị giảm, CD1 bị cắt hạn chế và cho các sản phẩm cắt khác với

trường hợp đầu (hình 4, hàng 2, 3, 4, 5) Các đoạn ADN với kích thước 28 kb, 56 kb, các tín hiệu phóng xạ đi từ giếng của gel quan sát như dự đoán Như vậy, CD1 đã là một nhị nguyên cân xứng có trọng lượng phân tử là 56 kb với cấu trúc đầu -chụm - đuôi (hình 5)

IV KẾT LUẬN

Bằng việc kết hợp các phương pháp khác nhau của sinh học phân tử như cắt hạn chế, cắt hoàn toàn ADN genomic với các men cắt thích hợp, phương pháp điện di xung PFGE và phương pháp lai phân tích Southern , chúng tôi đã xác định cấu trúc cũng như phân tử lượng của yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể CD1 trong hệ genome của nguyên sinh

động vật Leishmania mexicana M379 thuộc chủng

Garnham Chúng tôi đã sử dụng phương pháp này để xác định cấu trúc của một số vòng mini trong hệ gene ty thể của

Leishmania mexicana M379 [4b] Chúng tôi cho rằng

phương pháp có thể được sử dụng để xác định phân tử

lượng và cấu trúc của bất cứ ADN mạch vòng

Lời cảm ơn: Công trình nghiên cứu này được thực hiện tại phòng thí nghiệm của khoa Sinh học Đại cương, viện Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học, trường Đại học Tự do Brussels, Bỉ Tác giả cảm ơn sự giúp đỡ của Gs Ts

Hamers R và các bạn bè đồng nghiệp

Hình 3- Một đoạn ADN mạch thẳng có phân tử lượng  56

kb ( mũi tên ) được phát hiện trong điện trường cuả điện di

không cân xứng PFGE

1: Nhiễm sắc thể của Leishmania mexicana, chủng G1

được phân giải bởi điện di xung không cân xứng PFGE

2: thang chuẩn ADN 49 kb

B) Các nhiễm sắc thể của gel A được lai với CD1 phóng

xạ

Hình 4- Sự phối hợp của các phương pháp cho phép xác

định cấu trúc nhị phân của CD1

A Các đoạn của ADN bị cắt bởi men Cla I ở các nồng độ khác nhau ( 1: 1 g ADN /1 đơn vị Cla I; 2: 1 g / 0, 5 đơn

vị Cla I; 3: 1 g/ 0, 25 đơn vị Cla I; 4: 1 g / 0, 125 đơn vị

Cla I và 5: 1 g / 0, 065 đơn vị Cla I )

B Lai Southern của gel A Các mũi tên chỉ các phân tử lượng từ trên xuống dưới 56kb;

28 kb; 6 kp; 5,2 kb và 3,7 kb

Hình 5 - Yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể trong nhân của L mexicana M379, chủng Garnham CD1 là một nhị

nguyên cân xứng và có trọng lượng phân tử là  56 kb

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1- Julian D and Smith D (1978) Plasmid-determine

resistance to antimicrobial agents Ann Rev Microbial 32 : 469 – 518

2 - Liu, J; Salina, G; Gạịandran, N; Muithui, D;

Muyderman, S and Hamer, R (1991) DNA recombination associated with short direct repeat Mol Biochem

Parasitol 50 : 351 - 355

3 - Southern E M (1975) Detection of specific sequences among ADN fragments separated by gel electrophoresis J Mol Biol 98 : 503 – 517

4 - Klotz, L C and Zimm B H (1972) Macromolecule

5: 471 - 481

4a - Liu, J (1992) Thesis submitted for the degree of

Doctor of Science VUB-Brussels

4b - Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Hammers, R (2002) Tạo dòng phân tử và giải toàn bộ trình tự một ADN ty thể của nguyên sinh động vật Leishmania mexicana dòng Evans (E8) Tạp chí y học dự phòng Tập XI (6) : 22 - 24

5 - Le Ray, D (1975) Structure and antigenique de

Trypanosome brucei Analyse immuno electophoretic et etude comparative Ann Soc Belge Med trop 55 : 158 -

160

6 - Van de Ploeg., Giannini, S H and Cantor, C R (1985) Heat-shock protein gene - regulatory role in parasitic

protozoan Science 228 : 1443 - 1449

7 - Nguyễn Thị Hồng Hạnh (1999) Molecular analysis of the karyotype diversity between two clonal lines of

Leishmania mexicana M379, the Garnham line (ITMAP 2167) and the Evanline(ITMAP-2) Doctoral thesis

submitted for the degree of Doctor of Science

VUB-Brussel

8 - Feinberg, A P and Volgelstein, B (1983) A technique

for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments

to higth specificity Cell Biol 126 : 6 -13

9 - Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003) Phân biệt các cấu trúc của ADN bằng phương pháp điện di xung PFGE Những vấn đề cơ bản của khoa học sự sống Tr 887- 888

10 - Maniatis, T.M., Frisch, E.F and Sambrook, J (1982) Molecular clonning A laboratory Manual Cold Spring

Harbor laboratory Press Cold Spring Harbor

SUMMARY

EVALUATION OF THE STRUCTURE AS WELL AS THE MOLECULAR WEIGHT OF CIRCULAR DNAS

Nguyen Thi Hong Hanh

Institute of Biotechnology, NCST

Living organisms possessed ADNs of linear and circular structuctures with different linear and circular

configurations Circular DNAs in the genome of living organisms could adopt different configurations as well as

different molecular weight In some case, it is difficult to determine exactly their molecular weight as well as their configuration

The extrachromochomal circular elements CD1 was found

in the genome of Garnham strain G1 of Leishmania

mexicana M379 It seemed to be a dimer with molecular

weight  57 kb with head-to-tail configuration By using

three methods:

i) limit and complete restring genomic DNA by appropriate enzymes

ii) Pulsed-Field gel Electrophoresis (PFGE)

iii) Southern blot analysis, we were able to evaluate the real molecular weight of an extrachromosomal circular DNA, namely CD1 naturally occurring in the genome of

protozoan Leishmania As consequence, the dimer structure

of the molecule was determined with expected

organization The method was applied to determine the

molecular weight and structure of a minicircle class in the

mitochondria genome of Leishmania mexicana M379,

strain E8 We believed, that the methods described above could be applied to determine the molecular weight of any circular DNAs

Người thẩm định nội dung khoa học: TS Nguyễn Thị

Thanh Bình