Báo cáo nghiên cứu khoa học:"NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY BA KÍCH (MORINDA OFFICINALIS HOW)" ppt

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(40).2010 191 NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY BA KÍCH (MORINDA OFFICINALIS HOW) STUDY ON THE IN VITRO PROPAGATION OF MORINDA OFFICINALIS HOW. Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh Tư Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng TÓM TẮT Cây Ba kích (Morinda officinalis How.) là cây dược liệu quí. Do đó, vấn đề bảo tồn loài này rất cần thiết. Ở đây, chúng tôi tái sinh chồi in vitro trên môi trường cơ bản MS bổ sung 0,25 mg/L KIN. Đoạn thân (khoảng 1cm) của cây Ba kích in vitro được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS bổ sung các chất kích sinh trưởng khác nhau cho cảm ứng nhân nhanh chồi. Số chồi in vitro đạt lớn nhất trên môi trường cơ bản MS bổ sung 3,5 mg/L BA + 0,2 mg/L IBA (với 15,00 chồi/mẫu cấy). Chồi được tạo rễ trên môi trường MS bổ sung IBA hoặc NAA, hình thành rễ tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 0,2-0,25 mg/L IBA. Cây in vitro đưa ra nhà lưới, 97,9% cây sống và thích nghi với điều kiện tự nhiên. ABSTRACT Morinda officinalis How. is a valuable medicinal herb. Therefore, the conservation of this plant is a necessity. In this study, we regenerated in vitro shoots in the basal MS medium supplemented with 0.25 mg/L KIN. The stem segments of in vitro Morinda officinalis How. (about 1 cm in length each) were cultured in the basal MS medium supplemented with different growth regulators for multiple shoot induction. A maximum number of in vitro shoots were obtained in the medium containing 3.5 mg/L BA and 0.2 mg/L IBA (15.00 shoots/a sample). The shoots were rooted in the basal MS medium supplemented with IBA or NAA and best rooted in the medium containing 0.2- 0.25 mg/L IBA. In vitro plantlets acclimatized themselves in green houses and the transplants were adapted to natural conditions, with a survival of 97.9%. 1. Đặt vấn đề Hiện nay, nhu cầu của con người về nguồn dược liệu ngày càng tăng. Nguồn dược liệu con người đang sử dụng có thể được tổng hợp bằng nhiều con đường khác nhau như tổng hợp hóa học, tổng hợp từ vi sinh vật, song nguồn dược liệu từ thực vật đã được con người sử dụng từ lâu và nhu cầu ngày càng lớn [5]. Tuy nhiên, các loài cây dược liệu trong tự nhiên đang bị giảm về số lượng và chất lượng bởi sự khai thác quá mức; các điều kiện ngày càng bất lợi của môi trường tự nhiên,… dẫn đến nhiều loài cây dược liệu quý hiếm bị tuyệt chủng, ảnh hưởng đến nguồn cung cấp dược liệu bền vững cho con người. Cây Ba kích (Morinda officinalis How.) được sử dụng rộng rãi như một loại dược liệu quý có tác dụng bổ thận âm, bổ thận dương, tăng cường gân cốt, khử phong thấp [3]. Dịch chiết cồn từ củ cây Ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(40).2010 192 đối với các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp ăn và ngủ ngon [6]. Ngày nay, nhu cầu sử dụng loài cây này làm dược liệu đang gia tăng nên nó bị khai thác kiệt quệ. Mặt khác, vùng phân bố của Ba kích bị tàn phá nghiêm trọng khiến loài cây này lâm vào tình trạng gần như tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần phải được bảo vệ. Nguồn cung cấp cây giống Ba kích hiện nay chủ yếu bằng phương pháp giâm cành nhưng hệ số nhân rất thấp (chỉ đạt 0,61/năm); chất lượng giống lại không cao. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả nhân nhanh giống cây Ba kích bàng kỹ thuật in vitro, nhằm đáp ứng nhanh và bền vững nguồn cây giống có chất lượng tốt. 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu Chúng tôi sử dụng đoạn thân (1,0-1,5 cm) có mắt lá của cây Ba kích (Morinda officinalis How.) 1 năm tuổi lấy từ huyện Tây Giang (Quảng Nam) làm nguyên liệu thực nghiệm. 2.2. Phương pháp nghiên cứu + Tạo nguyên liệu khởi đầu Đoạn thân (có mắt lá) được rửa dưới vòi nước chảy, ngâm dung dịch thuốc diệt nấm (0,3%) khoảng 15 phút sau đó khử trùng bằng cồn 70 0 trong 60 giây, HgCl 2 0,1% trong 7 phút, rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng khoảng 3 lần. Mẫu vô trùng được sử dụng làm mẫu vật để tái sinh chồi in vitro trên môi trường cơ bản Murashige-Skoog, 1962 (MS) có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung chất kích thích sinh trưởng (KTST) kinetin (KIN) 0,25 mg/L tạo vvật liệu khởi đầu + Nhân nhanh chồi in vitro Đoạn thân có một mắt lá (dài 1 cm) được tách ra từ chồi của cây in vitro trên môi trường tái sinh được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung benzyladenine (BA) từ 2,0-4,0 mg/L và 0,2 mg/L indolbutỷric acid (IBA) để khảo sát khả năng nhân nhanh chồi in vitro. + Tạo rễ in vitro Chồi in vitro (khoảng 2 cm) được tách ra từ cụm chồi trên môi trường nhân nhanh được cấy trên môi trường cơ bản MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung napthalenacetic acid (NAA), IBA từ 0,1-0,5 mg/L hoặc tổ hợp NAA 0,25 mg/L và IBA từ 0,1-0,5 mg/L để khảo sát khả năng hình hành rễ in vitro. + Đưa cây in vitro ra đất Cây in vitro sinh trưởng trên môi trường tối ưu 30 và 45 ngày tuổi được chuyển ra nhà lưới trồng trên các loại cơ chất: đất cát pha: trấu (1:1) và trấu hun. Phun nước giữ ẩm 2 lần/ngày . Sau 30 ngày và 45 ngày, đánh giá khả năng sống sót và sinh trưởng. Tất cả các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH 5,8 trước khi khử trùng trong nồi hấp vô trùng ở 121 0 C trong 15 phút. Điều kiện nuôi cấy in vitro: nhiệt độ 25±2 0 C, cường độ chiếu sáng 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(40).2010 193 + Xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo Ducan test (p<0,05) bằng chương trình SAS (ver. 6.12). 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Ảnh hưởng của chất KTSTđến khả năng nhân chồi in vitro Kết quả trình bày ở bảng 1 cho thấy, trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,2 mg/L IBA và BA từ 2,0-4,0 mg/L đều kích thích phát sinh chồi in vitro. Nồng độ IBA là 0,2 mg/L và BA tăng dần từ 2,0-3,5 mg/L thì số chồi in vitro cũng tăng theo. Số chồi đạt cao nhất là 15,00 chồi/mẫu trên môi trường có 3,5 mg/L BA và 0,2 mg/L IBA sau 60 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên khi tăng nồng độ BA lên 4,0 mg/L thi ức chế sự phát sinh chồi in vitro (chỉ đạt 10,15 chồi/mẫu). Nghiên cứu của Ning-Zhen Huang và cs (2007) cho thấy, nuôi cấy chồi đỉnh của cây Ba kích in vitro thì hệ số nhân chồi cao nhất chỉ đạt là 6,0 khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/L IBA và 1,0 mg/L BA sau 60 ngày [7]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, môi trường MS có bổ sung 0,2 mg/L IBA và 3,5 mg/L BA rất thích hợp cho việc hình thành chồi in vitro cây Ba kích (xem hình 1A) Bảng 1. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro Chất KTST (mg/L) BA IBA Số chồi/ mẫu Chiều cao chồi (cm) 2,0 0,2 5,00 c 1,95 b 2,5 0,2 12,67 b 2,19 a 3,0 0,2 11,33 b 1,95 b 3,5 0,2 15,00 a 1,97 b 4,0 0,2 10,15 b 1,83 c Chú thích: Các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê p<0,05 3.2. Ảnh hưởng của chất KTST đến khả năng tạo rễ in vitro 3.2.1. Ảnh hưởng của NAA, IBA Kết quả bảng 2 cho thấy, nhìn chung IBA kích thích hình thành rễ in vitro mạnh hơn NAA ở các nồng độ từ 0,1-0,5 mg/L thể hiện qua thời gian cảm ứng hình thành rễ và tỉ lệ mẫu hình thành rễ. Môi trường MS bổ sung NAA từ 0,1-0,5 mg/L đều không kích thích khả năng tạo rễ in vitro sau 30 ngày cấy; sau 45 ngày nuôi cấy mới hình thành rễ và đạt cao nhất là 46,67%. Trong khi đó trên môi trường MS bổ sung IBA từ TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(40).2010 194 0,1-0,5 mg/L thì sự hình thành rễ chỉ sau 30 ngày (đạt 100% tỉ lệ mẫu ra rễ ở nồng độ IBA từ 0,2-0,25 mg/L - xem hình 1B). Tuy nhiên, khi tăng nồng độ cả NAA và IBA lên đến 0,5 mg/L thì ức chế hình thành rễ in vitro. Bảng 2. Ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng tạo rễ in vitro Chất KTST (mg/L) Số chổi ra rễ (%) NAA IBA Sau 30 ngày Sau 45 ngày 0,10 - 0,00 c 33,33 e 0,20 - 0,00 c 40,00 bc 0,25 - 0,00 c 46,67 bc 0,50 - 0,00 c 13,33 de - 0,10 0,00 c 60,00 b - 0,20 100,00 a 100,00 a - 0,25 100,00 a 100,00 a - 0,50 13,33 b 53,33 d Chú thích: Các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê p<0,05 3.2.2. Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA Kết quả nghiên cứu ở bảng 3 cho thấy, bổ sung NAA (0,25 mg/L) và IBA (0,1- 0,5 mg/L) đều kích thích ra rễ in vitro. Sau 30 ngày nuôi cấy, tỉ lệ mẫu ra rễ cao nhất đạt 80% trên môi trường MS có bổ sung 0,25 mg/L NAA và 0,1 mg/L IBA và thấp nhất là 26,67% trên môi trường MS có bổ sung tổ hợp 0,25 mg/L NAA và 0,5 mg/L IBA. Sau 45 ngày cấy, tỉ lệ mẫu ra rễ đều tăng ở các tổ hợp môi trường và đạt cao nhất 100% trên môi trường MS có bổ sung 0,25 mg/L NAA và 0,1 mg/L IBA và thấp nhất là 33,33% trên môi trường MS có bổ sung tổ hợp 0,25 mg/L NAA và 0,5 mg/L IBA. Khi nồng độ IBA lớn hơn 0,1 mg/L thì khả năng hình thành rễ in vitro giảm dần. Nhìn chung môi trường nuôi cấy có bổ sung tổ hợp IBA và NAA thì hiệu quả ra rễ kém hơn nhiều so với môi trường chỉ có IBA (bảng 2). Bảng 3. Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA đến khả năng tạo rễ in vitro Chất KTST (mg/L) Số chổi ra rễ (%) IBA NAA 30 ngày 45 ngày 0,10 0,25 80,00 a 100,00 a 0,20 0,25 53,33 b 60,00 b 0,25 0,25 33,33 c 46,67 c 0,50 0,25 26,67 cd 33,33 cd Chú thích: Các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê p<0,05 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(40).2010 195 3.3. Khả năng sống sót và sinh trưởng của cây in vitro khi đưa ra đất Kết quả bảng 4 cho thấy, nhin chung tỉ lệ sống sót ngoài tự nhiên của cây in vitro 30 ngày tuổi thấp hơn cây in vitro 45 ngày tuổi. Đối với cây in vitro (cả 30 ngày và 45 ngày tuổi), cơ chất đất cát pha là thích hợp nhất cho sự sống sót của chúng; tỉ lệ sống sót lớn nhất (đạt từ 97,9 - 98,90% ). Trong khi đó, các loại cơ chất như đất: trấu và tro trấu thì không thích hợp cho sinh trưởng cây in vitro. Khả năng cây in vitro sống trên hai loại cơ chất này thấp hơn nhiều so với cơ chất là đất cát pha (khả năng sống sót chỉ đạt từ 72,70 - 90,01%). Bảng 4. Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng sống sót của cây in vitro ngoài tự nhiên Tỷ lệ sống sót (%) Cây in vitro Đất cát pha Đất - trấu (1:1) Trấu hun 30 ngày tuổi 97,90 ± 3,18 81,80 ± 4,10 72,70 ± 2,11 45 ngày tuổi 98,90 ± 2,18 90,01 ± 3,15 80,90 ± 1,32 Cây in vitro (30 ngày tuổi) được đem ra trồng ngoài tự nhiên trên 3 loại cơ chất: đất cát pha, trấu - đất (1:1), tro trấu. Đánh giá sự sinh trưởng chiều cao của cây sau 30 và 45 ngày trồng. Kết quả trình bày ở ở bảng 5 cho thấy, cây sinh trưởng tốt trên 2 loại cơ chất là đất cát pha và đất: trấu (1:1), sinh trưởng tốt nhất trên cơ chất đất cát pha (đạt 9,9 cm sau 30 ngày và 15,14 cm sau 45 ngày trồng) - (hình 1C). Cây in vitro sinh trưởng chậm trên cơ chất trấu hun chiều cao cây chỉ đạt 6,88 cm sau 30 ngày và 7,98 cm sau 45 ngày trồng. Bảng 5. Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng sinh trưởng của cây in vitro (30 ngày tuổi) ngoài tự nhiên Chiều cao cây (cm) Thời gian trồng (ngày) Đất cát pha Trấu - đất (1:1) Trấu hun 0 6,04±0,40 6,25±0,42 6,18±0,44 30 9,90±1,08 9,80±1,40 6,88±0,32 45 15,14±1,10 11,50±0,61 7,98±0,34 Hình 1. Nhân in vitro cây Ba kích: A: Cụm chồi sinh trưởng trên môi trường nhân chồi; B: Chồi hình thành rễ in vitro; C: Cây in vitro sinh trưởng ngoài đất B C A TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(40).2010 196 4. Kết luận 1. Môi trường cơ bản MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung 3,5 mg/L BA và 0,2 mg/L IBA thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro cây Ba kích, đạt 15,00 chồi/mẫu sau 60 ngày nuôi cấy. 2. Môi trường cơ bản MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung IBA từ 0,2 - 0,25 mg/L thích hợp cho tạo rễ in vitro cây Ba kích, 100 % số chồi tạo rễ sau 30 ngày nuôi cấy. 3. Cây in vitro (30 ngày tuổi) có khả năng sống sót cao (đạt 97,9 %) và sinh trưởng tốt (chiều cao đạt 15,14 cm) sau 45 ngày trồng trên cơ chất đất cát pha. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Lee, Kui J (2004), “Micropropagation and environmental conditions affecting on in vitro and ex vitro growth of Acorus calamus”, In Vitro Cellular & Developmental Biology, 21-25 [2]. Lin LC, Nalawade SM, Mulabagal V, Yeh MS (2003), “Micropropagation of Polygonum multiflorum Thunb and quantitative analysis of the anthraquinones amodin and physcion formed in in vitro”, Biol Pharm Bull., 26(10):1467-71. [3]. Ning-Zhen Huang, Chuan-Ming Fu, Zhi-Guo Zhao, Feng-Luan Tang, Feng Li (2007), “Tissue culture and rapid proliferation of Morinda officinalis How.”, Botany,Guangxi Zhuangzu Autonomous Region and the Chinese Academy of Sciences,Guilin 541006, China. [4]. Murashige T, Skoog F (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures”, Physiol Plant, 15: 473-497. [5]. Tripathi L, and Tripathi JN (2003), “Role of biotechnology in medicinal plants”, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2( 2): 243-253. [6]. Wei LJ, Lu P and Su WP (2006), “Tissue culture and rapid propagation of Morinda officinalis How.”, Plant Physilogy Comunication, 42 (3), pages 475. [7]. Rout GR, Mahato A, Senapati SK (2007), “In vitro clonal propagation of Nyctanthes arbortristis Linn a medicinal tree”. Hort Sci. (Prague), 34(2): 84-89. . CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(40).2010 191 NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY BA KÍCH (MORINDA OFFICINALIS HOW) STUDY ON THE IN VITRO PROPAGATION OF MORINDA OFFICINALIS. Hình 1. Nhân in vitro cây Ba kích: A: Cụm chồi sinh trưởng trên môi trường nhân chồi; B: Chồi hình thành rễ in vitro; C: Cây in vitro sinh trưởng ngoài đất B C A TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ. BA lên 4,0 mg/L thi ức chế sự phát sinh chồi in vitro (chỉ đạt 10,15 chồi/mẫu). Nghiên cứu của Ning-Zhen Huang và cs (2007) cho thấy, nuôi cấy chồi đỉnh của cây Ba kích in vitro thì hệ số nhân