Đoạn thân khoảng 1cm của cây Ba kích in vitro được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS bổ sung các chất kích sinh trưởng khác nhau cho cảm ứng nhân nhanh chồi.. Tuy nhiên, các loài cây d
Trang 1NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY BA KÍCH
(MORINDA OFFICINALIS HOW)
STUDY ON THE IN VITRO PROPAGATION OF MORINDA OFFICINALIS HOW
Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh Tư
Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng
TÓM TẮT
Cây Ba kích (Morinda officinalis How.) là cây dược liệu quí Do đó, vấn đề bảo tồn loài này rất cần thiết Ở đây, chúng tôi tái sinh chồi in vitro trên môi trường cơ bản MS bổ sung 0,25 mg/L KIN Đoạn thân (khoảng 1cm) của cây Ba kích in vitro được nuôi cấy trên môi trường
cơ bản MS bổ sung các chất kích sinh trưởng khác nhau cho cảm ứng nhân nhanh chồi Số chồi in vitro đạt lớn nhất trên môi trường cơ bản MS bổ sung 3,5 mg/L BA + 0,2 mg/L IBA (với 15,00 chồi/mẫu cấy) Chồi được tạo rễ trên môi trường MS bổ sung IBA hoặc NAA, hình thành
rễ tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 0,2-0,25 mg/L IBA Cây in vitro đưa ra nhà lưới, 97,9% cây sống và thích nghi với điều kiện tự nhiên
ABSTRACT
Morinda officinalis How is a valuable medicinal herb Therefore, the conservation of this plant is a necessity In this study, we regenerated in vitro shoots in the basal MS medium supplemented with 0.25 mg/L KIN The stem segments of in vitro Morinda officinalis How (about 1 cm in length each) were cultured in the basal MS medium supplemented with different growth regulators for multiple shoot induction A maximum number of in vitro shoots were obtained in the medium containing 3.5 mg/L BA and 0.2 mg/L IBA (15.00 shoots/a sample) The shoots were rooted in the basal MS medium supplemented with IBA or NAA and best rooted in the medium containing 0.2- 0.25 mg/L IBA In vitro plantlets acclimatized themselves in green houses and the transplants were adapted to natural conditions, with a survival of 97.9%
1 Đặt vấn đề
Hiện nay, nhu cầu của con người về nguồn dược liệu ngày càng tăng Nguồn dược liệu con người đang sử dụng có thể được tổng hợp bằng nhiều con đường khác nhau như tổng hợp hóa học, tổng hợp từ vi sinh vật, song nguồn dược liệu từ thực vật đã được con người sử dụng từ lâu và nhu cầu ngày càng lớn [5] Tuy nhiên, các loài cây dược liệu trong tự nhiên đang bị giảm về số lượng và chất lượng bởi sự khai thác quá mức; các điều kiện ngày càng bất lợi của môi trường tự nhiên,… dẫn đến nhiều loài cây dược liệu quý hiếm bị tuyệt chủng, ảnh hưởng đến nguồn cung cấp dược liệu bền vững cho con người
Cây Ba kích (Morinda officinalis How.) được sử dụng rộng rãi như một loại dược liệu quý có tác dụng bổ thận âm, bổ thận dương, tăng cường gân cốt, khử phong thấp [3] Dịch chiết cồn từ củ cây Ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh
Trang 2đối với các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp ăn và ngủ ngon [6] Ngày nay, nhu cầu sử dụng loài cây này làm dược liệu đang gia tăng nên nó bị khai thác kiệt quệ Mặt khác, vùng phân bố của Ba kích bị tàn phá nghiêm trọng khiến loài cây này lâm vào tình trạng gần như tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần phải được bảo vệ Nguồn cung cấp cây giống Ba kích hiện nay chủ yếu bằng phương pháp giâm cành nhưng hệ số nhân rất thấp (chỉ đạt 0,61/năm); chất lượng giống lại không cao Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả nhân nhanh giống cây Ba kích bàng kỹ thuật in vitro, nhằm đáp ứng nhanh và bền vững nguồn cây giống có chất lượng tốt
2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1 Nguyên liệu nghiên cứu
Chúng tôi sử dụng đoạn thân (1,0-1,5 cm) có mắt lá của cây Ba kích (Morinda officinalis How.) 1 năm tuổi lấy từ huyện Tây Giang (Quảng Nam) làm nguyên liệu thực nghiệm
2.2 Phương pháp nghiên cứu
+ Tạo nguyên liệu khởi đầu
Đoạn thân (có mắt lá) được rửa dưới vòi nước chảy, ngâm dung dịch thuốc diệt nấm (0,3%) khoảng 15 phút sau đó khử trùng bằng cồn 700 trong 60 giây, HgCl2 0,1% trong 7 phút, rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng khoảng 3 lần Mẫu vô trùng được sử dụng làm mẫu vật để tái sinh chồi in vitro trên môi trường cơ bản Murashige-Skoog,
1962 (MS) có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung chất kích thích sinh trưởng (KTST) kinetin (KIN) 0,25 mg/L tạo vvật liệu khởi đầu
+ Nhân nhanh chồi in vitro
Đoạn thân có một mắt lá (dài 1 cm) được tách ra từ chồi của cây in vitro trên môi trường tái sinh được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung benzyladenine (BA) từ 2,0-4,0 mg/L và 0,2 mg/L indolbutỷric acid (IBA)
để khảo sát khả năng nhân nhanh chồi in vitro
+ Tạo rễ in vitro
Chồi in vitro (khoảng 2 cm) được tách ra từ cụm chồi trên môi trường nhân nhanh được cấy trên môi trường cơ bản MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung napthalenacetic acid (NAA), IBA từ 0,1-0,5 mg/L hoặc tổ hợp NAA 0,25 mg/L và IBA
từ 0,1-0,5 mg/L để khảo sát khả năng hình hành rễ in vitro
+ Đưa cây in vitro ra đất
Cây in vitro sinh trưởng trên môi trường tối ưu 30 và 45 ngày tuổi được chuyển
ra nhà lưới trồng trên các loại cơ chất: đất cát pha: trấu (1:1) và trấu hun Phun nước giữ
ẩm 2 lần/ngày Sau 30 ngày và 45 ngày, đánh giá khả năng sống sót và sinh trưởng
Tất cả các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH 5,8 trước khi khử trùng trong nồi hấp vô trùng ở 1210C trong 15 phút Điều kiện nuôi cấy in vitro: nhiệt độ
25±20 C, cường độ chiếu sáng 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày
Trang 3+ Xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần Số liệu thực nghiệm được xử lý thống
kê theo Ducan test (p<0,05) bằng chương trình SAS (ver 6.12)
3 Kết quả và thảo luận
3.1 Ảnh hưởng của chất KTSTđến khả năng nhân chồi in vitro
Kết quả trình bày ở bảng 1 cho thấy, trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,2 mg/L IBA và BA từ 2,0-4,0 mg/L đều kích thích phát sinh chồi in vitro Nồng độ IBA là 0,2 mg/L và BA tăng dần từ 2,0-3,5 mg/L thì số chồi in vitro cũng tăng theo Số chồi đạt cao nhất là 15,00 chồi/mẫu trên môi trường có 3,5 mg/L BA và 0,2 mg/L IBA sau
60 ngày nuôi cấy Tuy nhiên khi tăng nồng độ BA lên 4,0 mg/L thi ức chế sự phát sinh chồi in vitro (chỉ đạt 10,15 chồi/mẫu) Nghiên cứu của Ning-Zhen Huang và cs (2007) cho thấy, nuôi cấy chồi đỉnh của cây Ba kích in vitro thì hệ số nhân chồi cao nhất chỉ đạt là 6,0 khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/L IBA và 1,0 mg/L BA sau
60 ngày [7] Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, môi trường MS có bổ sung 0,2 mg/L IBA và 3,5 mg/L BA rất thích hợp cho việc hình thành chồi in vitro cây Ba kích (xem hình 1A)
Bảng 1 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro
Chất KTST (mg/L)
BA IBA
Số chồi/
mẫu
Chiều cao chồi (cm)
Chú thích: Các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê p<0,05
3.2 Ảnh hưởng của chất KTST đến khả năng tạo rễ in vitro
3.2.1 Ảnh hưởng của NAA, IBA
Kết quả bảng 2 cho thấy, nhìn chung IBA kích thích hình thành rễ in vitro mạnh hơn NAA ở các nồng độ từ 0,1-0,5 mg/L thể hiện qua thời gian cảm ứng hình thành rễ
và tỉ lệ mẫu hình thành rễ Môi trường MS bổ sung NAA từ 0,1-0,5 mg/L đều không kích thích khả năng tạo rễ in vitro sau 30 ngày cấy; sau 45 ngày nuôi cấy mới hình thành rễ và đạt cao nhất là 46,67% Trong khi đó trên môi trường MS bổ sung IBA từ
Trang 40,1-0,5 mg/L thì sự hình thành rễ chỉ sau 30 ngày (đạt 100% tỉ lệ mẫu ra rễ ở nồng độ IBA từ 0,2-0,25 mg/L - xem hình 1B) Tuy nhiên, khi tăng nồng độ cả NAA và IBA lên đến 0,5 mg/L thì ức chế hình thành rễ in vitro
Bảng 2 Ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng tạo rễ in vitro
Chú thích: Các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê p<0,05 3.2.2 Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3 cho thấy, bổ sung NAA (0,25 mg/L) và IBA (0,1- 0,5 mg/L) đều kích thích ra rễ in vitro Sau 30 ngày nuôi cấy, tỉ lệ mẫu ra rễ cao nhất đạt 80% trên môi trường MS có bổ sung 0,25 mg/L NAA và 0,1 mg/L IBA và thấp nhất là 26,67% trên môi trường MS có bổ sung tổ hợp 0,25 mg/L NAA và 0,5 mg/L IBA Sau
45 ngày cấy, tỉ lệ mẫu ra rễ đều tăng ở các tổ hợp môi trường và đạt cao nhất 100% trên môi trường MS có bổ sung 0,25 mg/L NAA và 0,1 mg/L IBA và thấp nhất là 33,33% trên môi trường MS có bổ sung tổ hợp 0,25 mg/L NAA và 0,5 mg/L IBA Khi nồng độ IBA lớn hơn 0,1 mg/L thì khả năng hình thành rễ in vitro giảm dần Nhìn chung môi trường nuôi cấy có bổ sung tổ hợp IBA và NAA thì hiệu quả ra rễ kém hơn nhiều so với môi trường chỉ có IBA (bảng 2)
Bảng 3 Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA đến khả năng tạo rễ in vitro
Chất KTST (mg/L) Số chổi ra rễ (%)
Chú thích: Các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê p<0,05
Trang 53.3 Khả năng sống sót và sinh trưởng của cây in vitro khi đưa ra đất
Kết quả bảng 4 cho thấy, nhin chung tỉ lệ sống sót ngoài tự nhiên của cây in vitro 30 ngày tuổi thấp hơn cây in vitro 45 ngày tuổi Đối với cây in vitro (cả 30 ngày và
45 ngày tuổi), cơ chất đất cát pha là thích hợp nhất cho sự sống sót của chúng; tỉ lệ sống sót lớn nhất (đạt từ 97,9 - 98,90% ) Trong khi đó, các loại cơ chất như đất: trấu và tro trấu thì không thích hợp cho sinh trưởng cây in vitro Khả năng cây in vitro sống trên hai loại cơ chất này thấp hơn nhiều so với cơ chất là đất cát pha (khả năng sống sót chỉ đạt từ 72,70 - 90,01%)
Bảng 4 Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng sống sót của cây in vitro ngoài tự nhiên
Tỷ lệ sống sót (%) Cây in vitro
Đất cát pha Đất - trấu (1:1) Trấu hun
30 ngày tuổi 97,90 ± 3,18 81,80 ± 4,10 72,70 ± 2,11
45 ngày tuổi 98,90 ± 2,18 90,01 ± 3,15 80,90 ± 1,32
Cây in vitro (30 ngày tuổi) được đem ra trồng ngoài tự nhiên trên 3 loại cơ chất: đất cát pha, trấu - đất (1:1), tro trấu Đánh giá sự sinh trưởng chiều cao của cây sau 30
và 45 ngày trồng Kết quả trình bày ở ở bảng 5 cho thấy, cây sinh trưởng tốt trên 2 loại
cơ chất là đất cát pha và đất: trấu (1:1), sinh trưởng tốt nhất trên cơ chất đất cát pha (đạt 9,9 cm sau 30 ngày và 15,14 cm sau 45 ngày trồng) - (hình 1C) Cây in vitro sinh trưởng chậm trên cơ chất trấu hun chiều cao cây chỉ đạt 6,88 cm sau 30 ngày và 7,98 cm sau 45 ngày trồng
Bảng 5 Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng sinh trưởng của
cây in vitro (30 ngày tuổi) ngoài tự nhiên
Chiều cao cây (cm) Thời gian
trồng (ngày) Đất cát pha Trấu - đất (1:1) Trấu hun
Hình 1 Nhân in vitro cây Ba kích: A: Cụm chồi sinh trưởng trên môi trường nhân chồi;
B: Chồi hình thành rễ in vitro; C: Cây in vitro sinh trưởng ngoài đất
A
Trang 64 Kết luận
1 Môi trường cơ bản MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung 3,5 mg/L BA và 0,2 mg/L IBA thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro cây Ba kích, đạt 15,00 chồi/mẫu sau 60 ngày nuôi cấy
2 Môi trường cơ bản MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung IBA từ 0,2 - 0,25 mg/L thích hợp cho tạo rễ in vitro cây Ba kích, 100 % số chồi tạo rễ sau 30 ngày nuôi cấy
3 Cây in vitro (30 ngày tuổi) có khả năng sống sót cao (đạt 97,9 %) và sinh trưởng tốt (chiều cao đạt 15,14 cm) sau 45 ngày trồng trên cơ chất đất cát pha
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Lee, Kui J (2004), “Micropropagation and environmental conditions affecting on in
vitro and ex vitro growth of Acorus calamus”, In Vitro Cellular & Developmental Biology, 21-25
[2] Lin LC, Nalawade SM, Mulabagal V, Yeh MS (2003), “Micropropagation of
Polygonum multiflorum Thunb and quantitative analysis of the anthraquinones amodin and physcion formed in in vitro”, Biol Pharm Bull., 26(10):1467-71
[3] Ning-Zhen Huang, Chuan-Ming Fu, Zhi-Guo Zhao, Feng-Luan Tang, Feng Li (2007), “Tissue culture and rapid proliferation of Morinda officinalis How.”,
Botany,Guangxi Zhuangzu Autonomous Region and the Chinese Academy of
Sciences,Guilin 541006, China
[4] Murashige T, Skoog F (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue cultures”, Physiol Plant, 15: 473-497
[5] Tripathi L, and Tripathi JN (2003), “Role of biotechnology in medicinal plants”,
Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2( 2): 243-253
[6] Wei LJ, Lu P and Su WP (2006), “Tissue culture and rapid propagation of Morinda
officinalis How.”, Plant Physilogy Comunication, 42 (3), pages 475
[7] Rout GR, Mahato A, Senapati SK (2007), “In vitro clonal propagation of
Nyctanthes arbortristis Linn.- a medicinal tree” Hort Sci (Prague), 34(2): 84-89
