HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN HESPERIDIN

HESPERIDIN, cây cỏ mực, phương pháp nghiên cứu hiện đại người ta đã xác định được thành phần hóa học của cỏ Mực, Hesperidin là một hợp chất flavonoid, Phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế hesperidin, Định tính, định lượng Hesperidin, Phổ UV, Phổ khối MS, Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR, Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13CNMR, Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết

A MỞ ĐẦU

Trong y học cổ truyền Việt Nam, cây cỏ mực hay còn gọi là cây Cỏ nhọ nồi, hạn liên thảo, mặc hạn liên, kim lăng thảo là loại cây có nhiều ứng dụng quan trọng trong việc chữa bệnh, được dùng để điều trị các bệnh như: nôn ra máu từ dạ dày, chảy máu cam, tiểu ra máu, xuất huyết tử cung, viêm gan mãn tính, viêm ruột, lỵ, trẻ em suy dinh dưỡng, ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược thần kinh, nấm da, ezecma, vết loét, bị thương, chảy máu, viêm da Ngoài ra Cỏ mực còn được dùng làm thuốc sát trùng trong bệnh ho lao, viêm cổ họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau dạ dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng tóc, là thuốc cầm máu hữu hiệu nhất

Cây cỏ mực có tên khoa học là Eclipta prostrata L (syn Eclipta alba L.), thuộc họ Cúc (Asteraceae), là loại cây thân thảo hằng niên, cao từ 10-60 cm, mọc bò hoặc có khi gần như thẳng đứng, có lông trắng, cứng, thưa Thân màu lục hay màu nâu nhạt hay hơi đỏ tía Lá mọc đối, phiến lá dài và hẹp cỡ 2,5 x 1,2 cm Mép lá nguyên hay có răng cưa cạn, hai mặt đều có lông Hoa trắng tập hợp thành đầu ở nách lá hay đầu cành, các hoa cái hình lưỡi ở ngoài, các hoa lưỡng tính hình ống ở giữa Quả bế dẹt

có 3 cạnh, có cánh dài 3 mm Vùng phân bố của cây Cỏ mực trên thế giới khá rộng vì

nó là loài cây nhiệt đới, mọc hoang ở chỗ ẩm mát [1]

Dựa vào các phương pháp nghiên cứu hiện đại người ta đã xác định được thành phần hóa học của cỏ Mực gồm: β-Sitosterol, Metyl gallat, Eclalbasaponin I, Eclalbasaponin II, Norwedelolactone, Hesperidin (Hespentin 7-O-rutinosid) Trong đó, Hesperidin (Hespentin 7-O-rutinosid) là chất đáng được đề cập đến; bởi lẽ Hesperidin (Hespentin 7-O-rutinosid) thường xuất hiện ở các loại cây có múi như: cam, quýt,… và

có nhiều ứng dụng trong y học hiện nay…[4]

B NỘI DUNG

1 Hợp chất Hesperidin

Hesperidin [1] là một hợp chất flavonoid chủ yếu trong vỏ quả cây họ Cam (Citrus

Rutaceae) được Lebrton tách chiết vào năm 1827 từ vỏ quả cây Hesperides, sau đó nó

được tìm thấy trong rất nhiều cây họ Cam (họ Cửu lý hương) [5], [8] Hesperidin có công thức phân tử: C28H34O15 Khối lượng phân tử: 610,56 Công thức cấu tạo của Hesperidin như sau:

Hình 1: Cấu trúc của Hesperidin Tên khoa học: (2S)-7-[[6-O-(6-Deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D- glucopyranosyl] oxy]-2,3-dihydro-5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one Tên khác: hesperetin 7-rhamnoglucoside; cirantin; hesperetin-7-rutinoside

Theo cấu trúc phân tử hesperidin thuộc về nhóm flavanone Phân tử hesperidin gồm một phân tử aglycone hesperetin (12) liên kết với một phân tử disaccharid (rutinose)

Do đó có thể coi hesperidin là dẫn xuất β-7-rutinoside của hesperetin Rutinose (6-O-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-D-glucose) là một disaccharid tạo nên bởi một phân tử rhamnose và một phân tử glucose bằng liên kết α-1,6 Trong phân tử hesperidin, glucose gắn với hesperetin còn rhamnose gắn với phân tử glucose.[6], [7]

Khi thủy phân hesperidin bằng kiềm thu được phloroglucinol và hesperetenic axít [8] Khi thủy phân hesperidin bằng axít thu được hesperetin, D-glucose, L-rhamnose

2

Hesperidin là bột màu trắng hay nâu nhạt, không mùi, không vị Khó tan trong nước (1 gam trong 50 lít nước) Tan trong formamid, DMF ở 60oC Tan ít trong metanol, axít axetic nóng Hầu như không tan trong acetone, benzene, chloroform Tan tự do trong kiềm loãng, pyridine tạo ra một dung dịch có màu vàng sáng.[12]

Nhiệt độ nóng chảy: 258-262 °C

Độ quay cực: [α]D20 = -76° (c = 2 trong pyridine)

Tác dụng chữa bệnh của hesperidin được các nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm trong hai thập kỷ vừa qua và đã có một số lượng lớn ấn phẩm được công bố về ứng dụng hesperidin trong điều trị bệnh.[6], [11]

Hesperidin cũng như các flavonoid khác có tác dụng kháng viêm, chống ôxy hóa, chống dị ứng, chống ung thư Hesperidin có tác dụng làm bền thành mạch và giảm tính thấm của mao mạch nên được sử dụng trong điều trị bệnh cao huyết áp và bệnh trĩ Tác dụng chữa ho của hesperidin là do khả năng chống dị ứng nhờ tính chất ức chế việc giải phóng histamine từ các tế bào lớn Hesperidin khi dùng phối hợp với vitamin C có tác dụng cộng hưởng và hỗ trợ hấp thụ vitamin C

2 Phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế hesperidin

Các hợp chất flavonoid là các polyphenol nên trong môi trường kiềm chúng chuyển thành dạng polyphenolat có khả năng tan trong nước Với hesperidin thì ngoài việc chuyển thành dạng polyphenolat nó còn chuyển thành dạng hesperidin chalcone [7], [10] Các dẫn xuất này có khả năng chuyển đổi thuận nghịch thành hesperidin [9] theo

sơ đồ sau:

Hình 2 Hesperidin chuyển sang các dạng dẫn xuất của nó.

Theo cô Nguyễn Ngọc Hạnh, quá trình chiết citroflavanoid có thể tiến hành theo sơ

đồ sau:

Hình 3: Sơ đồ điều chế Citroflavonoid Ngoài cách chiết, cô lập trên, ngày nay người ta sản xuất Hesperidin dựa trên các tiến bộ khoa học kỹ thật dựa theo sơ đồ sau:

4

Hình 4 Sơ đồ công nghệ sản xuất Hesperidin Hay cụ thể hơn là sơ đồ quy trình sau:

Hình 5: Quy trình tách chiết Hesperidin Quy trình công nghệ tách, chiết Hesperidin từ các nguyên liệu chứa Hesperidin bao gồm các công đoạn sau: [2],[3]

• Nghiền nguyên liệu chứa Hesperidin:

Các nguyên liệu chứa Hesperidin được nghiền với máy nghiền cỡ sàng 3mm đảm bảo sau khi chiết có thể loại bỏ bã dễ dàng mà vẫn đảm bảo hiệu suất cũng như năng suất của quá trình chiết;

• Chiết Flavanoit toàn phần bằng dung dịch kiềm

Công đoạn này được thực hiện trong thiết bị có khuấy hoặc bơm tuần hoàn với các điều kiện sau:

- Tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu là: 4/1 – 6/1 (TT/KL);

- pH của hỗn hợp chiết: 11- 12;

- Nhiệt độ chiết: 30- 400C;

6

- Thời gian chiết: 2 giờ.

Sau khi kết thúc giai đoạn chiết sẽ lọc bỏ bã và tạp chất không tan, thu được dịch lọc Điều chình pH của dịch lọc này về giá trị 4- 5 để kết tinh flavonoid trong 24 giờ Sau 24 giờ đem lọc, rửa bằng nước 5 lần Sau đó sấy ở 60oC trong 8 giờ thu được flavonoid toàn phần Lọc thu Flavanoit toàn phần

• Chiết Hesperidin ra khỏi hỗn hợp Flavanoit toàn phần:

Do hesperidin hầu như không tan trong acetone, benzene, chloroform nên chung tôi tiến hành tách hesperidin ra khỏi hỗn hợp flavonoid toàn phần như sau: Flavonoid toàn phần thu được ở trên được đem chiết rắn – lỏng bằng axêton 3 lần, sau đó chiết bằng etyl axetat với tỷ lệ rắn/lỏng: 1/5 (TT/KL) Thời gian mỗi lần chiết là 0,5 giờ, sẽ thu được hesperidin thô

• Tinh chế sản phẩm:

Hòa tan Hesperidin thô trong metanol ở nhiệt độ sôi với tỷ lệ Hesperidin/metanol 1/200 (TT/KL): Lọc dung dịch thu được qua giấy lọc để loại bỏ tạp chất không tan; chỉnh nồng dộ dung môi về 85% bằng nước; để kết tinh ở 250C trong 24 giờ; lọc tinh thể Hesperidin, rửa lại bằng metanol Sau đó sấy sản phẩm ở 600C trong 8 giờ

3 Định tính, định lượng Hesperidin

Hesperidin thành phẩm thu được được phân tích bằng các phương pháp phân tích hóa lý như: đo điểm chảy, IR, LC-MS H1-NMR, C13-NMR, HPLC … để xác định cấu trúc, hàm lượng

Sau đây là kết quả của việc phân tích bằng các phương pháp:

• Sản phẩm hesperidin có nhiệt độ nóng chẩy : 252 – 261oC

• Phổ UV của sản phẩm [3]

Trên phổ đồ có các số sóng đặc trưng ở 2925 cm-1 là dao động của liên kết CH Pick đặc trưng với cường độ cao nằm ở số sóng 3473 cm-1 là của nhóm OH Pick 1647 là của nhóm C=O Pick 1606 là dao động của liên kết C=C trong vòng thơm Pick 1130 -1195 cm-1 là số sóng đặc trưng của nhóm chức C-O

Hình 6: Phổ đồ UV của Hesperidin

• Phổ khối MS của hesperidin [3]

Phổ MS của hesperidin được ghi cả ở chế độ ion âm (negative mode) và dương (positive mode) Phổ MS của hesperidin ghi ở dạng negative mode có các pic đặc trưng tương ứng với số m/z của các ion: [M-H]- = 609, ion tạo thành do mất một đơn vị rhamnose có [M-H-146]- = 463, mất tiếp một đơn vị glucô có [M-H-146-162]- = 301 Ở chế độ ion dương phổ MS tương ứng có [M+H]+ = 611, ion tạo thành do mất một đơn

vị rhamnose có [M+H-146]+ = 465, mất tiếp một đơn vị glucô có [M+H-146-162]+ =

303 và một pic đặc thù cho lớp chất này hình thành do sự chuyển vị nội phân tử của ion [M+H]+ tạo thành ion [M+H-162]+ = 449 do mất một đơn vị glucô

8

Hình 7: Sơ đồ phân mảnh của hesperidin

• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR của hesperidin [3]

Phổ1H-NMR của hesperidin được ghi ở 500 MHz trong DMSO có: δ: 12,0 (1H,

s, 5-OH); 9,09 (1H, s, 3’-OH); 6,93 (3x1H, m, H-2’, H-5’và H-6’); 6,14 và

6,12 (2x1H, j= 2,1 Hz, H-6 và H-8); 5,51 (1H, t, j=3,1Hz, H-2); 5,49 (1H, d, H-1, Gl); 5,16 (1H, d, H-1, Rh); 3,791, (3H, m, OCH3); 3,634, 3,301 (2H, m, H-6, Gl); 3,55 (2x1H, m, H-5, Rh, H-5, Gl); 3,44 (4x1H, m, OH, Gl và Rh) 3,386, 3,132 (2x1H, H-3); 1,09 (3H, d, H-6, Rh).

Kết quả trên hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu đã công bố [13]

Qua dữ liệu phổ cho thấy có 1 nhóm OH ở vị trí C5 và 1 nhóm OH ở vị trí C5’ Ở

vị trí C2 chỉ có 1 proton còn ở vị trí 3 có 2 proton

• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR của hesperidin [3]

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân13C-NMR của hesperidin được ghi trong dung môi DMSO (phụ luc 4) có: δ: 197,0 (s, C=O), 165,146 (s, C-7), 163,039 (s, C-5), 162,499 (s, C-9), 147,98 (s, C-4’), 146,459 (s, C-3’), 130,914 (s, C-1’), 117,964 (d, C-6’), 114,147 (d, C-2’), 112,085 (d, C-5’), 103,338 (d, C-10), 100,597 (d, C-1, Rh), 99,482 (d, C-1, Gl), 96,4 (d, C-6), 95,571 (d, C-8), 78,374 (d, C-2), 76,277 (d, C-3, Gl), 75,539 (d, C-4, Gl), 72,999, d, C-2, Gl), 72,089 (d, C-4, Rh), 70,715 (d, C-3, Rh), 70,276 (d, C-2, Rh), 69,62 (d, C-5, Gl), 68,319 (d, C-5, Rh), 66,035 (t, C-6, Gl), 55,717 (C-11, 4’-O-CH3), 42,05 (t, C-3), 17,820 (CH3,Rh)

Các dữ kiện phổ 13C-NMR còn chứng minh sự tồn tại của đồng phân epime 2R củahesperidin (epime 2S) Các epime này trong thực tế không khác biệt nhiều về các

dữ kiện phổ 1H-NMR [9], tuy nhiên sự phân tích kỹ lưỡng các tín hiệu phổ cacbon 13 cho thấy một số tín hiệu xuất hiện ở dạng kép (doublet) cho phép nhận dạng sự tồn tại

của epime 2R đặc biệt là các tín hiệu cộng hưởng ở vòng B [δC 112,1 (d, C-5’), 114,1

(d, C-2’), 117,8 (d, C-6’), 130,96 (s, C-1’), 146,48 (C-3’) v 147,98 (s, C-4’)], các tín

hiệu ở vòng A [δC 162,5 (s, C-9), 163,0 (s, C-5) và 165,1 (s, C-7)] và một số tín hiệu

của các nhóm đường [δC 66,07 (t, C-6”), 69,7 (d, C-2”), 73,0 (d, C-4”), 99,5 (d, C-1”)]

Sự xuất hiện của các chất chuyển hóa thứ cấp trong thiên nhiên thường được cho là theo các con đường đặc thù về lập thể và sự tham gia của các enzym trong các bước của con đường sinh tổng hợp Tuy nhiên các đồng phân lập thể vẫn có thể cũng xuất

hiện như ví dụ về các đồng phân epimeric 2R và 2S của các flavanon do l sản phẩm

phụ của các qua trình gây bởi các enzym nhất định và cần có các phương pháp để nhận

biết các chất này Trong trường hợp của Hesperidin (dạng 2S) và epime 2R F Maltese

sử dụng phổ 1H-NMR để nhận biết giữa 2 đồng phân epime này [9 Phổ 13C-NMR đã

được xác định trong trường hợp của Hesperidin (epime 2S) l phương pháp nhanh để nhận biết chất này và epime 2R của nó [13]

Với các dữ liệu phân tích IR, UV, MS,1H-NMR và13C-NMR cho phép kết luận chất chiết được là hesperidin

10

4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết [3]

• Ảnh hưởng của pH dung môi chiết

Quá trình chiết flavonit toàn phần tốt nhất nên tiến hành ở pH trong khoảng 11 –

12 Ở pH thấp hơn hiệu suất chiết flavonoid toàn phần cũng như hiệu suất hesperidin thu được thấp Điều này phù hợp với lý thuyết vì các ion phenolat và polyphenolat được bền hóa tốt nhất ở pH > 10 Khi tiến hành chiết ở pH cao hơn mặc dù lượng flavonoid toàn phần cao hơn, nhưng hiệu suất hesperidin thu được giảm Kết quả này

có lẽ là do sự thoái biến của các phân tử flavonoid glycoside bởi phản ứng thủy phân một phần hoặc hoàn toàn nửa đường tạo ra dạng aglycone flavonoid

Tóm lại, quá trình tách chiết tốt nhất thực hiện ở pH = 11-12

• Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết

Tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu cần được duy trì vừa đủ để có thể khấy trộn được hỗn hợp chiết một cách hiệu quả Lượng dung môi sử dụng càng nhiều thì hiệu suất chiết sẽ càng giảm do sự hòa tan một lượng nhỏ hesperidin trong nước Từ các nghiên cứu thực nghiệm, người ta nhận thấy tỷ lệ dung môi chiết được khống chế trong khoảng từ 4/1 (TT/KL) đến 6/1 là đủ để khuấy trộn được hỗn hợp Ở tỷ lệ dung môi / nguyên liệu nhỏ hơn 3/1 thì chưa đủ dung môi để có thể khấy trộn hỗn hợp chiết

vì vậy mà làm giảm khả năng phân tán, tương tác giữa các phân tử flavonoid với các ion kim loại kiềm để chuyển hóa chúng thành dạng tan nên hiệu suất chiết giảm

• Ảnh hưởng của nhiệt độ

Quá trình chiết nên được tiến hành ở nhiệt độ từ 30 – 40oC Khi tăng nhiệt độ cao hơn không chỉ hiệu suất chiết hesperidin giảm mà còn rất khó lọc flavonoid toàn phần

ra khỏi dung dịch sau khi kết tinh có lẽ do nhiệt độ cao thúc đẩy quá trình hòa tan các hợp chất pectin vào nước Hơn nữa, ở nhiệt độ cao trong môi trường kiềm (pH = 11-12) sẽ thúc đẩy quá trình thủy phân, phân hủy các hợp chất flavonoid không những làm giảm hiệu suất thu hồi hesperidin mà còn gây khó khăn cho quá trình tinh chế sản phẩm Do đó nhiệt độ của quá trình chiết nên được duy trì ở 30 – 40oC

C KẾT LUẬN

Với việc áp dụng các kỹ thuật phân tích hiện đại và các phương pháp kiểm nghiệm kết quả cao như: IR, LC-MS, 1H-NMR,13C-NMR…, ta đã tách, chiết thành công Hesperidin từ cây cỏ mực (hoặc các nguyên liệu có chứa Hesperidin), đã xác định được cấu trúc của Hesperidin, cũng như các tính chất cơ bản của Hesperidin… Đặc biệt, sản phẩm Hesperidin được sản xuất theo quy trình công nghệ đã được giới thiệu trên hoàn toàn đạt tiêu chuẩn làm nguyên liệu sản xuất thuốc với các chỉ tiêu cơ bản sau: Hàm lượng Hesperidin 94,5%; pH: 5,55; Mất khối lượng do sấy 1,67%; Kim loại nặng: < 20 ppm; Arsen< 1 ppm; Tro sunfat 0,04%; góp phần không nhỏ trong việc kết hợp làm thuốc chữa bệnh và đặt nền móng cho sự phát triển của ngành dược liệu của quốc gia nói riêng và thế giới nói chung

12

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

[1 Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Thành phố Hồ Chí Minh

[2] Nguyễn Văn Chính (2010) “Công nghệ sản xuất Hesperidin”, Tạp chí CN Hóa chất

[3] Ths Nguyễn Văn Chính; đề tài: “Nghiên cứu quy trình tách chiết Hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc”; 2008

[4] Nguyễn Thị Thơi “Nghiên cứu thành phần hóa học cây cỏ mực (Eclipta Prostrata L., Asteraceae) ”, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Hóa học, Luận văn Thạc sĩ ngành: Hóa hữu cơ, 2011

Tiếng Anh

[5] A Di Mauro, B Fallico, A Passerini, P Rapisarda, E Maccarone; JAgric Recovery of hesperidin from orange peel by concentration of extracts on styrene-divinylbenzene resin Food Chem 1999; 47(10):4391-7

[6] A Garg, S Garg, L J D Zaneveld and A K Singla; Chemistry and

Pharmacology of The Citrus Bioflavonoid Hesperidin Phytother Res 15, 655–669

(2001)

[7].Erich Grotewold; The Science of Flavonoids; Springer Science and Business Media, Inc 2006 1-123

[8] F I Kanaze , C Gabrieli , E Kokkalou , M Georgarakis , I Niopas; Simultaneous reversed-phase high-performance chromatographic method for the determination of diosmin,hesperidin and naringin in different citrus fruit juices and pharmaceutical formulations J Pharm Biomed Anal 2003 Sep 19;33(2):243-249 [9] H Scarborough Observation on nature of vitamin P and the vitamin P potency

of certain Foodstuffs The Nature, vol 39, London (1945), ps 271-278