Nội dung chính của công nghệ tế bào là công nghệ nuôi cấy mô - tế bào. pptx

Các kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật Nuôi cấy mô-tế bào thực vật - công nghệ hiện đại trong nhân giống vô tính ở thực vật Mục đích chung của nuôi cấy mô M- tế bào thực vật là sử d

Nội dung chính của công nghệ tế bào là công nghệ nuôi cấy mô - tế bào

1 Nguyên tắc của phương pháp nuôi cấy

mô - tế bào

Nuôi cấy mô - tế bào dựa trên hai nguyên tắc sau:

1.1 Tính toàn năng của tế bào:

Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lưMợng thông tin

di truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi

Năm 1922N, đã nuôi được đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo trong 12

ngày Như vậy, lần đầu tiên tính toàn năng của tế bào được chứng minh bằng thực

nghiệm Sau 43 năm (năm 1965n), đã nuôi từng tế bào riêng biệt của cây thuốc lá và tạo được cây thuốc lá hoàn chỉnh trong ống

nghiệm Kết qủa này chứng minh đầy đủ tính toàn năng của tế bảo

1.2 Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào

Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái

tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức

năng nào đó

Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ tế bào phôi Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và qúa trình đó gọi là qúa trình phản biệt hóa

Trong cùng một cơ thể, mỗi loại tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt hóa và vì thế

triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác

nhau Những tế bào càng chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy ra qúa trình phản biệt hóa, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật, tế bào thần kinh động vật Người ta đã tổng kết rằng; những tế bào càng gần với

trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các tế bào của

cơ quan sinh sản (hạt phấn, noãn) rất dễ xẩy

ra qúa trình phản biệt hóa Vì vậy nói một cách hình tượng như Galson (1986) và Murashige (1974) thì khả năng hình thành cơ quan hay

cơ thể của các tế bào thực vật là giảm dần theo chiều hướng từ ngọn xuống gốc

Các tế bào động vật nói chung khó nuôi cấy hơn do chúng đã được biệt hóa qúa sâu sắc

và vì thế qúa trình ngược lại (phản biệt hóa) rất khó thực hiện

2 Các kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật

Nuôi cấy mô-tế bào thực vật - công nghệ hiện đại trong nhân giống vô tính ở thực vật

Mục đích chung của nuôi cấy mô M- tế bào thực vật là sử dụng các điều kiện như: nhiệt

độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hoà sinh trưởng thực vật… để điều khiển qúa trình sinh trưởng và phát triển của

tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu đặt ra

Trong mấy thập kỷ qua công nghệ nuôi cấy

mô tế bào thực vật đã phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học Nhờ áp dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh, mô sẹo… con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên và tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản

xuất ở quy mô lớn Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào đã duy trì và bào quản đ-ược nhiều giống cây trồng qúy hiếm hoặc loại

bỏ được nhiều mầm bệnh (phục tráng giống) Mặt khác sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp protoplast (tế bào trần) đã thực hiện được việc chuyển các gen mong muốn vào cây trồng… Bên cạnh đó các nhà nghiên cứu còn thu nhận các chất trao đổi thứ cấp từ tế bào nuôi cấy một sự ổn định và độc lập, ít lệ thuộc vào sản xuất của thực vật ngoài tự

nhiên

Ngoài ra, nuôi cấy mô - tế bào thực vật còn là một phương pháp nghiên cứu hiệu qủa nhất qúa trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật Phương pháp này giúp mở ra những hư-ớng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như : cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dưỡng

ở tế bào thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác…

2.1 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

Năm 1946, đã khởi đầu nuôi cấy mô và cơ quan tách rời bằng thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi cây măng tây Apragus offcinalis, sau đó

đã nuôi cấy cả những bộ phận khác của cây:

lá, hoa, thân

Nhu cầu dinh dưỡng của nuôi cấy mô hoặc cơ quan tách rời đều có điểm chung: nguồn

cacbon (đường), các nguyên tố đa lượng (N,

P, K, Ca), vi lượng (Mg, Fe, Mn, Zn, Co, …) các vitamin Tuy nhiên nuôi cấy mô đòi hỏi cao hơn nuôi cấy cơ quan tách rời, như phải bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa N (axit amin)

và đặc biệt là chất điều hòa sinh trưởng phải đầy đủ, vì mô tách rời không có khả năng tổng hợp những chất này

Trong nghiên cứu nuôi cấy mô và cơ quan

tách rời, việc chọn mẫu có tầm quan trọng đặc biệt: mẫu phải ở tình trạng sinh lý tốt và đang phát triển, đó là những phần non của cây hoặc phôi hợp tử trưỏng thành như mầm, phần trên

lá mầm, chồi bên của lá thứ nhất hay thứ hai, nơi chứa nhiều tế bào mô phân sinh

Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời được ứng dụng trong nghiên cứu điều kiện sinh trưởng đối với một bộ phận hoặc một mô của cây;

nhân nhiều và nhanh cây in vitro, tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu cơ bản như chọn dòng tế bào, đột biến soma

2.2 Nuôi cấy mô phân sinh

Đặc điểm của mô phân sinh là chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, lại không bị virut xâm nhập

Nuôi cấy mô phân sinh được dùng trong các trường hợp:

- Tạo ra những giống cây sạch virut từ những giống bị bệnh (phục tráng giống)

- Nhân giống in vitro

- Tạo cây đa bội thông qua xử lý coxixin

- Nghiên cứu qúa trình hình thành cơ quan

2.3 Nuôi cấy mô sẹo (callus)

Khi sự cân bằng các chất kích thích sinh trư-ởng trong thực vật thay đổi, cụ thể các mô

đỉnh sinh trưỏng hay nhu mô được tách ra và nuôi cấy trên môi trường có tỉ lệ auxin và

cytokinin thích hợp, thì mô sẹo được hình

thành Đó là một khối các tế bào phát sinh vô

tổ chức và có hình dạng không nhất định với màu vàng, trắng hoặc hơi xanh

Nguyên liệu để tạo mô sẹo là các phần non của cây, được đưa vào môi trường nuôi cấy Trong qúa trình nuôi cấy tạo mô sẹo, mẫu thư-ờng phải để trong tối, Tạo mô sẹo có thể coi là qúa trình giải biệt hóa, đưa những mẫu đã biệt hóa trở về trạng thái ban đầu của phôi

Mô sẹo khi hình thành sẽ gồm hai loạiM:

- Loại xốp: chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, chất tế bào loãng và không bào to

- Loại cứng thì ngược lại: các tế bào chắc,

nhân to, chất tế bào đậm đặc và không bào

nhỏ

Từ các khối mô sẹo có thể đưa vào môi trư-ờng nhân sinh khối để thu lượng lớn mô sẹo Nuôi cấy mô sẹo được ứng dụng trong nhiều trường hợp:

- Nhân giống in vitro ở những loài thực vật mà phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ít có hiệu qủa hoặc không thực hiện được

- Làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhân các chất có hoạt tính sinh học

- Nguyên liệu cho chọn dòng tế bào: đột biến, chọn dòng tế bào có khả năng chống chịu cao

- Nghiên cứu qúa trình hình thành cơ quan

2.4 Nuôi cấy phôi

Năm 1958, đã thu được những tế bào phôi vô tính đầu tiên từ mô dinh dưỡng của cây cà rốt

và đã đưa vào nuôi cấy in vitro Thành công này đã mở ra hướng mới trong nuôi cấy phôi

vô tính Phôi vô tính có khả năng nẩy mầm và tạo cây hoàn chỉnh như phôi hữu tính

Nuôi cấy phôi vô tính hiện nay được xem như một kỹ thuật mang lại nhiều hiệu qủa hơn

trong nhân giống cây trồng, trong khi nhân

giống vô tính theo phương pháp cổ điển còn nhiều hạn chế

Ngoài ra nuôi cấy phôi vô tính còn dùng để:

- Thử sức sống của phôi hạt

- Duy trì phôi yếu và cứu phôi lai xa

- Sản xuất hạt nhân tạo mà bản chất là tế bào phôi được bọc trong vỏ đặc biệt

2.5 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

Các thí nghiệm nuôi cấy bao phấn đầu tiên đ-ược thực hiện vào năm1966, tiến hành ở cây

cà độc dược và đã thu được cây đơn bội

Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn có ưu điểm là đơn giản về thao tác kỹ thuật và môi trường nuôi cấy, nhưng lại có thể tạo ra cả cây lưỡng bội từ mô soma của thành bao phấn, do vậy

sẽ khó phân biệt với cây tự lưỡng bội từ cây đơn bội

Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được dùng cho tạo các dòng thuần để:

- Nghiên cứu gen lặn vì chúng không biểu hiện

ở cơ thể dị hợp tử

- Chọn các dòng đột biến

2.6 Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần

Melcher và Berman (1959) là người đầu tiên tách, nuôi cấy tế bào đơn thực vật Tiếp theo nhiều tác giả khác đã nghiên cứu nuôi cấy tế bào đơn nhưng các thí nghiệm điển hình nhất

là của Street (1970), ông nuôi cấy và duy trì

đ-ược sự sinh trưởng liên tục của huyền phù tế bào

Các tế bào đơn tách từ mô thực vật bằng ph-ơng pháp nghiền hoặc xử lý enzym Sau đó chúng được nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy hoặc lắc tạo điều kiện thuận lợi cho sự trao đổi khí

và tiếp xúc với các chất dinh dưỡng

Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp, do chúng bị mất nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng, khi tách rời khỏi quần thể tế bào Vì thế việc lựa chọn môi trường dinh dưỡng và điều khiển nuôi cấy phù hợp là việc nghiên cứu đầu tiên trong nuôi cấy tế bào đơn

ứng dụng nuôi cấy tế bào đơn cho các

mục đích;

- Nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển và

phân hóa tế bào trong những điều kiện khác nhau

- Chọn dòng tế bào

- Thu nhận các chất trao đổi thứ cấp

Nuôi cấy tế bào trần N ( protoplast ) được bắt đầu từ những công trình của Cooking (1960) ông đã thu đợc protoplast từ tế bào rễ cà chua bằng phương pháp enzym

- Mô hay dùng để tách protoplast là nhu mô thịt lá, ngoài ra có thể dùng mô sẹo hay tế bào đơn Sau khi xử lý enzym thì thành tế bào bị loại bỏ, chỉ còn màng tế bào bao bọc tất cả các cấu trúc của tế bào Do vậy protoplast là đối tượng lý tưởng cho các nghiên cứu:

- Tạo con lai soma nhờ phương pháp dung hợp protoplast

- Chuyển các bào quan (ty thể, lạp thể) hoặc

cả nhân vào tế bào

- Qúa trình sinh tổng hợp màng tế bào

3 Sự phân hóa và hình thành cơ quan

trong mô và tế bào nuôi cấy

Trong các tế bào nuôi cấy thờng xẩy ra hai dạng đó là phân hóa cơ quan bằng con đờng hình thành nhu mô và phân hóa cơ quan qua

sự tạo phôi soma

3.1 Sự phân hóa nhu mô

Sự phân hóa nhu mô trong môi trờng nuôi cấy

in vitro đợc bẵt đầu bằng sự ngừng phân hóa

và tạo thành mô sẹo – một tổ chức tế bào

không phân hóa Dới tác dụng của các chất điều hòa sinh trởng và các yếu tố của môi tr-ờng nuôi cấy khả năng phân hóa của các mô mất phân hóa lại đợc khôi phục và phân hóa thành cơ thể hoàn chỉnh

Phân hóa cơ quan

Trong qua trình phân hóa cơ quan, ở những

mô sẹo không có tổ chức được hình thành các cấu trúc hình thái dẫn đến việc tạo chồi, rễ, cành, hoa, cây hoàn chỉnh Qúa trình phân

hóa này có thể thực hiện bằng cách thay đổi một số chất và các chất điều hòa sinh trởng trong môi trờng nuôi cấy

Qúa trình hình thành cơ quan trong mô xẩy ra qua hai giai đoạn, đó là tái phân hóa và giai đoạn hình thành các mầm mống cơ quan Khả năng hình thành cơ quan ở các mô khác nhau (Galston, 1968, Murashige) Đối với mô sẹo,

xu thế tạo cơ quan giảm dần khi mô cấy

chuyển nhiều lần vì khi mô cấy chuyển nhiều lần thờng hình thành các tế bào đa bội và lệch bội ngoài ra có thể mất các yếu tố di truyền

Sự phân hóa của mô nuôi cấy đã cho thấy một tiềm năng mãnh liệt trong tế bào thực vật, nhờ

đó các tế bào đã tái phân hóa để tạo thành tế bào mới của mô thực vật nuôi cấy và tạo

thành cơ thể hoàn chỉnh

3.2 Phân hóa phôi

ở một số loài thực vật tái sinh cây hoàn chỉnh

từ một tế bào xẩy ra theo sự phân hóa phôi nh trong trờng hợp phân hóa cơ quan, phân hóa phôi cũng bắt đầu từ sự tái phân hóa của các

tế bào đã biệt hóa trong mô nuôi cấy và sau

đó xẩy ra qúa trình tạo phôi Steward và cộng

sự (1958) đã mô tả sự hình thành cấu trúc

phôi trong tế bào cà rốt nuôi cấy trong môi tr-ờng lỏng Đầu tiên tế bào phân chia mạnh để tạo thành các cụm tế bào, trong các cụm này các phân tử của xylem đợc hình thành sau đó xẩy ra qua trình tạo mầm mống rễ Khi chuyển sang môi trờng nuôi tiếp thì quan sát thấy hình thành chồi và sau đó là cây hoàn chỉnh

Cả hai qúa trình phân hóa phôi và phân hóa nhu mô để hình thành cơ quan nh chồi, rễ, đều chịu tác động của các chất sinh trởng và các điều kiện nuôi cấy