Di truyền phân tử ( phần 22 ) Axit nuclêic - ARN Ở các sinh vật như: thực khuẩn thể, virus của động vật, virus của thực vật thì vật liệu di truyền là RNA. Ở các sinh vật bậc cao có RNA là bản sao mã của DNA. RNA có cấu tạo từ các đơn phân là các ribonucleotide. Giống với nucleotide, mỗi ribonucleotide gồm ba thành phần: đường ribose, H3PO4, bazơnitric (T được thay bằng U). Trong tế bào có ba loại RNA: 1. RNA riboxom (ribosomal RNA-rRNA) rRNA cùng với protein cấu tạo nên ribosome. rRNA chiếm tỷ lệ cao trong tế bào có thể đến 75% của tổng RNA. Ở các ribosome khác nhau có các rRNA khác nhau, chúng được đặc trưng bởi hằng số lắng S: - Eukaryote : ribosome có hệ số lắng khi ly tâm là 80S, gồm hai đơn vị: + Đơn vị lớn ( 60S) có rRNA 28S; 5,8S; 5S + Đơn vị nhỏ (40S) có rRNA 18S - Prokaryote và lục lạp, ty thể có hệ số lắng khi ly tâm là 70S, gồm 2 + Đơn vị lớn (50S): có loại rRNA 23S; 5S + Đơn vị nhỏ (30S): có rRNA 16S RNA ribosom có cấu trúc bậc I (mạch thẳng) và cấu trúc bậc hai. Trong ribosome, các rRNA tồn tại ở dạng cấu trúc bậc hai. RNA ribosom có cấu tạo là một sợi xoắn có nhiều vùng liên kết đôi theo nguyên tắc bổ sung A liên kết với U, G liên kết với X và có khi G liên kết với U. Trong tế bào rRNA chiếm tỷ lệ cao có thể lên đến 75-80% tổng số RNA 2. RNA vận chuyển (Transfer RNA - tRNA) Mỗi tRNA gắn với một phân tử amino acid, mang đến ribosome để tham gia tổng hợp protein. Mỗi tRNA đặc hiệu cho một loại amino acid. Có hơn 20 loại tRNA khác nhau tương ứng với hơn 20 loại amino acid. Trong thực tế, người ta thấy số lượng tRNA lớn hơn rất nhiều so với số lượng amino acid vì một amino acid có nhiều bộ ba mã hóa. Đồng thời cùng một bộ ba mã hóa, vẫn có thể có nhiều tRNA do hiện tượng biến đổi của các nucleotide trong tRNA tạo nên các loại tRNA mới và trong quá trình tổng hợp tRNA, sau khi hình thành chuỗi polynucleotide còn chịu sự tác động của các yếu tố của môi trường nội và ngoại bào làm các nucleotide bị biến đổi, tạo ra các tRNA mới. Các tRNA cùng tham gia vận chuyển một acid amin là các izoaceptor. Số lượng izoaceptor thay đổi tùy acid amin. Cấu trúc bậc I của tRNA: tRNA vận chuyển có phân tử lượng nhỏ: 25.000-30.000, gồm 75-90 nucleotide, có hằng số lắng 4S. Trong thành phần cấu trúc của tRNA có khoảng 10% các nucleotide hiếm với khoảng 30 loại khác nhau. Mọi cấu trúc của tRNA đều có 2 đầu 5' và 3' giống nhau: đầu 5' luôn chứa G với gốc P tự do, còn đầu 3' luôn có 3 nucleotide là CCA 3'-OH. Nhóm 3'-OH của A có thể liên kết với acid amin để tạo phức hợp tRNA-aminoacyl. Chuỗi polynucleotide cuộn lại có những đoạn tạo mạch xoắn kép, hình thành cấu trúc bậc hai của tRNA. Enzyme aminoacyl tRNA synthetase gắn amino acid với tRNA tương ứng. Mỗi enzyme đặc hiệu cho một loại amino acid riêng biệt và xúc tác phản ứng gắn với tRNA của nó nhờ năng lượng ATP tạo ra aminoacyl tRNA. Phức hợp aminoacyl tRNA đến ribosome gắn với mRNA bằng nhờ các bộ ba đối mã (anticodon) trên tRNA bắt cặp bổ sung với các bộ ba mã hóa (codon) trên mRNA. Các tRNA có một số đặc tính cấu trúc chung: chiều dài khoảng 73- 93 nucleotide, cấu trúc gồm một mach cuộn lại như hình lá chẻ ba nhờ bắt cặp bên trong phân tử. Đầu mút 3’ có trình tự kết thúc là CCA, amino acid luôn gắn vào đầu này. Đầu 5 chứa gốc phosphate của G. Mỗi t RNA có có 4-5 vùng với chức năng khác nhau: - Vòng DHU: có chứa nucleotide dihydrouridin, vùng này có chức năng nhận biết aminoacyl tRNA synthetase - Vòng anticodon: đọc mã trên mRNA theo nguyên tắc kết cặp anticodon – codon. - Vòng phụ: có thể không có ở một số RNA. - Vòng TφC: có chứa nucleotide pseudouridin, vùng này có chức năng nhận biết ribosom để vào đúng vị trí tiếp nhận aminoacyl tRNA (vị trí A) - Đấu 3’ –CCA: vị trí gắn với acid amin. tRNA chiểm khoảng 15% tổng số RNA của tế bào 3. RNA thông tin (messenger RNA – mRNA) RNA thông tin làm nhiệm vụ truyền đạt thông tin di truyền từ DNA đến protein. mRNA chiểm khoảng 5% tổng số RNA tế bào. Cấu trúc của mRNA: DNA polymerase khởi sự phiên mã ở đoạn nằm ngay trước vùng mã hóa được gọi là đoạn 5’ không mã hóa (5’-non coding). Do đó mRNA có đoạn đầu mang các tín hiệu cho ribosome nhận biết để gắn vào dịch mã. Ở đuôi 3’ sau dấu kết thúc có đoạn 3’ không mã hóa là nới gắn poly-A. Các mRNA của prokaryote có nữa thời gian (half life) tồn tại ngắn trung bình 2 phút. Các mRNA của Eukaryote có nữa thời gian tồn tại khoảng 30 phút - 24 giờ. Các tính chất của DNA 1. Biến tính (denaturation) và hồi tính (renaturation) Hai mạch đơn của phân tử AND gắn với nhau nhờ các liên kết hydro.Khi đun nóng DNA từ từ, vượt quá nhiệt độ sinh lý (khoảng 80- 95 0 C), các liên kết hydro giữa 2 mạch bị đứt và chúng tách rời nhau. Trước tiên các mối liên kết A-T, khi nhiệt độ > 90oC các liên kết G -C bị đứt. Đó là hiện tượng biến tính của DNA. Nhiệt độ mà ở đó 2 mạch DNA tách rời nhau được gọi là điểm chảy melting poin) của DNA: Tm. Nhiệt độ này đặc trưng cho mỗi loại DNA, phụ thuộc vào số lượng các liên kết hydro. DNA có tỷ lệ G-C cao sẽ có điểm chảy cao. DNA có 60% G-C thì điểm chảy là 95 o C. Ngoài nhiệt độ, người ta còn dùng chất formanide (NH2 - CH = 0) làm biến chất DNA ở 40 o C Các DNA bị biến chất được hạ nhiệt độ từ từ, ở 60 o -70 0 C các nucleotide sẽ gắn lại với nhau để tạo nên DNA mạch kép. Hiện tượng này gọi là hồi tính Có thể biết được DNA bị biến tính hoặc chưa nhờ vào sự gia tăng hấp thụ tia cực tím khi bị biến tính và sự giảm hấp thu tia cực tím khi hồi tính. Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, điều này xảy ra do “hiệu ứng siêu sắc” (hyperchromic effect), hoặc dựa vào sự thay đổi độ lắng tụ trong ống nghiệm khi ly tâm. 2. Lai acid nucleic Sử dụng đặc tính biến tính rồi hồi tính có thể tiến hành lai DNA với DNA, DNA với RNA, RNA với RNA. Nguyên tắc: lấy DNA A làm biến tính thành mạch đơn, trộn với DNA B cũng bị biến tính thành mạch đơn. Dung dịch được hạ nhiệt độ từ từ để xảy ra hồi tính. Đây là kiểu lai lỏng hay lai trong dung dịch. Quá trình hồi tính xảy ra, sợi A kết với A, B kết với B, đồng thời có sợi A kết với B tạo thành phân tử lai. Muốn lai được với nhau, giữa 2 loại DNA phải có những đoạn có trình tự bổ sung nhau. Có thể dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu để phát hiện đoạn lai. Hiện nay còn sử dụng phương pháp lai trên pha rắn, được sử dụng rộng nhất: + Phương pháp Southern blot, dùng cho DNA + Phương pháp Northern blot dùng cho RNA + Phương pháp dot (điểm) và slot (khe) blot dùng cho RNA và DNA - Lai tại chỗ (in situ hybridization) là kiểu lai phân tử trong đó trình tự acid nucleic cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô. Lai tai chỗ cho phép nghiên cứu NST, khuẩn lạc hay mô tế bào mà không cần tách chiết chúng. Dùng phương pháp lai DNA: + Có thể xác định mối quan hệ họ hàng giữa các loài. DNA người và DNA chuột chỉ lai được 25%. + Có thể tiến hành lai mRNA với DNA để xác định vị trí gen trên DNA tạo ra mRNA tương ứng. Phương pháp lai acid nucleic giúp hiểu chi tiết hơn về bộ gen, nó là cơ sở của phương pháp chẩn đoán mới dùng acid nucleic đang đuợc sử dụng rộng rãi. . Di truyền phân tử ( phần 22 ) Axit nuclêic - ARN Ở các sinh vật như: thực khuẩn thể, virus của động vật, virus của thực vật thì vật liệu di truyền là RNA. Ở các sinh. Phương pháp dot ( iểm) và slot (khe) blot dùng cho RNA và DNA - Lai tại chỗ (in situ hybridization) là kiểu lai phân tử trong đó trình tự acid nucleic cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong. lắng khi ly tâm là 70S, gồm 2 + Đơn vị lớn (5 0S): có loại rRNA 23S; 5S + Đơn vị nhỏ (3 0S): có rRNA 16S RNA ribosom có cấu trúc bậc I (mạch thẳng) và cấu trúc bậc hai. Trong ribosome, các