Lựa chọn hệ biểu hiện để sản xuất protein ở vi khuẩn (Các chủng E. coli) ppt

Lựa chọn hệ biểu hiện để sản xuất protein ở vi khuẩn (Các chủng E. coli ) Nhà máy E. coli Nhà máy E. coli. E. coli là loài vật chủ vi khuẩn Gram âm được ưa chuộng nhất trong sản xuất protein tái tổ hợp. Một trong những lý do là vì những thao tác kỹ thuật với E. coli khá dễ dàng và chuẩn hóa ở mọi phòng thí nghiệm. Thông thường, tất cả các chủng E. coli dùng trong biểu hiện đều xuất phát từ chủng E. coli K-12 hay B. Sự khác nhau giữa các chủng biểu hiện được phát triển và thương mại hiện nay là nhằm để giảm thiểu những vấn đề biểu hiện nhất định (xem chi tiết ở bảng phía dưới). Rất nhiều hệ thống promoter đã được thiết kế cho việc biểu hiện protein tuy nhiên chỉ có một số ít trở nên phổ biến và thương mại. Một promoter hữu ích phải có khả năng biểu hiện mạnh, có một mức độ biểu hiện nền thấp và dễ dàng chuyển nạp giữa các chủng E. coli khác nhau. Ngoài ra quá trình cảm ứng cũng cần đơn giản và rẻ tiền. Một trong những bất lợi trong việc sản xuất protein ở E. coli nhằm mục đích liệu pháp y học là thường lẫn với lipopolysaccharide, một loại nội độc tố ở người. Vì lý do như vậy mà một số loài vật chủ vi khuẩn khác như Caulobacter, Staphylococcus và Streptomyces được lựa chọn để biểu hiện protein. Các chủng vi khuẩn Bacillus Gram dương cũng là vật chủ được ưa thích, trong đó phải kể đến B. megaterium, B. subtilis và B. brevis. Những điểm nổi bật của các vật chủ này là: hoạt tính protease thấp, các plasmid tương đối bền về cả cấu trúc lẫn phân ly trong phân bào, khả năng sinh trưởng trên nhiều loại cơ chất khác nhau và hiệu suất biểu hiện cực cao. Trong đó, B. subtilis được nghiên cứu sâu và ứng dụng rộng rãi hơn 2 loài còn lại. Mức độ biểu hiện cao nhất là đạt được ở chủng đột biến sacUh. Chủng WB800 bị bất hoạt tất cả các protease ngoại bào và đã được tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và lên men quy mô lớn, tuy nhiên hiện giờ chưa được thương mại hóa. Các plasmid với promoter của operon xylose được sử dụng rộng rãi và cho mức độ biểu hiện gene cao nhất. Những gene này có thể được cảm ứng từ 130 đến 350 lần với 0.5% xylose. Các sản phẩm protein được tạo ra thường hay kém tan hoặc nằm trong các thể không tan (inclusion bodies). Để khắc phục điều này, bạn có thể hạ thấp nhiệt độ nuôi cấy khi cảm ứng xuống tới 16°C, thay thế các amino acid, biểu hiện đồng thời với các chaperone, sử dụng đoạn amino acid kèm có tính ưa nước cao, bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy sorbitol, glycyl betain, sucrose, hoặc raffinose, thay đổi pH của môi trường nuôi cấy và sau cùng có thể đổi chủng vi khuẩn khác. Tuy nhiên, bạn có thể chọn cách khác là hòa tan trở lại và tái tạo cấu trúc của protein trong thể không tan để thu được protein có hoạt tính. Việc giảm nồng độ chất cảm ứng thi thoảng cũng có hiệu quả. Để tăng cường khả năng biểu hiện các protein eukaryote hoặc protein có chứa codon hiếm ở E. coli, bạn có thể lựa chọn những chủng E. coli đã được cải biến di truyền phù hợp với mục đích này. Ngoài vấn đề vật chủ, promoter, thì số lượng bản sao plasmid cao, thấp hay trung bình cũng liên quan đến mức độ biểu hiện. Khi gắn protein tái tổ hợp với một đoạn cài (tag) lớn có thể làm tăng tính tan của tổng thể protein. Các đoạn cài liên kết maltose hoặc đoạn cài Sumo (Sumo-tags) có khả năng làm protein tan cực tốt, tuy nhiên lại kết vón sau khi loại bỏ đoạn cài khỏi protein tái tổ hợp. Protein với các cầu disulfide thường được tiết ra vùng ngoại vi bào chất (periplasm) thay vì trong tế bào chất (cytoplasm). Để định hướng tiết protein biểu hiện ra vùng ngoại vi bào chất, protein tái tổ hợp cần được gắn một đoạn peptide dẫn đường (leader peptide) ở phía đầu N. Thông thường các chủng E. coli K-12 hoặc B thường sử dụng cơ chế tiết protein kiểu I và kiểu II với các signal peptide sau: Lpp, LamB, LTB, MalE, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, PelB, PhoA, PhoE, SpA và Tat. Đọc đến đây có thể nhiều bạn muốn đặt câu hỏi: Vậy hệ thống biểu hiện nào tốt nhất?. Câu trả lời có lẽ làm bạn không hài lòng là Không có hệ thống nào là tốt nhất cho mọi trường hợp. Xin đừng thất vọng! Tuy nhiên, nếu không thì việc thiết kế biểu hiện protein sẽ trở nên một công việc tẻ nhạt chứ không nâng tầm thành một "nghệ thuật biểu hiện gene" như hiện nay. Vậy xin nhớ kỹ quy tắc ngón tay cái: kiểm tra trình tự protein trước tiên và sau đó lựa chọn một hệ biểu hiện phù hợp. . Lựa chọn hệ biểu hiện để sản xuất protein ở vi khuẩn (Các chủng E. coli ) Nhà máy E. coli Nhà máy E. coli. E. coli là loài vật chủ vi khuẩn Gram âm được. (cytoplasm). Để định hướng tiết protein biểu hiện ra vùng ngoại vi bào chất, protein tái tổ hợp cần được gắn một đoạn peptide dẫn đường (leader peptide) ở phía đầu N. Thông thường các chủng E. coli. Caulobacter, Staphylococcus và Streptomyces được lựa chọn để biểu hiện protein. Các chủng vi khuẩn Bacillus Gram dương cũng là vật chủ được ưa thích, trong đó phải kể đến B. megaterium, B.