Kỹ thuật liệu pháp gene mới: ứng dụng nuclease ngón tay kẽm được thiết kế trước docx

Kỹ thuật liệu pháp gene mới: ứng dụng nuclease ngón tay kẽm thiết kế trước Kể từ kỹ thuật chuyển gene kỹ thuật di truyền đời nay, tạo luồng tư tưởng nơi nhà y sinh học nhanh chóng ứng dụng kỹ thuật việc chẩn đóan, chữa trị bệnh di truyền không mức độ nghiên cứu phịng thí nghiệm mà phải nhanh chóng đưa ứng dụng lâm sàng Đến nhiều kỹ thuật áp dụng thành cơng dịng tế bào ni cấy chí mơ hình dùng chuột thí nghiệm bệnh người, chúng cho thấy trở ngại thực lớn chuyển chúng ứng dụng lâm sàng Trên trang 646 tờ Nature 435, (2 June 2005), Urnov cộng cơng bố cơng trình nghiên cứu theo phương thức giúp hiệu chỉnh sửa sai đột biến di truyền tế báo người Phương thức đời từ kết hợp trình sinh học bảo thủ mặt tiến hóa: cắt xun sợi đơi DNA điểm đặc hiệu sửa chữa sai sót sợi DNA tái tổ hợp đồng dạng Sự thành công Urnov cộng sự, mặt lý thuyết, cho thấy hịan tịan ứng dụng lâm sàng Thành công tác giả nhờ họ kế thừa phát triển từ nghiên cứu trước tảng phương thức kết hợp hai q trình sinh học nói Đây thực bước tiến đáng kể đường ứng dụng kỹ thuật di truyền vào chữa trị bệnh cho người Trước hết cần nhắc lại hầu hết chiến thuật chuyển gene thực chất liệu pháp thêm gene, nghĩa phiên gene bình thường (gene lành) gene chuyển vào dịng tế bào mà nhà nghiên cứu hay bác sỹ điều trị quan tâm, chúng tồn đồng thời với phiên đột biến chị em Nhưng mục đích sau việc đưa gene vào tế báo chỉnh sửa đột biến, gene lành phải có khả tạo protein bình thường điều khiển dấu hiệu điều hịa nội Q trình sửa chữa hay hiệu chỉnh đặc hiệu theo điểm đột biến chia làm bước: • Đầu tiên, điểm cần hiệu chỉnh phải dị tìm tỷ cặp base gene người • Kế đến, base đóng vai trị kẻ thay phải đưa vào tế bào cách hiệu • Cuối cùng, yếu tố phản ứng phải đưa vào dạng tế bào tương ứng thể (ví dụ tế bào phổi bệnh nhân mắc chứng xơ hóa) Để giải vấn đề đầu tiên, Urnov cộng lợi dụng ZFN (zinc-finger nucleases- nuclease ngón tay kẽm) Những protein tổng hợp mô tả từ 1996, sau chúng cải biến phát triển thành yếu tố phản ứng nhằm phân cắt DNA điểm đặc hiệu, chúng bao gồm vùng gắn DNA vùng phân cắt DNA Vùng gắn DNA ZFN bao gồm sợi "ngón tay kẽm", sợi gồm khỏang 30 amino acid làm bền ion kẽm Như tên gọi vùng gắn lên DNA gắn lên trình tự DNA đặc hiệu base Trình tự amino acid ngón tay kẽm biến thiên tùy theo trình tự DNA mà gắn Trong gene người, người ta tìm thấy khỏang 900 protein mang ngón tay kẽm danh sách bổ sung tương lai Vùng cắt DNA ZFN bắt nguồn từ enzyme FokI tự thân khơng mang tính đặc hiệu Để có chức phân cắt DNA, vùng phải nhị trùng hóa (dime) Do ZFN phải gắn vị trí gần vị trí cần hiệu chỉnh Bằng cách liên kết gắn ngón tay kẽm theo cách thức sóng đơi, hai ZFN nối sau hai ZFN kia, chúng tạo vị trí nhận diện đặc hiệu gồm 24 bp Và với trình tự 24 bp xác định trình tự tịan genome, cho phép dị tìm điểm cần hiệu chỉnh Như bước quy trình bước giải Chú thích: Những bệnh nhân mắc hội chứng SCID mang vài đột biến đặc hiệu ảnh hưởng chức tế bào T Urnov cộng sử phương thức minh họa để hiệu chỉnh khiếm khuyết thu tỷ lệ thành cơng đánh kể với dịng tế bào nuôi cấy mang đột biến a, ZFN (Zinc- finger nucleases) thiết kế cho vùng ngón tay kẽm nhận diện điểm đặc hiệu gần điểm đột biến b, Vùng phân cắt tạo vết cắt xun sợi đơi DNA c, Một trình tự dạng hoang dại (không đột biến) đưa vào tế bào và sử dụng khn mẫu cho q trình sửa chữa DNA tế bào – tái tổ hợp đồng dạng diễn d, Trình tự đột biến sửa chữa Sau nhị trùng hóa, enzyme tạo vết cắt xuyên sợi đôi DNA vị trí gần xác điểm đột biến Khi đó, chế sửa sai tế bào kích họat Trong số chế sửa sai này, "sự tái tổ hợp đồng dạng" tức trình sửa sai cách sử dụng trình tự tương tự có sẵn tế bào làm khn Trình tự tương tự dễ dàng tìm thấy genome, tìm thấy từ vật liệu DNA người chủ động đưa vào trước Như bước thứ hai giải quyếtthay đổi base Điểm đặc trưng đáng ý quy trình phức tạp tần xuất diễn kiện mong đợi Urnov cộng cho thấy họ thành công hiệu chỉnh khỏang 15-20% nhiễm sắc thể đột biến dịng tế bào ni cấy theo chu kỳ Hiệu suất cho phép việc đưa hai ZFNs khn DNA bình thường vào tế bào đủ để thực thay đổi điểm sai sót Các tác giả cịn chí cho họ thành công khỏang 5% tiến hành thực nghiệm tế bào T thu từ bệnh nhân, nên nhớ hiệu cải biến di truyền dòng tế bào T thường thấp Kết giải thích hịan tịan phù hợp với tốc độ tái tổ hợp đồng dạng, tế bào khơng có tượng DNA bị cắt xun sợi tỷ lệ khỏang 0,001% Đến vấn đề đặt công việc Urnov cộng có ý nghĩa việc chữa trị bệnh người Trình tự DNA mà tác giả sửa chữa dạng đột biến gây hội suy giảm miễn dịch kết hợp trầm trọng - SCID (severe combined immunodeficiency ) — bệnh gây chết cho trẻ giai đọan sớm, chưa có liệu pháp gene hay cấy gép tủy xương tỏ hữu hiệu Vài năm trước, có vài tác giả thành công nghiên cứu chuyển gene bệnh nhân SCID Họ sử dụng retrovirus để thêm gene bình thường vào tế bào đích (là tế bào máu biểu CD34) lấy từ bệnh nhân Sau thời gian nuôi cấy, tế bào được trở lại bệnh nhân Và khỏang 20−40% tế bào hồi hương có chứa gene bình thường Ở bệnh nhân, tỷ lệ chuyển gene thực số có ý nghĩa tế bào sau xử lý chúng có điểm thuận lợi chúng "khỏe mạnh" tế bào đột biến in vivo Do kết hợp nghiên cứu tác giả trước kết nghiên cứu Urnov cộng sự, nhà nghiên cứu hy vọng họ phục hồi chức miễn dịch cho bệnh nhân SCID Hơn nữa, hướng nghiên cứu cịn tránh gọi "q trình tích hợp khơng mong muốn" phương thức nhằm sửa chữa gene bệnh chèn phiên bình thường Ở nghiên cứu trước „q trình tích hợp khơng mong muốn“diễn mà q trình chèn tích hợp gene xảy vị trí khơng mong đợi (ví dụ gần gene thúc đầy tăng trưởng) Phương thức Urnov cộng giải vấn đề này, cho thấy khả hiệu chỉnh sai hỏng mà không tạo hiệu ứng phụ nghiêm trọng Một điểm lý thú phương thức mà Urnov cộng sử dụng khơng địi hỏi ZFNs khn DNA phải diện lâu tế bào Mặc dù có điểm ưu việt phân tích trên, kỹ thuật mà Urnov cộng đưa nhiều điểm cần hòan thiện trước thực ứng dụng lâm sàng người Ví dụ liệu phân tử ZFN cải biến có kích họat hệ thống miễn dịch khiến cho chúng bị đào thải khỏi thể Kế đến giới hạn với dòng tế bào thực nghiệm Kỹ thuật thực bị giới hạn dòng tế bào tách từ bệnh nhân, cải biến ex vivo sau cho quay lại thể, kỹ thuật sử dụng cho việc chuyển gene in vivo tỏ không hiệu Cuối cùng, điều quan trọng phải xác định tính đặc hiệu ZFN tế bào liệu dị tìm tái xếp DNA có thực diễn điểm đánh dấu hay không? Bằng cách sử dụng kỹ thuật Southern blot, Urnov cộng cho thấy khơng có nhầm lẫn đánh dấu DNA đích cần hiệu chỉnh khơng có tái xếp bất thường Do cần phải có nghiên cứu chi tiết vấn đề nói  ... truyền vào chữa trị bệnh cho người Trước hết cần nhắc lại hầu hết chiến thuật chuyển gene thực chất liệu pháp thêm gene, nghĩa phiên gene bình thường (gene lành) gene chuyển vào dịng tế bào mà nhà... tịan ứng dụng lâm sàng Thành cơng tác giả nhờ họ kế thừa phát triển từ nghiên cứu trước tảng phương thức kết hợp hai trình sinh học nói Đây thực bước tiến đáng kể đường ứng dụng kỹ thuật di truyền... đầu tiên, Urnov cộng lợi dụng ZFN (zinc-finger nucleases- nuclease ngón tay kẽm) Những protein tổng hợp mô tả từ 1996, sau chúng cải biến phát triển thành yếu tố phản ứng nhằm phân cắt DNA điểm