ENZYEME GIỚI HẠN ppt

Enzyme hạn chế được phát hiện vào năm 1970, chúng tồn tại trong tế bào vi khuẩn, có tác dụng cắt DNA ngoại lai ví dụ: DNA của phage tại những điểm xác định, để tiêu diệt DNA này.. Năm 19

1 MỞ ĐẦU

Sự sống đã xuất hiện trên trái đất hàng ngàn hàng triệu năm trước và kèm theo là những quá trình trao đổi chất diễn ra một cách liên tục từ đơn giản đến phức tạp, từ mức độ thấp đến mức độ cao.để thực hiện quá trình trao đổi chất hàng ngàn , hàng vạn các phản ứng hóa học phức tạp diễn ra một cách liên tục, nhịp nhàng liên quan chặt chẽ đến nhau, điều chỉnh lẫn nhau ở trong từng tế bào, từng cơ thể sống Các quá hóa học đó tiến hành với tốc độ mau lẹ phi thường nhưng lại hài hòa,cân đối với sự tham gia của các chất xúc tác tự nhiên hay còn gọi là các chất xúc tác sinh học Là chất xúc tác sinh học với bản chất là protein enzyme có tính xúc tác sinh học đặc hiệu rất cao và hiệu lực xúc tác rất lớn Pavlov đã nói : “hoạt động của enzyme là biểu hiện đầu tiên của sự sống, không có sự sống nào lại không có quá trình tác động của enzyme ’’

Và enzyme có nhiều loại mỗi loại có một biểu hiện và chức năng hoạt động riêng của nó Enzyme giới hạn cũng vậy , là những enzyme có mặt trong tế bào Enzyme giới hạn là đại diện quan trọng của một trong những enzyme dùng trong thao tác DNA

2 NỘI DUNG

2.1 Lịch sử ,Phân loại

Enzyme hạn chế (Restriction Enzyme _RE) là Enzyme thuộc nhóm

Enzyme endonuclease Enzyme hạn chế được phát hiện vào năm 1970, chúng tồn tại trong tế bào vi khuẩn, có tác dụng cắt DNA ngoại lai (ví dụ: DNA của phage) tại những điểm xác định, để tiêu diệt DNA này

Năm 1978, Arber (Thụy Sĩ), Nathans (Mỹ) và Smith (Mỹ) đã được nhận

Giải Nobel nhờ phát hiện ra enzyme hạn chế và những ứng dụng của chúng để giải quyết nhiều vấn đề quan trọng của sinh học phân tử Các enzyme này là những “chiếc kéo phân tử” có thể cắt DNA thành những đoạn xác định, đã mở

ra một thời kỳ phát triển mới của sinh học hiện đại-Thời kỳ thao tác gen Chất xúc tác sinh học, là các phân tử sinh học có bản chất protein đóng vai trò chất xúc tác cho các phản ứng biến đổi hóa sinh

Hiện nay, người ta đã tìm thấy hơn 900 enzyme hạn chế khác nhau từ

khoảng 250 chủng vi sinh vật Các enzyme hạn chế có ba loại (type): I, II và III Loại I.Vị trí cắt nằm ngoài trình tự nhận biết một khoảng không nhất định cách

xa vị trí nhận biết khoảng 1000 – 5000 base Do không có tính đăc hiệu trong cắt đoạn nên sản phẩm của nó không đồng nhất và không phát hiện được bằng điện

di trên gen.Điều kiện cần để cắt là có ATP,Mg++, S-AdolMet,

Loại II: enzym giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ngay tại đó Loại này

được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu hiện nay.Điều kiện cần để cắt là có

Mn++, Mg++

Loại III: enzym giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ở vị trí cách đó

khoảng 10-20 nucleotit về trước và tạo ra một số đầu cắt khắc nhau Điều kiện cần để cắt là có Mg++, S-AdolMet,

Các enzyme được dùng phổ biến hiện nay thuộc type II, có cơ chế tác động

đơn giản nhất Đây là các nuclease cắt ở một vị trí đặc hiệu nằm bên trong sợi DNA (chứ không phân hủy DNA từ hai đầu), nên được gọi là endonuclease Tên

gọi đầy đủ của chúng là các restriction endonuclease type II, hay được gọi đơn giản là enzyme hạn chế (restriction enzyme, RE).

2.2 Đặc điểm

2.2.1.Cách gọi tên

Cách gọi tên các enzyme hạn chế dựa trên các qui ước quốc tế :

E Escherichia (giống)

I First identified Order ID'd in bacterium

Enzym giới hạn được gọi tên dựa vào vi khuẩn mà chúng được phân lập theo cách dưới đây Tên chi và tên loài của sinh vật, mà ở đó tìm thấy enzyme, được dùng để đặt cho phần đầu của tên enzyme (viết nghiêng) bao gồm: chữ thứ nhất của tên chi và hai chữ đầu của tên loài Ví dụ: enzyme được tách chiết từ vi

khuẩn Escherichia coli thì có tên là Eco, còn enzyme được tách chiết từ vi khuẩn Bacillus globigii thì viết là Bgl…Ngoài ra, tên gọi enzyme hạn chế còn

được bổ sung thêm phần sau (viết thẳng), tùy thuộc vào chủng vi khuẩn liên quan và tùy thuộc vào sự có mặt hay không của các yếu tố ngoài nhiễm sắc thể

Ví dụ: RI trong enzyme Ecori có nghĩa như sau: R là viết tắt của chủng RY13, I

là bậc xác định đầu tiên trong vi khuẩn (first identified order in bacterium)

Giá trị của enzyme hạn chế là ở tính đặc hiệu của chúng Các enzyme này cắt DNA ở các vị trí nhận biết riêng biệt bao gồm từ 4-6 cặp nucleotide có trình

tự đối xứng đảo ngược nhau, các đoạn ngắn này gọi là palindrome (đoạn đối xứng: là đoạn DNA có hai sợi hoàn toàn đối xứng giống hệt nhau nếu lật ngược

đầu đuôi).Ví dụ: enzyme ecori nhận biết chuỗi hexanucleotide (6 nucleotide): Giống như ecori, nhiều enzyme hạn chế đã tạo ra các đoạn DNA với đầu lồi (protruding) 5’ Một số enzyme hạn chế khác (ví dụ: psti) tạo ra các đoạn DNA

có đầu lồi 5’ Trong khi đó, một số enzyme hạn chế (ví dụ: smai) lại cắt ở trục

đối xứng để tạo ra các đoạn DNA mang đầu bằng (DNA Mạch đôi có hai đầu sợi đơn bằng nhau)

2.2.2,Hoạt động

a, Điều kiện hoạt động:

Sự hoạt động của các Enzyme giới hạn chịu ảnh hưởng của các yếu tố như:

• Ảnh hưởng của nhiệt độ: Đa số các chất enzym ở động vật có hoạt độ

cao nhất ở điều kiện thân nhiệt (37 - 400C) sự tăng nhiệt độ ở giới hạn thích hợp (35 - 500C) Có tác dụng kích thích hoạt động của enzym tức là kích thích quá trình trao đổi vật chất Sốt là phản ứng bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của vi trùng, thực chất là tăng cường sự hoạt động của các loại Enzyme

• Ảnh hưởng của pH: Mỗi loại Enzyme giới hạn khác nhau có độ pH thích hợp khác nhau.

• Ảnh hưởng của nồng độ Enzyme và cơ chất: Người ta dùng hằng số

Michaelis- Men ten để biểu diễn trạng thái phân ly của ES.

• Ảnh hưởng của các chất kìm hãm :chất kìm hãm cạnh tranh và chất kìm hãm không cạnh tranh

• Ảnh hưởng của các ion kim loại : Mỗi ion kim loại hoạt hóa cho một Enzyme xúc tác một phản ứng nhất định

• Phản ứng của Enzyme giới hạn thực hiện trong một thể tích càng nhỏ càng đảm bảo cho Enzyme giới hạn tiếp xúc với cơ chất càng tốt hiệu quả phản ứng càng cao Enzyme giới hạn không mang tính đặc hiệu loài , có thể nhận biết và cắt DNA của tế bào động vật, thực vật hay vi sinh vật ở trình tự 6 cặp nucleotide

• Số lượng, kích thước đoạn cắt phụ thuộc vào số vị trí giới hạn trên mỗi phân tử DNA và đặc điểm nhận biết đặc trưng của mỗi loại Enzyme giới hạn

b, Vị trí điểm cắt Enzyme giới hạn chỉ cắt các trình tự lặp đối xứng khi đọc theo chiều 5´-3´ trên mạch DNA (palindrome) gọi là trình tự nhận biết Vị trí điểm

cắt của enzyme giới hạn có thể nằm trong hoặc ngoài trình tự nhận biết này

*Enzyme cắt DNA tại trình tự đặc hiệu và chúng cắt cầu nối đồng hóa trị trong một chuỗi , cầu nối hydrogen giữa hai chuỗi

*Vị trí nhận biết của Enzyme : Mỗi Enzyme nhận biết và cắt DNA tại một

trình tự đặc biệt là Restriction Enzyme có thể nhận biết 4-6 hoặc 8 cặp base ,

trình tự lặp đảo là palindromicsequece

Ví dụ: enzyme EcoRI nhận biết chuỗi 6 nuclease, enzyme HaeIII nhận biết

chuỗi 4 nucleotid :

Restriction endonuclease EcoRI có trình tự nhận biết :

ê

G A A T T C - → - -G A A T T C -

- -C T T A A G - → - -C T T A A G -

-

-

MboI và Sau3AI cùng nhận biết trình tự:

BamHI nhận biết trình tự:

C,Cách cắt :

Enzyme hạn chế có thể cắt theo 2 cách:

• Các đầu dính (cohesive ends) , còn gọi là đầu lồi hay đầu so le Các

Enzyme này gồm 2 loại là Enzyme cắt tạo đầu sole 5’ cuối có đầu 5 dài

hơn mạch đơn đầu 3’(Ví dụ : EcoRI, BamHI…) và Enzyme cắt tạo đầu 3’ cuối dài hơn mạch đơn đầu 5’(Ví dụ:kpnI,PacI…) Các Enzyme này Có thể bắt cặp ngược trở lại Ví dụ: đầu dính được tạo ra nhờ PstI

• Các đầu bằng (blunt ends) , còn gọi là đầu thô Một số Enzyme cắt hai

mạch DNA tại cùng một điểm Sau khi cắt đầu bằng không có khả năng

kết hợp lại Ví dụ: đầu bằng được tạo ra nhờ HaeIII

Dùng enzyme DNA ligase của phage T4 có thể gắn lại các đầu dính hoặc

đầu bằng Tuy nhiên, trường hợp đầu bằng thường cho hiệu quả thấp vì thế người ta có thể dùng các biện pháp khác như: Gắn vào đầu bằng một đoạn bổ

sung để tạo ra đầu dính hay dùng terminal transferase Enzyme này sẽ tạo ở đầu 3’ của DNA sợi đôi một homopolymer.s

Sơ đồ:Quá trình nối các đầu cắt bởi Enzyme giới hạn

2.4,Ứng dụng:

Ứng dụng trong kỹ thuật gene : xúc tác tổng hợp DNA ,RNA hay phân cắt acid nucleic có vai trò quan trọng trong kỹ thuật tinh sạch DNA , RNA trong kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA

Sử dụng trong phương pháp Northern blotting xác định các đoạn RNA đặc

biệt với nhiệm vụ cắt phân tử DNA :

Ứng dụng trong thiết lập bản đồ cắt giới hạn :các Enzyme giới hạn cắt khu

vực bên trong của phân tử DNA tại một trình tự nucleotide nhất định và tạo hỗn

hợp các đọan DNA với kích thước khác nhau Chúng nhận biết những trình tự ngắn của DNA và cắt dúng vào vị trí phân chia , các Enzyme giới hạn khác nhau có đoạn nhận biết với những trình tự base đặc trưng khác nhau Sơ đồ mô tả các vị trí cắt khác nhau của phân tử DNA là bản đồ cắt giới hạn Ví dụ ta

muốn lập bản đồ cắt giới hạn của các Enzyme BamHI, EcoRI đối với đoạn

DNA dài 15kb kết quả thu được là nếu chỉ dùng một loại Enzyme thì DNA chỉ

được cắt làm 2 đoạn với kích thước 14-1 kb ở BamHI, 12-3 kb ở EcoRI, nhưng

nếu cắt bằng cách phối hợp 2 loại Enzyme thì DNA có thể bị cắt thành 3 đoạn khác nhau về kích thước

Enzyme giới hạn kết hợp vói Enzyme nối tạo vector tái tổ hợp: Kết quả hoạt động của enzyme hạn chế phụ thuộc rất nhiều vào độ sạch của DNA Các chế phẩm DNA còn lẫn đệm chiết, phenol hoặc EtOH sẽ làm giảm chất lượng hoạt động của enzyme

3.KẾT LUẬN

Hầu hết các phân tử ADN trong tự nhiên đều lớn hơn nhiều so với kích thước có thể thao tác và phân tích một cách thuận lợi trong phòng thí nghiệm Trong các tế bào, phần lớn các nhiễm sắc thể thường là một phân tử ADN dài chứa hàng trăm thậm trí hàng nghìn gen khác nhau Vì vậy, để có thể phân lập

và phân tích từng gen, người ta phải cắt các phân tử ADN kích thước lớn thành các phân đoạn nhỏ Và Enzyne giới hạn giữ vai trò quan trọng trong công việc thao tác với gene Quá trình nghiên cứu Enzyne giới hạn ngày càng phát triển và

có nhiều ứng dụng trong các công trình nghiên cứu khoa học cũng như trong thực tế cuộc sống

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Chu Hoàng Mậu -Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử.NXB ĐẠI

HỌC SƯ PHẠM,2005

2 TS Trần Thị Lệ,Võ Văn Quang-Giáo trình hóa sinh thực vật NXB

NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI,2006

3 Phạm Thành Hổ -Nhập môn công nghệ sinh học NXB GIÁO DỤC.

4 Mai Xuân Lương -Giáo trình Enzyme ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT.

5 Mai Xuân Lương.-Kỹ thuật gen_nguyên lý và ứng dụng NXB KHOA

HỌC VÀ KỸ THUẬT

6.Nguyễn Hoàng Lộc-Công nghệ DNA tái tổ hợp Giáo trình điện tử.

7.Tài liệu trên mạng