ENZYEME GIỚI HẠN ppt

Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme –RE) SV:Vi Thị Thơ 40cnsh 1. MỞ ĐẦU Sự sống đã xuất hiện trên trái đất hàng ngàn hàng triệu năm trước và kèm theo là những quá trình trao đổi chất diễn ra một cách liên tục từ đơn giản đến phức tạp, từ mức độ thấp đến mức độ cao.để thực hiện quá trình trao đổi chất hàng ngàn , hàng vạn các phản ứng hóa học phức tạp diễn ra một cách liên tục, nhịp nhàng liên quan chặt chẽ đến nhau, điều chỉnh lẫn nhau ở trong từng tế bào, từng cơ thể sống. Các quá hóa học đó tiến hành với tốc độ mau lẹ phi thường nhưng lại hài hòa,cân đối với sự tham gia của các chất xúc tác tự nhiên hay còn gọi là các chất xúc tác sinh học. Là chất xúc tác sinh học với bản chất là protein enzyme có tính xúc tác sinh học đặc hiệu rất cao và hiệu lực xúc tác rất lớn. Pavlov đã nói : “hoạt động của enzyme là biểu hiện đầu tiên của sự sống, không có sự sống nào lại không có quá trình tác động của enzyme ’’. Và enzyme có nhiều loại mỗi loại có một biểu hiện và chức năng hoạt động riêng của nó. Enzyme giới hạn cũng vậy , là những enzyme có mặt trong tế bào Enzyme giới hạn là đại diện quan trọng của một trong những enzyme dùng trong thao tác DNA. Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme –RE) SV:Vi Thị Thơ 40cnsh 2. NỘI DUNG 2.1. Lịch sử ,Phân loại Enzyme hạn chế (Restriction Enzyme _RE) là Enzyme thuộc nhóm Enzyme endonuclease. Enzyme hạn chế được phát hiện vào năm 1970, chúng tồn tại trong tế bào vi khuẩn, có tác dụng cắt DNA ngoại lai (ví dụ: DNA của phage) tại những điểm xác định, để tiêu diệt DNA này. Năm 1978, Arber (Thụy Sĩ), Nathans (Mỹ) và Smith (Mỹ) đã được nhận Giải Nobel nhờ phát hiện ra enzyme hạn chế và những ứng dụng của chúng để giải quyết nhiều vấn đề quan trọng của sinh học phân tử. Các enzyme này là những “chiếc kéo phân tử” có thể cắt DNA thành những đoạn xác định, đã mở ra một thời kỳ phát triển mới của sinh học hiện đại-Thời kỳ thao tác gen. Chất xúc tác sinh học, là các phân tử sinh học có bản chất protein đóng vai trò chất xúc tác cho các phản ứng biến đổi hóa sinh. Hiện nay, người ta đã tìm thấy hơn 900 enzyme hạn chế khác nhau từ khoảng 250 chủng vi sinh vật. Các enzyme hạn chế có ba loại (type): I, II và III. Loại I.Vị trí cắt nằm ngoài trình tự nhận biết một khoảng không nhất định cách xa vị trí nhận biết khoảng 1000 – 5000 base. Do không có tính đăc hiệu trong cắt đoạn nên sản phẩm của nó không đồng nhất và không phát hiện được bằng điện di trên gen. Điều kiện cần để cắt là có ATP,Mg ++ , S-AdolMet, Loại II: enzym giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ngay tại đó. Loại này được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu hiện nay.Điều kiện cần để cắt là có Mn ++, Mg ++ Loại III: enzym giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ở vị trí cách đó khoảng 10-20 nucleotit về trước. và tạo ra một số đầu cắt khắc nhau. . Điều kiện cần để cắt là có Mg ++ , S-AdolMet, Các enzyme được dùng phổ biến hiện nay thuộc type II, có cơ chế tác động đơn giản nhất. Đây là các nuclease cắt ở một vị trí đặc hiệu nằm bên trong sợi DNA (chứ không phân hủy DNA từ hai đầu), nên được gọi là endonuclease. Tên gọi đầy đủ của chúng là các restriction endonuclease type II, hay được gọi đơn giản là enzyme hạn chế (restriction enzyme, RE). Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme –RE) SV:Vi Thị Thơ 40cnsh 2.2. Đặc điểm 2.2.1.Cách gọi tên Cách gọi tên các enzyme hạn chế dựa trên các qui ước quốc tế : E Escherichia (giống) co coli (loài) R RY13 (chủng) I First identified Order ID'd in bacterium Enzym giới hạn được gọi tên dựa vào vi khuẩn mà chúng được phân lập theo cách dưới đây Tên chi và tên loài của sinh vật, mà ở đó tìm thấy enzyme, được dùng để đặt cho phần đầu của tên enzyme (viết nghiêng) bao gồm: chữ thứ nhất của tên chi và hai chữ đầu của tên loài. Ví dụ: enzyme được tách chiết từ vi khuẩn Escherichia coli thì có tên là Eco, còn enzyme được tách chiết từ vi khuẩn Bacillus globigii thì viết là Bgl…Ngoài ra, tên gọi enzyme hạn chế còn được bổ sung thêm phần sau (viết thẳng), tùy thuộc vào chủng vi khuẩn liên quan và tùy thuộc vào sự có mặt hay không của các yếu tố ngoài nhiễm sắc thể. Ví dụ: RI trong enzyme Ecori có nghĩa như sau: R là viết tắt của chủng RY13, I là bậc xác định đầu tiên trong vi khuẩn (first identified order in bacterium). Giá trị của enzyme hạn chế là ở tính đặc hiệu của chúng. Các enzyme này cắt DNA ở các vị trí nhận biết riêng biệt bao gồm từ 4-6 cặp nucleotide có trình tự đối xứng đảo ngược nhau, các đoạn ngắn này gọi là palindrome (đoạn đối xứng: là đoạn DNA có hai sợi hoàn toàn đối xứng giống hệt nhau nếu lật ngược đầu đuôi).Ví dụ: enzyme ecori nhận biết chuỗi hexanucleotide (6 nucleotide): Giống như ecori, nhiều enzyme hạn chế đã tạo ra các đoạn DNA với đầu lồi (protruding) 5’. Một số enzyme hạn chế khác (ví dụ: psti) tạo ra các đoạn DNA có đầu lồi 5’. Trong khi đó, một số enzyme hạn chế (ví dụ: smai) lại cắt ở trục đối xứng để tạo ra các đoạn DNA mang đầu bằng (DNA Mạch đôi có hai đầu sợi đơn bằng nhau) 2.2.2,Hoạt động Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme –RE) SV:Vi Thị Thơ 40cnsh a, Điều kiện hoạt động: Sự hoạt động của các Enzyme giới hạn chịu ảnh hưởng của các yếu tố như: • Ảnh hưởng của nhiệt độ: Đa số các chất enzym ở động vật có hoạt độ cao nhất ở điều kiện thân nhiệt (37 - 40 0 C). sự tăng nhiệt độ ở giới hạn thích hợp (35 - 50 0 C) Có tác dụng kích thích hoạt động của enzym tức là kích thích quá trình trao đổi vật chất. Sốt là phản ứng bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của vi trùng, thực chất là tăng cường sự hoạt động của các loại Enzyme . • Ảnh hưởng của pH: Mỗi loại Enzyme giới hạn khác nhau có độ pH thích hợp khác nhau. • Ảnh hưởng của nồng độ Enzyme và cơ chất: Người ta dùng hằng số Michaelis- Men ten để biểu diễn trạng thái phân ly của ES. • Ảnh hưởng của các chất kìm hãm :chất kìm hãm cạnh tranh và chất kìm hãm không cạnh tranh. • Ảnh hưởng của các ion kim loại : Mỗi ion kim loại hoạt hóa cho một Enzyme xúc tác một phản ứng nhất định. Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme –RE) SV:Vi Thị Thơ 40cnsh • Phản ứng của Enzyme giới hạn thực hiện trong một thể tích càng nhỏ càng đảm bảo cho Enzyme giới hạn tiếp xúc với cơ chất càng tốt hiệu quả phản ứng càng cao. Enzyme giới hạn không mang tính đặc hiệu loài , có thể nhận biết và cắt DNA của tế bào động vật, thực vật hay vi sinh vật ở trình tự 6 cặp nucleotide . • Số lượng, kích thước đoạn cắt phụ thuộc vào số vị trí giới hạn trên mỗi phân tử DNA và đặc điểm nhận biết đặc trưng của mỗi loại Enzyme giới hạn . b, Vị trí điểm cắt Enzyme giới hạn chỉ cắt các trình tự lặp đối xứng khi đọc theo chiều 5´-3´ trên mạch DNA (palindrome) gọi là trình tự nhận biết. Vị trí điểm cắt của enzyme giới hạn có thể nằm trong hoặc ngoài trình tự nhận biết này. *Enzyme cắt DNA tại trình tự đặc hiệu và chúng cắt cầu nối đồng hóa trị trong một chuỗi , cầu nối hydrogen giữa hai chuỗi *Vị trí nhận biết của Enzyme : Mỗi Enzyme nhận biết và cắt DNA tại một trình tự đặc biệt là Restriction. Enzyme có thể nhận biết 4-6 hoặc 8 cặp base , trình tự lặp đảo là palindromicsequece. Ví dụ: enzyme EcoRI nhận biết chuỗi 6 nuclease, enzyme HaeIII nhận biết chuỗi 4 nucleotid : Restriction endonuclease EcoRI có trình tự nhận biết : ê G A A T T C → - G A A T T C - C T T A A G → - C T T A A G Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme –RE) SV:Vi Thị Thơ 40cnsh - - MboI và Sau3AI cùng nhận biết trình tự: BamHI nhận biết trình tự: C,Cách cắt : Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme –RE) SV:Vi Thị Thơ 40cnsh Enzyme hạn chế có thể cắt theo 2 cách: • Các đầu dính (cohesive ends) , còn gọi là đầu lồi hay đầu so le. Các Enzyme này gồm 2 loại là Enzyme cắt tạo đầu sole 5’ cuối có đầu 5 dài hơn mạch đơn đầu 3’(Ví dụ : EcoRI, BamHI…) và Enzyme cắt tạo đầu 3’ cuối dài hơn mạch đơn đầu 5’(Ví dụ:kpnI,PacI…). Các Enzyme này Có thể bắt cặp ngược trở lại . Ví dụ: đầu dính được tạo ra nhờ PstI • Các đầu bằng (blunt ends) , còn gọi là đầu thô. Một số Enzyme cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm. Sau khi cắt đầu bằng không có khả năng kết hợp lại. Ví dụ: đầu bằng được tạo ra nhờ HaeIII Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme –RE) SV:Vi Thị Thơ 40cnsh Dùng enzyme DNA ligase của phage T4 có thể gắn lại các đầu dính hoặc đầu bằng. Tuy nhiên, trường hợp đầu bằng thường cho hiệu quả thấp vì thế người ta có thể dùng các biện pháp khác như: Gắn vào đầu bằng một đoạn bổ sung để tạo ra đầu dính hay dùng terminal transferase. Enzyme này sẽ tạo ở đầu 3’ của DNA sợi đôi một homopolymer.s Sơ đồ:Quá trình nối các đầu cắt bởi Enzyme giới hạn Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme –RE) SV:Vi Thị Thơ 40cnsh 2.4,Ứng dụng: Ứng dụng trong kỹ thuật gene : xúc tác tổng hợp DNA ,RNA hay phân cắt acid nucleic có vai trò quan trọng trong kỹ thuật tinh sạch DNA , RNA trong kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA. Sử dụng trong phương pháp Northern blotting xác định các đoạn RNA đặc biệt với nhiệm vụ cắt phân tử DNA : Ứng dụng trong thiết lập bản đồ cắt giới hạn :các Enzyme giới hạn cắt khu vực bên trong của phân tử DNA tại một trình tự nucleotide nhất định và tạo hỗn hợp các đọan DNA với kích thước khác nhau. Chúng nhận biết những trình tự ngắn của DNA và cắt dúng vào vị trí phân chia , các Enzyme giới hạn khác nhau có đoạn nhận biết với những trình tự base đặc trưng khác nhau . Sơ đồ mô tả các vị trí cắt khác nhau của phân tử DNA là bản đồ cắt giới hạn. Ví dụ ta Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme –RE) SV:Vi Thị Thơ 40cnsh muốn lập bản đồ cắt giới hạn của các Enzyme BamHI, EcoRI đối với đoạn DNA dài 15kb kết quả thu được là nếu chỉ dùng một loại Enzyme thì DNA chỉ được cắt làm 2 đoạn với kích thước 14-1 kb ở BamHI, 12-3 kb ở EcoRI, nhưng nếu cắt bằng cách phối hợp 2 loại Enzyme thì DNA có thể bị cắt thành 3 đoạn khác nhau về kích thước. Enzyme giới hạn kết hợp vói Enzyme nối tạo vector tái tổ hợp: Kết quả hoạt động của enzyme hạn chế phụ thuộc rất nhiều vào độ sạch của DNA. Các chế phẩm DNA còn lẫn đệm chiết, phenol hoặc EtOH sẽ làm giảm chất lượng hoạt động của enzyme 3.KẾT LUẬN Hầu hết các phân tử ADN trong tự nhiên đều lớn hơn nhiều so với kích thước có thể thao tác và phân tích một cách thuận lợi trong phòng thí nghiệm. Trong các tế bào, phần lớn các nhiễm sắc thể thường là một phân tử ADN dài chứa hàng trăm thậm trí hàng nghìn gen khác nhau. Vì vậy, để có thể phân lập và phân tích từng gen, người ta phải cắt các phân tử ADN kích thước lớn thành các phân đoạn nhỏ. Và Enzyne giới hạn giữ vai trò quan trọng trong công việc thao tác với gene. Quá trình nghiên cứu Enzyne giới hạn ngày càng phát triển và có nhiều ứng dụng trong các công trình nghiên cứu khoa học cũng như trong thực tế cuộc sống. [...]...Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme –RE) SV:Vi Thị Thơ 40cnsh TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Chu Hoàng Mậu -Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử.NXB ĐẠI HỌC SƯ PHẠM,2005 2 TS Trần Thị Lệ,Võ Văn Quang-Giáo . Enzyme giới hạn cũng vậy , là những enzyme có mặt trong tế bào Enzyme giới hạn là đại diện quan trọng của một trong những enzyme dùng trong thao tác DNA. Enzyme giới hạn. định. Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme –RE) SV:Vi Thị Thơ 40cnsh • Phản ứng của Enzyme giới hạn thực hiện trong một thể tích càng nhỏ càng đảm bảo cho Enzyme giới hạn tiếp. nhau) 2.2.2,Hoạt động Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme –RE) SV:Vi Thị Thơ 40cnsh a, Điều kiện hoạt động: Sự hoạt động của các Enzyme giới hạn chịu ảnh hưởng của các