Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Nghiên cứu phương pháp điều chế nước rửa rau sinh học từ thịt trái cây bồ hòn (Sapindus mukorossi)

TÓM TATNghiên cứu này được tiễn hành dé nghiên cứu phương pháp điều chế nước rửa rausinh học từ thịt trái cây bồ hòn bằng cách phối trộn dịch chiết saponin từ thịt trái bồ hònvà acid cit

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP DIEU CHE

NƯỚC RUA RAU SINH HỌC TỪ THỊT TRAI CÂY BO HON

(Sapindus mukorossi)

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HQC MOI TRUONG

Sinh viên thực hiện : LE NHỰT TRUONG

Mã số sinh viên : 17126168

Niên khoá : 2017 - 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP DIEU CHE

NƯỚC RỨA RAU SINH HỌC TỪ THỊT TRÁI CÂY BÒ HÒN

(Sapindus mukorossi)

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiện

TS NGUYÊN NGỌC HÀ LÊ NHỰT TRƯỜNG

TP Thủ Đức, 03/2023

LỜI CẢM ƠN

Dé hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành vasâu sắc tới cô TS Nguyễn Ngọc Hà — Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môitrường đã tận tình hướng dẫn, giản dạy, chỉ bảo và giúp đỡ cho em trong suốt quá trìnhthực hiện khoá luận.

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Khoa học Sinh học đã tậntình giảng day truyền đạt kiến thức trong những năm em học tập Những kiến thức này

đã cho em nền tản dé làm nghiên cứu cũng như là hành trang kinh nghiệm cho sau này

Tiếp theo, em xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Thuy Dung, chị Thái Thi Thu Thuy,cũng như các bạn sinh viên khoá 17 và các bạn sinh viên khác của tập thé phòng LabRIBE 106 đã đồng hành, hỗ trợ và giúp đỡ cho em hoàn thành tốt khoá luận

Kết tiếp, em xin cảm ơn Cô, Anh và các bạn sinh viên của phòng vi sinh thuộc

Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã hỗ trợ chỉ dạy em trong nghiêncứu khoa học dé hoàn thành khoá luận

Cảm ơn cô TS Hồ Thị Trường Thy của khoa Thuỷ sản đã hướng dẫn và tạo điềukiện cho em đề thực hiện hoàn tất khoá luận tốt nghiệp

Cuối cùng con xin cảm ơn gia đình đã luôn là chỗ dựa vững trãi cho con trong suốtchặn đường học tập, gia đình luôn ở bên cạnh con là động lực to lớn giúp con vượt quanhiều khó khăn, cũng như giúp con hoàn thành khoá luận nảy

Mặc dù đã có nhiều cố gang dé hoàn thiện khoá luận nhưng bài báo cáo này van

còn nhiều thiếu sót, em mong nhận được ý kiến đóng góp của quý Thay, Cô dé khoáluận của em được hoàn chỉnh hơn.

Cuối cùng em xin kính chúc quý Thầy, Cô khoa Khoa học Sinh học luôn đạt nhiềuthành công to lớn trong các nghiên cứu khoa học Kính chúc toàn thể Thầy, Cô và BanGiám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đạt được nhiều thành công trong

sự nghiệp giảng dạy.

Em xin chân thành cảm ơn !

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên Lê Nhựt Truong, MSSV: 17126168, Lớp: DHI7SM (email

17126168@st.hcmuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đạihọc Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là khoá luận tốt nghiệp do bảnthân tôi thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực vàkhách quan Tôi xin chịu trách nhiệm trước hội đồng về những cam kết này

Tp Hô Chi Minh, ngày thắng năm

Người việt cam đoan

il

TÓM TATNghiên cứu này được tiễn hành dé nghiên cứu phương pháp điều chế nước rửa rausinh học từ thịt trái cây bồ hòn bằng cách phối trộn dịch chiết saponin từ thịt trái bồ hòn

và acid citric Dịch chiết được chiết bằng phương pháp sử dụng mấy khuấy từ (MagneticStirrer) với các điều kiện chiết xuất sau khi được khảo sát thì tốt nhất là dùng dung môinước với tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi 1 : 8 và thời gian khuấy là 6 giờ Khao sát nồng độ

ức chế tối thiểu (MIC) của saponin có trong dịch chiết từ thịt trái bồ hòn và acid citric

bằng đĩa 96 giếng đối với E.Coli và Salmonella đề phối trộn nước rửa rau Kết qua

saponin có trong dịch chiết có nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với Salmonella là 0,2mg/ml, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của aicd citric đối với Salmonella là 2 mg/ml vàE.Coli là 4 mg/ml Từ nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) phối trộn hai loại nước rửa rau từdịch chiết có nồng độ saponin trong đó là 16,51 mg/ml và acid citric là nước rửa rau A

có 1 % saponin và 10 % acid citric và nước rửa rau B có 1 % saponin và 20 % acid citric.

Tiến hành kiểm tra khả năng lại bỏ vi khuẩn của hai loại nước rửa rau được tạo ra bằngcách cho rau rửa với hai loại nước rửa rau, phân tích vi khuẩn có trong mẫu so với mẫuđối chứng không rửa bằng nước rửa rau Kết quả hai loại nước rửa rau đều có khả năng

loại bỏ vi khuẩn tốt, đặt biệt là loại bỏ được phan lớn lượng vi khuẩn Salmonella Giữahai loại nước rửa rau A và B thì nước rửa rau B có nồng độ 1 % saponin và 10 % acidcitric có hiệu quả kinh tế tốt hơn được ứng dụng trong việc sản xuất

Từ khoá: Bo hon, saponin, nước rửa rau, acid citric.

11

This study was conducted to study the preparation of biological vegetable washwater from Sapindus mukorossi fruit meat by mixing saponin extract from Sapindus mukorossi fruit meat and citric acid The extract was extracted using the Magnetic Stirrer method with the conditions of extraction after examination, it was best

to use a water solvent with a ratio of raw material / solvent 1: 8 and the mixing time was

6 hours Researched the minimum inhibitory concentration (MIC) of saponins contained

in the extract of Sapindus mukorossi fruit meat and citric acid with a 96 well plate for E.Coli and Salmonella for mixing with vegetable water The minimum inhibitory concentration (MIC) of saponins in the extract for Salmonella was 0.2 mg/ml, the minimum inhibitory concentration of aicd citric for Salmonella was 2 mg/mL and E Coli was 4mg/ml From the minimum inhibitory concentration (MIC), mix two types of vegetable washing water from a saponin extract with a concentration of 16.51 mg/ml and citric acid, vegetable washing water A with 1 % saponins and 10 % citric acids and

vegetable washing water B with 1% saponines and 20% citric acids Conduct a test of

the bacterial removal of two types of vegetable washing water generated by washing the vegetable with two kinds of water, bacterial analysis present in the sample compared to

the non-washed control sample with vegetable washing water The resulting two types

of vegetable washing water had a good ability to eliminate bacteria, in particular removing most of the Salmonella bacteria Between the two types of water A and B,

water B had a concentration of 1% saponins and 10% citric acid with better economic

efficiency applied in production.

Keywords: Sapindus mukorossi, saponin, vegetable washing water, acid citric.

1V

MỤC LỤC

tS As): aes a ea a a a era aes i

KÁC NHẬN VA CAM DOA IN vicencccenn coxcrnnetecnnncxnmamacetoncnmcenanenesercseas ii

¡y1 — Ô ,LÔỎ iiiABSTRACT zing cure en aE ane Wer ERR iv

GCI RUC i a 3o2iS8EG098-406400:36445881038059880:2008880x8iS83082u3-2303,/220908630SD#BbEuISESE.47 VDANE SÁCH CAG CHỮ VIET TAT buuendoesbinhnhgioiiAi01310605i600g805901861300086040043000008600 viiiDANH SÁCH CAC BANG 2.0 sssssssssssssesssssesnesessssneeseessnesesssnessesssniteseessnissessssenses ixTET BS CA) BN qụoautayvouitittzoidii5200408/000408003001810048/804p38000900481606080180 s40 x

TT: BE TẠI Tế n;ÿŸ“# nan nininaes.rianaemaiaoeadssajaaioinrrjaorasearaogi ]

a | «.ceosssesccstiniesoikeduetosZiksizBorGiiotiskisdicbtdkoflizlusiS2i,sso2xlisodtinugdsskosiglisdssii 51.3 NO1i dung 800.4 111 — 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆỆU 2- 22 ©2222222EE22EE22EE22EE222E222222zxzzze 3

2.1 Tổng quan về cây bổ hòn - 2 2-522©2222222E22E22EE22122E2EEEEEEEerkrrrrerrrrrrerrerve.T

eC Lr:2.1.2 Đặc điểm hình thai cccccceccecsessessessessecsessessessessessessessessnssesstssessessessesaeeaeees 32.2 Thanh phan hoá học của trai cây bồ hòn Sapindus mmuÑoroSsi - 42.2.1 Tính chất hoá học của saponin trong trái bồ hòn -2- 2: 22522 s25zz2zz+2 42.2.2 Ứng dụng của saponin trong trái b6 hồn - 2 2-c<c-scccezerercedrrerrrsscre 52.2.3 Các cách tách chiết saponin trong trái bồ hòn -2- 2¿©2222222z222222E2zz22zz+2 52.3 Téng quan vé nue rita rau 8n 6 62.3.1 Sơ lượt vé nước rửa rau oe ececceccecsessessessessessessessessessessessessessessesiessesiessesseesesaeees 63.3 ÍÔts0:mphiễn cm we mTÖE TÍN ĐEN seccoesecsszbeecbos00100502501G28201246L696304G03550000168580g000 62.4 Téng quan v6 acid na 62.4.1 Sơ lượt về acid €ïẨTiC 5-5252 S2 23222235212232112122121121211212121121121211211111 21 c0 6

2.4.2 Tính kháng khuẩn của acid €iẨriC 2: 2222222222EE22E22EE22EE2EE2232221223 22x, 72.5 Sơ lượt về vi khuẩn gây ngộ AGC e.ceececcceccc ccc essesssssessessesseessessesstessesstesseeseesteesees 82.5.1 E.Coli gay tidu chay 6 ion 8

2.5.2 Salmonella gây bệnh trên nBƯỜI - - + + + xen rerrrrrkrrkrrkre 9CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 2©2222222E2E22222E22222222ze 113.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2: 2¿©22222+2E+2EE22E+2EE22E2EE2ZEzrxzrrcrex 11

Su “Wah IS Wis NCCU ssueon sanctions omenuemn cuoniesinaeunius aoc stimunautoauamnbninnactaiioentacbatanntte 113.2.1 Đối tượng nghiên CU eee cece essesssessesssessesseessessesesessesssessesstetiessesseseessneesess 11

3.2.2 Chuẩn bị khuẩn thử nghién cece cece cceeeeeee eee eeeeseeeseeeeeseeeeseesseeseeneeeseees 11

3.2.3 Dụng cu và thiét Di ccceccccccceecsssessssssssuesnesnesnsssssnestesnssssssssssesssssseseeeseseesees 113.2.4 Hod Chat ccccccccceesessesssesesssesessesseesessesseereessssenssesessesieesssresseeseesesissisessteeeseeseees 113.3 PHưƯỚñg phap nñghiễN ÉỮÚssssaeessasbosriidiidnieiiolintEiagi0520i081-553000053981618300184 12 SeSele DCU lý ñgu0vfi NOU eens evarsasieieeeer mene ieee 123.3.2 Khao sát dé lay dịch chiết saponin từ thịt trái bồ hòn tốt nhất - 123.3.3 Xác định khối lượng cao chiẾt 22-52 22S2E25211231251211221221211211211 21.22 xe 133.3.4 Xác định saponin có trong dịch chiẾt - 2: ©22222222222222E22E22E222222xczzver 133.3.5 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC -2- 2©22+222222222E222222222z22zcxe2 143.3.6 Phối trộn tạo nước rita TaU - 2 +Ss+S22E9EE+E2E5212212121112121112121 1221 xe, 15

St ri (Cac bl TH TP eee eee 16

3.3.8 Phương pháp phân tích vi khuân -2- 25222+22E22E+2EE22E2Exerxrzrrerreer 17

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN ©-222222222E222E22222732222222222e2 18

4.1 Điều kiện chiết xuất từ thịt trái cây Bồ Hòn 2 22222222222222zzz+zze2 184.1.1 Lượng cao chiết thu đưỢC - 2 2+S+S22E2E2E125121121121121121121121121121 21.21 e 18l6 co a g gaa.aD Ả 194.1.3 Tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi tối tu - 2 2¿222+22+2E+2E+2EE+2E++E+zEzzzzzzse2 19

VI

4.1.4 Khao sát thời gian chiẾt -22- 52522 22222122E122122312212211211221211211 2122121 cre 20

4.1.5 So sánh phương pháp chiết của ethanol với nước khi cùng điều kiện 21

42 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch chiết saponin và acid citric đối với vi khuẩn 22

2.5.3 Hiệu quả loại bỏ vi khuẩn của nước rửa rau 2 25s+2222£2E+£z+£+zxzzzzzzzx4 25

4.3.1 Hiệu quả của nước rửa rau về mặt cảm quan 2: 2¿22222z+2zzzzzzzzz>z+2 254.3.2 Hiệu qua của nước rửa rau về việc loại bỏ vi khuẩn 2552 s+czzzscsec 29CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ, 2-5225 SesEEsrsreerrrrrreree 345.1 Kết luận 25-222 E2212211211211211211211211211211211212112112112112112111 1 re 34

SS guaauaagnasaaeoostentrgoosBdorotinodiioiitEsdton9000n0xinaussem 34TÀI LIEU KHAM KHẢO ©2222 SS2E22EE2EE22E12251221221211211211211211211211 212 c6 35

PT sen yneensooisooa tC00L-TEERSDSETĐEE TOXNNGGISSIGBOISUBSSEGESRIG-IGERGIGNGHESGGSEGHSSSNM/ĐE2BHNSEE 37

Vil

DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT

ANOVA Analysis of Variance, phân tích phương sai

MIC Minimum Inhibitory Contrentration, Nồng độ ức chế tối thiểu

SD Standard Deviation, độ lệch chuẩn

ctv Cộng tác viên

vill

Bảng 2.1.

Bảng 2.2.

Bảng 2.3.

Bảng 4.1.

Bảng 4.2.

Bảng 4.3.

Bảng 4.4.

Bảng 4.5.

Bang 4.6.

Bang 4.7.

Bang 4.8.

DANH SACH CAC BANG [3i15i0) ly;1181ai1ien 711700 ỐỔỐŠỐŠỐẻ Ốẻẻẻẻẽẻẻẽ 3 Phân loại vi khuân FCO co icnEn Si ho gHH HH hgg 0.00380111006611 266 8 Phân loại vi khuân Salmonella -2- 2s 2S+SE+E£EE£EE2E£E£EE2EZE2EEZErxerree 9

Khối lượng cao chiết thu được của các loại AUG! ST TC Ta 18

Khối lượng cao chiết thu được của các tỉ lệ nguyên liệu/ dung mdi 18

Khối lượng cao chiết thu được của các móc thời gian - 18

Khối lượng saponin thu được của các loại dung môi - 2-22 22 19 Khối lượng saponin thu được của các tỉ lệ nguyên liệu/ dung méi 20

Khối lượng saponin thu được sau khi chiết qua các khoảng thời gian 20

Kết quả so sáng của dung môi nước và ethanol 60% . -¿ 21

Nồng độ ức chế tối thiểu của MIC của dich chiết saponin và acid citric 23

1X

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây bồ hịn Sapindus 0w11ÄfOSi -5222-5522222E2222222322322212212211211222222e 3Hình 2.2 Cơng thức cấu tạo của saponin - 2: 22©22+22222++E++2E+2EE22E+22E22E2Exzrrces 4Hình 2.4 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn E CGÏi 525-522S22E£EE£E22E£EE2E22E222222222zE §Hình 2.4 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn ,S4zwowiella 2-52-5255S2222222£22£zzzzzszsz 9Hình 3.1 Thịt quả cây bồ hịn Sapindus tmwkOrOsSỉ 25-552©222522222222cSzzzscc+2 lãiHinh 3.2 Quy trink rita rau eee 16Hình 4.1 MIC của dich chiết saponin và acid citric đối với Ƒ Cọi 22Hình 4.2 MIC của dịch chiết saponin va acid citric đối với Salmonella 23Hình 4.3 Mẫu rau đối chứng - 2-2 22S22SE22EE2EE222122121122112112212211211221211 22220 25Hình 4.4 Mẫu rau nghiệm thức rửa bằng nước muối 1% -: -z+c+z 26Hình 4.5 Mẫu rau được rửa bằng nước rửa rau A -++c-+++cxxsrrxrsrrrre 26Hình 4.6 Mẫu rau được rửa bằng nước rửa rau B 2 ++cc+tsrrxrrrrrrrrrrree 27Hình 4.7 Hình nước muối 1 % trước và sau khi đùng 2 222+222z22zzzz+z+2 28Hình 4.8 Hình nước rửa rau A trước và sau khi dùng . -<-< - 28

Hình 4.8 Hình nước rửa rau B trước và sau khi dùng . -+-cc+cceeee+ 29Hình 4.10 Kết quả phân tích E.Coli của mẫu ở mật độ vi khuẩn pha lỗng 10'1 30Hình 4.11 Kết quả phân tích E.Coli của mẫu ở nơng độ vi khuẩn pha lỗng 102 31Hình 4.12 Kết quả phân tích Salmonella của mẫu - 2 2-©5222222222+22zz22z2 32Hình 4.13 Nước rửa rau A trước va sau khi pha lỗng 50 lần - 33

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hàng năm, trong cuộc sống thường nhật của mọi người thì trên đất nước có hàngngàn ca ngộ độc thực phẩm diễn ra có nhiều nguyên nhân khác nhau Trong những

nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm chính là dư lượng thuốc trừ sâu (Đỗ Đức

Ding va ctv, 2016) cùng với vi sinh vật chủ yếu là hai loại vi khuẩn E Coli và Salmonella(Trần Thị Hằng và ctv, 2020), những tác nhân đó thường có mặt trên các loại rau củ quả.Tình trạng ói mửa, tiêu chảy, chóng mặt thường là dấu hiệu chính của ngộ độc thựcphẩm Dé giải quyết các tình trạng trên thì phương pháp đơn giản nhất để giải quyết là

dùng các loại nước rửa dé làm sạch các loại thuốc trừ sâu và các vi sinh vật có trong rau

củ quả Đối với người tiêu dùng thường sử dụng nước muối dé rửa rau củ quả cho việctiêu thụ hằng ngày, nhưng khi sử dụng nước muối dé rửa rau củ thì trên rau củ nếu nước

muối quá mặn sẽ tồn động lại một lượng muối nhỏ sử dụng lâu dài sẽ không tốt Trên

thị trường hiện nay thì có nhiều loại nước rửa rau khác nhau nhưng chủ yếu là có thànhphan hoá học vậy nên việc tìm ra phương pháp điều chế nước rửa rau có nguồn gốc thiênnhiên là cấp thiết

Trong các loài cây trong thiên nhiên thì cây bồ hòn được cho là cây có khả tốttrong việc sử dụng là chất tây rửa tự nhiên Việc ứng dụng trong chất tây rửa của bồ hòn

là do trong trái của nó có chứa nhiều chất hoạt động bề mặt từ thiên nhiên (Sidra-TulMuntaha và ctv, 2015) Cũng đã có nhiều nghiên cứu sử dụng trái bồ hòn dé là chat tayrửa như là sử dụng dịch chiết xuất saponin từ quả bồ hòn để tạo nước rửa chén (Lê ThịNha, 2109) Ngoài ra trái bồ còn có nhiều công dụng khác như có kha năng diệt khuẩn

và diệt công trùng tét , trái bồ còn có nhiều ứng dung trong y học khi nó có thé làm cácloại thuốc chữa trị bệnh (Bhanubhai Suhagia và ctv, 2011) Trái cây bồ có nhiều côngdụng tốt lại là loại nguyên liệu thiên nhiên lại không có nhiều tác dụng phụ là loại nguyênliệu thích hợp là nước rủa rau tự nhiên, vì thế nghiên cứu này được thực hiện nhằm

nghiên cứu ra nước rửa rau từ thịt trái cây bồ hòn

1.2 Mục tiêu đề tài:

Nghiên cứu được quy trình điều chế nước rửa rau từ thịt trái cây bồ hòn (Sapindus

mukorossi).

1.3 Nội dung thực hiện:

Có 3 nội dung thực hiện:

Nội dung 1: Khảo sát điều kiện chiết xuất từ thịt trái cây Bồ Hòn (Sapindusmukorossi).

Nội dung 2: Khao sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dich chiết của trái Bồhòn và acid citric đến vi khuẩn có trong rau

Nội dung 3: Tạo hỗn hợp nước rủa rau có khả năng diệt khuẩn từ của trái Bồ hòn

và acid citric đên khả năng loại bỏ vi khuân có trong rau.

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tổng quan về cây bồ hòn

2.1.1 Tên gọi, nguồn gốc

Cây bồ hòn còn được gọi là vô hoạn thụ

hay bon hòn có tên khoa học là Sapindus

mukorossi thuộc họ Sapindaceae Cây bồ hòn

phân bồ rải rác chủ yếu ở những vùng á nhiệt

đới và nhiệt đới như An Độ, Malaysia và

Srilanca Loài cây bồ hòn này phân bố ở nước

ta chủ yếu mọc nhiều ở những vùng núi trung

du như Tuyên Giang, Bắc Giang, Thanh Hóa,

Thái Nguyên, Hà Tĩnh, Nghệ An, Yên Bái, Hình 2.1 Cây bồ hòn Sapindus mukrossi

cánh hình trứng có vảy ngắn ở gốc có lông không nở xoè, nhị 8 cong đài hơn tràng, bầuhình trứng nhẫn có 3 6 Quả gồm ba quả hạch nhưng hai tiêu giảm đi, chỉ còn một hình

tròn, vỏ quả màu vàng nâu nhạt, da nhăn nheo, trong chứa một hạt màu đen, hình cầu

Mùa hoa của cây là từ tháng 7 - 9, mùa quả của cây từ tháng 10 - 11 (Đỗ Tất Lợi, 2004)

2.2 Thành phan hoá học của trái cây bồ hòn Sapindus mukorossi

Trái cây của cây bồ hòn có thành phần chính là đường chiếm 10 % và chất nhay

và phần lớn các saponin chiếm từ 10 — 11,5 (Aparna Upadhyay và ctv, 2012) Hạt bồhòn chứa 23 % dầu, trong đó 92 % là chất béo trung tính, phần tryglycerid chứa 30 %oleo-palmito-arachidin glycerid, 13,3 % oleo-diarachidin glycerid và 56,7 % glycerid

loại di-olein như dioleo-palmitin, dioleostrearin và dioleo-arachidin (Bhanubhai

Suhagia va ctv, 2011) Trong thịt quả có tới 18 % saponosid Saponin mukorosinCsoHg4011.2H2O đã được chiết ra đưới dang kết tinh và sau khi thủy phân cho ra genin

là hederagenin và đường là L — arabinose, DI — glucose, L — rhamnose, và D — xylose.Các sapindosid có trong bồ hòn như sapindosid A, B, C, D, E, El, X, Y, Y2 đều lànhững saponin triterpen Ngoài ra còn có mukuroyiosid la, Ib, Ha, IIb là những saponin

có hoạt tính bề mặt mạnh (Sidra-Tul Muntaha và ctv, 2015) Nhiều phương pháp chiếtxuất saponin từ quả bồ hòn đã được mô tả, trong đó phương pháp đơn giản nhất là đunsôi bột quả với nước, cô đặc dịch chiết và tủa saponin bang sulfat amoni (Sidra-TulMuntaha va ctv, 2015).

2.2.1 Tinh chất hoá học của saponin trong trái bồ hòn

Araz-Rhas-Xyls-OAc 5 OH CH, H H Arag-Rhag-Xyly-OAc 6 CHẠOH H H

vỏ quả bồ hòn được biểu dién trong hình 2.2 Cac saponin có trong trái bồ có công thức

cấu tạo gồm: CaiHo6O12, C¿øHz4Ois, CasH76O17, CsoH7sO1s, Cs3Hs6Ox, CsgHo4O2,CsoHs;Oas Thành phan phan trăm của các nguyên tổ có trong saponin là 51 % O, 44 %

C, 6 % H Saponin có một đầu ưa nước, một đầu ky nước nên có hoạt tính bề mặt Vì

saponin là chất có hoạt tính bề mặt, nên nồng độ micelle tới hạn của chúng được tìm

thấy là 0,1 % Saponin được xem như acid yếu trong tự nhiên Quá trình thủy phân của

glycoside trong saponin được cho là nguyên nhân của tính acid yếu đó (Sidra-TulMuntaha và ctv, 2015).

2.2.2 Ứng dụng của saponin trong trái bồ hòn

Ứng dụng trong y học: Trái bồ hòn là nguyên liệu thường được sử dụng để chế tạo

nhiều thuốc chữa bệnh như tiết nhiều nước bọt, nổi mụn, động kinh, đau nửa đầu, bệnhchàm và bệnh vay nến Hạt của trái bồ hòn thì thường được sử dụng dé đều trị các bênh

như: sâu răng, viêm khớp, cảm lạnh thông thường, táo bón và buồn nôn (Aparna

Upadhyay và ctv, 2012).

Ứng dụng trong kháng khuẩn: chiết xuất saponin của trái bồ hòn có khả năng tốttrong việc kháng lại các vi khuẩn như Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Proteusvalgaris, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli va Klebsiella pneumonia (Meesala Srinivasarao va ctv, 2015).

Ung dung la chat hoat động bề mặt: Saponin từ trái bồ hòn có hoạt tính tây rửa khá

mạnh do chúng có chứa nhóm phân cực và không phân cực Do vậy, dung dịch chiết

xuất từ quả bồ hòn được sử dụng rộng rãi làm chất tay rua (Pham Hoang Danh va ctv,

2021), lam sach vét ban (Nguyén Ngoc Thang va ctv, 2021)

2.2.3 Các cách tách chiết saponin trong trái bồ hòn

2.2.3.1 Phương pháp ninh chiết

Phương pháp này được thực hiện bằng cách ngâm trái bồ hòn trong nước trong 14giờ sau đó được ninh chiết trong thiết bị Ti — Color I ở nhiệt độ 100 °C trong 30 phút dénguội lọc lấy dịch chiết lần 1 Phần trái bồ hòn sau lọc được nghiền nhuyễn sau đó đượcthêm nước và tiếp tục ninh chiết thêm 30 phút dé nguội và lọc lay dịch chiết lần 2, sau

đó trộn đều dịch chiết lần 1 với dịch chiết lần 2 để thành hỗn hợp dịch chiết (NguyễnNgọc Thắng và ctv, 2021)

2.2.3.2 Phương pháp chiết bằng máy khuấy từ

Phương pháp này được thực hiện bằng cách trộn bột bồ hòn đã được nghiền nhuyễn

với các dung môi theo các tỉ lệ rắn — lỏng khác nhau Với các loại dung môi như nước,

nước sôi 100 °C, ethanol, ethanol — nước, acetone va tỉ lệ rắn — lỏng gồm 2 tỉ lệ 1 : 10

và 1 : 20 Hỗn hợp giữa bột bồ hòn và dung môi được đặt trên may khuấy từ và khuấy

liên tục trong 6 giờ Sau đó lọc bỏ cặn thì ta thu được hỗn hợp dịch chiết (Merve DenizKose va ctv, 2016).

2.3 Tong quan về nước rửa rau

2.3.1 Sơ lượt về nước rửa rau

Nước rửa rau củ quả là các loại nước chứa các thành phan tay rửa thân thiện cho

con người và môi trường thường được dùng cho rau củ quả, thành phần của nước rửa

rau củ quả chủ yếu là các chất như: nước khử ion, acid citric, sodium, hương liệu Cácthành phần này có khả năng làm sạch các loại bụi ban, thuốc trừ sâu và các loài vi sinhvật mà nước thường không rửa được Trên thị trường thương mại đã xuất hiện nhiều loạinước rửa rau khác nhau có thành phần và nguồn gốc khác nhau đang được sử dụng.2.3.2 Một số nghiên cứu về nước rửa rau

2.3.2.1 Ứng dụng của bã đậu nành và bột hạt trà trong việc tạo nước rửa rau

Trong nghiên cứu này bã đậu nành và bột hạt trà được sử dung dé chiết xuất ra

saponin dé sử dụng làm nước rửa rau nhằm loại bỏ dư lượng thuốc trừ sâu có trên rau

củ quả Đầu tiên thì bã đậu nành với bột hạt trà được chiết xuất trong điều kiện là dungmôi ethanol 80 % với tỉ lệ rắn lỏng của bã đậu nành là 1 : 20 và bột hat trà là 1 : 10 trong

15 phút ở nhiệt độ 25 °C dé cho ra lượng saponin dùng dé pha vào trong nước rửa rau.Rau củ sau khi rửa qua nước rửa bằng phương pháp sục khí có lượng saponin trong nước

là 0,1 mg/ml được chiết từ bã đậu nành hoặc bột hạt trà cho kết quả dư lượng thuốc trừsâu bị loại bỏ đáng kế (Wei-Han Hsu, 2022)

2.3.2.2.Ứng dụng của chế phẩm nisin trong việc rửa rau

Chế phẩm nisin là một peptit kháng khuẩn đa vòng, được cấu tạo từ 34 gốc axitamin Các loại axit amin phổ biến có trong phân tử nisin là lanthionine (Lan),methyllanthionine (MeLan), didehydroalanine (DHA) và axit didehydroaminobutyric(Dhb) Thi trong nghiên cứu nay chế phẩm nisin được pha vào nước dé làm sạch vikhuẩn trên rau xa lách với nồng độ thử nghiệm là 9,765 ug/ml, ngâm rau trong nước rửa

10 phút thì có thé loại bỏ 97 — 100 % vi khuẩn gây bệnh trên rau xà lách (Nguyên KhoaĐăng và ctv, 2018).

2.4 Tống quan về acid citric

2.4.1 Sơ lượt về acid citric

Acid citric là một acid hữu cơ yếu được coi là một chất bảo quản tự nhiên thường

sử dụng để tạo vị chua cho các loại thực phẩm hay các loại nước ngọt Trong tự nhiên

6

acid citric tồn tại trong rất nhiều loại rau củ quá khác nhau nhưng chủ xuất hiện ở cácloại quả của chi Citrus, cụ thể thì acid citric xuất hiện nhiều ở các loài chanh, cam và

bưởi trong đó thì đối với chanh thì lượng aicd citre chiếm tới 8 % khối lượng của chúng

Công thức phân tử của acid citric là CeHgO7, khi ở nhiệt độ phòng thi acid citric

là chất kết tinh có màu trang Acid citric có thể tồn tại ở hai dang khác nhau là dạngkhan hay dạng ngậm một phân tử nước (monohydrat) Dạng khan kết tinh từ nước nóng,trong khi dạng monohydrat hình thành khi acid citric kết tinh từ nước lạnh Dạngmonohydrat có thê chuyên hóa thành dạng khan khi nung nóng tới trên 74 °C Khi acidcitric bị nung nóng trên 175 °C, nó bị phân hủy dé giải phóng dioxide cacbon và nước

Thông thường thì acid citric duoc ứng dụng trong việc ngăn ngừa việc oxy hoalàm nâu hoá trái cây cho nhiều loại trái cây dựa trên khả năng điều kiến các enzyme hoánâu ở trái cây của acid citric (Weerayuth Suttirak và Supranee Manurakchinakorn, 2010) Nhờ vào tính hoá ly của acid citric là do ba nhóm cacboxylic và một nhómhydroxyl của nó, những đặc chung đó cho phép acid citric được sử dụng theo nhiều cách

kha năng được sử dụng như một chat liên kết ngang dé tạo thành các polyme có thé phânhủy sinh học có tác dụng trong việc tăng cường chế phẩm dược (Maria Lambros va ctv,

2022) Ngoài ra acid citric còn được ứng dụng nhiều trong các loại nước tây rửa và cácloại xà phòng, không những thế acid citric là một trong những acid hữu cơ có khả năngdiệt khuẩn tốt

2.4.2 Tính kháng khuẩn của acid citric

2.4.2.1 Acid citric được ứng dụng trong trong việc sát trùng trên cây rau má

Trong nghiên cứu của Tống Thị Ánh Ngọc thì rau má là loại rau được dùng để

đánh giá khả năng sát trùng của acid citric Thí nghiệm được tiến hành như sau rau sau

khi được thu mua từ chợ về được rửa sơ bộ bằng nước 3 lần, tiếp tục ngâm rau má trongvòng 15 phút với acid citric ở các nồng độ thí nghiệm khác nhau Sau đó rau má đượcvớt ra, rửa lại bang nước và đem đi phân tích tổng số vi sinh vật hiếu khí va Coliforms.Kết quả thu được là khi sử dung acid citric 1 % tỏ ra có hiệu quả trong việc giảm mật sốColiforms và vi sinh vật tổng số hiểu khí Vì vậy, để rau sau khi rửa đảm bảo sạch song

vẫn duy trì được chất lượng cảm quan cao, rau được rửa bằng nước sạch kết hợp với

chất sát trùng là acid citric nồng độ 1 % là thích hợp nhất (Tống Thị Anh Ngọc va ctv,2010).

2.4.2.2 Tính ức chế của acid citric lên vi khuẩn được phân lập từ nho Ninh Thuận

Sau khi phân lập vi khuẩn từ nho Ninh Thuận thì nghiên cứu đã chọn được cácdòng vi khuẩn: Empedobacter brevis, Citrobacter sp., Enterobacterium ludwiggi,Bacillus cereus, Flavobacterium sp, Pseudomonas oryzihabitans, Bacillusthuringiensis đê thử nghiệm kha năng kháng khuẩn của acid citric Kết qua nghiên cứu

dat được là tìm ra được nồng độ ức chế tối thiểu MIC và nồng độ diệt khuẩn tối thiêu

MBC của acid citric đối với các dòng vi khuẩn trên nằm trong khoảng từ 0,12 mg/mlđến 3,8 mg/ml Nghiên cứu đã chỉ ra có thé sử dung acid citric ở nồng độ 3,8 mg/ml dé

sử lý sơ bộ cho nho ở Ninh Thuận (Nguyen Thị Hanh và ctv, 2016).

2.5 Sơ lượt về vi khuẩn gây ngộ độc

Trong hiện nay việc an toàn vệ sinh thực thẩm dang là một van dé được quan tâm

hàng từ các người tiêu dùng Ở Việt Nam hàng năm đều xảy ra nhiều ca ngộ độc thực

phẩm nguyên nhân chủ yếu là đến từ các nguồn thực phẩm không sạch sẽ Các loại thựcphẩm đó chủ yếu đến từ các loài vi sinh vật bị lây nhiễm vào qua quá trình thu hoạch,vận chuyên, xử lý và bảo quản thực thâm Vi sinh vật gây ngộ độc thực pham chủ yếu

là đến từ vi khuẩn E Coli và Salmonella chúng lây nhiễm là tiết ra các độc tốt có hai chocon người (Trần Thị Hằng và ctv 2020)

2.5.1 E.Coli gầy tiêu chảy ở người

Bang 2.2 Phân loại vi khuẩn E.Coli

Ngành Proteobacteria Lớp Gammaproteobacteria

Vi khuẩn E.Coli là vi khuẩn gram âm, có dạng hình que, khuẩn lạc màu vàng nhạtphát triển tốt ở nhiệt độ 37 °C và có khả năng di chuyển Tiêu chảy là bệnh thường gặp

ở mọi người nguyên nhân chủ là đến từ vi khuẩn E.Coli với nhiều nhóm có khả năng

gây bệnh như STEC (shigatoxin producing # coli), ETEC (enterotoxigenic È coli),EPEC (enteropathogenic EF coli), EIEC (enteroinvasive E coli), các vi khuẩn naythường mang các gen độc lực khác nhau như aggR (EAEC), ipaH (EIEC), elt va est(ETEC) giúp chúng có thé bám vào niêm mạc ruột, giải phóng yếu tô tan máu hoặc độc

tố ruột Triệu chứng chủ yếu khi ngộ độc E.Coli là đau bung, tiêu chảy din đến matnước và các chất điện giải rồi đến suy dinh dưỡng, khi trẻ bị suy dinh dưỡng lại có nguy

cơ bị tiêu chảy cao hơn (Trần Thị Thanh Huyền và ctv, 2019)

2.5.2 Salmonella gầy bệnh trên người

Bang 2.3 Phân loại vi khuẩn Salmonella

Ngành Proteobacteria Lớp Gammaproteobacteria

Bo Enterobacteriales

Ho Enterobacteriaceae

Chi Salmonella

Salmonella là một giống vi khuẩn hình que, thuộc gram âm phat triển tốt ở nhiệt

độ 35 — 37 °C và chúng có khả năng di chuyển Các triệu chứng chủ yếu khi nhiễm

9

khuẩn Salmonella thường là tiêu chảy, số cao liên tục, đau bụng Sự xâm nhiễm và gâyđộc của Salmonella chủ yếu từ thực phâm chưa nấu chin Các gen nằm trên nhiễm sắcthé va plasmid giúp cho vi khuẩn Salmonella đi vào tế bào biểu mô ruột của người vàđộng vật có vú một cách thuận lợi Tất cả các Salmonella đều mang cụm gen invABCnằm trong hệ thống gen SPI - 1 Locus invA nằm ở vị trí 59 phút trên nhiễm sắc

thé của Salmonella và trình tự nucleotid của gen invA mã hóa cho chuỗi polypeptid chứa

686 acid amin Gen spvR mã hoá protein điều hoà sự biểu hiện của operon spvABCD

Các gen spv biêu hiện khi Salmonella đã xâm nhiễm vào bên trong tế bao vật chủ,

làm tăng tính độc của Salmonella, giúp vi khuân xâm nhiễm và tồn tại bên ngoài ruột

như gan, tụy (Trần Thị Xuân Mai và ctv, 2011)

10

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2021 đến tháng 12/2022 tại phòng độc chất họcmôi trường (Ribe 106), Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Đại họcNông Lâm Tp Hồ Chi Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là thịt trái cây bồ hòn Sapindus mukorossi được lay từ các

Thiết bị: May khuấy từ, tủ mát, tủ sấy, nồi hấp vô trùng, tủ cấy vô trùng, cân kỹthuật, bếp đun cách thuỷ

3.2.4 Hoá chất

Các loại dung môi sử dụng trong các khảo sát gồm: ethanol, methanol và acidcitric Các loại môi trường cấy được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm TSA (TrypticSoy Agar), TSB (Tryptic Soy Broth).

bị

3.3 Phuong pháp nghiên cứu

3.3.1 Xử lý nguyên liệu

Thịt trái bồ hòn khi mua về được xấy khô ở nhiệt độ 80°C cho đến khi khô sau đóđược xay thành bột.

3.3.2 Khảo sát để lấy dịch chiết saponin từ thịt trái bồ hòn tốt nhất

Dịch chiết saponin từ thịt trái bồ hòn được chiết theo phương pháp cơ học dùngmay khấy từ Thịt quả bồ hòn được xay nhuyễn thành bột, cho 10 bột bồ hòn vào bìnhtam giác 250ml sau đó cho thêm dung môi theo tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi nhất định.Đặt bình tam giác lên máy khuấy từ khuấy điều trong khoảng 800 — 900 rpm sau mộtkhoảng thời gian ta thu được hỗn hợp dịch chiết và cặn bột thịt trái bồ hòn, lọc hỗn hợpqua vải lọc thu được dịch chiết saponin từ thịt trái bồ hòn

Phương pháp này được sử dụng để khảo sát 3 yếu ảnh hưởng đến quy trình tạo

dịch chiết đó là dung môi chiết, tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi chiết và thời gian chiết

Nguyên tắc: cố định hai yếu tố va thay đổi một yếu tố dé chọn được điều kiện tối

ưu cho yếu tố đó Sau đó thực hiện tương tự cho hai yếu tố còn lại

3.3.2.1 Khảo sát dung môi

Thực hiện khảo sát với các dung môi lần lượt là nước cat, ethanol 60%, methanol80%, có định hai yếu tố còn lại là tỉ lệ dung môi ở tỉ lệ 1:6 và thời gian chiết là 6 giờ,thí nghiệm được lập lại 3 lần Tiến hành thí nghiệm cho 10g bột bồ hòn vảo bình tamgiác 250ml sau đó thêm lần lượt 60ml các dung môi nước cất, ethanol 60%, methanol

80% vào các bình, đặt bình tam giác lên may khuấy từ và khuấy trong vòng 6 giờ Sau

đó lọc loại bỏ cặn đề thu lại dịch chiết và hỗn hợp dịch chiết đi phân tích saponin có

trong hỗn hợp dịch đề so sánh kết quả giữa các dung môi đề xác định dung môi tốt nhất.3.3.2.2 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi

Khao sát tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi với năm mức tỉ lệ là 1:2, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8,1:10 và cố định hai yếu tố là dung môi được dùng để chiết là dung môi ethanol 60 % (dung môi tối ưu nhất được xác định ở khảo sát dung môi) và thời gian chiết là trong 6giờ, thí nghiệm được lập lại 3 lần Đầu tiên cân 10g bột bồ hòn cho vào bình tam giác

250 ml thêm dung môi ethanol 60 % theo các tỉ lệ khảo sat lần lượt là 20, 40, 60, 80,

100 ml vào bình, đặt bình lên mấy khuấy từ và khuấy trong vòng 6 giờ Sau đó lọc loại

bỏ cặn dé thu lại dich chiết và đem hỗn hợp dịch chiết di phân tích saponin có trong hỗnhop dich dé so sánh kết quả giữa các dung môi dé xác định dung môi tốt nhất

12

3.3.2.3 Khảo sát thời gian chiết

Khảo sát thời gian chiết với từng khoảng thời gian như 2, 4, 6, 8 giờ và cố định

yếu tô dung môi là ethanol 60 % ( dung môi tối ưu nhất được xác định ở khảo sat dung

môi) và tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1:8 ( tỉ lệ tối ưu nhất được xác định ở khảo sát tỉ

lệ nguyên liệu/ dung m61),thi nghiệm được lập lại 3 lần Cho 10 g bột bồ hòn vào bìnhtam giác sau đó bỏ vào 80 ml dung môi ethanol 60 %, đặt bình tam giác lên máy khuấy

từ và khuấy trong vòng 2, 4, 6, 8 giờ Sau đó lọc loại bỏ cặn dé thu lại dịch chiết và dem

hỗn hợp dịch chiết đi phân tích saponin có trong hỗn hợp dịch để so sánh kết quả giữa

các dung môi dé xác định dung môi tốt nhất

3.3.3 Xác định khối lượng cao chiết

Xác định khối lượng cao thu được sau khi loại dung môi: Tất cả dịch chiết sau khichiết được bằng các điều kiện chiết được khảo sát ở trên được cô cạn trên bếp cách thuỷ

dé thu được lượng cao chiết Sau khi cô cạn trên bếp cách thuỷ thì đem sấy cao chiết đó

trong tủ sấy với nhiệt độ là 80 °C cho đến khi khô hoàn toàn, thu được khối lượng cótrong côc là khôi lượng cao chiét có chứa saponin.

3.3.4 Xác định saponin có trong dịch chiết

Phương pháp các định saponin được dựa trên nghiên cứu của Joong-Ho Kwon và

ctv (2003) trong việc phân tích saponin có trong nhân sâm.

Chuẩn bị mẫu phân tích: Hoa tan cao vô 150 ml nước cất khuấy mẫu đều nhau sau

đó dùng ống đông 50 ml mẫu dùng dé phân tích saponin

Chuẩn bị n-butanol bão hoà nước: n-butanol nguyên chất được pha với nước cấttheo tỉ lệ 1:1 trong phéu chiết 1L, sau đó hỗn hop nước cat với n-butanol được lắc điềutrong phiếu chiết Hỗn hợp sau khi được trộn đều được dé yên trong một khoảng thờigian dé tách lớp, bỏ lớp dich phía dưới thu lấy lớp dịch phía trên là dung dich n-butanolbão hoà nước.

Tiến hành: 50 ml dung dich mẫu ở trên thì được bố sung thêm 50 ml dietyl ete vôdung dịch lắc điều trong phéu chiết 250 ml dé trong một khoảng thời gian dé tách lớpsau đó loại bỏ lớp dietyl ete ở trên lấy lớp dịch ở dưới, lặp lại 2 lần như vậy Sau đó lớp

dich đã qua chiết bằng dietyl ete được chiết qua n-Butanol bão hoà nước với mỗi lần là

50 ml dung môi, thu lay dịch n-buntanol ở trên và dung dịch sau khi chiết qua n-butanolmột lần được chiết tiếp bằng n-butanol thêm như vậy 3 lần nữa Dung dịch đã thu được

13

sau khi chiết qua n-butanol được rửa bằng 30 ml nước cất hai lần, sau khi được rửa bằngnước thì dung dịch được cô cạn trên bếp thu được khối lượng saponin thô.

3.3.5 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC

Chuẩn bị môi trường cấy: Hoa tan 3 g môi trường Tryptic Soy Broth trong 100 mLnước cat, sau đó hấp tiệt trùng ở 120 °C trong 15 phút Môi trường sau khi hấp dé nguội

và bao quan trong tủ lạnh 2 — 8 °C.

Chuẩn bị đĩa môi trường thạch nuôi cấy vi khuẩn: môi trường Tryptic Soy Agar(TSA) cân 4g và được pha trong 100 ml nước cất, sau khi pha môi trường với nước cấtmang hấp tiệt trùng 120 °C trong 15 phút, đỗ 10 — 15 mL môi trường ra dia petri sau đó

để nguội cho thạch đong Trước khi sử dụng phơi đĩa thạch bên đèn cồn 10 — 15 phút để

mặt thạch ráo nước.

Tăng sinh vị khuẩn: dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ đĩa giống cay ra diamôi trường TSA và ủ ở nhiệt độ phòng va thời gian là 24 giờ.

Chuan bị dịch khuẩn (108 CFU/mL): dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ đĩa

tăng sinh hòa tan vào nước muối 0,85 % vô trùng và vortex đều hỗn hợp, sau đó điều

chinh độ đục dịch khuân bang cách cho thêm nước muối hoặc vi khuẩn sao cho giá trịOD600nm= 0,13 — 0,15.

Chuẩn bị dịch chiết saponin: dịch chiết từ trái bồ hòn được pha loãng bằng nướccat dé cho nồng độ xuống còn 6,4 mg/ml Hút 1,94 ml có nồng độ gốc là 16,51 mg/ml

sau đó định mức lên 5 ml bằng nước cat

Chuẩn bị dãy nồng độ : pha loãng dịch chiết saponin có nồng độ 6,4 mg/ml thành

dãy nồng độ 3,2 mg/ml; 1,6 mg/ml; 0,8 mg/ml; 0,4 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,05

mg/ml; 0,025 mg/ml; 0,0125 mg/ml; 0,00625 mg/ml Cách thực hiện như sau: cho 125

uL môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) vào 12 giếng được đánh số từ 1 đến 10 (gồm

10 ống nồng độ ) và 2 ống đối chứng được đánh dấu ( + ) cho đối chứng dương và ( - )

cho đối chứng âm, hút 125 uL cho vào giếng số 1, dùng micropipette mix hỗn hợp dung

dịch dé cho dung dịch đồng nhất, hút 125 uL dung dịch đã pha loãng ở giếng số 1 cho

vảo giếng số 2, dùng micropipette mix hỗn hợp dung dịch cho dung dịch đồng nhất, hút

125 uL dung dich đã pha loãng ở giếng số 2 cho vào giếng số 3, cứ tiếp tục như thé đếngiếng số 10 ta được dãy nồng độ đã nêu trên

14

Chuẩn bị acid citric 64 mg/ml: Acid citric được pha thành dich bang nước cất dé

có dich acid citric có nồng độ 64 mg/ml Cân 0,32 g acid citric được pha bang nước cất

Tiến hành: cho 50 pL dịch khuẩn đã pha vào giếng số 1 đến 10 Giếng đối chứng

dương chỉ chứa môi trường TSB và 50 wL dịch khuan Cho 50 wL dung dich nước muối

0,85 % vào giếng ( - ) không chứa dịch khuẩn đề làm đối chứng âm Ủ giếng ở nhiệt độphòng bình thường, thời gian ủ là 24 giờ.

Nông độ ức chế tối thiêu MIC được xác định ở giếng có nồng độ saponin có trongdịch chiết và acid citric thấp nhất vẫn ức chế được sự phát triển của vi khuẩn So sánhvới giếng đối chứng, giếng nào sinh đục hoặc có lắng cặn thì chứng tỏ ở nồng độ vàacid citric đó vi khuẩn vẫn phát triển, giếng nao trong thì ở nồng độ dich chiết saponin

và acid citric đó đã ức chế được sự phát triển của vi khuẩn Trường hợp ở nồng độ caonhất trong day thử nghiệm mà vẫn có sự phát triển của vi khuẩn thì ghi nhận kết quảMIC là lớn hơn nồng độ đó

3.3.6 Phối trộn tạo nước rửa rau

Dựa trên kết quả MIC của dịch chiết saponin từ thịt trái bồ hòn và acid citric sẽphối trộn hai loại nước rửa rau dé tiến hành tiếp thí nghiệm

Chuẩn bị dich chiết saponin từ trái bồ hòn: bột trái bồ hòn được chiết theo quytrình tách chiết đã khảo sát được ở nội dung 3.3.2 được sử dụng cho nội dụng này, dịch

chiết sau khi chiết được đem đi phân tích lại nồng saponin có trong dịch chiết saponin

cho nồng độ saponin trong hỗn hợp dung địch là 16,51 mg/mI

Chuẩn bị acid citric: cân 50 g acid citric dé pha trong 500 ml dung dịch nước rửa

rau để tạo dung dịch nước rửa rau có nồng độ acid citric là 10 % là nước rửa rau A Cân

100 g acid citric để pha trong 500 ml dung dịch nước rửa rau có nồng độ acid citric có

nồng độ acid citric là 20 % là nước rửa rau B

Tiến hành: dong 315 ml dịch chiết saponin có nồng độ saponin trong dung dich đãđược phân tích là 16,51 mg/ml và thêm vào 50 g và 100 g acid citric cho hai mẫu nước

l5