4.1. Điều kiện chiết xuất từ thịt trái cây Bồ Hòn 4.1.1. Lượng cao chiết thu được
Khối lượng cao chiết thu được trong từ cuộc khảo sát dung môi, khảo sát tỉ lệ
nguyên liệu/ dung môi, và khảo sát thời gian chiết cho kết quả thu được khối lượng cao chiết ghi nhận được trong Bảng 4.1, Bảng 4.2, Bảng 4.3.
Bảng 4.1. Khối lượng cao chiết thu được của các loại dung môi
Dung môi khảo sát Khối lượng cao chiết (g)/ 10 g nguyên liệu (n = 3) Nước cất 8,2224? + 0,1428
Ethanol 60 % 7,9935* + 0,1683 Methanol 80 % 8,0109* + 0,1812
Trong cùng một cột các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thông kê (P > 0,05)
Bảng 4.2. Khối lượng cao chiết thu được của các tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi
Khối lượng cao chiết (g)/ 10 g nguyên
Tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi ;
liệu (n = 3)
Tilé1:2 7,6649? + 0,1667 Tilé1:4 7,8073 + 0,0695 Tilé 1:6 7,6542° + 0,0854 Tilé1:8 7,4701® + 0,2630 Tilé 1:10 7,5463* + 0,0959
Trong cùng một cột các giá trị trung bình có ki tự theo sau khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thông kê (P > 0,05)
Bảng 4.3. Khôi lượng cao chiết thu được của các móc thời gian
Thời gian chiết Khối lượng cao chiết (g)/ 10 g nguyên liệu (n = 3)
2 giờ 7,6947* + 0.2068 4 giờ 7.9010 + 0.0960 6 giờ 7,9335* + 0.0659 8 giờ 7,9611^ + 0.0645
Trong cùng một cột các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thông kê (P > 0,05)
18
Dựa vào kết quả khối lượng dung môi của ba Bảng 4.1, Bảng 4.2, Bảng 4.3 thì cho thấy lượng cao chiết thu được giữa các nghiệm thức trong cùng một khảo sát thì không có sự khác biệt ý nghĩa. Khối lượng cao chiết thu được của từng nghiệm thức đều nằm trong khoảng từ 7,4701 — 8,2224 g và sự sai lệch về khối lượng giữa chúng không lớn.
Nhưng nồng độ saponin có trong cao chiết của từng nghiệm thức là có sự khác biệt rõ trong kết qua thu được sau khi phân tích lượng saponin của phan sau.
4.1.2. Dung môi tối ưu
Sau khi phân tích lượng saponin có trong mẫu bồ hòn qua cuộc khảo sát dung môi với các loại dung môi là nước cất, ethanol 60 %, methanol 80 % với tỉ lệ nguyên liệu/
dung môi là 1:6 và thời gian chiết là 6 giờ, kết quả đã được ghi nhận trong Bảng 4.4.
Bảng 4.4. Khối lượng saponin thu được của các loại dung môi
Dung môi khảo sát Khối lượng saponin (g)/10 g nguyên liệu (n = 3) Nước cất 1,6272° + 0,0625
Ethanol 60 % 1,81434+ 0,0798
Methanol 80 % L7739" 2 0.0771
Trong cùng một cot các giá tri trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thông kê (P < 0,05).
Từ Bảng 4.4. kêt quả trên cho thay cùng với các yêu tô về tỉ lệ nguyên liệu/ dung
môi và thời gian chiết thì các dung môi khác nhau đã thu được có sự khác biệt về lượng
saponin thu được. Đôi với các loại dung môi được khảo sát thì dung môi ethanol 60%
là dung môi có lượng saponin thu được cao nhất với 1,8143 g, mặc dù dung môi methanol 80% có lượng saponin thu được thấp hơn so với dung môi ethanol 60% là 1,7739 g nhưng sự sai lệch giữa hai dung môi là không quá lớn với nhau. Đối với dung môi là nước thì cho lượng saponin thu được thấp nhất chỉ 1,6272 g, cho thấy việc chiết bằng dung môi hữu cơ thì cho lượng saponin nhiều hơn so với chiết bằng nước. Dựa vào các kết quả trên thì dung môi ethanol 60 % là dung môi tốt nhất trong khảo sát, vậy nên đối với khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi tiếp theo sẽ lấy ethanol 60 % để làm dung
môi cho sự khảo sát.
4.1.3. Tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi tối ưu
Lượng saponin thu được trong khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi với các tỉ lệ
1:2, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8, 1:10 với dung môi là ethanol 60 % trong thời gian là 6 giờ kết quả
đạt được ghi nhận trong Bảng 4.5.
19
Bảng 4.5. Khối lượng saponin thu được của các tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi
; Khôi lượng saponin (g)/10 g nguyên
Tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi
liệu (n = 3)
Tỉ lệ 1:2 1,6402° + 0,0493 Tilé1:4 1,73872 + 0,1091
Tilé 1:6 1,8164? + 0,0423 Tilé1:8 1,8468? + 0,0401 Tilé 1:10 1,80822 + 0,0310
Trong cùng một cột các giá trị trung bình có ki tự theo sau khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thông kê (P < 0,05). „
Trong kêt qua ở Bang 4.4. ta thay được ở tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1 : 8 thì
trong 10 g mẫu cho lượng saponin thu được là cao nhất với khối lượng là 1,8468 g. Đối với hai tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi ở 1 : 6 và 1 : 10 ta thấy được gang không có sự khác biệt có ý nghĩa và không có sự sai lệch quá nhiều so với khi chiết bằng tỉ lệ 1 : 8 khi cho lượng saponin là 1,8164 g và 1,8082 g. Trong khi đó, khi chiết với tỉ lệ nguyên liệu/
dung môi là 1 : 4 thì sẽ không đạt kết quả tốt khi chỉ cho lượng saponin là 1,7387 g, còn đối với tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi 1 : 2 thi sé cho kết quả thấp nhất trong các thí nghiệm khảo sát với lượng saponin thu được là 1,6402 g. Từ các kết quả trên cho thấy lượng dung môi quá ít thì sẽ không đủ để hoà tan chất saponin ra khỏi mẫu, sử dụng nhiều dung môi hơn thì lượng saponin thu được sẽ nhiều hơn do hoà tan được nhiều saponin.
Tuy nhiên khi đạt một giới hạn nhất định thì du cho nhiều dung môi hơn đi nữa thì lượng saponin thu được vẫn không có sự khác biệt, vậy nên tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi tốt nhất là tỉ lệ 1 : 8. Vậy nên đối với khảo sát thời gian chiết tiếp theo tỉ lệ nguyên liệu/
dung môi 1 : 8 sẽ được sử dụng làm tỉ lệ cho cuộc khảo sát này.
4.1.4. Khảo sát thời gian chiết
Kết quả saponin thu được trong các mẫu bột bồ hòn của khảo sát thời gian chiết
với dung môi ethanol 60% với tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1:8 trong các khoảng thời gian 2 giờ, 4 gid, 6 gid đã được ghi nhận trong Bang 4.6.
Bảng 4.6. Khối lượng saponin thu được sau khi chiết qua các khoảng thời gian
Thời gian chiết Khối lượng saponin (g)/10 g nguyên liệu (n = 3) 2 giờ 1.6202 + 0.0834
4 gid 1.7736? + 0.0632
20
Thời gian chiét Khối lượng saponin (g)/10 g nguyên liệu (n = 3)
6 giờ 1.80188 + 0.0429 8 giờ 1.8008? + 0.0673
Trong cùng một cột các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt có ÿ nghĩa về mặt thông kê (P< 0,05).
Từ bảng bảng kết quả thì lượng saponin thu được tỉ lệ thuận với thời gian ly trích,
thời gian càng lâu thì lượng saponin thu được càng nhiều. Cụ thể là từ 2 giờ đến 6 giờ thì lượng saponin thu được tăng lên từ 1,6202 g lên đến 1,8018 g, trong khi chiết với
thời gian là 8 giờ thì lượng saponin thu được cũng chỉ là 1,8008 g. Do khi kéo dài thêm thời gian nữa thì lượng saponin thu được cũng không có sự tăng thêm do khả năng hoà
tan saponin của dung môi đã bị bão hoà. Vì thế với thời gian là 6 giờ được xem là thời gian tối ưu nhất khi dung để chiết xuất dịch chiết saponin.
Từ các kết quả của các điều kiện khảo sát từ dung môi, tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi và thời gian thì điều kiện chiết xuất tối ưu là dung môi ethanol 60 % với tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1:8 va thời gian chiết là 6 giờ. Nhưng do dung môi ethanol gây hại cho sức khoẻ cho con người và quá trình loại bỏ dung môi mắt thời gian nhiều nên thay thé dung môi ethanol thành nước dé chiết xuất dịch chiết. Đề kiểm chứng lại kết quả đã thực hiện so sánh lại phương pháp chiết của ethanol với nước khi cùng điều kiện.
4.1.5. So sánh phương pháp chiết của ethanol với nước khi cùng điều kiện
Kết quả của việc chiết bằng nước khi cùng điều kiện chiết với tỉ lệ nguyên/ dung môi là 1 : 8, thời gian chiết là 6 giờ với dung môi ethanol được thé hiện ở Bảng 4.7.
Bảng 4.7. Kết quả so sáng của dung môi nước và ethanol 60%
Dung môi khảo sát Khối lượng saponin (g)/10 g nguyên liệu (n = 3) Nước 1,6558° + 0,0809
Ethanol 60% 1,8018*+ 0,0429
Trong cùng mot cột các giá trị trung bình có ki tự theo sau khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thông kê (P< 0,05).
Mặc dù khi chiét bang dung môi nước có kêt quả khôi lượng saponin thô thu được ít hơn chỉ 1,655 g so với dung môi ethanol nhưng sự trênh lệch giữa hai dung môi là
không quá lớn. Khi so về các lợi ích thực tế khác như hiệu quả về mặt kinh tế hay thời gian và khả năng ảnh hưởng cho sức khoẻ thì dung môi nước có hiệu quả hơn. Vậy điều kiện chiết xuất hợp lý nhất dé chiết xuất dịch chiết điều kiện là dung môi nước với tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1 : 8 với thời gian chiết là 6 giờ. Với điều khiện chiết xuất tối
21
ưu đã tìm được để sản xuất ra dịch chiết saponin đề thực hiện việc khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu MIC cho dịch chiết để tạo nên nước rửa rau.
4.2. Nong độ ức chế tối thiếu (MIC) của dịch chiết saponin và acid citric đối với vi khuẩn Việc khả sát nồng độ ức chế tối thiêu MIC của dịch chiết saponin và cả acid citric là dùng dé xác định được nồng độ thích hợp dé thực hiện việc phối trộn giữa dịch chiết saponin và acid citric dé tạo nên nước rửa rau.
Dịch chiết saponin được chiết từ được chiết xuất từ điều kiện chiết tối ưu ở mục 3.3.2 được phân tích lại saponin có nồng độ là 16,51 mg/ml và dung dịch acid citric có nồng độ là 64 mg/ml được dùng dé tạo nên dãy nồng độ dùng cho khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu MIC.
Nông độ ức chế tối thiểu MIC được xác định dựa trên dãy nồng độ thử nghiệm,
‘ 4 uP 1 1`
` ôề rd get
| a (2 re
dỗ hi
z7
Hình 4. 1. Nong độ ức chế tối thiêu MIC của dịch chiết saponin và acid citric đối với
E.Coli. A1,A2,A3 là các giếng của dịch chiết saponin (dãy nông độ từ 1 — 10: 3,2; 1,6; 0,8;
0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125; 0,00625 mg/ml); B1,B2,B3 là các giếng của acid citric (dãy nông độ từ 1 — 10: 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625 mg/ml)
22
Kết quả từ các giếng cho thấy các giếng có nồng độ dịch chiết saponin và aicd citric thấp thì có hiện tượng màu môi trường bị đục đi hay xuất hiện các cặn lắng ở đáy giếng khi so sánh với các giếng đối chứng âm và đối chứng dương. Từ các hiện tượng đó thì ta có thé các định được các nồng độ ức chế tối thiếu MIC của dịch chiết trái bồ
hon và acid citric.
Giá trị của nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết saponin và acid citric được thé hiện trong Bảng 4.8.
Bang 4.8. Nong độ ức chế tối thiểu của MIC của dịch chiết saponin va acid citric Nồng độ ức chế tối thiêu MIC (mg/ml) Vi khuẩn :
Dịch chiết saponin Acid citric E.Coli - 4 mg/ml Salmonella 0,2 mg/ml 2 mg/ml
Nông độ ức chê tôi thiêu MIC đối với vi khuẩn nao càng cao thì kha năng ức chế đối với vi khuẩn đó càng thấp. Kết quả từ Bang 4.8 cho thấy kha năng ức chế vi khuẩn
23
Salmonella của dịch chiết saponin cao hơn so với acid citric còn đối với E.Coli. Khả năng ức chế của dịch chiết saponin của thịt trái cây bồ còn chưa xác định được do nồng độ saponin là 3,2 mg/ml trong dịch chưa đủ dé có khả năng gây ức chế cho vi khuẩn E.Coli. Đỗi với Salmonella thì nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết saponin là 0,2 mg/ml. Acid citric có nồng độ ức chế tối thiêu MIC đối với E.Coli là 4 mg/ml và Salmonella là 2 mg/ml. Kết quả nồng độ cho thấy đối với E.Coli và Salmonella, khả năng ức chế của dịch chiết saponin từ thị trái bồ hòn và acid citric đối với Salmonella tốt hơn là đối với E.Coli, dịch chiết saponin có khả năng ức chế cao hơn 10 lần so với acid citric đối với Salmonella.
Nông độ ức chế tối thiểu của dich chiết saponin trong nghiên cứu nay đối với
Salmonella là 0,2 mg/ ml trong khi đó trong nghiên cứu của Min-ping Wei và ctv (2021)
đối với dịch lên men chiết xuất từ quả bồ hòn thì cho nồng độ ức chế tối thiểu saponin đối Salmonella là 5 mg/ml thấp hơn so với nghiên cứu này. Vậy nên dịch chiết saponin trong nghiên cứu này có khả năng ức chế tốt hơn so với dịch lên men chiết trong nghiên cứu của Min-ping Wei và ctv. Khả năng ức chế của dịch chiết khi sử dụng trực tiếp sẽ tốt hơn so với khi lên men.
Nồng độ ức chế tối thiểu của acid citric trong nghiên cứu này đối với E.Coli và Salmonella lần lượt là 4 mg/ml va 2 mg/ml còn trong nghiên cứu của Jae-Seon Jang (2007) và ctv thì nồng độ ức chế tối thiểu của acid citric đối với E.Coli và Salmonella là 10 mg/ml và 10 mg/ml. Vậy nồng độ ức chế tối thiểu đối với E.Coli và Salmonella trong nghiên cứu nảy tốt hơn.
Vậy dựa trên kết quả MIC của dịch chiết có chứa saponin và acid citric ta phối trộn được nước rửa rau từ dịch chiết có chứa saponin va acid citric. Hai loại nước rửa rau khác nhau đã được phối trộn từ dịch chiết có chứa saponin và acid citric là nước rửa rau A có nồng độ saponin là 1 % và nồng độ acid citric là 10 % và nước rửa rau B có nồng độ saponin là 1 % và nồng độ acid citric là 20 % có trong nước rửa rau. Từ nước rửa rau đã phối trộn được ta đem đi thử nghiệm hiệu quả quả nước rửa trên rau để xem hiệu quả
làm sạch vi khuân có trong rau.
24
2.5.3. Hiệu quả loại bỏ vi khuẩn của nước rửa rau
Mẫu rau má được mua từ chợ đầu mối Thủ Đức được sử dụng đề thực hiện các thí nghiệm cho việc rửa rau, mẫu rau được bô sung thêm hai loại vi khuẩn là E.Coli và Salmonella bằng cách ngâm mẫu rau vào nước có pha hai con vi khuẩn E.Coli và Salmonella trong 30 phút, đem ra dé khô rồi trộn đều lại với nhau đó chia thành 4 nghiệm thức là DC là nghiệm thức đối chứng không dùng nước rửa rau, NT 1 là nghiệm thức dùng nước muối 1 % dé rửa rau, NT 2, NT 3 là nghiệm thức mà được rủa qua nước rửa được pha loãng 50 lần từ nước rửa rau A và B được phối trộn ở trên, mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần. Đầu tiên ngâm rau của ba nghiệm thức NT 1, NT 2, NT 3 vào nước rửa của từng loại trong 15 phút, sau đó đem ra rửa lại bằng nước thường. Mẫu rau sau khi được xử lý xé được đem di đánh gia về mặt hình thức và phân tích vi khuẩn để đánh
giá khả năng làm sạch của nước rửa rau.
oA 2 > z 2 À x 2
4.3.1. Hiệu quả của nước rửa rau về mặt cảm quan
25
Hình 4.4. Mẫu rau nghiệm thức rửa bằng nước muối 1%. a: mẫu rau trước khi
rửa; b: máu rau sau khi rửa
b: Mau rau sau khi rửa
26
b: Mau rau sau khi rửa
Từ các Hình 4.3, Hình 4.4, Hình 4.5 và Hình 4.6 thì mẫu rau má chưa xử lý qua nước rửa rau hay đã xử lý qua nước rửa đều có sự khác biệt với nhau. Đối với mẫu đối chứng thì mẫu rau không được xử lý qua nước rửa rau nên trên rau còn bám lại các bụi ban và mẫu rau không được tươi mới. Còn đối với mẫu rau được xử lý qua nước rửa thì trong sạch và tươi hơn bằng mắt thường nhìn thấy được. Nhưng đối với mẫu rau rửa bằng nước muối 1 % thì không được tươi hơn so với mẫu rau rửa bằng hai loại nước rửa rau, ngoài ra khi để 3 mẫu rau này trong môi trường bình thường thì mẫu rau rửa bằng nước muối 1% bị héo nhanh hơn là mẫu rau rửa bằng nước rửa rau. Đối với hai loại nước rửa rau A và B không thấy sự khác biệt.
Ngoài ra nước trước và sau khi dùng của ba loại nước rửa rau đều có sự khác biệt với nhau, trong nước rửa rau qua sử dung của ba dung dich nước rửa đều xuất hiện nhiều chat ran lắng và lơ lửng có trong nước được thé hiện ở Hình 4.7, Hình 4.8 và Hình 4.9.
27
Hình 4.7. Hình nước muối 1 % trước và sau khi dùng.
(a): Nước mudi 1 % trước khi rửa qua rau; (b): Nước muối 1 % sau khi rửa qua rau
Hình 4.8. Hình nước rửa rau A trước và sau khi dùng.
(a): Nước rửa rau A trước khi rửa qua rau; (b): Nước rửa rau A sau khi rửa qua rau
28
4.3.2.1. Kha năng loại bỏ E.Coli của các mẫu rau
Trong môi trường nuôi cay đặc trưng dé phân tích vi khuan E.Coli theo TCVN 7924 — 2 : 2008 thì các khuẩn lạc sẽ có màu xanh đặc trưng đề nhận dạng là vi khuẩn E.Coli và những vi khuẩn khác. Nhưng khi so sánh kết quả trong Hình 4.10 và Hình 4.11 sau khi phân tích vi khuẩn E.Coli ở hai nồng độ thì không thấy có sự xuất hiện của vi khuẩn E.Coli ké cả mẫu rau đối chứng cũng không xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng có màu xanh. Ở mẫu đối chứng đối chứng đã được bé sung vi khuẩn E.Coli đã được bổ sung có thể là do đối với vi khuẩn E.Coli khi được b6 sung vào trong mẫu chưa lâu dé cho vi khuẩn E.Coli đủ thời gian dé bám vào mẫu hoặc do việc bé sung như vậy làm cho vi khuẩn bị yếu đi không có năng sinh ra chất phan ứng với môi trường đặt trưng dé bắt màu.
29
30
Mặc dù không thé đánh giá được vi khuẩn E.Coli nhưng trên đĩa mẫu van thấy được sự xuất hiện của nhiều vi khuẩn khác nhau. Dựa trên mặt độ xuất hiện của vi khuẩn xuất hiện trong đĩa petri có thể nhận thấy được sự khác biệt về mặt độ vi khuẩn, trong Hình 4.10 và Hình 4.11 thì lượng vi khuẩn xuất hiện ở NT 1 rửa bằng nước muối 1 % có mật độ xuất hiện vi khuẩn cao hơn so với 2 mẫu còn lại và cao hơn cả mẫu đối chứng.
Đối với 2 mẫu rửa bang nước rửa rau A và B thì mật độ vi khuẩn thấp hơn nhiều so với mẫu DC, nhưng mật độ vi khuẩn của hai loại nước rửa rau không khác nhau quá nhiều.
Điều này chứng tỏ nước rửa rau vẫn có kha năng loại bỏ được nhiều loại vi khuẩn khác.
4.3.2.2. Kết quả của việc phân tích Salmonella của các mẫu rau
Nguyên tac phân tích Salmonella cũng giống như E.Coli thì môi trường nuôi cay đặc trương theo TCVN 4829 : 2005 thì các khuẩn lạc nào là vi khuẩn của Salmonella thì sẽ có đặc trưng nhưng vùng thạch chỗ vi khuẩn mọc lên sẽ mắt đi màu đỏ của thạch
31