3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2021 đến tháng 12/2022 tại phòng độc chất học
môi trường (Ribe 106), Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Đại học
Nông Lâm Tp. Hồ Chi Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là thịt trái cây bồ hòn Sapindus mukorossi được lay từ các tỉnh miền trung.
Hình 3.1. Thịt qua cây bồ hòn Sapindus mukorossi 3.2.2. Chuẩn bị khuẩn thử nghiệm
Mau vi khuẩn thuần chủng của E.Coli và Salmonella được cung cấp bởi phòng vi
sinh thuộc Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường.
3.2.3. Dụng cụ và thiết bị
Dung cụ: bình tam giác (250ml), ống đong (100ml), cốc thuỷ tinh (100ml, 250m]), phiếu chiết (250ml, 1L), vải lọc, đĩa petri, đĩa 96 giếng, que cấy vòng, đèn cồn,
micropipette (5 mL, | mL và 100 pL), chai thủy tinh (1 L).
Thiết bị: May khuấy từ, tủ mát, tủ sấy, nồi hấp vô trùng, tủ cấy vô trùng, cân kỹ thuật, bếp đun cách thuỷ.
3.2.4. Hoá chất
Các loại dung môi sử dụng trong các khảo sát gồm: ethanol, methanol và acid citric. Các loại môi trường cấy được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm TSA (Tryptic
Soy Agar), TSB (Tryptic Soy Broth).
bị
3.3. Phuong pháp nghiên cứu 3.3.1. Xử lý nguyên liệu
Thịt trái bồ hòn khi mua về được xấy khô ở nhiệt độ 80°C cho đến khi khô sau đó
được xay thành bột.
3.3.2. Khảo sát để lấy dịch chiết saponin từ thịt trái bồ hòn tốt nhất
Dịch chiết saponin từ thịt trái bồ hòn được chiết theo phương pháp cơ học dùng may khấy từ. Thịt quả bồ hòn được xay nhuyễn thành bột, cho 10 bột bồ hòn vào bình tam giác 250ml sau đó cho thêm dung môi theo tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi nhất định.
Đặt bình tam giác lên máy khuấy từ khuấy điều trong khoảng 800 — 900 rpm sau một khoảng thời gian ta thu được hỗn hợp dịch chiết và cặn bột thịt trái bồ hòn, lọc hỗn hợp qua vải lọc thu được dịch chiết saponin từ thịt trái bồ hòn.
Phương pháp này được sử dụng để khảo sát 3 yếu ảnh hưởng đến quy trình tạo dịch chiết đó là dung môi chiết, tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi chiết và thời gian chiết.
Nguyên tắc: cố định hai yếu tố va thay đổi một yếu tố dé chọn được điều kiện tối ưu cho yếu tố đó. Sau đó thực hiện tương tự cho hai yếu tố còn lại.
3.3.2.1. Khảo sát dung môi
Thực hiện khảo sát với các dung môi lần lượt là nước cat, ethanol 60%, methanol 80%, có định hai yếu tố còn lại là tỉ lệ dung môi ở tỉ lệ 1:6 và thời gian chiết là 6 giờ, thí nghiệm được lập lại 3 lần. Tiến hành thí nghiệm cho 10g bột bồ hòn vảo bình tam giác 250ml sau đó thêm lần lượt 60ml các dung môi nước cất, ethanol 60%, methanol 80% vào các bình, đặt bình tam giác lên may khuấy từ và khuấy trong vòng 6 giờ. Sau đó lọc loại bỏ cặn đề thu lại dịch chiết và hỗn hợp dịch chiết đi phân tích saponin có trong hỗn hợp dịch đề so sánh kết quả giữa các dung môi đề xác định dung môi tốt nhất.
3.3.2.2. Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi
Khao sát tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi với năm mức tỉ lệ là 1:2, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8,
1:10 và cố định hai yếu tố là dung môi được dùng để chiết là dung môi ethanol 60 % ( dung môi tối ưu nhất được xác định ở khảo sát dung môi) và thời gian chiết là trong 6 giờ, thí nghiệm được lập lại 3 lần. Đầu tiên cân 10g bột bồ hòn cho vào bình tam giác 250 ml thêm dung môi ethanol 60 % theo các tỉ lệ khảo sat lần lượt là 20, 40, 60, 80, 100 ml vào bình, đặt bình lên mấy khuấy từ và khuấy trong vòng 6 giờ. Sau đó lọc loại bỏ cặn dé thu lại dich chiết và đem hỗn hợp dịch chiết di phân tích saponin có trong hỗn hop dich dé so sánh kết quả giữa các dung môi dé xác định dung môi tốt nhất.
12
3.3.2.3. Khảo sát thời gian chiết
Khảo sát thời gian chiết với từng khoảng thời gian như 2, 4, 6, 8 giờ và cố định yếu tô dung môi là ethanol 60 % ( dung môi tối ưu nhất được xác định ở khảo sat dung môi) và tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1:8 ( tỉ lệ tối ưu nhất được xác định ở khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ dung m61),thi nghiệm được lập lại 3 lần. Cho 10 g bột bồ hòn vào bình tam giác sau đó bỏ vào 80 ml dung môi ethanol 60 %, đặt bình tam giác lên máy khuấy từ và khuấy trong vòng 2, 4, 6, 8 giờ. Sau đó lọc loại bỏ cặn dé thu lại dịch chiết và dem hỗn hợp dịch chiết đi phân tích saponin có trong hỗn hợp dịch để so sánh kết quả giữa các dung môi dé xác định dung môi tốt nhất.
3.3.3. Xác định khối lượng cao chiết
Xác định khối lượng cao thu được sau khi loại dung môi: Tất cả dịch chiết sau khi chiết được bằng các điều kiện chiết được khảo sát ở trên được cô cạn trên bếp cách thuỷ dé thu được lượng cao chiết. Sau khi cô cạn trên bếp cách thuỷ thì đem sấy cao chiết đó trong tủ sấy với nhiệt độ là 80 °C cho đến khi khô hoàn toàn, thu được khối lượng có
trong côc là khôi lượng cao chiét có chứa saponin.
3.3.4. Xác định saponin có trong dịch chiết
Phương pháp các định saponin được dựa trên nghiên cứu của Joong-Ho Kwon và ctv (2003) trong việc phân tích saponin có trong nhân sâm.
Chuẩn bị mẫu phân tích: Hoa tan cao vô 150 ml nước cất khuấy mẫu đều nhau sau đó dùng ống đông 50 ml mẫu dùng dé phân tích saponin.
Chuẩn bị n-butanol bão hoà nước: n-butanol nguyên chất được pha với nước cất theo tỉ lệ 1:1 trong phéu chiết 1L, sau đó hỗn hop nước cat với n-butanol được lắc điều trong phiếu chiết. Hỗn hợp sau khi được trộn đều được dé yên trong một khoảng thời gian dé tách lớp, bỏ lớp dich phía dưới thu lấy lớp dịch phía trên là dung dich n-butanol
bão hoà nước.
Tiến hành: 50 ml dung dich mẫu ở trên thì được bố sung thêm 50 ml dietyl ete vô dung dịch lắc điều trong phéu chiết 250 ml dé trong một khoảng thời gian dé tách lớp sau đó loại bỏ lớp dietyl ete ở trên lấy lớp dịch ở dưới, lặp lại 2 lần như vậy. Sau đó lớp dich đã qua chiết bằng dietyl ete được chiết qua n-Butanol bão hoà nước với mỗi lần là 50 ml dung môi, thu lay dịch n-buntanol ở trên và dung dịch sau khi chiết qua n-butanol một lần được chiết tiếp bằng n-butanol thêm như vậy 3 lần nữa. Dung dịch đã thu được
13
sau khi chiết qua n-butanol được rửa bằng 30 ml nước cất hai lần, sau khi được rửa bằng nước thì dung dịch được cô cạn trên bếp thu được khối lượng saponin thô.
3.3.5. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC
Chuẩn bị môi trường cấy: Hoa tan 3 g môi trường Tryptic Soy Broth trong 100 mL nước cat, sau đó hấp tiệt trùng ở 120 °C trong 15 phút. Môi trường sau khi hấp dé nguội
và bao quan trong tủ lạnh 2 — 8 °C.
Chuẩn bị đĩa môi trường thạch nuôi cấy vi khuẩn: môi trường Tryptic Soy Agar (TSA) cân 4g và được pha trong 100 ml nước cất, sau khi pha môi trường với nước cất mang hấp tiệt trùng 120 °C trong 15 phút, đỗ 10 — 15 mL môi trường ra dia petri sau đó để nguội cho thạch đong. Trước khi sử dụng phơi đĩa thạch bên đèn cồn 10 — 15 phút để
mặt thạch ráo nước.
Tăng sinh vị khuẩn: dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ đĩa giống cay ra dia
môi trường TSA và ủ ở nhiệt độ phòng va thời gian là 24 giờ.
Chuan bị dịch khuẩn (108 CFU/mL): dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ đĩa tăng sinh hòa tan vào nước muối 0,85 % vô trùng và vortex đều hỗn hợp, sau đó điều chinh độ đục dịch khuân bang cách cho thêm nước muối hoặc vi khuẩn sao cho giá trị
OD600nm= 0,13 — 0,15.
Chuẩn bị dịch chiết saponin: dịch chiết từ trái bồ hòn được pha loãng bằng nước cat dé cho nồng độ xuống còn 6,4 mg/ml. Hút 1,94 ml có nồng độ gốc là 16,51 mg/ml sau đó định mức lên 5 ml bằng nước cat.
Chuẩn bị dãy nồng độ : pha loãng dịch chiết saponin có nồng độ 6,4 mg/ml thành dãy nồng độ 3,2 mg/ml; 1,6 mg/ml; 0,8 mg/ml; 0,4 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,05
mg/ml; 0,025 mg/ml; 0,0125 mg/ml; 0,00625 mg/ml. Cách thực hiện như sau: cho 125
uL môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) vào 12 giếng được đánh số từ 1 đến 10 (gồm 10 ống nồng độ ) và 2 ống đối chứng được đánh dấu ( + ) cho đối chứng dương và ( - ) cho đối chứng âm, hút 125 uL cho vào giếng số 1, dùng micropipette mix hỗn hợp dung dịch dé cho dung dịch đồng nhất, hút 125 uL dung dịch đã pha loãng ở giếng số 1 cho vảo giếng số 2, dùng micropipette mix hỗn hợp dung dịch cho dung dịch đồng nhất, hút 125 uL dung dich đã pha loãng ở giếng số 2 cho vào giếng số 3, cứ tiếp tục như thé đến giếng số 10 ta được dãy nồng độ đã nêu trên.
14
Chuẩn bị acid citric 64 mg/ml: Acid citric được pha thành dich bang nước cất dé có dich acid citric có nồng độ 64 mg/ml Cân 0,32 g acid citric được pha bang nước cất
va được định mức lên 5 ml.
Chuẩn bị dãy nồng độ acid citric: bằng cách pha loãng dung dịch acid citric có nồng độ 64 mg/ml thành dãy nồng độ 32 mg/ml; 16 mg/ml; 8 mg/ml; 4 mg/ml; 2 mg/ml;
1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,0625 mg/ml. Cách thực hiện chuẩn bị dãy nồng độ acid citric thì tương tự như phương pháp thực hiện chuẩn bị dãy nồng độ của dịch chiết saponin ở trên.
Tiến hành: cho 50 pL dịch khuẩn đã pha vào giếng số 1 đến 10. Giếng đối chứng dương chỉ chứa môi trường TSB và 50 wL dịch khuan. Cho 50 wL dung dich nước muối 0,85 % vào giếng ( - ) không chứa dịch khuẩn đề làm đối chứng âm. Ủ giếng ở nhiệt độ
phòng bình thường, thời gian ủ là 24 giờ.
Nông độ ức chế tối thiêu MIC được xác định ở giếng có nồng độ saponin có trong dịch chiết và acid citric thấp nhất vẫn ức chế được sự phát triển của vi khuẩn. So sánh với giếng đối chứng, giếng nào sinh đục hoặc có lắng cặn thì chứng tỏ ở nồng độ và acid citric đó vi khuẩn vẫn phát triển, giếng nao trong thì ở nồng độ dich chiết saponin và acid citric đó đã ức chế được sự phát triển của vi khuẩn. Trường hợp ở nồng độ cao nhất trong day thử nghiệm mà vẫn có sự phát triển của vi khuẩn thì ghi nhận kết quả MIC là lớn hơn nồng độ đó.
3.3.6. Phối trộn tạo nước rửa rau
Dựa trên kết quả MIC của dịch chiết saponin từ thịt trái bồ hòn và acid citric sẽ phối trộn hai loại nước rửa rau dé tiến hành tiếp thí nghiệm.
Chuẩn bị dich chiết saponin từ trái bồ hòn: bột trái bồ hòn được chiết theo quy trình tách chiết đã khảo sát được ở nội dung 3.3.2 được sử dụng cho nội dụng này, dịch chiết sau khi chiết được đem đi phân tích lại nồng saponin có trong dịch chiết saponin cho nồng độ saponin trong hỗn hợp dung địch là 16,51 mg/mI.
Chuẩn bị acid citric: cân 50 g acid citric dé pha trong 500 ml dung dịch nước rửa rau để tạo dung dịch nước rửa rau có nồng độ acid citric là 10 % là nước rửa rau A. Cân 100 g acid citric để pha trong 500 ml dung dịch nước rửa rau có nồng độ acid citric có nồng độ acid citric là 20 % là nước rửa rau B
Tiến hành: dong 315 ml dịch chiết saponin có nồng độ saponin trong dung dich đã được phân tích là 16,51 mg/ml và thêm vào 50 g và 100 g acid citric cho hai mẫu nước
l5
rửa rau A và B sau đó được định mức lên 500 ml bang nước cat dé cho ra hỗn hợp nước rửa rau A có nồng độ saponin là 1 % và acid citric là 10 % hoặc nước rửa rau B có nồng
độ saponin là 1 % và acid citric là 20 %.
3.3.7. Cách rửa rau
Chuẩn bị mẫu rau: rau được mua từ chợ đầu mối Thủ Đức được bổ sung vi khuan E.Coli va Salmonella bằng cách ngâm mẫu rau vào nước có pha hai con vi khuẩn E.Coli va Salmonella trong 30 phút, đem ra dé khô rồi trộn đều lại với nhau. Chia mẫu thành các nghiệm thức gồm: DC, NT 1, NT 2, NT 3 với khối lượng từ mẫu từ 30 — 35 g. Trong đó các nghiệm thức DC là nghiệm thức mẫu rau đối chứng không qua rửa với các loại nước rửa rau, nghiệm thức NT 1 là nghiệm thức rau được rửa qua dung dich nước muối
1 %, nghiệm thức NT 2, NT 3 là các nghiệm thức được rửa qua 2 loại nước rửa rau A
và B đã được chuẩn bị ở mục 3.3.5.
Chuẩn bị nước rửa rau: Nước rửa rau được pha loãng 50 lần từ nước rửa rau A có nồng độ saponin là 1% và acid citric là 10 % và nước rửa rau B có nồng độ saponin là
1% và acid citric là 20 %.
Rửa lại VỚI nude =>.
thường ,
Hình 3.2. Quy trình rửa rau
Tiến hành: Mẫu rau của 4 nghiệm thức được thêm vào | L nước rửa rau đã được chuẩn bị sẵn cho từng nghiệm thức và ngâm rau trong nước rửa rau trong thời gian 15 phút. Sau đó lay rau ra khỏi nước rửa rau sau đó được rủa qua nước thường một lần dé
rửa di lượng nước rửa rau còn sót lại.
16
3.3.8. Phương pháp phân tích vi khuẩn
Mẫu rau sau khi rửa từ các nghiệm thức NT 1, NT 2, NT 3 và mẫu rau DC được đem đi phân tích vi khuân E. Coli và Salmonella.
Phương pháp phân tích Sa/monella được thực hiện theo TCVN 4829 : 2005
Phương phap phân tích E.Coli được thực hiện theo TCVN 7924 — 2 : 2008 3.3.9. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả của các khảo sát thực hiện trong nghiên cứu điều được trình bày dưới dạng giá trị trung bình của các lần lặp lại + SD. Kết quả thí nghiệm được thống kê bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2010 và xử lý bằng phần mềm Minitab 16 với sự khác biệt của các giá trị trung bình được so sánh bang cách phân tích ANOVA đơn yếu tổ với độ
tin cậy trên 95 %.
17