Giáo trình thực hành hóa sinh 2

Sau khi học xong học phản, sinh viên cần đạt được: - CLO1: Gidi thich được cơ chế phản ứng và nguyên tắc thực hiện các phương pháp định lượng phục vụ cho việc phân tích thành phản hoá ho

TRUONG DAI HOC CONG NGHE TP HCM KHOA DIEU DUONG VA XET NGHIEM

GIỚI THIỆU

Học phan Thực hành hóa sinh 2 nhăm giúp người học củng có lại các kiến thức hóa sinh

đã học ở phản lý thuyết Giúp cho sinh viên nắm vững các phương pháp phân tích định lượng hóa sinh cơ bản phục vụ cho việc phân tích thành phản hoá học cơ bản trong cơ

thể người như carbohydrate, lipid, acid amin, protein, enzyme Ngoài ra, học phân còn

giúp người học nâng cao kỹ năng làm việc với máy móc, thiết bị phân tích dụng cụ trong phòng thí nghiệm, rèn luyện kỹ năng làm việc nhóm Sau khi học xong học phản, sinh viên cần đạt được:

- CLO1: Gidi thich được cơ chế phản ứng và nguyên tắc thực hiện các phương pháp định lượng phục vụ cho việc phân tích thành phản hoá hoc của các chát trong cơ thê sống

- CLO2: Sử dụng thành thạo thiết bị, dụng cụ xét nghiệm cơ bản

- CLOS: Bồ trí được, tự thực hiện được, tính toán và biện giải được kết quả định

lượng thành phản hóa học cơ bản của cơ thể sống

- CLO4: Gần trọng, tỉ mỹ, có trách nhiệm, trung thực trong thực hiện các thủ thuật phòng thí nghiệm áp dụng vào công tác xét nghiệm

Phương pháp kiểm tra, đánh giá:

Điểm đánh giá Chuyên can + hoat động tích Cực Bai 1 dén 5 5

Điểm thi kết | - Thi viết + trắc nghiệm - Bail dén5 | 20%

thúc HP - Thi thao tác thực hành - Bail dén5 | 20%

NHUNG DIEU CAN CHÚ Ý ĐÓI VỚI NGƯỜI HỌC

Ngoài những nội quy của phòng thí nghiệm, người học cần chú ý các điều sau đây:

1 Độ chính xác c¿a kết quá thí nghiệm

Một nhân viên thực hành xét nghiệm giỏi luôn tìm cách để thu được những kết qua thir nghiệm chính xác Sự sai lệch kết quả đo có thẻ do ngẫu nhiên, hoặc do sai số của dụng

cụ, máy móc, thậm chí có thẻ là do sự bất cân của người thực hiện phép đo Vi vay, dé giảm thiêu các sai lệch không lý giải được, mỗi thí nghiệm hoặc phép đo cần được thực hiện lặp đi lặp lại nhiều lần và lấy giá trị trung bình của các làn thực hiện

2 Chuan bi that tốt cho mổi buổi thực hành

Thời gian làm việc ở phòng thực hành có giới hạn Vì vậy, để học tốt môn này, người học cần đọc trước bài thực hành ở nhà để nắm kỹ phản lý thuyết và thao tác thực hành, tính toán các số liệu cần thiết khi làm bài thí nghiệm, xem lại phản lý thuyết và các tài liệu tham khảo có liên quan, sắp xếp một cách khoa học kế hoạch tiến hành các thí

nghiệm Trong khi học, người học phải quan sát, ghi nhận và mô tả các hiện tượng xay

ra khi tiến hành thí nghiệm Người học cần phải tập tinh ti mi, chu đáo và có khả năng

dy tra trước những diễn biến có thẻ xảy ra đối với mẫu thí nghiệm, nhằm đề các thí nghiệm được tiên hành một cách suôn sẻ

NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM

Điều 1 Sinh viên mặc áo blouse trắng, đeo bảng tên; chuân bị đầy đủ bài thực hành theo

yéu cau va lam đây đủ các bài thực hành theo chương trình

Điều 2 Sinh viên đến phong thi nghiém ding gio quy định Khi muốn thực hành bù phải

có đơn xin phép có xác nhận trước đó của giảng viên Trong đợt thực hành không được

bù quá 1 buổi

Điều 3 Giữ trát tự và thao tác cđn th¿n khi thực tập Sắp xếp sạch sẽ, ngăn nắp bàn thực tập, dụng cụ và hóa chát dùng cho thí nghiệm Báo cáo két quả trung thực, khách quan Điều 4 Tuân thủ hướng dẫn của giảng viên khi sử dụng các dựng cự dể vỡ, các hóa chát

dể cháy nó

Điều 5 Tiết kiệm điện, nước và hóa chát Tránh gây đồ vỡ hóa chất và dụng cụ Khi đồ

vỡ dụng cụ phải báo ngay cho giảng viên hướng dẫn và phải bồi hoàn đầy đủ

Điều 6 Không di chuyên hóa chát dùng chung sang chỗ khác Không mang hóa chat, dụng cụ ra khỏi phòng thí nghiệm Không làm các thí nghiệm ngoài bài thực tập Điều 7 Không ăn, uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm

Điều 8 Sau mỗi buỏi thực tập, sinh viên rửa sạch dụng cụ, dọn dẹp ngăn nắp và lau bàn rồi bàn giao đầy đủ cho giảng viên phụ trách phòng thí nghiệm

Điều 9 Thực hiện đúng các quy định vẻ phòng cháy chữa cháy Khi xảy ra cháy, dùng

các phương tiện cứu hỏa thích hợp đề dập lửa

Điều 10 Trước khi ra về phải khóa tất cả các vòi nước, tắt hết các dụng cụ điện.

BAI 1: PHUONG PHAP PHAN TiCH QUANG PHO

HAP THU TU NGOAI (UV) — KHA KIEN (VIS)

Muc TIEU

- Trình bày được các định luật về sự hấp thu ánh sáng và ứng dụng của phương pháp

quang phỏ hap thu UV-VIS

- Trình bày được sơ đồ khối của một máy quang phỏ

- Thực hiện được quy trình pha và quét phô đề tìm bước song hap thu cuc dai ymax, thiét lập đường chuẩn và xác định nồng độ một dung dịch

NOI DUNG THUC TAP

1 Cae dinh luat vé sw hap thu anh sang

hap thu, k là hệ số háp thu và I là bề dày của lớp chát háp thu

1.2 Đừnh luật Beer

Sự giảm cường độ chùm tia sáng khi đi qua một dung dịch chất háp thu phụ thuộc vào

số lượng các tiêu phân chất háp thu mà ánh sáng gặp phải trên đường đi của chùm sáng, nghĩa là phụ thuộc vào nồng độ © của dung dich chat hap thu:

k=aC Với k là hệ số hấp thu, a la hang sé hap thu, C la néng dé chat hap thu

1.3 Dinh luGt Lamber-Beer

Két hợp 2 định luật Lamber va Beer, ta có:

Một số đại lượng liên quan đến sự hấp thu ánh sáng:

Độ truyền quang (Độ truyền qua/Độ truyền suốt/Độ thấu quang ): T

Nếu C = 1% hoặc C = Ig/100 mI và độ dày lớp dung dịch đo | = 1 cm thì lúc này

độ hấp thu A được gọi là độ tat E

2 Cau tao may quang phổ

2.1 Cau tao cơ bản

Một máy quang phô thường có 10 bộ phận chủ yếu sau:

1 Nguôồn sáng: đèn Tungsten (Wolfram) cho ánh sáng khả kiến (bước sóng À từ

khoảng ngắn hơn 340 nm đến 900 nm) và đèn Deutrium (D2) cho ánh sáng tử ngoại (bước sóng từ 190 nm đến khoảng dài hơn 340 nm)

2 Gương phản xạ: điều chỉnh hướng truyền ánh sáng

3 Hệ thống thấu kính hội tụ và phân kỳ: có tác dụng tạo ra các chùm tia sáng song

song

4 Bộ tách ánh sáng: một số dòng máy cũ sử dụng lăng kính trong khi các dòng máy mới sử dụng cách tử để tách ánh sáng phát ra từ nguồn sáng thành những chủm sáng đơn sắc có bước sóng xác định

5 Khe sáng: có tác dụng che chắn các tia sáng khác, chỉ cho tỉa sáng có bước sóng xác định đi qua

6 Kính lọc phụ: lọc các tia tạp còn lại khỏi dòng sáng đơn sắc

Cuvet: cốc chứa dung dịch hấp phụ cần đo

8 B6 phan phat hién: là tế bào quang điện, có tác dụng tiếp nhận dòng tia sang 16

ra khỏi cốc đo đề tạo ra tín hiệu dòng điện

5

9 Bộ phận khuếch đại: có vai trò khuếch đại dòng quang điện

10 Bộ phận thê hiện kết quả đo: các dòng máy đời trước sử dụng đồng đồ kim hoặc đồng hỗ số đề thể hiện kết quả Các dòng máy đo ngày nay thường kết hợp với máy vi tính, việc diéu khién thiết bị và thể hiện kết quả được thực hiện bằng phần mềm chuyên dụng cài đặt trên máy vi tính

9

Light Collimator Prismor Wavelength Sample Detector

Cuvet sử dụng trong phòng thí nghiệm thường được cầu tạo bởi 3 loại chất liệu:

- Cuvet nhựa: chỉ dùng để đo ở vung VIS vì chất liệu nhựa có thể hấp thu tia UV lam sai lệch kết quả đo ở vùng UV

- Cuvet thủy tỉnh: tương tự như cuvet nhựa, cuvet thủy tính chỉ dùng để đo ở vùng VIS, thường dùng để chứa các mẫu đo pha trong dung môi hữu cơ (vì dung môi hữu cơ có thê làm tan nhựa)

- Cuvet thạch anh: dùng để đo ở cả vùng VIS lẫn UV vì thạch anh có tính thấu quang toàn phần

2.2 May quang pho hai chim tia

Trong quá trình đo quang, theo thời gian, cường độ ánh sáng phát ra từ nguồn sáng có thê thay đổi Hơn nữa, không thê đo các mẫu cùng một lúc mà phải đo lần lượt Điều này dẫn đến sai lệch kết quả ổo

Đề khắc phục sai lệch do sự thay đổi cường độ ánh sáng từ đèn, hệ thông máy đo quang phé hai chim tia (Double beam) da duoc phat triển

Nguyên tắc làm việc của máy đo quang phô hai chùm tia:

- Ảnh sáng từ nguồn sáng được tách thành hai chùm tia nhờ hệ thống gương và thấu

6

kính Hai chùm tia này sẽ có tính chất hoàn toàn tương tự nhau

- Trong quá trình đo, một chùm tia sẽ được chiếu xuyên qua mẫu cần đo Chùm tia còn

lại được chiếu xuyên qua một mẫu làm chuẩn

- Bộ phận tính toán, xử lý kết quả sẽ so sánh tín hiệu nhận được giữa tia ló ra từ mẫu đo

và tia ló ra từ mẫu chuẩn đề cho ra kết quả

Hinh 2 So do cau tao may quang pho hai chum tia

3 Ứng dụng của phương pháp quang phố

3.1 Phân tích và giải phố của chất hóa học

Mỗi chất có cầu tạo phân tử khác nhau nên sẽ khác nhau về sự hấp thu ánh sáng ở các bước sóng khác nhau Vì vậy, nếu đo độ hấp thu của một chất trên toàn miền ánh sang UV-VIS (từ 200 mm đến 900 nm) sẽ thu được một phô hấp thu đặc trưng cho chất đó Phương pháp này thường được gọi là quét phố (wavelength scan)

Tuy nhiên, phương pháp này thường chỉ được áp dụng đối với những chất mà trong phân

tử có liên kết đôi Đối với những chất mà phân tử chỉ có liên kết đơn, hầu như chúng không hấp thu ánh sáng ở vùng UV-VIS nên không thê áp dụng phương pháp quét phô nay dé phân tích

Ví dụ: Albumin là một loại protein không màu Albumin tạo phức với CuZ* (trong môi trường kiềm) tạo sản phẩm phức màu tím hồng hấp thu mạnh ở bước sóng 546 nm Do

độ hấp thu ở bước sóng 546 nm Đối chiếu với dung dịch protein chuẩn được pha theo nồng độ biết trước và được đo trong củng điều kiện với mẫu chưa biết, từ đó suy ra nồng

độ mẫu chưa biết nồng độ

C tht Atht

C chuan 4 A chuẩn

Với:

C thử là nồng độ dung dịch cần đo

C chuẩn là nồng độ dung dịch mẫu đã biết trước nồng độ

A thử là độ hấp thu của mẫu chưa biết nồng độ

A chuẩn là độ hấp thu của mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ

Trong thực hành xét nghiệm, để tăng tính chính xác, các quy trình đo thường yêu cầu pha nhiều dung dịch chuẩn với nồng độ khác nhau để tạo thành dãy chuẩn Đo độ hấp thu của tất cả các mẫu trong dãy chuẩn đề lập thành phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thu Phương trình này được gọi là phương trình đường chuẩn Phương trình đường chuẩn sẽ được dùng để tính toán lại nồng độ sau khi đo được độ hấp thu của mẫu chưa biết nồng độ

3.3 Dinh luong hoat dé enzyme

Hoạt độ của enzyme được xác định bằng cách xác định lượng cơ chất mắt đi hoặc lượng sản phẩm tạo thành trong một đơn vị thời gian Lượng cơ chất hoặc lượng sản phẩm có thê được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thu quang theo nguyên tắc được nêu ở

8

phan 3.2

4 Thực hành

4.1 Quét phổ, tìm bước sóng hấp thu cực đại của một chất hấp phụ

Pha dung dịch Tartrazin 0,01% và dung dịch xanh methylene 0,01%

Thực hiện quét phổ trên máy đo quang và xác định các đỉnh hấp thu cực đại của hai chất

màu này

4.2 Vẽ đồ thị chuẩn, lập phương trình đường chuẩn

Pha dãy dung dịch chuẩn Tartrazin: lấy 5 bình định mức 100 ml, cho vào lần lượt mỗi bình chính xác 0.5 ml, 1 mi, 5 ml, 10 mi, 20 ml dung dich tartrazine 1% Bồ sung thêm nước cất đến vạch, lắc đều

Đo độ hấp thu quang tại bước sóng hấp thu cực đại đã xác định ở phân 4 I

Vẽ lên đề thị các kết qua do với trục hoành la nồng độ tartrazIne và trục tung là độ hấp thu Tính toán hệ số góc và tung độ góc của đường thăng hồi quy để lập phương trình hồi quy

Chú ý: Phương pháp đo quang kém tin cậy khi dung dịch chất hấp thu có nồng độ quá đậm đặc (A > 0.6) Trong trường hợp này, cần pha loãng dung dịch đo để kết quả A nằm trong khoảng < 0.6

4.3 Xác định nồng độ của một mẫu bắt kỳ

Đo độ hấp thu của mẫu được phát bởi phòng thí nghiệm Dựa vào phương trình đường chuẩn để tính toán nồng độ tartrazine trong mẫu

BAI 2: DINH LUQNG CARBOHYDRATE

NOI DUNG THUC TAP

1 Định lượng sơ bộ đường khử trong nước tiểu bằng ky thuat Benedict

2.1 Nguyên tắc

Nước tiêu thông thường không có các loại đường khử nói chung Ở trạng thái bệnh lý,

trong nước tiêu có thể xuất hiện các loại đường khử như glucose, galactose,

pentose Kỹ thuật Benedict nhằm phát hiện các loại đường khử nhưng không phân biệt

cu thé là loại đường gì Tuy nhiên, đại đa số các bệnh lý đều liên quan đến sự có mặt ølucose trong nước tiêu

Dựa trên phản ứng Fehling và dựa trên màu của sản phẩm tạo thành, có thê đánh giá sơ

bộ lượng đường khử trong nước tiêu

2.2 Tiến hành

Pha thuốc thử Benedict:

Dung dich A gồm: Natri citrate 173 g, Tinh thế NazOOa 200 ø, nước cất 700 mi, lắc cho tan hét

Dung d/ch B gồm: CuSOxa.5HzO 17,3 ø: nước cất 100 ml, lắc cho tan hét

Đồ dàn dung dịch B vào dung dịch A, lắc đều Thêm nước cất vừa đủ 1000 mị, đun cách thủy cho sôi rồi lọc

Tiền hành phản ứng: Cho vào ông nghiệm 2,5 ml dung dịch thuốc thử Benedict và 10 giọt nước tiêu, đun cách thủy cho sôi trong 3 phút

Nhận định két qua:

- Nếu ống thử có màu xanh lam trong suốt: mẫu thử không có đường

- Nếu ông thử chuyền sang xanh lá cây: phản ứng dương tính, lượng đường khoảng 5g

- Nếu dịch trong ông thử có màu xanh lá cây thãm, ống thử có tủa vàng hoặc đỏ gạch:

phản ứng dương tính, lượng đường trong nước tiêu khoảng 5-10 g1

- Nếu dịch ống thử chuyên sang màu vàng, đáy ống thử có tủa đỏ gạch hoặc xám: Phản

ứng dương tính, lượng đường khử trong nước tiêu khoảng 10-20 gf

2 Định lượng glucose máu bằng phương pháp enzyme đo quang

máu Tuy nhiên, với tính đặc hiệu của enzyme glucose oxidase có thể giúp hạn chế sai

số này

Glucose trong máu được oxy hóa đặc hiệu bởi enzyme glucose oxIdase tạo thành

gluconic acid và sinh ra HaOzs HaO› tiếp tục phản ứng với 4-amino antipyrine và phenol

dưới sự xúc tác cua peroxidase dé tao thành quinoneimin Quinioneimin hấp thu cực đại

ở bước sóng 546 nm và là chất được đo quang đề xác định nồng độ glucose trong máu ban dau

- Glucose oxidase >10kU/L

- Dung dich glucose chuan 100 mg/dL (5.55 mmol/L)

2.3 Mẫu thứ

Huyét thanh hoặc huyết tương đã được chống đông bằng heparin

Xét nghiệm được tiền hành chậm nhất 1 giờ sau khi lây máu Đề tránh sự phân hủy glucose, có thẻ dùng chát ức ché NaF hoặc KF (dùng 20 microlit dung dịch NaF 2g/100

mL cho 1 mL máu), có thê để máu 1 ngày ở 20-25 °C hoac 7 ngày ở 4-8 °C

2.2 Tin hành

Chuẩn bị các ống: