Báo cáo thí nghiệm hóa sinh

Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand: Phương pháp này dựa trên cơ sở trong môi trưởng kiểm các đường khử glucose, frucfose, maltose,.. Ở phương pháp Bertrand, để khử cá

DAI HOC QUOC GIA THANH PHO HO CHI MINH

TRUONG DAI HOC BACH KHOA

KHOA KY THUAT HOA HOC

BAO CAO THI NGHIEM HOA SINH

Giảng viên hướng dẫn: Trân Trúc Thanh

Sinh viên: Vũ H'ôYến Nhi-1914528

Lop: LO1

Tp H 6Chi Minh, 2022

BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG ACID DINITRO

SALICYLIC (DNS)

I Nguyên tắc thí nghiệm:

Phương pháp dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử axit dinitrosalicylic (DNS) 3,5 — dinitrosalicylic acid (DNS) cé mau vang trong dung dich ki €m sé khử thành acid 3-amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam

Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS

II Phuong phap thí nghiệm:

- Chuan bi cdc héa chat va mau c% dinh luong đường khử:

[1 Thuốc thử DNS:

Hoà tan 10g DNS vào 400ml nước cất

Hoa tan 16g NaOH vào 150 ml nước cất

Thêm dung dịch NaOH vừa pha vào dung dịch DNS ở trên

Hoà tan bằng khuấy ở t° không quá 500C

OHoOddada Tiếp tục khuấy và cho thém ting it mét 300g potassium sodium tartrate

cho đến khi tan hoàn toàn, chú ý bao kín cốc pha hóa chất

O Sau khi hòa tan hoàn toàn, định mức dung dịch đến 1 Lit, trữ trong chai tối

+ Dung dich glucose10 mg/ml

+ Mẫu c3n định lượng đường khử: 7up

Mẫu c3n định lượng có hàm lượng đường tổng là 43g trong 390 ml Thực hiện pha loãng mẫu 200 In để nềng độ đường khử rơi vào trong khoảng xác định của phương trình đường chuan glucose (0-10 mg/ml)

- Tiến hành dựng đ ôthi đường chuẩn glucoso (0-10 mg/ml) va phân tích đường khử Bảng 1: Thứ tự thí nghiệm phân tích đường khử

No.1 No.2 No.3 No.4 No.5

ĐÐun sôi cách thủy 5 phút, làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phòng

—————————>

Bang 2: Két qua do ODs4onm của dãy chuẩn glucose

Hinh 3: D Gthi biéu dién su tuong quan gitfa n tng dé glucose va dé hap thu ODs4onm

Mối tương quan giữ n Ông độ glucose va d6 ha’p thu OD 540nm

12

=1 xlL

Theo thông tin sản phẩm trong 390ml Z7up có 43g đường tổng tương đương 110mg/ml Tuy nhiên, theo thí nghiệm ta thu được 52.4 mg/ml Vì lượng đường tổng trong sản phẩm không phải toàn bộ là đường khử nên theo phương pháp này ta không thể xác định chính xác lượng đưởng tổng như trong thông tin sản phẩm

IV Các phương pháp khác:

1 Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand:

Phương pháp này dựa trên cơ sở trong môi trưởng kiểm các đường khử (glucose, frucfose, maltose,.) khử đồng II thành đồng I theo phản ứng Fehling với sự có mặt của Kalinatri tartrat Kết tủa đồng I oxit (Cu2O) có màu đỏ gạch, có khả năng khử với muối Fe3+ thành muối Fe2+ trong môi trưởng axit

Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 > 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O

Fe2+ sinh ra có tính khử lại tác dụng với KMnO4 là chất oxy hóa nên dùng KMnO4 để chuẩn độ Fe2+ trong môi trưởng axit

10FeSO4 + 2KMnO4 + SH2SO4 —› K2SO4 + 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3 + 8 H2O Dựa vào lượng KMnO4 sử dụng ta có thể tính được lượng đường khử trong dung dịch bằng cách tra tỉ lệ giữa dung dịch KMnO4 và đường khử của Bertrand

Có nhi`âi phương pháp khác xác định hàm lượng đường như phương pháp Somosgyi, phương pháp Codextan, phương pháp DNS Tuy nhiên, phương pháp Bertrand là phương pháp thưởng được sử dụng nhất vì độ chính xác, tính kinh tế và phù hợp với tiêu chuẩn đo lưỡng của Việt Nam Ở phương pháp Bertrand, để khử các tạp chất có trong mẫu phân tích, người ta thường sử dụng dung dịch kếm feroxyanua Ưu điểm của dung dịch này là kinh tế, không gây độc, đảm bảo việc khử tạp tốt và ít ảnh hưởng đến quá trình định phân đường

2 Xác định đường khử bằng phương pháp Graxianop:

Đường khử khi đun nóng với dung dịch kiên cùng với ferixyanua sẽ khử ferixyanua thành feroxyanua và đường khử chuyển thành acid đường Dùng metylen xanh làm chất chỉ thị

sẽ mất màu xanh khi phản ứng kết thúc Phản ứng như sau:

© 2K3Fe(CN), + 2KOH + CH,OH(CHOH),CHO —>

——> 2K,Fe(CN), +2H;O + COOH(CHOH);COOH

* Tài liệu tham khảo:

https://chatluongthucpham.com/duong-khu-la-gi/

BÀI 2 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BIURET

1 Nguyên tắc

Trong môi truởng ki`ân, hợp chất chứa liên kết peptide sé phản ứng với thuốc thử chứa ion

d “ng (Cu) tạo thành phức màu xanh dương có độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 550nm

Đệ hấp thụ quang này tỉ lệ thuận với nồng độ liên kết peptide trong phan tng vì thế dùng để định lượng protein

- Dung dich albumin:10 mg/ml

- Dung dich Biuret: 9g sodium potassium tartrate, 3g CuSO H.O, hoa tan 100ml NaOH

0.2N định mức với nước cất thành I lít

3 Tiến hành

Dựng đ ồthi đường chuẩn albumin và phân tích n*ng độ protein

Bảng 3: Thứ tự thí nghiệm phân tich n “ng dé protein

chất hoặc đã ống nghiệm sạch mới

Ủ ở nhiệt độ phòng, 20 phút

Do ODssonm 0 0,051 | 0,090 0,148 |0205 |0261 |0206 |0,178 |0,166

1 Chuẩn bị mẫu: P1, P2 và P3 là 3 mẫu lặp lại có thể dùng trực tiếp mẫu phân tích

Nếu ng độ protein trong mẫu phân tích dự đoán cao thì phải pha loãng Ghi lại cách pha loãng và độ pha loãng (n) để tính nông độ protein trong mẫu gốc

2 Thực hiện phản ứng với các bước tu3n tự như trong bảng 3

3 Vẽ đ ôthi đường chuẩn nông độ albumin- trị số OD 550nm

4 Tinh gid tri trung bình của OD 550nm của 3 mẫu P, nếu giá trị này nằm ngoài đường

chuẩn thì phải pha loãng mẫu

5 Sử dụng giá tri trung binh cha OD 550nm mau P và đồthị đường chuẩn albumin, tính được a mg/ml protein trong mẫu pha loãng

6 Nhân với hệ số pha loãng (n) để được ng độ protein trong dung dịch mẫu gốc (Chú ý pha loãng sao cho OD 550nm của mẫu phân tích nằm trong giới hạn đường chuẩn)

- Vay n tng độ đường khử trong mẫu là: 6.730 x 1 = 6.730 ( mg/ml)

Protein

R R CHC —NH—CH—C—NH

- Dé nhay va kha năng ứng dụng

Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phấp xác định dung dịch mẫu chứa vài chục 7ø protein thưởng nhạy cảm trong khoảng 5-2000mg Protein Tuy nhiên phương pháp này không dùng để định lượng các Protein không chứa acid amin vòng thơm như gelatin, đối với những hợp chất có chứa ion kali thì tạo kết tủa ảnh hưởng đến kết quả

1 Định lượng protein theo phương pháp Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250): -_ Nguyên tắc

Dựa phản ứng màu của protein với xanh Coomassie Brillant Blue G-250) và cả khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm Trong môi trưởng axit Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết chặt chế với protein, tương tác với cả nhóm ky nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử Protien làm dung dịch có màu xanh Cưởng độ màu tỷ lệ với nồng độ

protein trong dung dịch Dựa vào đường chuẩn của Protein suy ra ham lượng Profein trong

- Dé nhay va kha năng ứng dụng

Phương pháp này dùng cho protein tan trong nước, phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng Phương pháp này nhạy hơn 2-3 lần so với phương pháp Lowry, nhanh va đơn giản hơn nhi i

vì nó cho phép xác định tới vài #g protein/ml, đồng thời làm gaimr ảnh hưởng của muối, đệm, các chất khử Tuy nhiên phương pháp này không dùng với những chất có chứa surfactants vì gây ra kết tủa của các chất phản ứng Những chất có tính kiên mạnh làm tăng mật độ quang gây sai lệch kết quả Màu Coomassie lam ban cuvet thach anh nên chỉ dùng covet tht tinh dé

- Vô hoạt enzym và két tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch axit trichloacetic

- Định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng máu với thuốc thử Folin

- _ Dựa vào đồthi đường chuẩn tính lượng sản phẩm do enzym xúc tác tạo nên dựa vào

đ ồthi đường chuẩn tyrosine

Il Bb ng phap thi nght m:

Cho 5ml Casein 0.65% vào Thém dung dich enzyme vao

4 ống nghiệm, ủ 37°C, 5phút E—> 3 ống (trử ống blank)

Thêm enzyme vào tất cả 4

ống sao cho thế tích enzyme

IH Kết quả thí nghiệm:

1 Dựng đường chuẩn tyrosine:

Bảng 4: Dựng đường chuẩn L-tyrosine

Mỗi mẫu enzyme c3 4 ống nghiệm 1 ống làm mẫu blank, và 3 ống tiếp theo dùng để đo hoạt

tính protease ở 3 nông độ pha loãng khác nhau

Trục hoành: n ông d6 tyrosine tinh theo zmole/ml

O Truc tung: dé hap thu OD 660nm

IH Kết quả:

H Tính hoạt tính của protease:

- Hoat d6 Protease được tính theo ơn vị trên mỗi mi:

11 = Tổng thể tích dịch lọc (mL)

10 = Thời gian phản ứng (phút)

0,5 = Thể tích enzyme (mL) của enzyme được sử dụng

2 = Thể tích địch lọc dùng trong phản ứng tạo màu (ml)

- Hoat tinh trong mau protease ran (Unit/mg)

Được pha loãng tính bằng UnitmL enzyme chia cho lượng chất rắn được sử dụng trong phản ứng này ban đầu (mg/mL)

Units/mg chat ran = = = 0,00019857

- _ Hoạt tính riêng của enzyme:

Units/mg protein= = =0,01286

IV Kết luận:

Trong thơm có chứa enzyme protease dùng để thủy phân protein, chúng có khả năng phá vỡ phân tử protein thành các acid amin hoặc peptide

N wng độ protease càng cao, lượng protein bị thủy phân càng nhi Gu

Các chất xúc tác sinh học không chỉ xác tác cho các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, mà ở những đi`âi kiện nhất định, sau khi tách khỏi hệ thống sống chúng vẫn luôn giữ được hoạt tính xúc tác Chẳng hạn như khi nghi ân tế bào thơm nhưng chúng van con git? duoc enzyme protease

V Mở rộng:

Hoạt độ của các chất xúc tác sinh học trong tế bào và cơ thể sống được đi `âi hòa nghiêm

ngặt theo nhị lâi cơ chế khác nhau

Nhóm enzyme profease xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide (-CO-NH); trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm thủy phân cuối cùng là các acid amin Ngoài ra, nhỉ `âI protease cũng có khả năng thủy phân liên kết ester và vận chuyển amine

Proteases

1/ Các yếu tế ảnh hưởng đến hoạt d6 enzyme:

- Ảnh hưởng của nông độ enzyme

- Ảnh hưởng của n ng dé co’ chat

- Ảnh hưởng của các chất kìm hãm

- Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

- Ảnh hưởng của ng độ muối

Ngoài các yếu tố trên hoạt độ enzyme còn phụ thuộc vào nhị âi yếu tố khác như: ánh sáng (đặc biệt là tia tử ngoại), sóng siêu âm, tia bức xạ

2/ Ung dung chung ctia Enzyme Protease:

Oo

Oo

Trong công nghiệp thực phẩm:

Chế biến thịt: protease thủy phân một phần protein trong thịt, làm cho thịt có một độ mầm thích hợp và tăng hương vị cho thịt

Sản xuất dịch đạm: tử Streptomyces fradiae tách được chế phẩm Keratineza thủy phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch dam tử da, lông vũ

Công nghiệp sữa: protease được dùng để sản xuất pho mat nhở hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng

Sản xuất bánh: chỉ dùng prorease ở giai đoạn cực ngắn để amino acid va peptide tu do phản ứng với một số thành phn của bột

Sản xuất bia: dùng protease để thủy phân có giới hạn protein của bia

Trong công nghiệp đa: protease được sử dụng để làm m'`ôn da nhở sự thuỷ phân sơ bộ lông, tách các mô liên kết phía ngoài ra, chỉ còn lớp collagen tạo lớp mỏng và m`ân da Trong công nghiệp dệt: đây là protease được sử dụng để xử lý bên ngoài các sợi tơ, làm nhiệm vụ kết dính các sợi tơ Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã

làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tầm do đó làm giảm

lượng hóa chất để tẩy trắng

Trong chế biến thủy sản: tăng lượng nước mắm nhờ thủy phân protein thành các acid

c TA cv " a we ’ é

amin làm tăng hiệu suất thu hổ đạm của nước mắm

3/ Phương pháp xác định họat tính enzyme:

Khi tiến hành thí nghiệm đo họat tính enzyme cân chú ý những điểm sau:

Cần tránh những yếu tố có thể biến tính protein/ enzyme

- Cac thông số nhiệt độ, pH, nông độ ion và thành phần dung dịch đệm ảnh hưởng lên

hoat tinh enzyme Thử hoạt tính phải được tiến hành trong đi `âi kiện thích hợp như đi`âi

kiện sinh lý, đi `âi kiện t ồn trữ thực phẩm hoặc đi `âi kiện mà hoạt lực có thể đạt tối ưu

- _ Với những enzyme c3 có chất hoạt hóa hoặc chất ổn định thì phải cho các chất này vào enzyme trước khi cơ chất vào hỗn hợp phản ứng

- - Nâng độ cơ chất trong phản ứng enzyme phải trong giới hạn thích hợp, đủ thừa để bão hòa enzyme nhưng không quá cao để kìm hãm enzyme Sau khi dừng phản ứng lượng

cơ chất được chuyển hóa 20-30%

- _ Thời gian xác định hoạt tính thưởng 5-30 phút Tốt nhất là xác định tốc độ ban đìâi của phản ứng (30-60 giây), vì giai đoạn này tốc độ phản ứng lớn nhất, sau đó bắt đ`âi giảm

- Khi xác định hoạt tính phải làm mẫu đối chứng song song với mẫu thí nghiệm Trong mẫu đối chứng enzyme phải bị bất hoạt trước khi tiếp xúc với cơ chất

Trang thai can bang

- _ Giàu chất dinh dưỡng

[1 Dứa là loại quả có hàm lượng calo thấp nhưng rất giàu các chất dinh dưỡng khác Một

số chất dinh dưỡng có trong dứa bao g ồn chất xơ, mangan, vitamin B9, magie, kali, chất béo, vitamin C

H Đặc biệt, vitamin C có trong dứa rất cần thiết có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch, giúp cơ thể phát triển toàn diện và khỏe mạnh

- _ Nhi âi chất chống oxy hóa

Oo Không chỉ giàu chất dinh dưỡng, dứa còn chứa nhi 'âi chất chống oxy hóa, được gọi là flavonoid va axit phenolic Các chất này mang lại nhi tác dụng lâu dài đối với cơ thể người, bao ø ôn làm giảm nguy cơ mắc bệnh v`êhệ miễn địch và chứng viêm mãn tính

- - Hỗ trợ tiêu hóa

[1 Trong dứa có chứa một nhóm các enzyme tiêu hóa được gọi là bromelain Chúng có chức năng phá vỡ các phân tử protein thành các khối xây dựng như axit amin và peptide Những phân tử protein bị phá vỡ sau đó có thể dễ dàng hấp thu vào ruột non

O Di nay đặc biệt hữu ích với những người bị suy tuyến tụy — tinh trang tuyến tụy không thể tạo ra đủ các enzyme tiêu hóa mà cơ thể c ân

- - Giảm nguy cơ ung thư

[ Mội số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, bên cạnh việc chống oxy hóa và giảm viêm, dứa còn

có tác dụng giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh ung thư Những enzyme tiêu hóa bromelain có trong đứa có thể ngăn ngửa sự phát triển các tế bào ung thư, bao ø Ẳn ung thư da, ống mật và da day

- _ Tăng cường khả năng miễn dịch

[HH Không chỉ là một loại quả, đứa còn được biết đến như mệt phẦn của y học cổ truy n trong nhi ân thế kỷ Các loại vitamin, khoáng chất và enzyme có trong dứa giúp tăng khả năng miễn dịch và chống viêm

- _ Giảm các triệu chứng của bệnh viêm khớp

[1 Viêm khớp là căn bệnh phổ biến, nhất là ở người cao tuổi Do có đặc tính chống viêm, dứa có khả năng giảm đau do chứng viêm ở các khớp Một số nghiên cứu đã cho thấy chất bromelain có trong dứa rất hiệu quả trong việc đi u trị các bệnh thoái hóa khớp

- Tang khả năng phục h'ổ sau phẫu thuật

[1 Chất bromelain có liên quan đến khả năng giảm sưng, b`ần tím và đau nhức xảy ra sau khi phẫu thuật Ngoài ra, đặc tính chống viêm của bromelain cũng giúp giảm viêm mô sau quá trình tập thể dục nặng

Tài liệu tham khảo:

Giáo trình Hóa sinh học cơ sở

Thí nghiệm Hóa sinh Đại học Bách Khoa Hà Nội

Bài 4A ĐỊNH LƯỢNG LIPID THÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SOXHLET

I Nguyên tắc thí nghiệm:

Trong tế bào, lipid ở dạng tự do và liên kết Lipid tự do tập trung chủ yếu ở các cơ quan

dự trữ như hạt, quả (ở thực vật) và mô mỡ (ở đệng vật) Để xác định hàm lượng lipid, chiết rút lipid ra khỏi nguyên liệu bằng dung môi hữu cơ

Có 2 phương pháp để xác định

Phương pháp xác định trực tiếp: chiết xuất lipid ra khỏi nguyên liệu và cân trực tiếp Phương pháp gián tiếp: chiết xuất lipid ra khỏi nguyên liệu và cân lại nguyên liệu Dùng dung môi kị nước trích lï hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được nghiâ nhỏ Các dung môi chiết xuất lipid théng dung 1a etylic (ether petrol, benzen, cloroform, tetraclorua cacbon .) Trong phòng thí nghiệm thưởng str dung ete etylic, vi ete cé dé bay hoi cao, nhiét

độ sôi thấp tốc độ của quá trình chiết xuất phụ thuộc vào mức độ nghi a nhỏ của nguyên liệu Ngoài lipid ra còn có một số hợp chất khác như: vitamin hoa tan trong lipid phosphatit, steroid, cũng được chiết ra Tuy nhiên, hàm lượng các chất này rất ít, nên phương pháp này vẫn chấp nhận trong các thí nghiệm thông thường Vì vậy, lipid chiết xuất trong hai phương pháp trên gọi là lipid thô

Quá trình chiết xuất lipid được thực hiện trên máy Soxhlet, øg âm có: bình c3 (a), trụ

chiết (b), ống sinh hàn (c)

Hóa chất: Ether etylic hoặc ether petrol

II Phuong phap thi nghiém:

Ill Kéétqa thínghệ m:

Hàm lượng lipid có trong 100g mẫu nguyên liệu:

X=

Với: X: ham lượng lipid (%)

a: khối lượng túi mẫu nguyên liệu trước khi chiết (g)

b: khối lượng túi mẫu nguyên liệu sau khi chiết (g)

c: khối lượng nguyên liệu đem xác định (g)

IV Kếtluận:

Qua kết quả trên cho ta thấy hàm lượng lipid trong đậu phộng

* Ưu điểm của máy Soxhlet:

Tiết kiệm dung môi, một ít đụng môi chiết kiệt được mẫu

Không tốn thời gian châm dung môi mới và lọc dịch chiết như các kĩ thuật khác Chỉ ca cắm

điện mở nước hoàn lưu là thiết bị sẽ tự đệng thực hiện quá trình chiết

* Nhược điểm của máy Soxhlet:

Trong quá trình chiết các hợp chất chiết ra tử bệt nguyên liệu được trữ lại trong bình cần nên

chúng luôn được đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi, vì thế hợp chất nào kém b`ân nhiệt sẽ

dạng các hạt câầi và được bao bọc bởi một lớp màng lipo-protein Do đó, để việc xác định chất

béo trong dịch sữa đạt độ chính xác cao thì cẦn loại bỏ lớp lipo-protein bảo vệ trước khi trích

ly chất béo bằng các dung môi hữu cơ

Mục đích: Trích ly chất béo trong các sản phẩm thực phẩm dạng lỏng, đặc biệt là các loại sữa động vật và thực vật

Nguyên tắc:

Trích ly chất béo bằng cách bổ sung lần lượt 4 dung môi khác nhau: amoniac, c ôn, diethyl ether va petroleum ether C và ammoniac dùng để kết tủa và loại protein ra khỏi các hạt ci béo Dicthy cther được dùng để trích ly chất béo và các thành phẦn tan trong chất béo Petroleum ether được bổ sung vào để trích ly béo và một lượng nhỏ các thành ph tan trong béo do petroleum ether là dung môi trích ly có tính chọn lọc cao hơn so voi diethyl ether Hỗn hợp sau khi bổ sung dung môi và khuấy đảo tách thành hai pha: pha nhẹ nằm ở trên bao gần dung môi và chất béo, pha nặng nằm ở dưới g `ên nước và các chất hòa tan trong nước Ta thu pha nhẹ g ôn dung môi va chất béo, làm bay hoi dung môi ta thu được tổng chất

béo trong mẫu sữa.