1. Nguyên tắc
Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc ký được dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao g ồn pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thưởng là silica gel,aluminium oxit, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao g lâm dung dịch c Ân phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành ph Ân trong dung dịch.
Các amino acid có độ phân cực phân cực khác nhau sẽ tan trong các dung môi có độ phân cực tương ứng trong pha động.
Vì các amino acid là những hợp chất không màu, nên ninhydrin thưởng được dùng để làm chất chỉ thị phát hiện ra các amino acid đó, nhở vào sự hình thành phức chất Ruhemann màu tim xanh khi ninhydrin tác dụng với gốc amin.
Mỗi amino acid có một hệ số phân bố riêng giữa pha di động và pha tĩnh. Kết quả là hỗn hợp amino acid được phân tích ra thành từng amino acid riêng biệt.
Trong những đi âi kiện nhất định (dung môi, nhiệt độ, loại bản mỏng sắc ký...) tốc độ dịch chuyển của dung môi và các amino acid của hỗn hợp được đặc trưng bởi hệ số Rf
Rf =
+
.
Khoảng dịch $ ¡_ Khoảng dịch chuyển
chuyển của 6 của cấu tử
dung môi
ae Ỷ
M
Ninhyrin phản ứng với amino acid:
O
OH
z O oO
OH
Ninhydrin ‘6 —> No
+ oO
HạN——CH——C——oH ° 0
Ruhemann's purple Amino acid
2. Héa chaat
1. Hỗn hợp dung méi n-butanol : acid acetic : nuée = 5:1:5 2. Dung dich ninhydrin
3. Hỗn hợp amino acid
Tiến hành
é Z
Bản mỏng sắc kí
Kẻ 2 đường bút chì cách đáy dưới 1,5cm; cach day
trén 1 cm
Chia đường kẻ dưới thành những đoạn bằng nhau
v
Chấm các mẫu amino
: > ^“
acid bằng ống mao quản, để khô
Ghi nhận kết quả
Rót dung môi sắc ký vào bình sắc ký
Phun thuốc thử ninhydrin, sấy khô
Đặt bản mỏng vào bình sao cho dung môi ở dưới
đường kẻ, đậy kín
A
Khi dung môi đến đường kẻ trên, lấy ra.
Để khô
3. Kết quả
Hình 1. Hình ảnh sắc ký bản mỏng khi thực hiện
Vì hỗn hợp amino acid chưa thể tách ra thành vệt rõ ràng do thao tác chấm, nên không thể tính kết qua Rf.
Doan đường di chuyển của cấu tử (mm)
28 36 35
Đoạn đường di chuyển của dung môi (mm) 75 75 75
Rf 037 048 045
Bảng 1. Giá trị Rf thực hành với hệ dung môi n-bufanol: acetic acid: nước = 5:1:5
Hình 1.
Titnh Anh
H So sánh các thành ph trong mẫu với amino acid có trong giá trị Rf mẫu:
Acid amin Methionine Leucine L-Tyrosine
Số liệu I1 0,43 0,62 OAl
Số liệu 2 0.48 066 | mm
Bảng 2. Giá trị Rf tham khảo với hệ dung môi n-butanol: acetic acid:nước = 4:1:5 Vì không thể tính được giá trị Rf của hỗn hợp amino acid, nên bảng 2 so sánh chỉ mang tính chất tham khảo.
Il. Kếtluận
- Các amino acid có độ phân cực khác nhau sẽ tan trong các dung môi có độ phân cực khác nhau.
- Trong hệ dung môi n-butanol: acetic acid: nước = 5:1:5, Leucine hòa tan tốt nhất.
- Hén hợp amino acid kéo thành vệt dài tương ứng với 3 loại amino acid trên.
HI. Mở rộng: Phương pháp khác để phân tích amino acid:
1/ Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) xem là phương pháp tách các thành phần từ hợp chất tự nhiên thích hợp và hiệu quả nhất. Đây cũng là phương pháp tách hiệu quả hàng đi được sử dụng trong phép phân tích các axit amin (AAA) từ các sản phẩm tự nhiên, cho phép phân tách và phát hiện bằng phương pháp hấp thụ tia tử ngoại hoặc huỳnh quang. Tuy nhiên, các axid amin phổ biến nhất không chứa nhóm mang màu, do đó thưởng phải tạo thêm dẫn xuất trước khi tiến hành HPLC hay phản ứng sau cét (post-column).
Các acid amin là các phân tử rất phân cực, do vậy các phương pháp sắc ký thông thường như sắc ký lỏng hiệu năng cao kiểu phân bố pha đảo (RP-HPLC), hay sắc ký khí (GC) không thể thực hiện mà không tạo dẫn xuất.
Qui trình tạo dẫn xuất có một số mục đích như sau:
+ Làm tăng khả năng bay hơi, + Giảm khả năng hoạt hóa, hoặc
+ Cải thiện hiệu quả và cách phân tích sắc ký của các hợp chất được quan tâm.
Một số phương pháp sắc ký lỏng chuyên dụng trong định lượng amino acid như sắc ký trao đổi ion (IEC) vàsắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC). ặc dù kỹ thuật này cho độ phân
giải và độ nhạy phù hợp, nhưng quá trình tạo dẫn xuất lại làm tăng độ phức tạp, giá thành và thời gian phân tích.
- Kỹ thuật sắc ký trao đổi ion kết hợp bộ tạo dẫn xuất sau cột với tác nhân ninhydrin là một trong những phương pháp được ứng dụng phổ biến nhất để định lượng axit amin. Quá trình tách các axit amin trên cột trao đổi ion được thực hiện kết hợp với sự thay đổi độ pH và độ mạnh yếu của các ion (cation). Để tăng hiệu quả tách áp dụng thêm chu trình Gradient nhiệt độ.
- Sắc ký lỏng pha đảo cặp ion kết hợp với đầu dò khối phổ, IPRPLC-MS/MS là kỹ thuật cho phép phân tích các axit amin mà không cẦn tạo dẫn xuất, do đó giảm các lỗi phát sinh do các tác nhân, nhiễu, dẫn xuất tạo thành không bền, các phản ứng phụ, ... Sử dụng tác nhân tạo dẫn xuất dễ bay hơi, quá trình phân tách bằng kỹ thuật cặp ion (ion pair — IP) dựa trên hai cơ chế khác nhau như sau:
+ Tác nhân IP được hấp thụ tại b`Êmặt giữa pha tĩnh và pha động; và
+ Sự hình thành của một lớp khuếch tán và điện thế b`ềmặt tĩnh điện phụ thuộc vào n ông độ b`ềmặt của tác nhân IP.
2/ Sắc ký khí (GC): được dùng trong tách và phân tích các hợp chất dễ bay hơi mà không làm phân hủy chúng.
Quá trình tạo dẫn xuất thường gặp nhất là quá trình silyl hóa (đưa nhóm thế vào phân tử), đây là phương pháp mà trong đó hydro axit được thay thế bằng nhóm alkylsilyl. Nhược điểm của phương pháp này là tác nhân và dẫn xuất dễ bị tác động bởi độ ẩm và tính không ổn định của dẫn xuất. Có một số axit amin không b`ầ (như arginine và axit glutamic). Arginine phân hủy thành ornithine, con axit glutamic bị sắp xếp lại cấu trúc thành axit pyro-glutamic.
Một phương pháp tạo dẫn xuất trong GC là phương pháp axyl hóa hoặc este hóa, tác nhân hiện nay được sử dụng là kết hợp một andehit và rượu (anđehit pentafluorpropyl hoặc trifloroformate va isopropanol) hoac alkyl chloroformate và rượu.
Quá trình silyl hóa diễn ra thông qua quá trình thay thế trực tiếp của nhóm carboxyl tạo este và các nhóm amin thành carbamate, phản ứng được xúc tác bởi một chất mang tính bazơ (như pyridine hoặc picoline). Các este alkyl cực kỳ b`ền và có thể giữ được trong một thởi gian dài.
* Sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC-MS) là phương pháp phân tích với độ lặp lại thời gian lưu tốt, và dễ tự động hóa.
Nhược điểm chính của kỹ thuật này là do tính kém b`ân với nhiệt độ của một số hợp chất và/hoặc dẫn xuất của chúng, rất khó để phân tích dưới hi hết các đi âi kiện của sắc ký khí (GC). Phổ khối là một trong số những kỹ thuật hiệu quả nhất để xác định cấu trúc của các hợp chất
tự nhiên. Kỹ thuật khối phổ hoạt động dựa trên việc tách ra của các ion tạo bởi ngu ồn lon hóa và tỷ lệ khối lượng/điện tích (m/z) của chúng.
Kỹ thuật này cho phép đo chính xác khối lượng phân tử (MW), xác nhận mẫu, chứng minh độ tỉnh khiết của mẫu, kiểm tra sự thay thế, và trình tự sắp xếp của các axit amin. Quá trình này rất hữu hiệu trong việc xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ và trình tự sắp xếp của oligo- nucleotit hoặc của chuỗi polypeptit.
Ưu điểm chính của MS là chỉ yêu c`âi một lượng mẫu rất nhỏ (từ ng đến pg).
Fẽù Tài liệu tham khảo:
1. Analytical Chemistry, book edited by Ira S. Krull
2. Peptide and Amino Acids Separation and Identification from Natural Products
— Tác giả: lon Nedal, Paulina Vlazan1, RalucaOana Pop1, Paula Sfarloagal, Ioan Grozescul va Adina-Elena Segneanu
3. Analysis of amino acids using paper chromatography (Table I), P. S. RAO AND R.
M. BERI , trang 372.