Protein tubulin đóng vai trò vào việc tham gia xây dựng các microtubule – các vi ống như một khung quan trọng hỗ trợ hình thái tế bào trong kỳ trung gian và là thành phần chính của trục
TỔNG QUAN
Ung thư gan
1.1.1 Giới thiệu về ung thư gan
Ung thư gan là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến nhất tại Việt Nam và trên toàn thế giới, với tỷ lệ mắc và tử vong cao Bệnh đang có xu hướng gia tăng ở độ tuổi trẻ, đe dọa tính mạng của hàng triệu người Việc phát hiện sớm và áp dụng phác đồ điều trị phù hợp là rất quan trọng để giảm thiểu nguy cơ tử vong.
Ung thư gan là tình trạng khối u phát triển không kiểm soát trong các tế bào gan, dẫn đến việc phá hủy tế bào gan và cản trở chức năng bình thường của gan Gan, một cơ quan có kích thước bằng quả bóng đá, nằm ở phần trên bên phải của bụng, thực hiện nhiều chức năng quan trọng như bảo vệ cơ thể khỏi độc tố, tiết mật để tiêu hóa chất béo và lưu trữ glucose cùng các dưỡng chất thiết yếu cho cơ thể trong những lúc thiếu thức ăn và nước uống.
Hình 1.1 Khối u ung thư ở gan người
Ung thư gan được chia thành hai loại chính: ung thư gan nguyên phát, bắt nguồn từ tế bào gan, và ung thư gan thứ phát, thường xảy ra khi ung thư từ các bộ phận khác như ruột kết, phổi hoặc vú lan đến gan Ung thư di căn, tức là ung thư bắt đầu ở một vị trí khác trong cơ thể và sau đó lây lan đến gan, phổ biến hơn so với ung thư gan nguyên phát.
Ung thư ruột kết di căn được đặt tên theo cơ quan khởi phát, cụ thể là bệnh ung thư bắt đầu từ ruột kết và sau đó lan rộng đến gan.
Ung thư gan nguyên phát có thể hình thành từ nhiều loại, trong đó ung thư biểu mô tế bào gan (HepatoCellular Carcinoma - HCC) là loại phổ biến nhất, chiếm khoảng 75% các trường hợp Khoảng 70-90% HCC phát sinh do viêm gan mạn tính do virus B, virus C, xơ gan, bệnh lý gan do rượu và bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu Ngoài ra, các yếu tố nguy cơ khác như nhiễm độc và hút thuốc lá cũng góp phần vào sự phát triển của bệnh Các loại ung thư gan khác như ung thư đường mật trong gan và ung thư nguyên bào gan ít gặp hơn nhiều.
Ung thư gan xảy ra khi các tế bào gan có những thay đổi đột biến trong DNA, dẫn đến sự phát triển ngoài tầm kiểm soát và hình thành khối u DNA là vật liệu quyết định mọi quá trình hóa học trong cơ thể, và các đột biến có thể làm thay đổi các quá trình này Khối u ác tính có thể phát triển từ các bệnh lý như viêm gan B mạn tính, viêm gan C mạn tính, hoặc do uống rượu quá mức Tuy nhiên, trong một số trường hợp, ung thư gan cũng xuất hiện ở những người không có bệnh lý rõ ràng, khiến việc xác định nguyên nhân trở nên khó khăn.
1.1.2 Điều trị ung thư gan
Hiện nay có nhiều phương pháp được sử dụng để tiến hành điều trị ung thư gan như là:
Xạ trị và hóa trị là hai phương pháp điều trị ung thư hiệu quả Xạ trị sử dụng năng lượng cao từ tia X và proton để tiêu diệt tế bào ung thư và thu nhỏ khối u, đồng thời bảo vệ các mô khỏe mạnh xung quanh Trong khi đó, hóa trị sử dụng thuốc để tiêu diệt các tế bào phát triển nhanh chóng, bao gồm cả tế bào ung thư.
Phẫu thuật là phương pháp điều trị hiệu quả để loại bỏ khối u gan, đặc biệt khi khối u nhỏ và chức năng gan vẫn tốt Trong một số trường hợp, bác sĩ có thể đề nghị phẫu thuật để cắt bỏ ung thư gan cùng với một phần mô gan khỏe mạnh xung quanh Ngoài ra, phẫu thuật ghép gan cũng là một lựa chọn, trong đó lá gan bị bệnh sẽ được thay thế bằng lá gan khỏe mạnh từ người hiến tặng.
6 từ người hiến tặng Phẫu thuật ghép gan là lựa chọn cho một tỷ lệ nhỏ người bị ung thư gan giai đoạn đầu [7]
Tiêu diệt tế bào ung thư bằng nhiệt hoặc lạnh
Phương pháp điều trị bằng thuốc nhắm mục tiêu đang thu hút sự chú ý đáng kể trong lĩnh vực y học Thuốc nhắm mục tiêu hoạt động bằng cách tấn công và ức chế các điểm yếu cụ thể trong tế bào ung thư, góp phần làm chậm sự tiến triển của bệnh ở bệnh nhân mắc ung thư gan tiến triển.
Khái quát các hợp chất flavonoid
1.2.1 Giới thiệu về các hợp chất flavonoid
Flavonoid là một nhóm hợp chất có mặt trong các tế bào quang hợp, xuất hiện phổ biến trong thực vật Chúng có mặt trong nhiều loại thực phẩm như trái cây, rau, quả hạch, hạt, thân, hoa, cũng như trong trà, rượu, keo ong và mật ong, và đóng vai trò quan trọng trong chế độ ăn uống hàng ngày của con người.
Flavonoid là các dẫn chất polyphenol với cấu trúc đa dạng, chủ yếu có màu vàng, nhưng cũng có thể màu đỏ, xanh, tím hoặc không có màu Về mặt hóa học, flavonoid gồm 15 carbon, tạo thành khung C6-C3-C6 với hai vòng benzen A và B liên kết qua một dị vòng pyran Các nhóm thế khác nhau thường xuất hiện ở vòng A và B.
Hình 1.2 Khung sườn chung của các flavonoid
Flavonoid được phân loại thành các nhóm nhỏ như chalcone, 3-hydroxyflavone và flavanone, tùy thuộc vào nhóm thế chứa oxy ở vòng C và mức độ bão hòa tại vị trí 2, 3 của vòng C, cũng như sự mở vòng pyran ở trung tâm.
Chalcone là một nhóm flavonoid đặc trưng bởi sự thiếu vắng vòng pyran C, được gọi là flavonoid mạch hở Nó có cấu trúc với hệ thống -𝛼,𝛽 không bão hòa và bao gồm 3 đơn vị carbon Chalcone tồn tại dưới dạng cis hoặc trans, trong đó đồng phân trans có tính ổn định nhiệt động cao hơn do hiệu ứng không gian từ vòng A và nhóm carbonyl Ngoài ra, chalcone còn là tiền chất quan trọng trong việc tổng hợp các hợp chất flavonoid khác như 3-hydroxyflavone và flavanone.
Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của các nhóm chất: a) chalcone; b) 3-hydroxyflavone; c) flavanone
3-hydroxyflavone (flavonol) là một loại flavonoid đặc trưng bởi nhóm ketone >C=O tại vị trí thứ 4 và nhóm hydroxyl >OH ở vị trí thứ 3, cùng với sự không bão hòa tại vị trí 2, 3 trên vòng C Nguồn cung cấp flavonol phong phú bao gồm hành tây, cải xoăn, rau diếp, cà chua, táo, nho và các loại quả mọng Ngoài trái cây và rau củ, trà và rượu vang đỏ cũng là những nguồn giàu flavonol.
Flavanone, một lớp hợp chất quan trọng, thường xuất hiện trong các loại trái cây họ cam quýt như cam, chanh và nho Những hợp chất này góp phần tạo ra vị đắng đặc trưng của nước ép và vỏ trái cây họ cam quýt Flavanone còn được biết đến với tên gọi dihydroflavone, mang cấu trúc vòng đặc trưng.
Flavanone có cấu trúc khác biệt so với 3-hydroxyflavone, với vòng C bão hòa và không có nhóm hydroxyl tại vị trí 3 Sự khác biệt này nằm ở việc flavonol có liên kết đôi tại vị trí 2 và 3 của vòng C.
Flavonoid đã được sử dụng trong các ứng dụng trị liệu từ hàng ngàn năm qua thông qua các loại thực vật và thảo mộc để điều trị nhiều bệnh khác nhau Chúng có nhiều hoạt tính điều trị tiềm năng, bao gồm kháng viêm, kháng estrogen, ức chế enzyme, kháng khuẩn, kháng dị ứng, kháng oxy hóa, và hoạt tính mạch máu Đặc biệt, flavonoid còn thể hiện tiềm năng trong hoạt tính kháng ung thư.
Các hợp chất flavonoid có khả năng ngăn chặn chu kỳ tế bào và gây ra apoptosis, một quá trình mà tế bào ung thư thường kháng cự Chúng can thiệp vào các protein kinase và thụ thể tăng trưởng như EGFR, PDGFR và VEGFR, đóng vai trò quan trọng trong sự tăng sinh và tồn tại của tế bào ung thư Flavonoid cũng thể hiện hoạt tính kháng ung thư thông qua khả năng loại bỏ các oxy phản ứng (ROS), nguyên nhân gây ra stress oxy hóa và liên quan đến viêm, góp phần vào sự phát triển của nhiều bệnh thoái hóa và ung thư Chúng có khả năng ổn định các gốc tự do nhờ các nhóm hydroxyl phenolic, hoạt động như chất kháng oxy hóa trong điều kiện bình thường và là chất kháng oxy hóa mạnh trong tế bào ung thư, kích hoạt con đường apoptosis Hơn nữa, flavonoid kích hoạt các enzyme kháng oxy hóa và ức chế các enzyme tiền oxy hóa, góp phần vào tác dụng kháng ung thư của chúng.
Nghiên cứu trên 9.959 nam giới và phụ nữ cho thấy mối liên hệ tỷ lệ thuận giữa việc tiêu thụ flavonoid và hoạt động kháng ung thư, với lượng flavonoid cao nhất có thể giảm nguy cơ ung thư phổi tới 50% Flavonoid không chỉ có khả năng ngăn ngừa ung thư mà còn hỗ trợ điều trị bệnh, bằng cách dừng chu kỳ tế bào ở các pha G1/S, G2/M và khắc phục tổn hại DNA do gốc oxy hóa Một nghiên cứu khác với 10.054 cá nhân tại Phần Lan chỉ ra rằng tiêu thụ quercetin cao giúp giảm nguy cơ ung thư phổi, trong khi myricetin có liên quan đến việc giảm nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt Những phát hiện này khẳng định vai trò quan trọng của flavonoid trong việc ngăn ngừa ung thư.
Nghiên cứu của Gayathri Rajendran và cộng sự chỉ ra rằng chalcone có khả năng kháng lại nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư vú và ung thư phổi Đặc biệt, các chalcone chứa dị vòng với nitơ, lưu huỳnh và nhóm thế methoxy đã được báo cáo có hoạt tính kháng lại vi khuẩn, bệnh bạch cầu, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư ruột kết.
Mô hình docking phân tử
Sự phát triển trong hiểu biết về cấu trúc protein thông qua tinh thể học tia X và cộng hưởng từ hạt nhân đã thúc đẩy việc áp dụng docking protein-phối tử để đánh giá tính tương thích của các phối tử với vị trí liên kết Trong thập kỷ qua, docking đã trở thành một trong những công cụ chủ yếu trong thiết kế thuốc dựa trên máy tính, giúp sàng lọc hàng loạt hợp chất nhằm hỗ trợ nghiên cứu và phát triển thuốc.
Docking phân tử là một kỹ thuật mô hình hóa mục tiêu, dùng để dự đoán cấu trúc và vị trí gắn kết của các phối tử vào khoang gắn kết của protein và enzyme trong không gian ba chiều Kỹ thuật này đóng vai trò quan trọng trong việc dự đoán ái lực và hoạt tính của các dược chất đối với protein, từ đó hỗ trợ trong nghiên cứu và phát triển thuốc.
Khả năng hoạt hóa hoặc ức chế một protein chức năng thường phụ thuộc vào khả năng gắn kết của phối tử với enzyme/protein Docking đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các cấu trúc ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất, từ đó giúp tổng hợp các chất có hoạt tính tốt nhất trên protein đích Nó cũng dự đoán tâm hoạt động và vị trí, cấu hình thuận lợi của phối tử trong cơ chế xúc tác của enzyme Docking phân tử đã trở thành công cụ thiết yếu trong khám phá thuốc, nghiên cứu mô hình gắn kết phối tử và tương tác liên phân tử, đồng thời ước tính năng lượng tự do gắn kết và xếp hạng các chất dựa trên ái lực gắn kết Ngoài ra, docking cho phép sàng lọc ảo các thư viện chất lớn và đề xuất giả thuyết về cách thức các phối tử ức chế mục tiêu Mục tiêu chính của docking là tìm ra phức hợp phối tử-protein ổn định với năng lượng liên kết thấp nhất.
Quá trình docking bắt đầu bằng việc áp dụng các thuật toán để xác định cấu dạng gắn kết của phối tử trong khoang gắn kết, nhằm kiểm tra độ chính xác của sự định hướng Sau đó, các cấu dạng này được chấm điểm dựa trên mức độ gắn kết phù hợp với đích tác động Những cấu dạng gắn kết tốt nhất sẽ được giữ lại và đánh giá lại để xác định năng lượng tự do của sự gắn kết một cách chính xác Quá trình này không chỉ xem xét các dạng năng lượng đơn giản như lực tĩnh điện hay lực Van der Waals, mà còn bao gồm các yếu tố phức tạp như entropy và năng lượng solvate hóa.
Nhiều thuật toán tìm kiếm cấu dạng đã được phát triển và áp dụng rộng rãi trong phần mềm docking phân tử Trong số đó, thuật toán so khớp (MA) dựa vào khoảng cách giữa các nhóm chức trong protein và phối tử Các phương pháp xây dựng tăng dần (IC) cho phép đưa phối tử vào vị trí hoạt động của protein theo kiểu phân mảnh và thêm dần các mảnh Phương pháp Monte Carlo (MC) tạo ra các cấu dạng của phối tử thông qua chuyển động quay liên kết, tịnh tiến thân cố định hoặc quay Cuối cùng, các thuật toán di truyền (GA) lấy cảm hứng từ thuyết tiến hóa của Darwin để tạo ra các cấu hình tối ưu.
Bằng cách áp dụng 11 tập các cấu dạng của phối tử thông qua đột biến và trao đổi chéo, chúng ta có thể mô phỏng động lực học phân tử (MD) để dự đoán sự di chuyển của từng nguyên tử trong môi trường của các nguyên tử khác theo thời gian Phương pháp này cho phép thể hiện tính linh hoạt của cả phối tử và protein một cách hiệu quả hơn so với các thuật toán khác.
Chức năng tính điểm được phát triển để mô tả sự tương tác giữa protein và phối tử một cách nhanh chóng và chính xác Nó không chỉ xếp hạng các cấu trúc và định hướng của phối tử khi liên kết với vị trí hoạt động mà còn dự đoán ái lực liên kết protein-phối tử, giúp tối ưu hóa hợp chất dẫn đường và sàng lọc các hợp chất tiềm năng trong các cơ sở dữ liệu lớn Chức năng này ước lượng năng lượng liên kết của phức hợp phối tử-thụ thể, dựa vào hằng số liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔG), xem xét các tương tác như Van der Waals, liên kết kỵ nước, liên kết hydrogen, liên kết cộng hóa trị và liên kết tĩnh điện Độ chính xác của chức năng tính điểm tăng lên với số lượng tham số hóa lý, nhưng thời gian tính toán sẽ lâu hơn nếu số lượng biến lớn.
Các hàm tính điểm cần phải đạt được sự cân bằng giữa độ chính xác và tốc độ để tối ưu hóa hiệu quả trong việc xử lý các cơ sở dữ liệu lớn.
1.3.2 Docking bằng phần mềm MOE
Môi trường hoạt động phân tử (MOE) là một nền tảng phần mềm tích hợp cho khám phá thuốc, cung cấp các công cụ trực quan hóa, mô hình hóa và mô phỏng MOE được các nhà sinh học, nhà hóa dược và nhà hóa học tính toán sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm, công nghệ sinh học và nghiên cứu học thuật.
Molecular Operating Environment (MOE) cung cấp nhiều thuật toán và hàm tính điểm docking để dự đoán tương tác giữa phối tử và protein mục tiêu, bao gồm Alpha PMI, FlexX, Triangle Matcher, London dG, và Alpha HB Ứng dụng docking của MOE tìm kiếm các cấu dạng tương tác thuận lợi giữa ligand và cấu trúc protein/enzyme mục tiêu Mỗi phối tử sẽ tạo ra và tính điểm cho một số cấu dạng liên kết Quá trình lắp ghép bắt đầu từ cấu dạng ngẫu nhiên hoặc do người dùng xác định, với việc tìm kiếm các cấu dạng thuận lợi thông qua các nhiễu loạn ngẫu nhiên của các liên kết có thể xoay Hơn nữa, việc tìm kiếm có thể được hạn chế bằng cách áp dụng các ràng buộc về góc, độ xoắn và khoảng cách, sau đó điểm số docking được tính toán.
Điểm số docking, phản ánh ái lực gắn kết giữa protein và phân tử hợp chất, được đánh giá dựa vào năng lượng tiêu thụ trong việc tạo ra các liên kết hydro, tương tác ion, tương tác vòng thơm và tương tác kỵ nước (Van der Waals) Điểm số docking càng thấp cho thấy ái lực gắn kết càng mạnh.
Hình 1.4 Nguyên lý cơ bản của docking phân tử
Hình 1.5 Màn hình làm việc của phần mềm MOE
Protein tubulin
Tubulin là một trong những nhóm protein phong phú nhất ở sinh vật nhân thực [21]
Trong sinh học phân tử, tubulin là một siêu họ protein bao gồm các dạng đồng phân như 𝛼-tubulin, 𝛽-tubulin và các dạng xa hơn như 𝛾-tubulin, 𝛿-tubulin, 𝜀-tubulin, ζ-tubulin, η-tubulin và ι-tubulin Tuy nhiên, không phải tất cả các loại protein này đều có mặt ở mọi loài sinh vật nhân thực Trong khi 𝛼-tubulin, 𝛽-tubulin và 𝛾-tubulin phổ biến ở hầu hết các loài, các dạng tubulin khác chỉ xuất hiện ở một số loài nhất định và chức năng của chúng vẫn đang được nghiên cứu Ở người, có năm nhóm nhỏ tubulin: 𝛼-tubulin, 𝛽-tubulin, 𝛾-tubulin, 𝛿-tubulin và 𝜀-tubulin, cùng với ζ-tubulin.
Vào năm 1968, Taylor và các cộng sự đã xác định α và β-tubulin là những thành phần chính cấu tạo nên các vi ống (microtubule), đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành khung tế bào, phân chia tế bào và vận chuyển nội bào Cả hai loại protein này đều là protein hình cầu, với trình tự amino acid được xác định lần đầu vào năm 1981, cho thấy sự tương đồng lên tới 41% Mỗi loại protein có chuỗi khoảng 450 amino acid và trọng lượng phân tử khoảng 50 kD.
Mức độ bảo tồn của protein 𝛼-tubulin và 𝛽-tubulin trong quá trình tiến hóa đạt khoảng 60%, cho thấy cấu trúc của chúng gần như giống nhau ở tất cả các loài.
Tubulin có nhiều dạng kiểu hình (isotype) khác nhau, điều này đã được dự đoán trước năm 1981 Năm 1967, Behnke và Forer đã gợi ý rằng sự ổn định của các vi ống thực hiện các chức năng khác nhau là lý do cần thiết cho sự tồn tại của nhiều dạng tubulin Đề xuất này đã dẫn đến việc xây dựng giả thuyết đa tubulin.
Multitubulin là một dạng protein có nhiều kiểu hình tubulin, mỗi kiểu hình đảm nhận một chức năng cụ thể Sự đa dạng này được giải thích bởi sự tồn tại của nhiều gen riêng lẻ mã hóa cho α-tubulin và β-tubulin, dẫn đến những khác biệt nhỏ trong trình tự amino acid Phần lớn sự khác biệt giữa các kiểu hình này nằm ở cấu trúc và chức năng của chúng.
15 gốc cuối cùng của trình tự là một vùng quan trọng trong sự tương tác của vi ống với các protein liên kết vi ống (MAP), góp phần tạo ra sự khác biệt về chức năng của vi ống Số lượng kiểu hình tubulin tăng lên cùng với độ phức tạp của sinh vật.
Mặc dù nấm men chỉ có hai kiểu hình α-tubulin và một β-tubulin, nhưng các sinh vật nhân thực cao hơn sở hữu tới tám kiểu hình β-tubulin và sáu kiểu hình α-tubulin Ở người, có 9 gen mã hóa cho mỗi loại tubulin Ngoài ra, còn có nhiều kiểu hình α và β-tubulin khác nhau do các sửa đổi sau dịch mã.
Hình 1.6 Cấu trúc của α-tubulin (xanh lá) và β-tubulin (cam)
1.4.2 Vai trò của protein tubulin
Protein tubulin, bao gồm α-tubulin và β-tubulin, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành vi ống Vi ống là các cấu trúc rỗng với đường kính khoảng 25 nm và chiều dài thay đổi, chủ yếu được tạo thành từ các tubulin heterodimer có trọng lượng phân tử khoảng 100 kD Những heterodimer này được hình thành qua sự tương tác không cộng hóa trị giữa α-tubulin và β-tubulin, tự sắp xếp từ đầu đến đuôi để tạo ra các sợi nguyên sinh (tiền sợi) có đường kính 4-5 nm Thông thường, vi ống bao gồm 12-13 tiền sợi được sắp xếp song song theo chiều ngang, tạo nên cấu trúc vững chắc.
15 hình trụ rỗng với 2 đầu, một đầu âm được bao bọc bởi các tiểu đơn vị α-tubulin và đầu dương bao bọc bởi β-tubulin (Hình 1.7 và Hình 1.8) [27]
Hình 1.7 A Cấu trúc của vi ống bao gồm các tubulin heterodimer; B Tubulin heterodimer gồm 2 tiểu đơn vị α-tubulin và β-tubulin
Hình 1.8 Quá trình hình thành vi ống (microtubule) Động lực học vi ống
Một trong những đặc điểm quan trọng của các đại phân tử là tính động học, tức là sự thay đổi cấu trúc theo thời gian Vi ống là những cấu trúc năng động, luôn duy trì trạng thái cân bằng giữa quá trình tăng trưởng (polymer hóa) và co lại (depolymer hóa) Chúng có khả năng chuyển đổi nhanh chóng từ trạng thái tăng trưởng sang trạng thái co lại (catastrophe) và ngược lại (rescue), quá trình này được gọi là “sự mất ổn định”.
Vi ống là cấu trúc quan trọng trong tế bào, bắt đầu hình thành khi cả α-tubulin và β-tubulin liên kết với guanosin triphosphate (GTP) trong quá trình polymer hóa Sự kết hợp này tạo ra nắp cấu trúc GTP-β-tubulin, giúp ổn định vi ống Khi nồng độ GTP-β-tubulin đủ cao, nhiều tubulin heterodimer sẽ tiếp tục được thêm vào, thúc đẩy sự phát triển của vi ống Tuy nhiên, GTP sẽ bị thủy phân thành guanosine diphosphate (GDP) bởi β-tubulin, dẫn đến việc tubulin gắn với GDP trở nên kém bền vững Khi tốc độ tăng trưởng giảm xuống dưới tốc độ thủy phân GTP, vi ống có thể bị tháo rời, tạo ra "sự mất ổn định" giúp tế bào điều chỉnh hình dạng, phát triển và di chuyển, đồng thời thực hiện nhiều chức năng quan trọng, bao gồm cả quá trình nguyên phân tế bào.
Hình 1.9 Sự mất ổn định của vi ống
Hành vi động thứ hai, hay còn gọi là “máy chạy bộ”, liên quan đến sự gia tăng các tubulin heterodimer ở đầu dương và sự thoái lui của chúng ở đầu âm Quá trình này giúp điều chỉnh chiều dài của vi ống và cho phép vi ống di chuyển một cách linh hoạt từ vị trí này sang vị trí khác.
Hành vi sinh lý trong tế bào đóng vai trò quan trọng trong quá trình nguyên phân, giúp hoàn thành các chức năng cần thiết cho sự sống.
Chức năng của vi ống
Microtubule là thành phần chính của bộ khung tế bào, đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì hình dạng tế bào và phát triển Chúng tham gia vào tín hiệu tế bào, vận chuyển các túi, ty thể và các thành phần khác, đồng thời hỗ trợ sự di động và phân chia tế bào, bao gồm cả quá trình nguyên phân và phân cực tế bào.
1 Vi ống có vai trò quan trọng trong quá trình nguyên phân, quá trình một tế bào nhân thực tiến hành phân chia để tạo thành hai tế bào con giống nhau Trong quá trình nguyên phân, vi ống tạo thành các trục phân bào chịu trách nhiệm tổ chức, phân tách và di chuyển các nhiễm sắc thể đến các cực của tế bào mới [29] (Hình 1.10) Ngoài ra, các vi ống còn tham gia vào sự chuyển động của các bào quan và định vị mặt phẳng phân chia tế bào Nhìn chung, các vi ống rất cần thiết cho sự tiến triển thành công của quá trình nguyên phân
Hình 1.10 Vai trò của vi ống trong quá trình nguyên phân
2 Vi ống là một trong ba thành phần giúp hình thành nên bộ khung tế bào, cung cấp cho tế bào cả hình dạng và cấu trúc có tổ chức (Hình 1.11).
Enzyme ATP-citrate lyase
1.5.1 Giới thiệu ATP-citrate lyase
ATP-citrate lyase (ACLY) là enzyme quan trọng trong việc chuyển đổi citrate thành acetyl-CoA và oxaloacetate, hỗ trợ tổng hợp acid béo trong tế bào ACLY chủ yếu hoạt động trong tế bào, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình chuyển hóa năng lượng và tổng hợp lipid.
Enzyme ACLY không chỉ liên kết với mạng lưới nội chất trong tế bào động vật có vú mà còn được phát hiện ở nhân tế bào Nghiên cứu cho thấy ACLY tồn tại trong cả nhân và tế bào chất của tế bào u nguyên bào thần kinh đệm, ung thư biểu mô đại tràng ở người, và nguyên bào sợi phôi chuột Hơn nữa, sự biểu hiện quá mức của enzyme này liên quan đến nhiều tình trạng bệnh lý, bao gồm gan nhiễm mỡ, rối loạn lipid máu, tiểu đường, và các loại ung thư như ung thư đại trực tràng, vú, tuyến tiền liệt, gan, dạ dày, và cổ tử cung.
Sự biểu hiện quá mức của enzyme ACLY liên quan đến khả năng biệt hóa và tiên lượng kém của nhiều loại khối u, ung thư Việc ức chế dược lý hoặc di truyền enzyme này đã cho thấy khả năng giảm thiểu sự tăng sinh của tế bào ung thư và kích thích quá trình apoptosis Nhiều nghiên cứu đã làm nổi bật vai trò quan trọng của ACLY trong ung thư, mở ra cơ hội lớn cho enzyme này như một mục tiêu điều trị chính trong chiến lược chống ung thư.
ACLY ở người là một protein homotetramer gồm 4 tiểu đơn vị giống hệt nhau, mỗi tiểu đơn vị chứa 1101 amino acid và có trọng lượng phân tử khoảng 120 kD (Hình 1.14)
Mỗi tiểu đơn vị của enzyme bao gồm mô đun citryl-CoA synthetase (CCS) ở đầu N và citryl-CoA lyase (CCL) ở đầu C Mô đun CCS chứa 5 miền chức năng, trong đó miền 3 và 4 tạo thành nếp gấp ATP để liên kết với ATP, miền 5 là vị trí liên kết citrate, miền 1 là vị trí liên kết với CoA, và miền 2 chứa amino acid His760 được phosphoryl hóa để bắt đầu quá trình xúc tác của ACLY Mô đun CCL có trình tự tương đồng với citrate synthase (CS) và tham gia vào phản ứng tạo thành acetyl-CoA và oxaloacetate sau khi chất trung gian (3S)-citryl-CoA di chuyển vào mô đun này.
1.5.2 Vai trò của enzyme ATP-citrate lyase
ACLY là một enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa glucose và tổng hợp lipid, xúc tác chuyển đổi citrate và CoA thành oxaloacetate và acetyl-CoA với sự tham gia của ATP Glucose được hấp thụ qua hệ thống vận chuyển và chuyển đổi thành pyruvate qua con đường đường phân Sau đó, pyruvate được chuyển hóa thành acetyl-CoA, cung cấp chất nền cho chu trình tricarboxylic acid (TCA) trong ty thể, nơi tạo ra ATP.
Quá trình phosphoryl oxy hóa tạo ra citrate, một chất chuyển hóa trung gian, sau đó được xuất vào tế bào chất và chuyển đổi thành acetyl-CoA nhờ sự xúc tác của ACLY Acetyl-CoA đóng vai trò là khối xây dựng quan trọng cho tổng hợp lipid và con đường mevalonate.
Hình 1.14 Cấu trúc của enzyme ATP-citrate lyase
Hình 1.15 Các miền chức năng trên một tiểu đơn vị của ACLY
Acetyl-CoA không chỉ tham gia vào quá trình tổng hợp acetylcholine mà còn trong acetyl hóa histone và protein Trong tế bào chất, acetyl-CoA được carboxyl hóa thành malonyl-CoA nhờ enzyme acetyl-CoA carboxylase (ACACA) Enzyme tổng hợp acid béo (FAS) sau đó chuyển đổi acetyl-CoA và malonyl-CoA thành acid béo chuỗi dài qua phản ứng ngưng tụ Ngoài ra, acetyl-CoA còn là chất nền cho con đường mevalonate (MVA), nơi farnesyl pyrophosphate (FPP) được tổng hợp, dẫn đến geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), cần thiết cho tổng hợp protein Acetyl-CoA cũng hỗ trợ protein acetylase trong việc sửa đổi histone, ảnh hưởng đến cấu trúc nhiễm sắc thể Các acid béo và cholesterol tổng hợp từ acetyl-CoA có vai trò trong sản xuất thành phần cấu trúc của màng tế bào, vận chuyển và lưu trữ năng lượng, cũng như tạo ra các phân tử tín hiệu sinh học Từ đó, có thể thấy rằng ACLY là một mắt xích quan trọng trong nhiều quá trình tế bào.
Hình 1.16 Vai trò của ACLY trong các quá trình sinh tổng hợp khác nhau
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để hiểu rõ về cơ chế xúc tác của ACLY diễn ra theo ba bước như sau (Hình 1.17) [63]:
1 Phản ứng bắt đầu với việc liên kết Mg-ATP với ACLY tự do xúc tác quá trình phosphoryl hóa amino acid histidine (His760), kích thích giải phóng Mg-ADP
2 Sau quá trình phosphoryl hóa hình thành nên một dạng phospho-enzyme xúc tác cho sự tạo thành của citryl phosphate gắn với enzyme Tiếp theo citryl phosphate bị tấn công bởi nhóm thiol của CoA, do đó hình thành liên kết thioester giữa citrate và CoA tạo ra citryl-CoA, giải phóng phosphate vô cơ [63]
3 Tại thời điểm này enzyme liên kết với chất trung gian citryl-CoA bị phân cắt bởi phản ứng retro-Claisen dẫn đến sự hình thành acetyl-CoA và oxaloacetate, được giải phóng khỏi vị trí hoạt động của enzyme [63]
Hình 1.17 Cơ chế xúc tác của ACLY
ACLY đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo chất béo, và trong quá khứ, enzyme này đã được xem là mục tiêu điều trị cho các bệnh liên quan đến tăng lipid và cholesterol máu Hiện nay, ACLY vẫn tiếp tục được nghiên cứu vì ảnh hưởng của nó đến tổng hợp lipid và cholesterol.
Chất ức chế ACLY đã cho thấy hiệu quả tích cực trong các thử nghiệm lâm sàng ở người, đặc biệt trong vai trò là thuốc giảm cholesterol, với 27 mục tiêu tốt trong lĩnh vực này.
Nhiều khối u ác tính hiện nay có biểu hiện rối loạn chuyển hóa, đặc biệt liên quan đến quá trình đường phân, tăng hấp thu glucose và tổng hợp lipid Tế bào ung thư thường trải qua sự tái lập trình đáng kể các con đường trao đổi chất, dẫn đến nhu cầu năng lượng và đại phân tử tăng cao do tốc độ tăng sinh nhanh Một trong những dấu hiệu quan trọng của tế bào ung thư là sự gia tăng tổng hợp lipid mới, cung cấp lipid cần thiết cho sự phát triển và phân chia tế bào Con đường tổng hợp lipid bao gồm cả tổng hợp acid béo và con đường MVA, dẫn đến sản xuất cholesterol và isoprenoid Khác với tế bào bình thường, hầu hết tế bào ung thư tăng cường sinh tổng hợp lipid nội sinh, ngay cả khi mức lipid ngoại bào thấp Trong khi đó, nhiều tế bào bình thường ưu tiên sử dụng lipid từ chế độ ăn uống, mặc dù một số mô như tế bào mỡ và tế bào gan có con đường tổng hợp acid béo tích cực Tuy nhiên, quá trình tổng hợp lipid mới thường bị ức chế ở hầu hết các tế bào bình thường, và trong nhiều tế bào ung thư, việc cung cấp chất dinh dưỡng từ mạch máu bị hạn chế, khiến chúng chủ yếu dựa vào tổng hợp lipid mới.
Các tế bào ung thư thường phụ thuộc vào quá trình đường phân (glycolysis) để tạo năng lượng ATP, ngay cả trong điều kiện có oxy, hiện tượng này được gọi là hiệu ứng Warburg Glucose bị tiêu thụ một cách "phung phí", không được chuyển hóa hoàn toàn qua chu trình TCA mà dừng lại ở một số điểm nhất định Mặc dù quá trình đường phân tạo ra ATP với hiệu suất thấp hơn so với chu trình TCA, nhưng nó lại diễn ra nhanh chóng, đáp ứng nhu cầu năng lượng liên tục cho tế bào ung thư Do đó, nhiều tế bào ung thư có đặc điểm tăng hấp thu glucose để cung cấp đủ năng lượng cho sự phát triển của chúng.
Tăng sinh mạnh mẽ thúc đẩy quá trình di căn, trong khi các chất trung gian trao đổi chất của quá trình đường phân đóng vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp cao phân tử, đáp ứng nhu cầu phân chia nhanh chóng của tế bào.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Lựa chọn cấu trúc và chuẩn bị mục tiêu tác động
Cấu trúc tinh thể của protein tubulin và enzyme ATP-citrate lyase đã được tìm kiếm và tải về từ ngân hàng dữ liệu protein (www.rcsb.org) Nhiều cấu trúc tinh thể của tubulin và ATP-citrate lyase được phát hiện, trong đó protein được lựa chọn có độ phân giải thấp và phối tử đồng kết tinh là chất ức chế mạnh đã được nghiên cứu Cụ thể, tinh thể đồng kết tinh của tubulin với phối tử N-[(7S)-1,2,3,10-tetramethoxy-9-oxo-6,7-dihydro-5H-benzo[d]heptalen-7-yl]ethanamide (colchicine) có độ phân giải 2,30 Å (mã số 4O2B) và tinh thể của ATP-citrate lyase với phối tử methyl-3-chloro-5-[(4,6-difluoro[1,1'-biphenyl]-3-yl)sulfamoyl]-4-hydroxybenzoate độ phân giải 3,67 Å (mã số 6O0H) đã được chọn làm mục tiêu nghiên cứu.
Chuẩn bị protein mục tiêu bằng bộ công cụ LigX
LigX là bộ công cụ của MOE 2008.10, phục vụ cho việc khảo sát tương tác giữa đích tác động và phối tử, bao gồm cả công cụ xử lý protein Ứng dụng Prepare trong LigX giúp xử lý protein để đạt được dạng gần giống tự nhiên theo quy trình của phần mềm.
Quá trình chuẩn bị protein khi sử dụng LigX gồm các bước sau:
- Xác định phối tử (ligand) đồng kết tinh (Verify ligand/Choose ligand) Hình 2.2
Hình 2.2 Bước xác định phối tử đồng kết tinh bằng LigX
Proton hóa (protonate) là quá trình mà các amino acid trong protein nhận proton và tích điện Hầu hết dữ liệu cấu trúc tinh thể của protein không bao gồm nguyên tử hydro, điều này ảnh hưởng đến hiểu biết về cấu trúc và chức năng của protein.
34 trạng thái ion hóa của amino acid thường được xác định Lệnh protonate sẽ bổ sung các nguyên tử hydro dựa trên trạng thái ion hóa của các nguyên tử đã được nhập vào cửa sổ MOE Sau đó, các nguyên tử nặng được cố định, và quá trình giảm thiểu năng lượng ngắn hạn được thực hiện để điều chỉnh vị trí của các nguyên tử hydro mới thêm vào, trong khi các nguyên tử nặng vẫn giữ nguyên vị trí.
Hình 2.3 Bước proton hóa các amino acid trong protein (các nguyên tử hydro màu xám được thêm vào)
Cố định và tối thiểu hóa năng lượng trong protein là quá trình mà các nguyên tử được hạn chế trong một vùng không gian chuyển động, nhằm ngăn chặn sự dịch chuyển quá xa khỏi tọa độ ban đầu Các lực nhân tạo bổ sung được áp dụng để kéo các nguyên tử trở về vị trí ban đầu của chúng Sau đó, quá trình tối thiểu hóa năng lượng của phân tử protein được thực hiện để đạt được cấu trúc ổn định.
Hình 2.4 Bước cố định và tối thiểu hóa năng lượng phân tử protein
Xóa các phân tử nước không liên kết trong phức hợp protein-phối tử là một bước quan trọng, vì nhiều phân tử nước có thể giữ vai trò thiết yếu trong việc duy trì cấu trúc protein hoặc làm trung gian cho các tương tác phối tử Tuy nhiên, các phân tử nước không quan trọng còn lại thường có thể bị loại bỏ mà không ảnh hưởng đến chức năng của phức hợp.
Hình 2.5 Bước xóa các phân tử nước không liên kết trong phân tử protein
- Lưu lại protein vừa được chuẩn bị dưới dạng file *.moe.
Xây dựng dữ liệu các hợp chất ức chế
Hai nhóm chất chalconoid và 3-hydroxyflavone gồm 22 hợp chất đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Hoàng Minh Hảo, cung cấp cơ sở dữ liệu cho quá trình docking Cấu trúc của các hợp chất đã được xác định thông qua các phương pháp phổ MS và NMR Tên gọi cùng cấu trúc hóa học chung của các nhóm được trình bày trong Bảng 3.1, trong khi công thức cấu tạo của từng hợp chất được thể hiện ở Phụ lục 1.
Chuẩn bị phối tử bằng MOE
Bước 1: Tải cấu trúc phối tử vào MOE
Cấu trúc 2D của phối tử được tạo ra bằng phần mềm ChemDraw 22.0 và sau đó được lưu dưới định dạng SMILES bằng cách sử dụng công cụ Edit Copy As SMILES.
Trong MOE, bạn cần di chuyển đến công cụ Builder, dán chuỗi SMILES đã sao chép và nhấn vào biểu tượng mặt cười để tải lên cấu trúc của phối tử (Hình 2.6).
Hình 2.6 Cấu trúc của phối tử sau khi được tải lên MOE
Bảng 2.1 Cấu trúc chung các nhóm hợp chất ức chế dùng trong nghiên cứu
Nhóm Cấu trúc chung Số chất
Bước 2: Tối thiểu hóa năng lượng phối tử
Cấu trúc 3D của phối tử được tải lên MOE sẽ trải qua quá trình tối thiểu hóa năng lượng nhằm sửa chữa các giá trị không phù hợp về độ dài liên kết, góc liên kết, góc xoắn và các tương tác không liên kết bất thường Chương trình cơ học phân tử tính toán năng lượng của cấu dạng ban đầu, sau đó điều chỉnh các thông số như độ dài liên kết và góc liên kết để tạo ra cấu dạng mới với năng lượng thấp hơn Quá trình này tiếp tục cho đến khi sự thay đổi cấu dạng không còn làm thay đổi đáng kể năng lượng, đạt đến mức năng lượng tối thiểu Cấu dạng cuối cùng là cấu dạng bền vững nhất và chương trình sẽ tự động dừng lại.
Nghiên cứu này áp dụng chương trình tối thiểu hóa năng lượng phân tử trong phần mềm MOE, với điểm dừng được xác định khi thay đổi năng lượng nhỏ hơn 0,0001 kcal/mol Phương pháp gradient liên hợp được sử dụng, phù hợp cho các phân tử có kích thước nhỏ.
Trong MOE, sử dụng công cụ Compute Energy Minimize Chọn trường lực MMFF94x (trường lực Merck); Gradient: 0,0001 kcal/mol Các thông số khác để mặc định Hình 2.7
Hình 2.7 Thông số cài đặt và cấu trúc phối tử sau khi tối thiểu năng lượng
Bước 3: Lưu phối tử đã giảm thiểu năng lượng dưới dạng file *.mdb Sau đó, phần mềm sẽ hiển thị cửa sổ Database Viewer Tại đây, sử dụng công cụ Entry Add Entry để tải cấu trúc phối tử lên Tiếp theo, chọn công cụ Compute Energy Minimize để tối thiểu hóa năng lượng phối tử một lần nữa Sau khi hoàn tất chuẩn bị, phối tử sẽ được tiến hành docking.
Docking phân tử
2.3.1 Thiết lập các thông số docking
Sau khi xác định mục tiêu tác động là protein và thu thập các phối tử cần thiết, quá trình docking được thực hiện bằng phần mềm MOE 2008.10 Trong giao diện chính của MOE, người dùng sử dụng công cụ Compute để tiến hành phân tích.
Simulations Dock và cài đặt các thông số như sau Hình 2.8:
Vị trí docking trên trang Ligand Atoms được xác định là khoang gắn kết giữa phối tử đồng kết tinh và protein mục tiêu, trong đó có sự tham gia của các amino acid quan trọng.
- Ligand: Ligand Atoms khi tiến hành quá trình docking lặp lại (re-docking) hoặc MDB
File khi docking các phối tử đã được chuẩn bị trước đó
Sử dụng phương pháp Triangle Matcher, việc đặt các phối tử mặc định cho phép xác định các trung tâm liên kết và bề mặt liên kết trên protein và phối tử như vòng thơm, trung tâm cho và nhận hydro, cũng như liên kết ion Sự gắn kết sẽ xảy ra khi các trung tâm và bề mặt bổ sung của chúng phủ lên nhau.
- Rescoring 1: London dG Đặt chức năng tính điểm đầu tiên là London dG và giữ lại
10 cấu dạng của phối tử có điểm số thấp nhất
- Refinement: Forcefield Các cấu dạng phối tử sẽ được tinh chỉnh giảm thiểu năng lượng trong khoang gắn kết bởi trường lực
- Rescoring 2: London dG Với cài đặt này các cấu dạng đã tinh chỉnh sẽ được xếp hạng lại một lần nữa theo chức năng tính điểm London dG
Sau khi hoàn tất việc cài đặt các thông số, hãy chọn OK để khởi động quá trình docking Khi quá trình docking hoàn tất, các cấu hình và điểm số sẽ được lưu dưới định dạng *.mdb.
2.3.2 Docking lặp lại (Re-docking) Để đánh giá cách xử lý protein và các thông số cài đặt của phần mềm MOE có phù hợp để tiến hành docking các phối tử hay không ta dùng phương pháp docking lặp lại (re- docking) Phân tử hợp chất (ligand) có sẵn trong cấu trúc tinh thể của protein mục tiêu sẽ được docking lại vào khoang gắn kết như ở phần 2.3.1 Kết quả re-docking được đánh giá dựa vào giá trị RMSD (căn bậc hai bình phương độ lệch trung bình của cấu dạng phối tử sau docking so với cấu dạng có sẵn trong cấu trúc tinh thể - đây là thông số cho biết mức độ sai lệch của các cấu dạng phối tử trên sau docking so với cấu dạng có sẵn trong cấu trúc tinh thể) Nếu giá trị RMSD ≤ 2,00 Å thì kết quả docking là đáng tin cậy và mô hình docking được xem là có khả năng sử dụng để giải thích cách thức và khả năng gắn kết của các phối tử vào vùng gắn kết [70] Đồng thời kết hợp đánh giá tương tác của phân tử hợp chất sau khi re-docking với tương tác của nó trong phức hợp đồng kết tinh để tăng thêm độ tin cậy của mô hình.
Đánh giá, phân tích kết quả docking
Kết quả docking cung cấp danh sách các cấu dạng liên kết giữa phối tử và protein, được sắp xếp theo thứ tự điểm số docking tăng dần (Hình 2.9) Điểm số docking, tính bằng kcal/mol, phản ánh tổng năng lượng tiêu thụ cho việc hình thành các tương tác giữa phối tử và protein mục tiêu Điểm số càng thấp cho thấy khả năng liên kết mạnh mẽ hơn giữa phối tử và protein.
Cấu dạng có tương tác với vị trí gắn kết của protein và năng lượng liên kết nhỏ nhất sẽ được ưu tiên phân tích sâu hơn Các tương tác giữa phối tử và vị trí gắn kết của protein sẽ được trình bày dưới dạng 2D và 3D, đồng thời phân tích bằng phần mềm MOE Những tương tác này bao gồm liên kết hydro, tương tác van der Waals, tương tác π–π, cation–π, tương tác ion và tương tác kỵ nước.
Hình 2.8 Các thông số được cài đặt để chuẩn bị cho mô hình docking
Hình 2.9 Kết quả thu được sau khi tiến hành quá trình docking