Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân tích độc lực và mức độ biểu hiện gen giữa chủng Aeromonas hydrophila độc lực cao (vAh) và chủng vAh đột biến hệ quorum sensing tuýp 2 (mluxs)

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO -TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC PHAN TÍCH ĐỘC LỰC VÀ MỨC ĐỘ BIEU HIEN GEN GIỮA CHUNG Aeromonas hydrophila ĐỘC LỰC CAO vAh VA

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO

-TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHAN TÍCH ĐỘC LỰC VÀ MỨC ĐỘ BIEU HIEN GEN GIỮA CHUNG Aeromonas hydrophila ĐỘC LỰC CAO (vAh) VA CHỦNG vAh ĐỘT BIẾN HỆ QUORUM SENSING TUÝP 2

(mLuxS)

Nganh hoc : CONG NGHỆ SINH HỌCSinh viên thực hiện : ĐÀO DUY TIÊN

Mã số sinh viên : 19126182Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thu Đức, 03/2024

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG DAI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HQC SINH HOC

KHOA LUAN TOT NGHIEP

PHAN TÍCH ĐỘC LUC VA MỨC ĐỘ BIEU HIEN GEN GIỮA CHUNG Aeromonas hydrophila ĐỘC LUC CAO (vAh) VA CHUNG vAh DOT BIEN HE QUORUM SENSING TUYP 2

(mLuxS)

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiện

TS NGÔ HUỲNH PHƯƠNG THẢO ĐÀO DUY TIÊN

TP Thủ Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Dé tài “ PHAN TICH ĐỘC LỰC VÀ MỨC ĐỘ BIÊU HIỆN GEN GIỮA CHUNGAeromonas hydrophila ĐỘC LỰC CAO (vAh) VÀ CHUNG vAh ĐỘT BIEN HỆ

QUORUM SENSING TUYP 2 (mLuxS)” là nội dung được tôi chọn dé nghiên cứu va

làm khóa luận tốt nghiệp sau bốn năm học chuyên ngành Công nghệ Sinh học thuộckhoa Khoa học Sinh học tại trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Lời đầu tiên, tôi xin cảm ơn đến Ban giám đốc Trung tâm Công nghệ Sinh họcThành phó Hồ Chi Minh đã tạo điều kiện giúp tôi thực hiện đề tài nghiên cứu tại trungtâm.

Dé hoàn thành công trình nghiên cứu và hoàn thiện đề tài này, tôi xin chân thànhcảm ơn sâu sắc đến TS Ngô Huỳnh Phương Thảo đã chỉ bảo, chia sẻ kinh nghiệm vàhướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu dé tôi hoàn thiện dé tai này Ngoài ra, tôi xingửi lời cảm ơn đến các Anh, Chị thuộc phòng Công nghệ Sinh học Thủy Sản - Trungtâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ va tạo điều kiện thuận lợi

để tôi học tập, nghiên cứu vả trau đồi kinh nghiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thay, Cô khoa Khoa học Sinh học đã tận tâm giảngdạy những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập, rèn luyện tại trường giúp tôi

đủ khả năng dé hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình đã dạy đỗ, tạo điều kiện chỉ tôi được học hành,được rèn luyện ban thân và là chỗ dựa tinh than, là nguồn động lực giúp tôi vượt quanhững khó khăn Cảm ơn những người bạn đã luôn bên cạnh chia sẻ, động viên và cổ

vũ tỉnh thần trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Với điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế, khóa luận này không

tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của cácthầy cô dé em có điều kiện bé sung, nâng cao ý thức của mình, dé phục vụ tốt hơn trongcông tác thực tế sau này

Trân trọng cảm ơn!

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên: Đào Duy Tiên, MSSV: 19126182, Lớp: DH19SHB thuộc ngành Công

nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tôi xin cam đoan: đây làKhóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trongnghiên cứu là hoản toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

trước hội đồng về những cam kết này

Tp Ho Chí Minh, ngày 31 tháng 03 năm 2024

Người việt cam đoan (Ký và ghi rõ họ tên)

il

TÓM TẮT

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm so sánh độc lực và mức độ biểu hiện gengiữa chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila độc lực cao (vAh) và chủng đột biến hệquorum sensing tuýp 2 (mLuxS) gây bệnh nhiễm trùng xuất huyết trên cá tra(Pangasianodon hypophthalmus) Nồng độ vi khuẩn vAh được khảo sát sơ bộ bangphương pháp tiêm vào xoang bụng cá tra ở các nồng độ 2,5 x 10° CFU/cá, 10° CFU/ca,7,5 x 10*CFU/ca nhằm tim ra nồng độ thích hợp dé tiến hành công độc chính thức, cáđược theo dõi 2 tuần sau tiêm Nong độ có tỷ lệ gây chết cá khoảng 80% được chọn détiến hành thi nghiệm công độc với chủng vAh hoang đại và đột biến là 1,5 x 10° CFU/cá

và cá được theo dõi 3 tuần sau công độc Kết quả tỷ lệ gây chết cá của chủng vAh hoangđại là 77,50 + 10,61% cao hơn tỷ lệ gây chết của chủng vAh đột biến 30,00 + 7,07%.Tổng cộng 12 đoạn gen: ace4, mglB, argF, FAD, hutH, mfd, flgA, flgF, metF, ggt, hcp]

và ahh! được chọn ra dé so sánh mức độ biéu hiện gen giữa chủng vAh hoang dai vàvAh đột biến với gen tham chiếu rpoB Sau khi được thực hiện PCR kiểm tra thì việckhuếch đại ba gen là 7/3, metF, ggt không thành công nên không được tiếp tục sử dungtrong thí nghiệm đánh giá mức độ biéu hiện gen Các gen còn lại được định lượng bằngphản ứng real-time PCR, sau đó kết quả được phân tích trên phần mềm “REST 2009”.Kết quả cho thay sáu gen øceA, mgiB, FAD, hutH, figA, flgF có mức độ biểu hiện ởchủng vAh đột biến giảm so với chủng vAh hoang đại, hai gen hep! và ahh! có mức độbiểu hiện ở chủng vAh đột biến tăng so với chủng vAh hoang dai và gen argF không cókhác biệt có ý nghĩa thống kê giữa hai chủng Đa số các gen ở chủng vAh đột biến đều

có mức độ biểu hiện giảm so với chủng vAh hoang dại Các kết quả thu được trongnghiên cứu này cho thay, chủng vAh đột biến hệ quorum sensing tuýp 2 (mLuxS) cóđộc lực và mức độ biểu hiện của một số gen liên quan đến khả năng sinh trưởng, khả

năng gây độc giảm so với chủng vAh hoang dai.

Từ khóa: Aeromonas hydrophila, biểu hiện gen, độc lực vi khuẩn, hệ quorumsensing tuýp 2 (mLuxS), Pangasianodon hypophthalmus.

ill

This study was conducted to compare the virulence and gene expression levels

between the highly virulent Aeromonas hydrophila strain (vAh) and the quorum sensing

type 2 mutant strain (mLuxS) causing hemorrhagic infections in pangasius fish

(Pangasianodon hypophthalmus) The virulence of vAh was preliminarily investigated

by intraperitoneal injection challenge in catfish at the concentrations of

2.5 x 10° CFU/fish, 10° CFU/fish, 7.5 x 10* CFU/fish to find the lethal dose of 80%.

The fish were monitored for 2 weeks after injection The bacterial concentration

(1.5 x 10° CFU/fish) causing fish mortality rate around 80% was chosen for the

virulence testing of the wild and mutant vAh strains and fish were monitored for 3 weeks

after the challenge The results showed that the fish mortality caused by the wild vAh

strain was 77.50 + 10.61%, higher than that of the mutant strain (30.00 + 7.07%) A total

of 12 genes (aceA, mglB, argh, FAD, hutH, mfd, figA, flgF, metF, ggt, hcp] and ahh!)

were selected to compare the gene expression levels between the wild-type and mutant

vAh strains with the reference rpoB gene After being tested by PCR, three genes (m/fd,

metF, get) were not amplified successfully, so they were not used 1n the gene expression

analysis The remaining genes were quantified using real-time PCR, then the results

were analyzed on the software "REST 2009" Six genes (aceA, mẹglB, FAD, hutH, figA,

jig’) were down-regulated in the mutant vAh strain compared to the wild strain, two

genes (hcp! and ahh!) were up-regulated in the mutant strain compared to the wild

strain and the argF gene showed no statistically significant difference between two

strains Most genes in the mutant vAh strain had reduced expression levels compared to

the wild-type vAh strain This study determined that the vAh strain mutant for quorum

sensing system type 2 (mLuxS) had reduced virulence and gene expression levels in

some gene related to growth and virulence, compared to the wild type vAh strain.

Keywords: Aeromonas hydrophila, gene expression, bacterial virulence, type II

quorum sensing, Pangasianodon hypophthalmus.

IV

IRSA 008 eee nee eee eee ee V

ee eh EL Ug le aeeensneeeennnnnornontritietsttintrtnurrtotitutititosutiaô viiiTAA BÁGH GAZA GS sannggnosenbiouohioanoioGrgitotoiyg0G0400130306018060đ960613880100.60g00g80i ix

2.1.3 Đặc điểm hình thái 2 222+S2S2SE2S2E2212E1212712212121221211112112111211211121121 12 xe 4

7.1.4, Đặc điểm sinh trường vã¿sÌih BẴN s«sssceessessisodicntiBg0.06101G300461088.03601833609.00640006060g06 4

2.2 Tông quan về vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra 42.2.1 Tổng quan về vi khuẩn Aeromonas hydrophila độc lực cao (vAh) 6

2.2.2 Tổng quan về hệ thống quorum sensing tuýp II (LuxS) 2-5252: 7

2.2.3 Tổng quan về dich bệnh xuất huyết do Aeromonas hydrophila độc lực cao gây ra

WIND ssc visas 8161560805 sans cs esas ot a ann in nS wae SRBEA EHO Ne NUTR SSD HU aT SOLS BERS TEENS ND 10

2.4 Tổng quan về gây bệnh trên cá bằng phương pháp tiêm xoang bụng 102.5 Tổng quan về kỹ thuật real-time POR so sec SGS 0050000221060 0606000800) 00670606655 11CHUONG S, VAT LIED VÀ PHƯƠNG PHẬT scccenesconcsoxmascesmnmnnsenenmnenstanncruerste 12

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2-22©22+22++2EE22EE22EE22E2222222322222222-ee 123.2 Vat li6u 3020 1 12

3.2.1 Đối tượng nghiên COU cece ccccecceesseesecsesseeseesecssesessessesssssessessessessesseeseesesseeees 12

3.2.2 Hóa chất và môi trường nuôi cấy -2¿©2+22++22++2E++2E+2EE+z2E+zzxrerxrr 12

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 2-22 2S SE 2E22E22E212121212112112121 22 Xe 15

3.3 hương: phap tig biG tC ecco mens sree maemo 15

3.3.1 Nội dung 1: Đánh giá độc lực của chủng vAh hoang dai và chủng vAh đột biến

hệ quorum sensing tuýp 2 (mLuxS) trên cá tra bằng phương pháp tiêm 15

3.3.1.1, Ghuẩn bị cỡ tra cho thi nghiệm công HỘP seo crinccaraiescncscersnorensaeensneninessenentncsit 153.3.1.2 Hoạt hóa độc lực của chủng vAh hoang dại và chủng vAh đột biến mLuxS 163.1.1.3 Khảo sát sơ bộ nồng độ vi khuẩn chủng vAh hoang dai dùng dé công độc tiêm

3.3.2 Nội dung 2: So sánh mức độ biéu hiện gen giữa chủng vAh hoang dai va chủngvAh đột biến MLUXS 2-5: 2S2+SS2E£EE2EE2EEEE2E21212112111211117111211101111 1111 tre 18

3.3.2.1 Kiểm tra khả năng khuếch đại trình tự mong muốn các cặp môi bằng phan ứng

1.5 1 19

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 52 52 +E22E22E22E22E2E2E2Erxrree 204.1 Kết quả chuẩn bị cá tra cho thí nghiệm GỐN 0G nạctiispscg01016821501314680128E408880638) 388 204.2 Kết quả hoạt hóa độc lực của chủng vAh hoang dai và chủng vAh đột biến mLuxS

4.3 Kết quả khảo sát sơ bộ nồng độ vi khuẩn vAh hoang đại dùng dé công độc tiêm.224.4 Kết quả công độc cá so sánh độc lực của chủng vAh hoang dại và chủng vAh độtbiến mLuXS - 2-2-5 SS92E921921521571211212121111111111111121111111111111212121 1e 244.5 Kết quả kiểm tra kha năng khuếch đại trình tự mong muốn các cặp môi 2d4.6 Kết quả so sánh mức độ biểu hiện gen giữa chủng vAh hoang dai và chủng vAh đột0600 28CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ KIEN NGHHỊ .2- 2 2©.+E2EE2CE2EE2E22222-2e2 31

5.1 Kết luận - 2 22s 2221221211212212112111211111121121112112111211211121121112211212 22 e 315.2 {0n 31TÀI LIEU THAM KHẢO 2-2 ©SSS£SE£EE£2E£EEE2EE2121121121121121121121121271 2122 e2 42

CS | 36

Vil

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

OD : Mat d6 quang hoc (Optical density)

PBS : Dung dich dém Phosphate buffer salt

PCR : Polymerase chain reaction

Qs : Quorum sensing

TSA : Môi trường Tryptone Soy Agar

TSB : Môi trường Tryptone Soy Broth

vAh :Chủng Aeromonas hydrophila độc lực cao (Hypervirulent Aeromonas

hydrophila)

Vill

DANH SÁCH CAC BANG

Trang

Bảng 3.1 Các cặp mỗi sử dụng trong phản ứng real-time PCR so sánh mức độ biéu hiệngen giữa vAh hoang dai và vAh đột biến mLuxS 2-22 ©22222222222zz22z22zzzx2 13Bảng 3.2 Các cặp môi sử dụng trong phản ứng PCR dé kiểm tra sự hiện diện của chủng

vAh hoang dai và vAh đột biến mLuxS -2- 2-52 5S22S22E£SE22E2£E2ZEZEZEzEzxessez 15

Bảng 3.3 Nghiệm thức khảo sát sơ bộ nồng độ vi khuẩn chủng vAh hoang đại dùng đểBOP AOC ĐỂ TT asses sccasensanasun E6 1000500 80tDENHEESS.G30S88G8814G8GSBSERESSSE2IRRSGESGĐMIGGISHSSSESSRICEBBSSGSOMEQG20 B0313000008888 17

Bảng 3.4 Nghiệm thức công độc so sánh độc lực chủng vAh hoang đại và đột biến 18

Bang 4.1 Tỷ lệ cá chết tích lũy theo ngày của thí nghiệm khảo sát nồng độ vi khuẩn

9000015012001, BA 23

Bảng 4.2 Tỷ lệ cá chết tích lũy theo ngày của thí nghiệm công độc so sánh độc lựcchủng vAh hoang đại và đột biến hệ QS tuýp 2 (MLUXS) 2 2222z22zzc+2 25

1x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cá tra Pangasianodon hypophfÏÏWH11S - óc 55s s++s£+ss+vExskkseexsxseeesexse 3

Hình 2.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila có một tiên mao Ảnh kính hiển vi điện tử

ssn Sag op ns Hag Ba Zee SURES eT eR 5

Hình 2.3 Sơ đồ biểu dién hệ thống quorum sensing tuýp 2 trên 4eroznowas §Hình 2.4 Cá tra chết do vi khuan vAh gây ra 2 5252222222E222E22E22222E2Ezrxeei 9Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra mẫu cá thí nghiệm 20

Hình 4.2 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn vAh trên đĩa môi trường TSA 21

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phâm PCR khuẩn lac vAh - 525525525522 22Hình 4.4 Tỷ lệ cá chết tích lũy theo ngày của thứ nghiệm khảo sát nồng độ vi khuẩnching vVAh hoang dat 23

Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra mẫu gan thận cá chết trong thí nghiệmkhảo sát sơ bộ nồng độ vi khuẩn chủng vAh hoang địại 2- 2 2225222z+£Sz2zzcx2 24Hình 4.6 Cá chết trong thí nghiệm công độc với chủng vAh -:-525525522 25Hình 4.7 Tỷ lệ cá chết tích lũy theo ngày trong thí nghiệm công độc so sánh độc lực củachủng vAh hoang dai và chủng vAh đột biến hệ QS tuýp 2 (mLuxS) 26Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc từ cá chết trong thí nghiệm côngGOO) sisnesaiecanrayaunit euneou amie ani Mri er EAE 27

Hình 4.9 Kết quả điện di sản pham PCR kiểm tra khả năng khuếch đại trình tự các cặpmôi ở Bảng 1.1 và chứng âm mỗi cặp mÙ 2 2 2222222E+2E2EE££E+2EEzZEzzzzzrxz 28Hình 4.10 Bảng kết quả phân tích biểu hiện gen chủng vAh hoang đại và đột biếnLaue trêu phẩn mẫm REST BUUÕ,.scsecssnnbeesbonioiodebiokikihindosiiEs12S000013650155G38g0071630100 29Hình 4.11 Biểu đồ thé hiện sự biểu hiện gen giữa chủng vAh hoang đại và đột biếnmLuxS trên phần mềm REST 20009 -2- 2¿©222222E22EE£EE2EE2EEEEE2EE2EEZEEerErzrrcrer 29

CHƯƠNG 1 MỞ DAU

1.1 Đặt vấn đề

Nuôi trồng thủy sản là một ngành mang lai giá trị xuất khẩu cao và quan trọng đốivới nước ta, trong đó xuất khâu cá tra chiếm một phần không nhỏ Hiện nay, Việt Nam

có khoảng 5700 ha nuôi cá tra chủ yếu ở các tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long (Bộ

NN&PINN, 2022) Trong sáu năm, từ 2017 - 2022 sản lượng cá tra tăng dần từ 1,2 triệu

tấn lên 1,7 triệu tấn và kim ngạch xuất khẩu của mặt hàng cá tra dao động từ1,5 - 2,4 tỷ USD/năm, chiếm 16 - 26% tổng giá trị xuất khâu thủy sản Việt Nam(VASEP, 2023) Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam nói riêng và toảnthế giới nói chung còn đối mặt với nhiều khó khăn, đặc biệt tình hình dịch bệnh ngàycàng phức tạp, khó kiểm soát đang là thách thức lớn đối với ngành nuôi cá tra hiện nay

Cá tra nuôi công nghiệp với quy mô lớn và mật độ cao tạo điều kiện cho nhiều bệnhdịch phát triển như bệnh gan thận mủ, bệnh xuất huyết, bệnh đốm đỏ, Trong đó, bệnhxuất huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila độc lực cao (vAh) gây ra là một trongnhững bệnh phô biến với tỷ lệ chết cao

Bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila độc lực cao (vAh) gây ra được

ghi nhận lần đầu tiên trên đối tượng cá chép ở Trung Quốc vào năm 1898, sau đó cũngbệnh nay được phát hiện tại Mỹ vào năm 2004 trên cá da trơn (Rasmussen-Ïvey va ctv,

2016) Đây được cho là nguyên nhân chính dẫn đến sự bùng phát của dịch bệnh xuấthuyết trên cá tra tại Việt Nam (Thảo PH Ngô và ctv, 2022) Bệnh xuất huyết xuất hiện

ở đa số các loài cá tra nuôi lồng, bè, ao hé nước ngọt và ở tất cả các giai đoạn nuôi, bệnh

lây lan nhanh, tỷ lệ chết cao Bệnh xuất huyết do Aeromonas hydrophila ở Việt Namdiễn ra quanh năm, tập trung vào đầu mùa khô, đặc biệt là khi cá bị stress và bệnh có

thé lay lan từ cá bệnh sang cá khỏe mạnh trong cùng một ao nuôi, từ ao nuôi này sang

ao nuôi khác, từ vùng nuôi này sang vùng nuôi khác (Hà Kiều, 2016) Ching Aeromonas

hyđrophila độc lực cao (vAh) gây bệnh xuất huyết trên cá tra ở Việt Nam mới được

công bố và giải trình tự gen cách đây không lâu, vẫn còn thiếu các nghiên cứu về tínhđộc lực, mức độ biểu hiện gen giữa chủng vAh hoang đại và chủng đột biến

Bên cạnh đó, hệ thống Quorum sensing (QS) là một quá trình giao tiếp của vikhuân liên quan đên việc sử dụng các tín hiệu sinh hóa và điêu chỉnh sự biêu hiện gen

(Asma Lamin và ctv, 2022), từ đó trở thành mục tiêu nghiên cứu ở nhiều chủng vi khuẩngây bệnh dựa vào kha năng điều hòa biểu hiện gen dé kiểm soát một số kiểu hình độc

lực Ở vi khuẩn Gram âm có ba cơ chế QS gồm: hệ thống tự cảm ứng tuýp 1, tuýp 2 và

tuýp 3 với vai trò kiểm soát khác biệt nhau (Lê Thị Thu Thảo và ctv, 2023) Trong đó,

hệ thống QS tuýp 2 (mLuxS) vẫn chưa được nam rõ và biểu hiện vai trò kiểm soát khácnhau ở từng loai vị khuẩn, hon nữa chưa có nhiều nghiên cứu về hệ thống QS tuýp 2 ởchủng vAh.

Từ những thực tiễn trên, dé tài “Phân tích độc lực và mức độ biểu hiện gen giữa

chủng Aeromonas hydrophila độc lực cao (vAh) và chủng vAh đột biến hệ quorumsensing tuýp 2 (mLuxS)” được thực hiện.

1.2 Mục tiêu đề tài

So sánh độc lực giữa chủng vAh hoang dại và chủng vAh đột biến (mLuxS) nhằmxác định mối liên hệ giữa tính độc lực cao của chủng vAh và hệ quorum sensing tuýp 2

Chọn ra một số gen có biểu hiện khác nhau giữa chủng vAh hoang dại và chủng

vAh đột biến, thông qua kỹ thuật real-time PCR dé khang định mức độ biểu hiện gen

khác nhau giữa chủng vAh hoang đại và đột biến (mLuxS)

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Đánh giá độc lực của chủng vAh hoang dại va chủng vAh đột biến hệquorum sensing tuýp 2 (mLuxS) trên cá tra bằng phương pháp tiêm

Nội dung 2: So sánh mức độ biểu hiện gen giữa chủng vAh hoang dại và chủng

vAh đột biến mLuxS

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Téng quan vé ca tra

2.1.1 Phan loai khoa hoc

Ca tra Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878) co hé théng phan loainhư sau: Ngành Chordata, lớp Osteichchthyes, bộ Siluriformes, họ Pangasiidae, giôngPangasius, loài Pangasianodon hypophthalmus (Nguyễn Thị Hồng, 2014)

2.1.2 Phân bố

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) có nguồn gốc từ hệ thống sông Mê Kông

và sông Phraya, là một trong những loài thủy sản được nuôi trồng quan trọng nhất ở cácnước Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan, Lào, Bangladesh, Án Độ và một số nơikhác trên thế giới trong hai thập kỷ qua (Sanjib Kumar Manna và ctv, 2021) Tại diaphận sông Mê Kông của Việt Nam thường ít khi thấy sự xuất hiện của cá tra tự nhiêntrưởng thành do tập tính di cư ngược dòng để tìm bãi đẻ trứng Qua các cuộc khảo sát,

bãi đẻ tự nhiên của cá tra đã được phát hiện ở địa phận Campuchia trên các cây cỏ thủy

sinh ven bờ Sau khi trứng nở, cá bột sẽ xuôi dòng về hạ lưu và một số xuôi về phầnsông Mê Kông của Việt Nam (Nguyễn Thị Hồng, 2014)

Ở Việt Nam, đồng bằng sông Cửu Long gồm các tỉnh Đồng Tháp, An Giang, BếnTre, Vinh Long và thành phố Cần Thơ được biết đến là vùng trọng điểm nuôi cá da trơn,đặc biệt là cá tra ( Đỗ Thị Thanh Hương và ctv, 2021) Theo Bộ NN&PTNT, năm 2023,diện tích nuôi trồng cá tra cả nước khoảng 5700 ha, sản lượng khoảng 1,61 triệu tan,kim ngạch xuất khâu ước đạt 1,8 tỷ USD, dự tính sẽ duy trì diện tích nuôi trồng ồn địnhtrong các năm sắp tới nhưng tăng về sản lượng Cá tra được nuôi ở quy mô công nghiệpvới mật độ cao tạo điều kiện cho một số mầm bệnh phát triển như: gan thận mủ, nhiễm

3

trùng xuất huyết, đốm đỏ, trong đó bệnh nhiễm trùng xuất huyết do vi khuẩnAeromonas hydrophila độc lực cao gây ra có tỷ lệ chết cao, có thé lên đến hơn 80%.2.1.3 Đặc điểm hình thái

Cá tra là một loài cá có da trơn (không vay), thân dai, thon và đẹp Phan lưng cá

có màu xám đen, phần bụng có màu trắng bạc, vây lưng cao, vây bụng có ngạnh, miệngrộng và có hai đôi râu dài Ở Việt Nam, cá tra nuôi khi trưởng thành có kích thướckhoảng 4 - 5 kg tuy nhiên thực tế cũng có thé nặng đến 10 - 20 kg (Nguyễn Thị Hồng,2014).

2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng và sinh sản

Tốc độ tăng trưởng của cá tra khá nhanh, tuôi thọ của cá tra ngoài tự nhiên có thélên đến 20 năm Nhiều cá thé cá tra được bắt gặp ngoài tự nhiên có kích thước 1,8 - 2m

và trọng lượng khoảng 18 - 20 kg Cá tra nuôi có tốc độ tăng trưởng phụ thuộc vào môitrường sống và thức ăn được cung cấp, thức ăn có nguồn gốc từ động vật và chứa nhiềuđạm thì cá rất nhanh lớn Khi còn nhỏ, cá tra tập trung phát triển chiều dài cơ thể Khitrọng lượng đạt 2,5 kg trở đi, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với mức tăng chiềudài cơ thé Cá tra hai tháng tuổi, chiều dai dat được khoảng 10 - 12 em và trọng lượng

từ 14 - 15g Sau một năm, trọng lượng cá đạt khoảng 1 - 1,5 kg, sự gia tăng về trọnglượng cơ thé bắt đầu nhanh hơn sự gia tăng về chiều dài cơ thé

Cá tra từ 2 - 3 năm tuôi, trọng lượng đạt khoảng 2,5 - 3 kg mới bắt đầu có khả năngsinh sản (cá đực 2 năm tuổi, cá cái 3 năm tuổi) Thời gian sinh sản được sát định vàokhoảng tháng 5 - 7 hang năm, cá sẽ di cư về nơi có điều kiện sinh thái phù hop dé timbãi đẻ (Campuchia và Thái Lan) Tại đây, các cây cỏ va rễ cây được cá chọn làm giá thé

dé đẻ trứng, trứng nở trong vòng 24 giờ sau khi đẻ và cá bột trôi theo dòng nước về hạnguồn Trung bình mỗi lần cá tra dé được khoảng 30000 - 40000 trứng với kích thướcdao động từ 1 - 1,5 mm (Nguyễn Thị Hồng, 2014)

2.2 Tống quan về vi khuẩn Aeromonas hydrophila gay bệnh xuất huyết trên cá tra

Aeromonas là một loài vi khuẩn có thé được tìm thay ở môi trường nước ngọt,nước lợ, trầm tích, cửa sông, rong biển, cỏ biển, nước thải, nước uống và cả thức ăn

(Isonhood và Drake, 2002; Semwal và ctv, 2023) Vi khuan Aeromonas hydrophila là

một loại trực khuan da hình, Gram âm, không hình thành bào tử, có phan ứng oxydasedương tính (Simmons va Gibson, 2012), được biết đến với kha năng chịu đựng được cácđiều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ, pH độ mặn (Palumbo và ctv, 1987; Peatman và ctv,

2018) Aeromonas hydrophila có thé sông sót va phát triển ở nhiệt độ từ 0 - 45°C vớinhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 22 - 32°C (Semwal va ctv, 2023) Vi khuẩn này thường

gây bệnh cho các loài động vật khác nhau cả trên cạn lẫn dưới nước như cá, động vật

lưỡng cư, chim, bò sát, động vật có vú (Thao PH Ngô va ctv, 2022) Aeromonas

hydrophila là vi khuẩn thuộc ngành Proteobacteria, lớp Gammaproteobacteria, bộAeromonadales, họ Aeromonadaceae, giống Aeromonas, và thuộc nhóm Aeromonas diđộng và di động nhờ có 1 tiên mao (Bùi Quang Té, 2006)

Bệnh do Aeromonas hydrophila gây ra được xem là mầm bệnh cơ hội ở cá da trơn

bị căng thang, mật độ cao hoặc suy giảm miễn dịch với các triệu chứng như sưng mô,

loét da, hoại tử, nhiễm trùng xuất huyết, lồi mắt, tổn thương gan thận (Thurlow và ctv,

2019; Xiong va ctv, 2024) Khả năng gây bệnh và độc lực của Aeromonas hydrophila

phụ thuộc vào khả năng sản xuất các thành phần liên quan đến viêm dạ dày, ruột nhưnội độc tố, ngoại độc tố, siderophores, độc tố tế bào, Elastase, collagenase,metallicoprotease, enolase, lipase và serine protease đều là các enzyme thủy phân đượctìm thấy trong 4eromonas hyđrophila có thê góp phần tạo độc lực (Semwal và ctv,2023) Các yếu tô độc lực ở Aeromonas hydrophila đã được xác định bao gồm sự hìnhthành chất nhờn, haemolysin, hoạt động phân giải protein, peptide kháng khuẩn, độc tốruột, hoạt động phân giải lipid, aerolysin, cytosin và gelatinase Những yếu tô này đượcAeromonas hydrophila sử dụng như một cơ chế bảo vệ, sinh tồn và hình thành mam

bệnh (Semwal và ctv, 2023).

2.2.1 Tổng quan về vi khuẩn Aeromonas hydrophila độc lực cao (vAh)

Khác với chủng Aeromonas hydrophila được coi là mầm bệnh cơ hội ở cá da trơn

do căng thắng hoặc bị suy giảm nién dịch, chủng Aeromonas hydrophila độc lực cao

(vAh) phân loại trình tự loại 251 (ST251) bằng Multilocus Sequence Typing (MLST)

được cho là mam bệnh chính ở cá da trơn khỏe mạnh với ty lệ tử vong cao ở cá trưởng

thành và cá cỡ thương phẩm (Thurlow và ctv, 2019; Thao PH Ngô va ctv, 2022) Bệnh

do vi khuẩn vAh gây ra ngày càng trở thành một van dé nổi cộm đối với ngành nuôi

trồng thủy sản trên khắp thế giới

Vào năm 1989, chủng vAh đầu tiên là Aeromonas hydrophila J-1 được phân lập

từ dịch bệnh nhiễm trùng xuất huyết do Aeromonas di động (MAS) gây ra trên cá chép

ở Giang Tô, Trung Quốc (Rasmussen-Ivey và ctv, 2016) Chung vAh này được phanloại trình tự là 251 (ST251) và được cho là có khả năng gây tử vong cao ở cá trắm cỏ(Ctenopharyngodon idella) (Xu va ctv, 2023) Dịch bệnh MAS lại tiép tuc bung phattại tinh Giang Tô của Trung Quốc vào năm 2010 với tác nhân gây bệnh là Aeromonashydrophila J-35, chủng vAh này cũng được phân loại là loại trình tự ST251

(Rasmussen-Ivey va ctv, 2016) Ngoài ra, một chủng vAh khác là Aeromonas

hydrophila ZC1 được phân lập từ cá tram cỏ có dấu hiệu của bệnh MAS từ một trangtrại thuộc tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc cũng có phân loại trình tự ST251(Rasmussen-Ivey va ctv, 2016; Xu va ctv, 2023) Trong khi đó, mãi đến năm 2004,trường hợp nhiễm bệnh MAS đầu tiên liên quan đến ST251 được ghi nhận ở Mỹ khi

Aeromonas hydrophila S04 - 690 được phân lập trên cá da trơn nhiễm bệnh tại

Washington, Mississippi (Rasmussen-Ivey và ctv, 2016) Ké từ đợt bùng phát đầu tiên,vào mùa hè năm 2009 các đợt bùng phát địch MAS liên tiếp diễn ra ở phía tây Alabamagây hậu quả nghiêm trọng (Xu và ctv, 2023) Mặc dù dịch bệnh MAS xuất hiện ở Mỹsau Trung Quốc nhưng đã dé lại hậu quả vô cùng nghiêm trọng cho ngành nuôi trồngthủy sản của nước này, dặc biệt là cá da trơn.

Theo Hossain và ctv (2014), căn cứ trên các phân tích cây di truyền thì ghi nhận

rằng các chủng vAh phân lập trên cá da trơn ở Mỹ có nguồn gốc từ vAh phân lập trên

cá chép tại Trung Quốc Việc nhập khẩu cá hay các sản phẩm từ cá đã đem lại các trậndịch lớn gây hậu quả nghiêm trọng do những chủng vAh gây ra tại các trang trại nuôi

cá đa trơn trên khắp nước Mỹ Vào năm 2015, Pang và ctv dựa trên phân tích so sánh

bộ gen đã khẳng định rằng chủng vAh gây bệnh xuất huyết ở Trung Quốc và Mỹ có

6

cùng nguồn gốc tổ tiên trình tự loại ST251 Ngoài ra, thông qua việc phân tích bộ gen

TS Ngô Huỳnh Phương Thảo và ctv (2022) đã cho thấy chủng vAh được phân lập tại

Việt Nam có quan hệ di truyền gần gũi với chủng vAh phân lập trên cá chép nhiễm bệnh

ở Trung Quốc hơn so với chủng vAh phân lập trên cá da trơn nhiễm bệnh ở Mỹ Hiệnnay, ở Việt Nam vẫn chưa có nhiều số liệu được công bồ về sự xuất hiện của chủng vAhtrong nuôi trồng thủy sản nhưng với tỷ lệ gây chết cao, loại dịch bệnh này gây thiệt hạilớn cho nền kinh tế đặc biệt là ngành nuôi trồng thủy sản, do đó cần phải có các biệnpháp kiểm soát dé phòng ngừa và xử lí kịp thời

2.2.2 Téng quan về hệ thống quorum sensing tuýp II (LuxS)

Quorum sensing (QS) được biết đến như một hệ thống giao tiếp giữa các tế bàocho phép vi khuẩn theo dõi mật độ quan thé của chúng, cũng như kiểm soát và điềuchỉnh khả năng hình thành mang sinh học, sản xuất kháng sinh, biểu hiện độc lực (Mi

và ctv, 2024) Việc sản xuất, phát hiện và phản ứng với các phân tử tín hiệu ngoại bàođược gọi là chất tự động cảm ứng (AI) AI được tích lũy trong môi trường khi mật độ

quan thé vi khuan tăng lên, dựa vào điều nay mà vi khuẩn theo dõi được mật độ tế bao

từ đó thay đôi biểu hiện gen chúng (Rutherford va Bassler, 2012) Các chat tự động cảmứng của vi khuân Gram âm chủ yếu là N-Acylhomoserine lactones (AHL) được sản xuấtbởi protein loại LuxI và LuxR (Ampomah-Wireko va ctv, 2021) Đến nay, có ba hệthống quorum sensing (tuýp 1, tuýp 2, tuýp 3) ở vi khuân Gram âm nói chung va chiAeromonas noi riêng.

Hệ thống quorum sensing tuýp 2 (LuxS) được phát hiện trong khoảng một nửa bộgen vi khuẩn đã được giải trình tự, đóng vai trò quan trọng trong hệ thống QS (Kozlova

va ctv, 2008; Yao và ctv, 2019) Lan đầu tiên, hệ thống quorum sensing tuýp 2 được xácđịnh và mô tả là chất điều hòa phát quang sinh học ở vi khuẩn Vibrio harveyi (Chai vàctv, 2023) Bên cạnh đó, hệ thống quorum sensing tuýp 2 còn điều chỉnh sự phát triểncua Escherichia coli, Bacillus anthracis va Actinobacillus Actinomycetemcomitan

(Xu va ctv, 2006) Ngoai ra, hé thong này còn đóng một vai trò trong khả năng vận độngcủa E coli và điều chỉnh độc lực của Streptococcus pyogenes, Clostridium perfringens,Vibrio vulnificus, Streptococcus pyogenes (Xu và ctv, 2006) Hệ thống quorum sensing

tuýp 2 được cảm ứng bởi các phân tử tín hiệu tự cam AI-2 được cho là quy định nhiều

kiểu hình vi khuẩn bao gồm sự hình thành mang sinh học, kha năng vận động và độclực (Kozlova và ctv, 2008) Mà các phân tử tín hiệu AI-2 là sản pham thứ cấp được xúc

7

tác tong hợp bởi enzyme LuxS do gen /uxS mã hóa Bên cạnh đó, các protein tương đồngvới enzyme LuxS, LuxQ, LuxU, LuxO của hệ thống quorum sensing tuýp 2 đã được tìm

thay ở Aeromonas hydrophila ATCC 7966T và Aeromonas đhakensis

+ Al-2 receptor? 9

swarming =

virdence associated genes density + ahyRI (AI-1) transcription

LitR regulated genes —

gây chết ở chuột trễ hon vi khuan dai, chủng đột biến /uxS của Neisseri men-ingitidis đã

bị giảm độc lực ở mô hình chuột sơ sinh, Vào năm 2008, Kozlova và ctv đã chứng

minh rằng việc loại bỏ gen /xŠ của Aeromonas hydrophila làm thay đôi rõ rệt cau trúcmàng sinh học và độc lực của chủng vi khuẩn này Nhìn chung các nghiên cứu về QStrên các chủng Aeromonas hydrophila đã được triển khai nhiều, tuy nhiên các công bốchỉ tập trung về cơ chế, về kiêu hình đặc trưng, về điều kiện môi trường tác động, vềliệu pháp ức chế hệ thống QS, vẫn còn thiếu các công bố về độc lực và mức độ biéu hiệngen Hiện nay, các nghiên cứu về hệ thống QS của Aeromonas hydrophila phân lập taiViệt Nam hầu như chưa được công bố, chủng vAh cũng chỉ vừa được phân lập và công

bồ nên việc so sánh độc lực và mức độ biéu hiện gen giữa vAh hoang dai và đột biến hệ

QS tuýp 2 mang lại nhiều thông tin mới mẻ

2.2.3 Tổng quan về dịch bệnh xuất huyết do Aeromonas hydrophila độc lực cao gây

ra

Bệnh xuất huyết còn có các tên gọi khác là nhiễm trùng xuất huyết, bệnh lỡ loét,

bệnh lỡ đốm đỏ, do Aeromonas di động gây ra là dịch bệnh phô biến ở các sinh vật dướinước, đặc biệt là môi trường nước ngọt Theo Rasmussen-Ivey va ctv (2016) vi khuẩnvAh gây xuất huyết bên trong và bên ngoài đáng kể, mắt lỗi, thường dẫn đến cái chếtcho vật chủ trong vòng vai giờ sau khi biéu hiện bệnh

Năm 1989, lan đầu tiên bệnh xuất huyết do vAh được ghi nhận trên cá chép ở tỉnhGiang Tô, Trung Quốc có trình tự loại ST251 với khả năng gây chết vật chủ cao dẫnđến thiệt hại ước tính khoảng 2200 tấn cá chết mỗi năm (Rasmussen-Ivey và ctv, 2016).Dịch bệnh xuất huyết liên quan đến chủng vAh trình tự loại ST251 lại tiếp tục bùng phát

ở tỉnh Giang Tô, Trung Quốc vào năm 2010, ngoài ra một chủng vAh khác cũng được

phát hiện tại tỉnh Quảng Đông của Trung Quốc, thiệt hại được ước tính hơn 5 tỷ nhân

dân tệ mỗi năm (Rasmussen-Ivey và ctv, 2016) Bên cạnh đó, bệnh do vAh cũng được

báo cáo lần đầu tiên ở Mississippi của Mỹ vào năm 2004, trước khi bùng phát thành

dịch bệnh lớn vào năm 2009 6 Alabama, Mỹ với 2000 tan cá chết được ghi nhận ở năm

đầu tiên và tăng lên vượt quá 10500 tan cho đến nay (Hossain và ctv, 2014; Ivey và ctv, 2016) Ở Việt Nam, thông tin về nhiễm bệnh đo vAh trong ao nuôi cá nướcngọt còn nhiều hạn chế nhưng với tỷ lệ gây chết cao, loại dịch bệnh này gây thiệt hại

Rasmussen-lớn cho nền kinh tế đặc biệt là ngành nuôi trồng thủy sản, do đó cần phải có các biệnpháp kiểm soát, phòng ngừa và xử lí kịp thời.

2.3 Tông quan về các gen liên quan đến khả năng sinh trưởng và kha năng gây độc

ởvAh

FAD là một gen liên quan đến kha năng sinh trưởng tham gia vào các phản ứngvận chuyền điện tử trong nhiều con đường trao đổi chất của ty thé (Henriques và ctv,2021).

Một số gen liên quan đến kha năng gây độc như: ace4, mglB, argF, hutH, fig,figF, ahh1, hcp1 Trong đó gen aceA cần thiết cho sự tồn tại và phát triển của vi khuẩngây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) (Dunn va ctv, 2009) Gen mg/B mã hóa

trong một operon điều hòa quá trình phiên mã của một bộ gen với một số gen cần thiết

cho sự phát triển của đại thực bào và độc lực của F Tularensis (Xiao và ctv, 2008)

Gen argF có liên quan đến yếu tổ độc tính của vi khuan Mycobacterium tuberculosis(Gordhan và ctv, 2002) Gen hutH được bao tồn cao ở hau hết các vi khuẩn và tham gia

vào quá trình cân bằng chuyên hóa năng lượng của vi khuẩn, đóng vai trò quan trọng

trong việc hình thành màng sinh học, khả năng vận động và độc tính đối với mô hìnhchuột của V parahaemolyticus ( Pengxuan va ctv, 2023) Gen flgA là một gen độc lực

liên quan đến kha năng vận động ở Helicobacter pylori (chủng ATCC 26695)(Rodriguez và ctv, 2021) Gen hcp/ là một tác nhân được giải phóng bởi hệ bài tiết loại

VỊ (T6SS) trong một số chúng Escherichia coli (E coli) tang cường độc lực của E Coli(Wang va ctv, 2023) Và gen ahh/ là một trong những yếu tố độc lực quan trọng nhất,kiểm soát một số yếu tố độc lực khác nhau ở A dhakensis (Chen va ctv, 2020)

2.4 Tống quan về gây bệnh trên cá bằng phương pháp tiêm xoang bụng

Tiêm xoang bụng là phương pháp tiêm qua thành bụng của cá nhưng không đâm

sâu vào trong, không làm tốn thương các cơ quan nội tạng của cá Khi thực hiện phương

pháp này, cá phải được gây mê trước đó dé không giãy giụa, tránh gây thủng nội quan,cần thực hiện nhanh chóng sau khi cá đã được gây mê Trước tiên, cá được đặt nằmngửa dé các cơ quan nội tạng dồn xuống phía dưới, vị trí tiêm thích hợp nhất là ở giữa

đường nối cung mang và hậu môn Sau khi tiêm, cá được sục khí để dần tỉnh lại Phương

pháp này có ưu điểm là cá sẽ được tiêm với liều lượng đồng đều (1% trọng lượng cơ thécá), vi khuân được đưa trực tiếp vào cơ thé cá dé gây bệnh Tuy nhiên, phương pháp này

10

được thực hiện tiêu tốn nhiều thời gian, công sức của người thực hiện và vi khuẩn đượcxâm nhập theo đường này không giống với tự nhiên.

2.5 Tổng quan về kỹ thuật real-time PCR

Vào năm 1984, Kary Mullis đã phát minh ra phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

và được coi là một cuộc cách mang trong khoa học (Deepak và ctv, 2007) Tuy nhiên,

phản ứng PCR vẫn còn nhiều hạn chế, kết quả chỉ được biết sau khi phản ứng kết thúc

và phải thực hiện một số kỹ thuật đi kèm khác như điện di hay đo OD Ngoài ra, kết quảghi nhận được của phan ứng là nồng độ cuối cùng của sản phâm PCR, trong khi đó sựthay đôi về nồng độ trong quá trình phan ứng và sự ảnh hưởng của lượng mẫu đầu vàođến kết quả thì không được ghi nhận Dé giải quyết những vấn dé này, kỹ thuật real-time PCR (qPCR) ra đời được coi là một bước nhảy vọt về công nghệ vào cuốithế kỷ 20 Kỹ thuật real-time PCR cho phép người dùng biết được số lượng bản saoDNA mục tiêu được tạo ra ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt nhờ chất phát huỳnh quang Ngườithực hiện phản ứng real-time PCR không cần thiết phải tiếp tục các thí nghiệm đề đọc

và phân tích kết quả như điện di hay đo OD, kết quả cuối cùng của phản ứng khuếch đạicũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng khuếch đại

Giống với PCR, kỹ thuật real-time PCR bao gồm các thành phan cơ bản nhưdNTP, DNA Polymerase, DNA mạch khuôn, cặp môi, và dung dịch đệm Khi thực hiện

kỹ thuật qPCR, các thành phần phản ứng được phối trộn với nhau trong tube và đặt vàomáy real-time PCR đề thực hiện quá trình nhân bản DNA Hiện nay, thay vì phối trộn

các thành phan phan ứng real-time PCR riêng lẻ thì các nhà nghiên cứu ưu tiên sử dung

real-time PCR mix (các thành phần phản ứng đã được phối trộn sẵn thành một dung dịchđồng nhất) Nhung real-time PCR khác với PCR ở chỗ sử dụng chat phát huỳnh quang

dé máy có thé phát hiện và đo cường độ tín hiệu huỳnh quang qua mỗi chu kỳ (tương

quan với sé lượng bản sao DNA được tạo ra) Kết qua của real-time PCR được thực hiện

dưới đạng biểu đồ và có thể quan sát được qua mỗi chu kỳ, từ đó có thể đánh giá hiệuquả của quá trình khuếch đại DNA mục tiêu

ll

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: thí nghiệm được nghiên cứu từ ngày 01/08/2023 đến 30/12/2023.Địa điểm: phòng Công nghệ sinh học Thủy sản, Trung tâm Công nghệ Sinh họcThành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cá tra sử dụng trong Nội dung 1 được Công ty Vĩnh Hoàn cung cấp, ương nuôitại khu thực nghiệm phòng CNSH Thủy sản, Trung tâm CNSH TP Hồ Chí Minh từ cábột đến khi cá đạt trọng lượng khoảng 13,776 + 6,377 g trong các bể composide 500 L

Chung Aeromonas hydrophila độc lực cao (vAh) hoang dại được phân lập tại An

Giang vào năm 2013, được kiểm tra và giữ chủng ở -80°C tại phòng CNSH Thủy san,Trung tâm CNSH TP Hồ Chí Minh Ching Aeromonas hydrophila đột bién hệ quorumsensing tuýp 2 (mLuxS) được tạo từ chủng vAh bằng phương pháp tái t6 hợp tươngđồng và được giữ chủng ở nhiệt độ -80°C tại phòng CNSH Thuy sản, Trung tâm CNSH

TP Hồ Chí Minh

RNA của các chủng vAh hoang đại và chủng đột biến hệ quorum sensing tuýp 2(mLuxS) được tách từ dich nuôi cấy 24 giờ ở pha cân bằng Chất lượng các mẫu RNA(3 lần lặp lại/mẫu) được kiểm tra nồng độ bằng thiết bị Nanodrop và kiểm tra độ nguyênven bang cách điện di trên gel agarose 1,5%, được giữ ở -20°C tại phòng CNSH Thủysản, Trung tâm CNSH TP Hồ Chí Minh

3.2.2 Hóa chất và môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy vi khuân vAh chủng hoang đại và đột biến: môi trường TSB(Tryptic Soya Broth, Himedia, Ấn Ðộ), môi trường TSA (Tryptic Soya Agar, Himedia,

An Độ)

Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm công độc: thuốc mê Benzocaine (25 mg/L,Sigma, US), đệm PBS 1X.

Hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR: Dream Taq Green PCR Master Mix 2X

(Thermo Fisher Scientific Inc, Mỹ), Water nuclease-free (Thermo Fisher Scientific Inc,

Mỹ), mỗi xuôi 10 mM, mỗi ngược 10 mM, DNA vi khuẩn.

12

Hóa chất sử dụng cho phản ứng real-time PCR: Maxima SYBR Green/ROX qPCRMaster Mix 2X (Thermo Fisher Scientific Inc, Mỹ), Water nuclease-free (Thermo Fisher

Scientific Inc, Mỹ), mỗi xuôi 10 mM, mỗi ngược 10 mM, cDNA vi khuẩn

Hóa chất sử dụng cho điện di: Agarose gel 1,5% (BioLab), đệm TAE 0,5X(Merck), 0,5 mM EDTA (Merck), Ethidium Bromide (Merck), GeneRuler DNA Ladder

Mix SM0331, 6X TriTrack DNA Loading Dye (Thermo Fisher Scientific Inc, My).

Các cặp môi sử dung trong thí nghiệm so sánh mức độ biéu hiện gen giữa chủngvAh hoang đại và đột biến (mLuxS) được thiết kế bởi phòng CNSH Thủy sản thuộcTrung tâm CNSH TP Hồ Chi Minh Căn cứ vào phân tích so sánh hệ gen phiên mã(transciptome) giữa chủng vAh hoang dai và chủng đột biến mLuxS trong nghiên cứutrước đây của phòng CNSH Thủy sản vào năm 2022, 12 gen có mức độ biểu hiện khácbiệt có ý nghĩa thống kê giữa hai chủng này được lựa chon dé kiểm tra bằng phươngpháp real-time PCR Bên cạnh đó gen rpoB là gen bảo tồn, có sự biểu hiện ôn định giữacác chủng trong cùng loài, nên được chọn làm gen tham chiếu trong nghiên cứu đánh

giá mức độ biéu hiện gen tương đối

Bang 3.1 Các cặp mỗi sử dụng trong phan ứng real-time PCR so sánh mức độ biểuhiện gen giữa vAh hoang đại và vAh đột biến mLuxS

Môi Trình tự Nhiệt Kích Chức năng gen

mgIB-F CAGTTCACTTGGTGTACAGC 55 287 D-galactose/

methyl-mglB-R GCAGTACGTCGACCTGATCG 60 galactoside binding

periplasmic protein

argF-F GATCGATCTGGCCATCGACC 60 277 Ornithine

carbamoyl-argF-R 9 CTTCCACGATCTCCTGACCG 60 transferase

13

Bảng 3.1.(tt) Các cặp môi sử dung trong phản ứng real-time PCR so sánh mức độ biéuhiện gen giữa vAh hoang đại và vAh đột biến mLuxS

Môi Trình tự Nhiệt Kích Chức năng gen

độ thước

nóng (bp)

chảy

CC)FAD-F GAGATGTTGTCCGAGGTAAC 55 245 Electron transfer

FAD-R GAGTTCGGGTCTGGCAGAGC 62 flavoprotein

(subunit beta)

hutH-F GACGCCGCCGTTGTTGACCAG 64 293 — Histidine

ammonia-hutH-R TACTCCCTGCGCTGCCAGC 64 lyase

mfd-F GCACATGTCGCCGAGCACC 64 147

‘Transcription-repair-mfd-R = GCTCGATGTCTATGCCATGC 57 coupling factor

flgA-F GGCTTGAGTTCGCGCTTGC 62 301 Flagella basal body

fglA-R CGCCTGCCATTGAGTCGC 60 P-ring formation

protein

flgF-F §CATGGCATGCTGATGACCAC 57 203 Flagellar basal-body

flgF-R CATCGGCAGCGGCAGCACGATG 66 rod protein

metF-F GTATCGACGCCAGCCGCG 62 307

Methylenetetra-metF-R = GCGCAGGTAGGTCTCGACG 64 hydrofolate reductase

ggt-F ACTGCGTGGGGTTCCGAG 60 294 Glutathione

get-R CCGATCTGCAAGACGTTGC 60 hydrolase proenzyme

hep1-F AAGTCAGACTTCGCCGGATC 57 302 Type VI secretion

hepl1-R =CGAGATGCTGGTGCAAGAG 60 system effector

ahh1-F ACATTCTGCGGGTTGCCG 58 285 Hemolysin

ahhl-R =ACGCCAACCATGGTCTGAG 60

rpoB-F GGATCACGGTGCCTACAT 56 161 Gen tham chiéurpoB-R = =TAACGCTCGGAAGAGAAGA 56

14

Bảng 3.2 Các cặp môi sử dụng trong phan ứng PCR dé kiểm tra sự hiện diện của

chủng vAh hoang đại và vAh đột biến mLuxS

Mỗi Trình tự Nhiệđộ Kích Tác giả

nóng thước

chảy °C) (Œbp)2968-F CTATTACTGCCCCCTCGTTC 58,7 Grifin va

2968-R ATTGAGCGGTATGCTGTCG 59,8 67 ctv (2013)

LuxS-F ATGCCGTTATTGGACAGTTITAC 63 Nghién

LuxS-R TCAGAGGCTTTTCAGCTTCTC 64 ụ cứu này

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Thiết bị: cân phân tích (Sartorius, Đức), tủ nuôi cấy lắc (Bioteck), máy đo quangphổ kế (GENESYSTM 10S UV-Vis Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific,USA), may Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, USA), tủ mat 4°C (Sanyo,

Nhật Ban), tủ ủ nhiệt (Sanyo, Nhat Ban), tủ lạnh -20°C (Sanyo, Nhật Ban), tủ đông sâu

-80°C (Sanyo, Nhật Bản), tủ cấy an toàn sinh học cấp II (ESCO, Singapore), may PCR

MasterCycler gradient (Eppendorf, Duc), máy Real-Time PCR Light Cycler 96

(Roche, Thụy Sỹ), bồn điện di, máy đọc gel (GelDoc-it2, UVP), máy vortex, máy ly tâmCentrifuge 5810R (Eppendorf, Đức), máy ly tâm lạnh Centrifuge 5415R (Eppendorf,

Đức) 13200 max, máy đo pH, máy khuấy từ

Dụng cụ: micropipette (10 pl, 20 pl, 100 pl, 200 pl, 1000 pl), tuýp eppendorf các

loai, dau tip cac loai, falcon cac loai, que cay, dia petri, kim tiém, cuvette, ống đong, bê

composite (500 L), xô nhựa (5 L), vợt, hệ thông sục khí và các dụng cụ cần thiết khác

trong phòng thí nghiệm.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nội dung 1: Đánh giá độc lực của chủng vAh hoang dại và chủng vAh đột

biến hệ quorum sensing tuýp 2 (mLuxS) trên cá tra bằng phương pháp tiêm

3.3.1.1 Chuẩn bị cá tra cho thí nghiệm công độc

Cá tra ở giai đoạn noãn hoàng được công ty Vĩnh Hoàn cung cấp, sau đó đượcương nuôi trong các bể composide 500 L trong phòng thí nghiệm thuộc Trung tâmCNSH TP Hồ Chí Minh Môi trường nuôi cá tra phải đảm bảo các tiêu chí như nhiệt độ

22 - 30°C, độ pH 6,5 - 9,5, độ oxy hòa tan 2,5 - 7,5 mg/L, độ kiềm 15 - 25,7 mg/L, nồng

độ amoniac 0,7 - 1,0 mg/L, độ mặn < 2 ppm, độ cứng 15,5 - 35,5 mg/L, nồng độ

15