Acid amin và phương pháp phân tích

Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích

MỤC LỤC

I.

II L Giới thiêu về acid amin:

1 Thành phần và cấu tao:

III Protein là polymer của các amio acid nối với nhau bằng các liên kết cộng hoá trị làliên kết peptide Protein có thể bị thuỷ phân tạo thành các acid amin tự do bằng nhiều phuơng phápkhác nhau Người ta đã xác định protein được cấu trúc từ 20 loại acid amin khác nhau

IV Acid amin là chất hữu cơ mà phân tử chửa ít nhất một nhóm carboxyl (-COOH) và

ít nhất một nhóm amino (NH2), trừ prolin chỉ có nhóm NH (thực chất là một acid imin) Trong phân

tử acid amin đều có các nhóm COOH và NH2 gắn với carbon ở vị trí a Hầu hết các acid amin thunhận được khi thuỷ phân protein đều ở dạng L-a acid amin Như vậy các protein chỉ khác nhau ởmạch nhánh, hay còn gọi là chuỗi bên (thường được ký hiệu: R)

2 Màu sắc và mùi vi:

V Các acid amin thường không màu, nhiều loại có vị ngọt kiểu đường như glycine,alanine, valine, serine histidine, triptophan; một số loại có vị đắng như isoleucine, arginine hoặckhông có vị như leucine Bột ngọt hay còn gọi là mì chính là muối của natri với acid glutamic(monosodium glutamate)

3 Tính tan:

VI Các acid amin thường dễ tan trong nước, khó tan trong alcohol và ether (trừ proline

và hydrogenxyproline) Chúng cũng dễ hoà tan ừong acid và kiềm loãng (trừ tyrosine)

4 Tính quang hoc:

VII Các acid amin trong phân tử protein đều có ít nhất một carbon bất đối (trừ glycine)

vì thế nó đều có biểu hiện hoạt tính quang học, nghĩa là có thể lảm quay mặt phang của ánh sángphân cực sang phải hoặc sang ừái Quay phải được ký hiệu bằng dấu (+), quay ừái được ký hiệubằng dấu (-) Góc quay đặc hiệu của acid amin phụ thuộc vào pH của môi trường

VIII Tuỳ theo sự sắp xếp ừong cấu trúc phân tử của các nhóm liên kết với carbon bất đối

mà các acid amin có cấu trúc dạng D hay L (hình 1) gọi là đồng phân lập thể số đồng phân lập thểđược tính theo 2 (n là số carbon bất đối)

X.

XI Hình 1: Đồng phân lập thể của aỉanine

XII Hầu hết các acid amin khác hấp thụ tia cực tím ở bước sóng (X) khoảng từ 220 -280

XIV nm Đặc biệt cùng nồng độ 10 M, trong bước sóng khoảng 280 nm tryptophan hấpthụ ánh sáng cực tím mạnh nhất, gấp 4 lần khả năng hấp thụ của tyrosine (hình 2.8) vàphenylalanine là yếu nhất Phần lớn các protein đều chứa tyrosine nên người ta sử dụng tínhchất này để định lượng protein

5 Hình 2: Phổ hấp thụ ánh sáng cực tỉm của tryptophan và tyrosineTính lưỡng tính:

XV Trong phân tử acid amin có nhóm carboxyl -COOH nên cỏ khả năng nhường

proton (H ) thể hiện tính acid, mặt khác cỏ nhỏm amỉn-NH2 nên cỏ khả năng nhận proton nên thểhiện tính base Vì vậy acid amin có tính chất lưỡng tính,

XVI Trong môi trường acid, acid amin ở dạng catìon (tích điện dương), nếu tăng dần pHacid amin lần lượt nhường proton thứ nhất chuyển qua dạng lưỡng cực (trung hoà về điện), và tiếptục tăng pH acid amin sẽ nhường proton thứ hai chuyển thành dang anion (tích điện âm) Vỉ vậy đôikhỉ người ta coi nỗ như một di-acỉd

II, Thu nhản acid amin:

XVII A Tinh sach protein trước khi thu nhân acid amin:

1 Giởi thiêu:

XVIII Phân tích acid amin của proteỉn là một trong những phương pháp tốt nhất và chínhxác nhất đề định lượng protein Sự cần thiết của việc thu nhận mẫu ở nồng độ cao và không bịnhiễm là một vấn đề cần giải quyết để xác định cấu tạo protein Nhiều phương pháp hiện có để loại

bỏ chất đệm, muối ra khỏi proteỉn như phương pháp kết tủa hoặc sẳc ký lỏng cao áp đảo pha HPLC) gây thất thoát proteỉn nhiều, làm việc đánh giá nồng độ thực ừở nên khỏ khăn Sau đây làhai phương pháp thường dùng để thu hồi protein từ chất đệm: phương pháp lọc gel, cột vi xoáy tốc

(RP-độ cao, và sự hấp thu vào màng poly vinylidene diíluoride (PVDF) trong hộp chuẩn bị mẫuProSorb

2 Nguyên liêu:

XIX 2,1 Thiết bi:

1 Cột vi xoáy tốc độ cao (Việc lựa chọn kích cỡ thích hợp của cột vi xoáy quan trọng cho thểtích mẫu MỈU thể tích càng nhỏ thì nên chọn cột nhỏ)

2 Hộp chuẩn bị mẫu ProSorb

1 Nước HPLC (luôn dùng chất phản ứng và nước có chất lượng tốt nhất)

2 Triíluoroacetic acid (TFA)

3 0.1% TFA

3 Phương pháp:

3.1 Chuẩn bi côt macrospin (mẫu 50-150 ỊJ,L)

1 Cột macrospin cần được chuẩn bị cơ bản theo đề nghị của nhà sản xuất Lắp cột nhẹ nhàng

để thu hồi gel ở đáy cột Hydrate hóa gel với 500 ụL nước HPLC ừong 15 phút ở nhiệt độ phòng

(phần trăm mẫu thu hồi được tăng khi thời gian hydrate hóa tăng cột vi xoáy), sau đó ly tâm cộtừong 4 phút ở 2000g để làm cân bằng cột

2 Rửa cột 3 lần với 500 pL nước để bảo đảm sự cân bằng

3 Thấm khô phần ngoài cột để loại ẩm và đặt nó vào một ống mới Đối với cột macrospin,

thêm 50-150 ịiL mẫu vào đỉnh, cẩn thận đặt mẫu vào giữa cột.

4 Ly tâm ống 4 phút ở 2000g, rửa cột với ít nhất 200 JJ,L nước

5 Lấy mẫu đã tinh sạch ra và r ủ t chân không ở tốc độ cao đến khô trước khi thủy phân (Khimẫu chứa nồng độ protein hoặc peptide cao với thể tích thích hợp, không cần tinh sạch mẫu thêm,chỉ cần pha loãng mẫu với nước HPLC đến một dung dịch muối không ảnh hưởng đến quá trìnhphân tích.)

3.2 Cột vi xoáy (mẫu 5-25 pL)

1 Giống như đối với cột macro, rút gel khô đến đáy thùng Làm ướt với 50 pL nước và ly tâm

3 phút, ở lOOOg để cân bằng cột Đe có kết quả tốt nhất, rửa cột 3 lần với 200pL nước Đe ly tâmnhững cột này, đặt chúng trực tiếp vào một máy ly tâm vi mô hoặc dùng một ống ly tâm rỗng 1.7mL

2 Sau khi cột đã cân bằng, thấm khô để loại bỏ ẩm bám bên ngoài cột

3 Thêm 5-25 pL mẫu vào đỉnh cột, cẩn thận đặt mẫu vào giữa cột

4 Đặt cột vào một ống mới, xoay ống 3 phút ở lOOOg Sau khi ly tâm, mẫu đã tinh sạch ởtrong ống và sẵn sàng để sử dụng

3.3 Chuẩn bi hôV mẫu ProSorb

1 Đảm bảo rằng mẫu đựng trong dung dịch 0.1% TFA để đạt kết quả tốt nhất (Acetonitrile(ACN) với nồng độ hơn 15% cản trở mẫu dính vào PVDF, vì vậy những phần của HPLC nên phaloãng với nuớc cất hoặc 0,1% TFA để giảm nồng độ của ACN xuống nhỏ hơn 15%) Nếu thể tích íthơn 100 JJ,L, pha loãng mẫu thành 100 JJ,L với 0.1% TFA Nếu mẫu có chất tẩy, pha loãng đểnồng độ chất tẩy thấp hơn giá trị trong bảng 1 vì chất tẩy có thể ảnh hưởng sâu sắc đến sự kết dínhprotein vào màng PVDF Bảng 1 tóm tắt nồng độ của chất tẩy có thể chứa ương mẫu trước khi kếtdính vào màng Ngoài ra, nếu mẫu chứa lượng chất tẩy lớn hơn lượng tối đa ừong bảng 1, có thểthêm một lượng nhỏ methanol vào mẫu trước khi cho mẫu vào hộp mẫu ProSorb)

XX Bảng 1: Hàm lượng chất tẩy tối đa

2 Đặt thiết bị ProSorb vào một giá ống nghiệm thích hợp

3 Làm ướt màng PVDF trong hồ nhỏ với 10 pL methanol (hộp mẫu ProSoib nên được chuẩn

bị kỳ như chỉ dẫn của nhà sản xuất, dùng nước MilliQ cho mọi bước lảm sạch để giảm lượng acidamin còn sót lại.)

4 Cho mẫu vào hồ nhỏ (100 đến 400 ịiL thể tích), để cho mẫu chảy qua màng (Thao tác với

I.

mẫu nên cẩn thận vì protein và peptide có thể dính vào ống thủy tinh hoặc nhựa Neu mẫu nhỏ, có

thể giảm thiểu tổn thất ở cartridge bằng cách cho 100 ịiL dung dịch đệm vào màng ướt trước khi cho

mẫu vào Mầu có thể thêm trực tiếp vào dung dịch đệm.)

5 Đảm bảo rằng mẫu hồ nhỏ tiếp xúc hoàn toàn với chất hấp thụ và sự chuyển chất lỏng bắtđầu

6 Thêm những mẫu thử thể tích nhỏ, nếu cần (đổi chất hấp thụ sau mỗi 750 JJ,L)

7 Rửa màng với 100 JJ,L 0.1 % TFA 2 lần

8 Lấy mẫu và làm khô màng PVDF

3.4 Thu nhân mẫu đã thủy phân trên màns PVDF

1 Đặt màng PVDF vào đáy của ống thủy phân

2 Thủy phân như bình thường Sau khi acid đã được làm khô từ mẫu thủy phân, thêm 10 pg

methanol Chiết 2 lần với 50 ịiL dung dịch gồm 20% MeOH, 0,1N HC1 và chuyển đến ống

Eppendorf 0,5mL

3 Đặt ống Eppendorf vào thùng PICOTAG và làm khô nó

4 Pha loãng với dung dịch đệm loãng và lọc, dùng một cột vi xoáy Mầu đã sẵn sàng đề phântích acid amin

XXXIV B Thu nhân acid amin bằng thủy phân p ro tem:

1 Thủy phân bằns acid:

XXXV Đe thu nhận acid amin, phưong pháp thường được dùng nhất là thủy phân bằngdung dịch HC1 6N dư ở nhiệt độ 100-120°c trong 24 giờ Sản phẩm thu được chủ yếu là các acidamin dưới dạng tự do dưới dạng hydrogenclorate Một số acid amin như serine và threonine bị pháhủy một phần, tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, glutamine và asparagines bị phân hủy thành acidglutamic, acid aspartic và NFLt+

2 Thủy phân bằng kiểm:

XXXVI Người ta còn có thể thu nhận acid amin bằng phương pháp thủy phân vớidung dịch NaOH, bằng cách đun nóng ừong nhiều giờ Sản phẩm thu được hầu hết là các acid aminnhưng đều bị racemic hóa, các acid amin cysteine, serine, threonine bị phá hủy nhưng tryptophankhông bị phá hủy Vì vậy, phương pháp thủy phân bằng kiềm thường chỉ dùng để xác địnhtryptophan

3 Thủy phân bằne enzvme:

XXXVII Để thu nhận chế phẩm acid amin, ngày nay việc thủy phân bằng enzymeđược ứng dụng rộng rãi ừong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau do việc sử dụng enzyme có nhiều

ưu điểm

XXXVIII Các enzyme thủy phân protein thành các acid amin hay các peptide có phân

tử lượng thấp được gọi chung là peptidhydrogenlase Có nhiều loại peptidhydrogenlase, chúng đượcphân biệt nhờ tính đặc hiệu khác nhau với liên kết peptid Một số loại cắt đứt liên kết peptide ở đầutận cùng của chuỗi polypeptide được gọi là exopeptidase như carboxypeptidase phân giải liên kếtpeptide đầu c tận cùng, aminopeptidase phân giải liên kết peptide đầu N tận cùng Một số khác chỉcắt đứt ở giữa chuỗi polypeptide được gọi là các endopeptidase như pepsin, tripsin

XXXIX III Đinh lương acid amin bằng phương pháp sắc kv:

XL Người ta có thể dùng nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, ở đây chỉ giới thiệunguyên tắc của một số phương pháp thông dụng để phân tích acid amin

XLI II Sắc ký giấy

XLII Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân bố giữa hai pha dung môi:dung môi cố định và dung môi di động Dung môi cố định thường là nước giữ ở giấy sắc ký (ươngđiều kiện bảo hoà hơi nước, giấy có thể giữ 15-22% nước tính theo trọng lượng giấy) Dung môi diđộng thường là một dung môi hữu cơ bảo hoà nước di chuyển ừên tờ giấy theo mao dẫn kéo theocác chất trong dung dịch Tốc độ di chuyển của từng chất không giống nhau và mỗi chất được đặctrưng bởi một trị số nhất định gọi là Rf

XLIII Trong đó: - a là khoảng cách chuyển dịch của chất

phân tích - b là khoảng cách chuyển dịch của dungmôi

XLIV Có ĩủiiều kiểu sắc ký giấy khác nhau, đó là sắc ký một chiều đi lên, sắc

ký một chiều đi xuống, sắc ký vòng nằm ngang và sắc ký hai chiều Loại giấy thuờng dùng

là Whatman số 1 và Schleicher-Schull 2044 a và b, dung môi gồm các chất nhu 4 Butanol: 1Acetic acid: 5 Nước (dùng cho chiều thư nhất); 3 Phenol: 1 Nước (dùng cho chiều thứ hai)

2) Sắc ký lớp mỏng

XLV Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên lý thuyết của sắc ký giấy, nghĩa

là cũng dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: chất hấp phụ được tráng rộng trên một phiếnkính tạo thành một lớp mỏng và pha di động là dung môi thích hợp Dung môi di chuyển lảmdịch chuyển các chất trong mẫu thử Các chất hấp phụ thường dùng là silicagel, alumin oxyt,sephadex ,v.v được kết hợp với thạch cao (gypse) để dán vào phiến kính

3) Sắc ký khí

XLVI Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng tính chất khó bay hơi của cácacid amin nên có thể sử dụng chương trình nhiệt để chuyển chúng thành các dẫn xuất (thường làN-acetyl-amin) Cho tác dụng acid amin với cồn amylic và HBr khan, sau đó cho tác dụng hỗn

hợp này với anhydrid acetic Cột thường dùng là loại Chromosorb w (60-80 mesh) có một lớp polyetylenglycol 1% (carbơvvax 1564 hoặc 6000) Chương trình nhiệt giữa 125 c và 155 c, tốc

độ chảy 60-240 mL/phút.

XLVII IV Mồt vài nhưotip oháo cu thế

XLVIII A Phân tích acid amin bằng phưong pháp sắc ký lỏng cao áp sau phản ứng tạo dẫn xuất vói l-íluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (thuốc thử Maríey)

1 Giói thiêu

XLIX Việc tạo dẫn xuất của acid amin kèm theo việc phân tích sắc ký lỏng cao áp

có đảo pha (RP-HPLC) được xem là phương pháp thích hợp nhất để phân tích acid amin Cácbước tạo dẫn xuất không chỉ cần thiết cho sự tương tác vói pha không phân cực và ổn định, màcòn cần cho việc đo quang

L Thuốc thử Marfey l-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide hoặc fluoro-2,4-dinitrophenyl)-amino]propanamide được sử dụng để tách và xác định cấu hình acidamin Thuốc thử phản ứng hóa học với nhóm amino của đối hình acid amin để tạo ra dẫn xuất

(S)-2-[(5-ổn định mà có thể tách bằng phương pháp RP-HPLC (hình 1) Dinitronphenyl alanine amid hấpthu mạnh bước sóng 340 nm (£ = 30000 M"1 cm"1), điều này cho phép đầu dò xác định được ởphạm vi subnmol

LI Việc tạo dẫn xuất với thuốc thừ Martey cũng được dùng để định lượng 19 L-acidamin thường gặp Ưu điểm của thuốc thử Maríèy là:

1 Có khả năng tạo sắc phổ trên bất kỳ thiết bị phân tích HPLC nào mà không cần phảităng nhiệt độ cột phản ứng

2 Những dung môi không tinh khiết khác khó dò được bước sóng 340 nm

3 Phát hiện cả sự có mặt của proline khi chạy cột sắc ký đơn

4 Tạo dẫn xuất acid amin ổn định

LII Kỹ thuật đo đơn giản này đem lại cho những nhà phân tích acid amin một phươngpháp hiệu quả và Tẻ tiền Việc tạo dẫn xuất với thuốc thử Marfey còn có những ứng dụng trongcác lĩnh vực hóa sinh, trong đó có việc xác định cơ chất và sản phẩm trong những phản ứngenzyme cùa acid amin

LIII Hình 3:

Thuốc thử Marfey Ợ) và L,L- dẫn xuất

từ L-acìd amin và thuốc thử

I)

2 Nguyên liêu-Thiết biĩ

2.1 Thủy phân urotein

• Ống nghiệm bằng thủy tinh chịu nhiệt kích thước 25-50 x 5 mm

• Ống nghiệm thủy tinh có nắp khoen siết chặt

2.2 Phản ứne thu nhân dẫn xuất

• dd acid amin chuẩn

• Bộ kit thử L-acid amin chuẩn LAA21

• Thuốc thử Marfey Lưu ý: thuốc thử Maríey là dẫn xuất của trinitrobenzene, chất nghi ngờ là có khả năng gây ung thư nên càn thận trọng khi sửdụng

l-fluoro-2,4-• HPLC grade triethylamine, methanol, acetone và dimethyl sultbxide (DMSO)

2.3 Phân tích sắc kỷ:

• Hệ thống vận chuyển dung môi: bất kỳ thiết bị phân tích bằng sắc ký lỏng cao ápnào cũng có thể sử dụng để thu nhận dẫn xuất của acid amin

• Cột sắc ký: cột silicat Cg chuyển đổi pha, ví dụ nhu: LiChrospher 100 RP 8 (250

X 4.6 mm; 5 pm from Macherey-Nagel), Aquapore RP 300 (220 X 4.6 mm; 7 pmfrom Perkũi-Elmer), Nucleosil 100-C8 (250 X 4.6 mm; 5 pm from Macherey-Nagel), or Vydac C8 (250 X 4.6 mm; 5 pm from The Separations group)

• Đầu dò UV/vis kèm theo ô chửa chất lỏng dài 0.5-1 cm, thể tích 3-5 JJ,L Dầnxuất của acid amin đuợc phát hiện ở 340 nm

• Tổng họp peak: các phàn mềm máy tính được dùng để tổng hợp và định lượngpeak của acid amin

• Dung môi: phải được chuẩn bị với HPLC grade và phải được loại khí

•S Dung môi A: 13 mM triíluoroacetic acid (TFA) cùng với 4% (v/v)

LV tetrahydroíìưan ữong nước

LVI ■S Dung môi B: Acetoniừile (50% v/v) trong dung môi A.

3 Phương pháp:

3.1 Thủy phân protein:

LVII ■S Lấy vào lọ thủy tinh nhỏ 50-500 pmol mẫu protein hoặc 20 pL dung

dịch acid amin chuẩn chứa 2.5 pmol/mL mỗi 17 acid amin, sau đó lảm khô dưới áp suấtnhẹ ừong thiết bị cô đặc SpeedVac

LVIII •S Đặt những lọ thủy tinh mẫu ừên vào lọ thủy tinh có nút khoen chặt chứa

200 pL dung dịch HC16N

LIX ■S Sục khí argon vào những lọ trên trong 5-15 phút rồi đậy nắp kín và

không cho không khí lọt vào

LX ■S ủ những lọ thủy tinh ở 110°c trong 24 giờ hoặc 150°c ừong 2 giờ ừong

tủ ấm khô

LXI ■S Chờ một thời gian cho quá trình thủy phân xảy ra xong, lấy những lọ

thủy tinh khỏi tủ ấm, lảm nguội về nhiệt độ phòng và mở nắp từ từ

LXII ■S Lấy lọ thủy tinh nhỏ ở trong ra, lau khô bề mặt ngoài bằng giấy mềm rồi

lảm khô ở áp suất nhỏ

3.2 Phản ứng thu nhân dẫn xuất:

LXIII ■S Thêm 50 pL hỗn họp theo tỉ lệ triethylamine : methanol: nước = 1 : 1 : 2

vào lọ đã làm khô rồi ừộn vortex thật đều, sau đó đem làm khô

LXIV ■S Chuẩn bị dung dịch thuốc thử cho phản ứng tạo dẫn xuất (18.4mM)

bằng cách cho 5 mg thuốc thử Marfey vào 1 mL dung dịch acetone

LXV ■S Cho hỗn hợp acid amin đã làm khô hoặc mẫu protein đã thủy phân vào

100 pL triethylamine 25% v/v, rồi thêm vào 100 pL dung dịch thuốc thử Marfey và trộnvortex thật đều

LXVI s ủ lọ thủy tinh đó ở 40°c trong 60 phút trong điều kiện khuấy trộn nhẹ và

tránh ánh sáng để phản ứng tạo dẫn xuất xảy ra

LXVII ■S Sau khi ủ, thêm vào hỗn hợp 20 pL dung dịch HC1 2N Khi này phản

ứng kết thúc Làm khô hỗn họp dưới áp suất nhỏ

LXVIII ■S Bảo quản hỗn họp ở -20°c trong bóng tối cho đến khi sử dụng.

LXIX ■S Thêm vào mẫu đã lảm khô lmL dung dịch dimethyl sulíòxide (DMSO)

50%

LXX.v/v

3.3 Phân tích sắc ký:

LXXI ■S Thêm dung môi A và dung môi B vào hệ thống phân tích sắc ký lỏng

cao áp theo hướng dẫn của nhà sản xuất

LXXII ■S Cân bằng cột chạy sắc ký và đầu dò với 90% dung môi A và 10% dung

môi B

LXXIII ■S Đem mẫu đi phân tích ở nhiệt độ phòng; nếu cần có thể pha loãng với

dung môi A bằng cách thêm vào cột 20 pL (50-1000 pmol)

LXXIV ■S Rửa giải cột với hàm lượng dung môi A và B như bảng 2 việc phân tích

dẫn xuất 2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide của 18 L-acid amin thường gặp và acidcysteic thu được kết quả trong 120 phút (hình 4)

đỉnh của biểu đồ sắc phổ ở những hàm lượng 100, 250, 500 và 1000 pmol.s Khỉ quá trìnhphân tích sẳc ký kết thủc, rửa cột và bơm vào methanol đã loại khí 20% v/v để bảoquân Trước khi sử dụng lại, làm sạch với 100% methanoỉ

II Bảng 2: Chương trình HPLC cho sự phân giải dẫn xuất acid amin với thuốc

thử Maríiey

III.

XCVIII Hình 4: Sự tách dẫn xuất 2,4-dmịtrophenyl-5-L-alanỉne amid của L-acỉd amỉn bằng phương pháp HPLC Thuốc thử Marfey tạo dẫn xuất từ ỉượng 20 ỊẲ L hỗn hợp acid amm chuẩn Thiết bị: cột

LiChrospher ỉ 00 RP 8 (250 X 4.6 mm; 5 ịim ýrom Macherey-Nageỉ); mẫu chứa ĨOỒ pmoỉ dẫn xuất của

18 L-acid amm; dung môi A chứa 13mM acid trìfluoroacetỉc cùng tetrahydro/uran 4% v/v trong nước; dung môi B chứa acetonitriỉe 50% v/v trong dung môi A; tốc độ chảy ImL/phủt; đầu dò bước sòng 340 nm;

cột rửa giải với lượng dung môi B trong dung môi A phủ họp Dẩn xuất acid amm được biểu thị bằng

những chữ cải, ví dụ acỉd cysteic được ký hiệu là CYA, còn cysteine là Cs FFDA đặc trưng cho đinh của thuốc thử; đmh không cổ ký hiệu tượng trưng cho thuốc thử phụ cỏ liên quan, như được chỉ trong quả trình chạy sắc phổ riêng ỉẻ trong thuốc thử riêng.

4 Chú Ý:

phẩm trong phản ứng enzyme, việc tách protein từ acid nucleic là cần thiết Thêm dungdịch acid perchloric 4M vào dịch cô đặc cuối cùng nồng độ IM và ủ trên đá trong ít nhất

15 phút Khỉ thêm cùng một thề tích dung dịch KOH 2M ờ trạng thái lạnh, acid

bề mặt, đem làm khô rồi sử dụng cho quá trình tạo dẫn xuất

C ■S Việc tách hoàn toàn dung dịch HC1 ra khỏi hỗn hợp là rất quan trọng cho phản

ứng giữa các acid amin và thuốc thử Marfey

CI ■S Tỉ lệ giữa thuốc thử Marfey và tổng luợng acid amin không nên vuợt quá tỉ lệ

3:1

CII ■S Trong suốt quá trình thu nhận dẫn xuất, màu của hỗn hợp phản ứng chuyển từ

vàng sang cam rồi đỏ

CIII ■S Trong quá trình acid hóa, màu của hỗn hợp chuyển sang vàng.

CIV •S Hỗn hợp acid amin sẽ giữ được tính chất ổn định trong hơn 1 tháng khi

bảo quản ở -20°c trong bóng tối Trong dung dịch DMSO 50% v/v, dẫn xuất thu được sẽ ổn đinh trong 72 giờ ở -4°c và hơn 6 tuần nếu bảo quản ở -20°c.

CV.•S Đe quá trình đạt hiệu suất cao nên sử dụng thiết bị phun HPLC tự động.

CVI ■S Cột phản ứng silicat Cg từ những nhà sản xuất khác nhau sẽ cho kết quả

của 19 dẫn xuất acid amin, tuy nhiên, khu vực dốc gradient của dung môi B nên tương tựcho mỗi cột Nếu tính thêm acid S-carboxymethyl-L-cysteine và tryptophan thì 2 acid nàytách riêng biệt ừong sắc phổ riêng lẻ

CVII ■S Việc xác định mỗi đỉnh trên biểu đồ sắc phổ được thiết lập bằng việc

thêm lượng dư acid amin gấp 3 lần 0 thuốc thử nên được chạy theo từng mẻ với thuốc thửMarfey để xác định peak liên quan Thuốc thử dư sẽ gây cản trở cho việc tách riêng peakcủa arginine và glycine Lysine và tyrosine được tách riêng như những dẫn xuất không thểthay thế

CVIII B Xác định hàm lượng acid amin trong thực phẩm bằng phương pháp đảo pha trong phân tích sắc kí vói chất dẫn xuất mói butylthiocarbamyl và benzylthiocarbamyl

1 Giói thiêu:

CIX Phân tích acid amin với phương pháp phân tích sắc ký lỏng đảo pha và chiếu uvthường được sử dụng đối với những dụng cụ có độ nhạy cao và nhanh hơn nhiều so với phươngpháp phân tích acid amin bằng phương pháp trao đổi ion chuyên dụng Dần xuất acid aminphenylthiocarbanyl (PTC) được sử dụng trong phân tích acid amin bằng phương pháp RP HPLC.Đây là phương pháp tốt nhất cho phân tích những dẫn xuất acid amin bậc 2 proline và hydroxyproline Tuy nhiên, nhược điểm chính của nó là đòi hỏi 1 hệ thống hút chân không và tốn thời gian

để loại những sản phẩm phụ được sinh ra trong quá trình và loại thuốc thử dư để tránh nhiễu đối vớiđỉnh phân tích

CX Mặc dù có những tiến bộ trong việc tìm thuốc thử cho thu nhận dẫn xuất vì nhữngdẫn xuất vẫn còn khuyết điểm, các nhà khoa học vẫn càn thuốc thử với những đặc điểm: đơn giản,nhạy, ổn định, có khả năng vay hơi cho phương pháp phân tích acid amin với RP HPLC và đầu dò

uv Dần xuất sử dụng ừong phương pháp phân tích này rất đa dạng, ngoài phương pháp PTC còn cóOPA (dansyl, dabsyl, 4- nhro phenyl thiocarbonyl (NPTC)) Với những dẫn xuất OPA, những sảnphẩm acid amin bậc 2 proline, hydro proline không thể phát hiện bởi vi OPA không phản ứng vớiacid amin bậc 2 khi có mặt những tác nhân oxi hóa Hơn nữa, dẫn xuất Dansyl được hình ừong bóngtối và không bền khi thời gian phản ứng kéo dài, dưới tác dụng của dung môi, ánh sáng và bị nhiễubởi những đỉnh song vì những sản phẩm phụ trong suốt quá trình dẫn xuất hóa Dần xuất dansyl,theo báo cáo thấy rằng nó liên kết với những hợp chất hóa học để tiêu diệt vi khuẩn rất chặt chẽ.Nhược điểm của dẫn xuất này là sự vượt mức hàm lượng ure, muối photphat, NH4NO3 sẽ thay đổi

pH đệm của phản ứng và gây cản trở cho quá trình

CXI Dan xuất hóa với 4- niữo phenyl thiocarbonyl (NPITC) tạo nên sự ổn định của dẫnxuất NPITC - 1 chất rất phù họp cho phân tích RP-HPLC và đầu dò uv ở 254- 340 nm Nhược điểmcủa NPITC là sự là sự vượt mức thuốc thử không dễ bị loại bỏ dưới áp lực chân không Trongtrường hợp này người ta thường dùng dung môi là toluene để trích ly nó 1 thuốc thử dễ bay hơi hơntrong phương pháp này là BITC, nó là dẫn xuất của 22 acid amin tiêu chuẩn BTC acid amin đượcphân tích bằng RP-HPLC và đầu dò uv phát hiện ở bước song 250nm Thuốc thử này cũng rất phùhọp trong phân tích acid amin trong thực phẩm

CXII Ưu điểm của BITC: dễ bay hơi, do đó giảm thời gian phân tích (vì những sản phẩmphụ và thuốc thử dư dễ loại bỏ); khả năng tách dẫn xuất với cystine, cystein, PTC không có khảnăng này, những dẫn xuất acid amin bậc 2, proline, hydroxyproline cũng được dò thấy với độ nhạycảm rất cao Nhưng asparagines và serine thì không thấy rõ và khả năng bền của dẫn xuất BTC ởnhiệt độ phòng chỉ khoảng 8h

CXIII BZTC có dạng tương tự BTC (ngoại trừ NPITC) được thu nhận dẫn xuất từ 22 acidamin đối với BZTC thành công và những dẫn xuất này được tách ra hoàn toàn ừong pha đảo của cộtNova Thuốc thử BZITC kém bay hơi hơn so với BITC nhưng khả năng bay hơi tương tự PITC Ưuđiểm của dẫn xuất BZTC là đạt hiệu quả cao hơn trong phương pháp đảo pha so với dẫn xuất PTCtrong cùng điều kiện thí nghiệm.

2 Nguyên liẽu-Thiết bi:

CXIV 2.1 Thiết bi:

1 Máy hút chân không

2 Hệ thống phân phối dung môi Specừa-Physics 8800 cùng với hệ thống bài khí và ổnđịnh dung môi

3 Đầu dò buớc song uv Specừa 200

4 NovaPakC18

5 Thiết bị đun nóng dạng cột Eppendorf CH-30

2.2 Thuốc thử:

1 BITC, BZITC, PITC (bảo quản ở 0-5°C)

2 Bolvine serum albumin (BSA), acid amin chuẩn, norleucine Acid amin chuẩn bảoCXV quản ở nhiệt độ phòng còn BSA đuợc giữ ở 2-8°C

3 HPLC - grade acetonitrile, CH3OH, teừa hydroíuran (giữ ở nhiệt độ phòng)

4 Những thuốc thử khác

5 Mầu thực phẩm

2.3 Duns dich chuẩn:

1 Dung dịch acid amin chuẩn: Trộn hỗn họp acid amin chuẩn, ngoại trừ glutamine,cystine, cysteine, đuợc chuẩn bị ở nồng độ 2.5 pmol/mL ữong dd HC1 0.01M Dungdịch chuẩn của glutamine và cysteine đuợc chuẩn bị với nuớc

2 Chuẩn bị dung dịch đệm: gồm hỗn hợp acetonitrile-methanol-triethylamine với tỉ lệ10:5:2 chứa L-norleucine (nồng độ 2.5 pmol/mL) với vai trò nhu chất chuẩn bên ừong,đuợc bảo quản ả 0-5°C và phải chuẩn bị lại sau khoảng thời gian rất ngắn

3 Phương pháp:

CXVI 3.1 Quá trình thủy phân BSA và mẫu thưc phẩm:

1 Cho BSA (4mg) và bột đậu nành đã nghiền hoặc mẫu trứng đã đồng hóa (0,2g) lần lượtvào ống nghiệm 5ml và 25ml với nắp vặn có lỗ và màng ngăn

2 Thêm 0,5ml và 15ml HC1 6M chứa 0,1% phenol vào ống nghiệm 5ml và 25ml, theothứ tự

3 Sau khi vặn nắp chặt, đâm 2 kim tiêm bằng thép không rỉ qua màng ngăn

4 Nối 1 kim ngập ừong dung dịch với nitơ khô cung cấp, kim còn lại nối vào bơm chânkhông

5 Rút chân không bằng bơm chân không trong 5 phút, đồng thời sục khí nitơ vào

6 Tháo kim nối với bơm chân không trước khi tháo kim nối với nitơ

7 Cẩn thận tháo nắp có lỗ, thay bằng nắp không có lỗ vì những lỗ nhỏ có thể tạo thành khi

áp suất cao

8 Thủy phân ở 145°c trong 4 giờ

9 Làm khô bã BSA với nitơ ở 50°c, hòa tan vởi 5ml HC1 0,01M Mấu đã sẵn sàng choquá trìhh tạo dẫn xuất

10 Lọc bã đậu nành và trứng, sấy với thiết bị sấy thùng quay Hòa tan và điều chỉnh tới50ml HC10.01M

11 Dùng sắc ký trao đổỉ catỉon để làm sạch đung dịch thủy phân đậu nành và trứng

12 Cho 5ml dung dịch thủy phân đi qua cột trao đổi cation 100 X 13 mm (Dowex 5 X 8) với

vận tốc 6 giọt/phút để giữ lại acid amin ờ nhựa trao đổi ion.

13 Rửa cột nhiều lần với 20ml nước

14 Tách rửa acid amin trên cột trao đổi cation với 40ml dung dịch ammonia 4M, tốc độ 6

giọt/phút.