Acid amin và phương pháp phân tích

Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích Acid amin và phương pháp phân tích

MỤC LỤC I. Phân tích thực phẩm Acid amin Page 1 II. L Giới thiêu về acid amin: 1. Thành phần và cấu tao: III. Protein là polymer của các amio acid nối với nhau bằng các liên kết cộng hoá trị là liên kết peptide. Protein có thể bị thuỷ phân tạo thành các acid amin tự do bằng nhiều phuơng pháp khác nhau. Người ta đã xác định protein được cấu trúc từ 20 loại acid amin khác nhau. IV. Acid amin là chất hữu cơ mà phân tử chửa ít nhất một nhóm carboxyl (-COOH) và ít nhất một nhóm amino (NH2), trừ prolin chỉ có nhóm NH (thực chất là một acid imin). Trong phân tử acid amin đều có các nhóm COOH và NH2 gắn với carbon ở vị trí a. Hầu hết các acid amin thu nhận được khi thuỷ phân protein đều ở dạng L-a acid amin. Như vậy các protein chỉ khác nhau ở mạch nhánh, hay còn gọi là chuỗi bên (thường được ký hiệu: R). 2. Màu sắc và mùi vi: V. Các acid amin thường không màu, nhiều loại có vị ngọt kiểu đường như glycine, alanine, valine, serine histidine, triptophan; một số loại có vị đắng như isoleucine, arginine hoặc không có vị như leucine. Bột ngọt hay còn gọi là mì chính là muối của natri với acid glutamic (monosodium glutamate). 3. Tính tan: VI. Các acid amin thường dễ tan trong nước, khó tan trong alcohol và ether (trừ proline và hydrogenxyproline). Chúng cũng dễ hoà tan ừong acid và kiềm loãng (trừ tyrosine). 4. Tính quang hoc: VII. Các acid amin trong phân tử protein đều có ít nhất một carbon bất đối (trừ glycine) vì thế nó đều có biểu hiện hoạt tính quang học, nghĩa là có thể lảm quay mặt phang của ánh sáng phân cực sang phải hoặc sang ừái. Quay phải được ký hiệu bằng dấu (+), quay ừái được ký hiệu bằng dấu (-). Góc quay đặc hiệu của acid amin phụ thuộc vào pH của môi trường. VIII. Tuỳ theo sự sắp xếp ừong cấu trúc phân tử của các nhóm liên kết với carbon bất đối mà các acid amin có cấu trúc dạng D hay L (hình 1) gọi là đồng phân lập thể. số đồng phân lập thể được tính theo 2 (n là số carbon bất đối) Phân tích thực phẩm Acid amin Page 2 IX. X. XI. Hình 1: Đồng phân lập thể của aỉanine XII. Hầu hết các acid amin khác hấp thụ tia cực tím ở bước sóng (X) khoảng từ 220 -280 XIII. -3 XIV. nm. Đặc biệt cùng nồng độ 10 M, trong bước sóng khoảng 280 nm tryptophan hấp thụ ánh sáng cực tím mạnh nhất, gấp 4 lần khả năng hấp thụ của tyrosine (hình 2.8) và phenylalanine là yếu nhất. Phần lớn các protein đều chứa tyrosine nên người ta sử dụng tính chất này để định lượng protein. 5. Hình 2: Phổ hấp thụ ánh sáng cực tỉm của tryptophan và tyrosineTính lưỡng tính: XV. Trong phân tử acid amin có nhóm carboxyl -COOH nên cỏ khả năng nhường coo- coo- Phân tích thực phẩm Acid amin L-Al anine Page 3 D-Alanine COCr + I X HgN—ọ—H 1 CH 3 L-Alanine GOỌ" 1 X H—ộ—NH 3 1 CH 3 D-Alanine proton (H ) thể hiện tính acid, mặt khác cỏ nhỏm amỉn-NH2 nên cỏ khả năng nhận proton nên thể hiện tính base. Vì vậy acid amin có tính chất lưỡng tính, XVI. Trong môi trường acid, acid amin ở dạng catìon (tích điện dương), nếu tăng dần pH acid amin lần lượt nhường proton thứ nhất chuyển qua dạng lưỡng cực (trung hoà về điện), và tiếp tục tăng pH acid amin sẽ nhường proton thứ hai chuyển thành dang anion (tích điện âm). Vỉ vậy đôi khỉ người ta coi nỗ như một di-acỉd. II, Thu nhản acid amin: XVII. A. Tinh sach protein trước khi thu nhân acid amin: 1. Giởi thiêu: XVIII. Phân tích acid amin của proteỉn là một trong những phương pháp tốt nhất và chính xác nhất đề định lượng protein. Sự cần thiết của việc thu nhận mẫu ở nồng độ cao và không bị nhiễm là một vấn đề cần giải quyết để xác định cấu tạo protein. Nhiều phương pháp hiện có để loại bỏ chất đệm, muối ra khỏi proteỉn như phương pháp kết tủa hoặc sẳc ký lỏng cao áp đảo pha (RP- HPLC) gây thất thoát proteỉn nhiều, làm việc đánh giá nồng độ thực ừở nên khỏ khăn. Sau đây là hai phương pháp thường dùng để thu hồi protein từ chất đệm: phương pháp lọc gel, cột vi xoáy tốc độ cao, và sự hấp thu vào màng poly vinylidene diíluoride (PVDF) trong hộp chuẩn bị mẫu ProSorb. 2. Nguyên liêu: XIX. 2,1 Thiết bi: 1. Cột vi xoáy tốc độ cao (Việc lựa chọn kích cỡ thích hợp của cột vi xoáy quan trọng cho thể tích mẫu. MỈU thể tích càng nhỏ thì nên chọn cột nhỏ) 2. Hộp chuẩn bị mẫu ProSorb. 3. Màng vận chuyển Immobilon-PSQ. 4. Ống thủy phân mẫu (toàn bộ vật dụng thủy tinh dùng cho thủy phân nên được lảm sạch kỹ và đun đến 500°C) 5. Lọ phản ứng. 2.2 Chất phản ứns: 1. Nước HPLC (luôn dùng chất phản ứng và nước có chất lượng tốt nhất) 2. Triíluoroacetic acid (TFA) 3. Methanol 4. Acid clohữic (HC1) 5. Phenol Cụ thể: 1. 20% methanol, 0.1 N HC1 2. 6N HC1 + 0.1% phenol Phân tích thực phẩm Acid amin Page 4 3. 0.1% TFA 3. Phương pháp: 3.1 Chuẩn bi côt macrospin (mẫu 50-150 ỊJ,L) 1. Cột macrospin cần được chuẩn bị cơ bản theo đề nghị của nhà sản xuất. Lắp cột nhẹ nhàng để thu hồi gel ở đáy cột. Hydrate hóa gel với 500 ụL nước HPLC ừong 15 phút ở nhiệt độ phòng (phần trăm mẫu thu hồi được tăng khi thời gian hydrate hóa tăng cột vi xoáy), sau đó ly tâm cột ừong 4 phút ở 2000g để làm cân bằng cột. 2. Rửa cột 3 lần với 500 pL nước để bảo đảm sự cân bằng. 3. Thấm khô phần ngoài cột để loại ẩm và đặt nó vào một ống mới. Đối với cột macrospin, thêm 50-150 ịiL mẫu vào đỉnh, cẩn thận đặt mẫu vào giữa cột. 4. Ly tâm ống 4 phút ở 2000g, rửa cột với ít nhất 200 JJ,L nước. 5. Lấy mẫu đã tinh sạch ra và r ủ t chân không ở tốc độ cao đến khô trước khi thủy phân. (Khi mẫu chứa nồng độ protein hoặc peptide cao với thể tích thích hợp, không cần tinh sạch mẫu thêm, chỉ cần pha loãng mẫu với nước HPLC đến một dung dịch muối không ảnh hưởng đến quá trình phân tích.) 3.2 Cột vi xoáy (mẫu 5-25 pL) 1. Giống như đối với cột macro, rút gel khô đến đáy thùng. Làm ướt với 50 pL nước và ly tâm 3 phút, ở lOOOg để cân bằng cột. Đe có kết quả tốt nhất, rửa cột 3 lần với 200pL nước. Đe ly tâm những cột này, đặt chúng trực tiếp vào một máy ly tâm vi mô hoặc dùng một ống ly tâm rỗng 1.7 mL. 2. Sau khi cột đã cân bằng, thấm khô để loại bỏ ẩm bám bên ngoài cột. 3. Thêm 5-25 pL mẫu vào đỉnh cột, cẩn thận đặt mẫu vào giữa cột. 4. Đặt cột vào một ống mới, xoay ống 3 phút ở lOOOg. Sau khi ly tâm, mẫu đã tinh sạch ở trong ống và sẵn sàng để sử dụng. 3.3 Chuẩn bi hôV mẫu ProSorb 1. Đảm bảo rằng mẫu đựng trong dung dịch 0.1% TFA để đạt kết quả tốt nhất (Acetonitrile (ACN) với nồng độ hơn 15% cản trở mẫu dính vào PVDF, vì vậy những phần của HPLC nên pha loãng với nuớc cất hoặc 0,1% TFA để giảm nồng độ của ACN xuống nhỏ hơn 15%). Nếu thể tích ít hơn 100 JJ,L, pha loãng mẫu thành 100 JJ,L với 0.1% TFA. Nếu mẫu có chất tẩy, pha loãng để nồng độ chất tẩy thấp hơn giá trị trong bảng 1 vì chất tẩy có thể ảnh hưởng sâu sắc đến sự kết dính protein vào màng PVDF. Bảng 1 tóm tắt nồng độ của chất tẩy có thể chứa ương mẫu trước khi kết dính vào màng. Ngoài ra, nếu mẫu chứa lượng chất tẩy lớn hơn lượng tối đa ừong bảng 1, có thể thêm một lượng nhỏ methanol vào mẫu trước khi cho mẫu vào hộp mẫu ProSorb) XX. Bảng 1: Hàm lượng chất tẩy tối đa XXI. Chất tẩy XXII. Nồng độ tối đa (v/v hoặc w/v) XXIII. TritonX- 100 XXIV. 0.01 XXV. Tween-20 XXVI. 0.01 XXVII. SDS XXVIII. 0.02 XXIX. Octyl glucoside XXX. 0.25 XXXI. Brii 35 XXXII. 0.02 XXXIII. 2. Đặt thiết bị ProSorb vào một giá ống nghiệm thích hợp. 3. Làm ướt màng PVDF trong hồ nhỏ với 10 pL methanol (hộp mẫu ProSoib nên được chuẩn bị kỳ như chỉ dẫn của nhà sản xuất, dùng nước MilliQ cho mọi bước lảm sạch để giảm lượng acid amin còn sót lại.) 4. Cho mẫu vào hồ nhỏ (100 đến 400 ịiL thể tích), để cho mẫu chảy qua màng. (Thao tác với Phân tích thực phẩm Acid amin Page 5 I. mẫu nên cẩn thận vì protein và peptide có thể dính vào ống thủy tinh hoặc nhựa. Neu mẫu nhỏ, có thể giảm thiểu tổn thất ở cartridge bằng cách cho 100 ịiL dung dịch đệm vào màng ướt trước khi cho mẫu vào. Mầu có thể thêm trực tiếp vào dung dịch đệm.) 5. Đảm bảo rằng mẫu hồ nhỏ tiếp xúc hoàn toàn với chất hấp thụ và sự chuyển chất lỏng bắt đầu. 6. Thêm những mẫu thử thể tích nhỏ, nếu cần (đổi chất hấp thụ sau mỗi 750 JJ,L) 7. Rửa màng với 100 JJ,L 0.1 % TFA 2 lần. 8. Lấy mẫu và làm khô màng PVDF. 3.4 Thu nhân mẫu đã thủy phân trên màns PVDF 1. Đặt màng PVDF vào đáy của ống thủy phân. 2. Thủy phân như bình thường. Sau khi acid đã được làm khô từ mẫu thủy phân, thêm 10 pg methanol. Chiết 2 lần với 50 ịiL dung dịch gồm 20% MeOH, 0,1N HC1 và chuyển đến ống Eppendorf 0,5mL. 3. Đặt ống Eppendorf vào thùng PICOTAG và làm khô nó. 4. Pha loãng với dung dịch đệm loãng và lọc, dùng một cột vi xoáy. Mầu đã sẵn sàng đề phân tích acid amin. XXXIV. B. Thu nhân acid amin bằng thủy phân p ro tem: 1. Thủy phân bằns acid: XXXV.Đe thu nhận acid amin, phưong pháp thường được dùng nhất là thủy phân bằng dung dịch HC1 6N dư ở nhiệt độ 100-120°c trong 24 giờ. Sản phẩm thu được chủ yếu là các acid amin dưới dạng tự do dưới dạng hydrogenclorate. Một số acid amin như serine và threonine bị phá hủy một phần, tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, glutamine và asparagines bị phân hủy thành acid glutamic, acid aspartic và NFLt + . 2. Thủy phân bằng kiểm: XXXVI. Người ta còn có thể thu nhận acid amin bằng phương pháp thủy phân với dung dịch NaOH, bằng cách đun nóng ừong nhiều giờ. Sản phẩm thu được hầu hết là các acid amin nhưng đều bị racemic hóa, các acid amin cysteine, serine, threonine bị phá hủy nhưng tryptophan không bị phá hủy. Vì vậy, phương pháp thủy phân bằng kiềm thường chỉ dùng để xác định tryptophan. 3. Thủy phân bằne enzvme: XXXVII. Để thu nhận chế phẩm acid amin, ngày nay việc thủy phân bằng enzyme được ứng dụng rộng rãi ừong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau do việc sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm. XXXVIII. Các enzyme thủy phân protein thành các acid amin hay các peptide có phân tử lượng thấp được gọi chung là peptidhydrogenlase. Có nhiều loại peptidhydrogenlase, chúng được phân biệt nhờ tính đặc hiệu khác nhau với liên kết peptid. Một số loại cắt đứt liên kết peptide ở đầu tận cùng của chuỗi polypeptide được gọi là exopeptidase như carboxypeptidase phân giải liên kết peptide đầu c tận cùng, aminopeptidase phân giải liên kết peptide đầu N tận cùng. Một số khác chỉ cắt đứt ở giữa chuỗi polypeptide được gọi là các endopeptidase như pepsin, tripsin XXXIX. III. Đinh lương acid amin bằng phương pháp sắc kv: XL. Người ta có thể dùng nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, ở đây chỉ giới thiệu nguyên tắc của một số phương pháp thông dụng để phân tích acid amin. XLI. II Sắc ký giấy XLII. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân bố giữa hai pha dung môi: dung môi cố định và dung môi di động. Dung môi cố định thường là nước giữ ở giấy sắc ký (ương điều kiện bảo hoà hơi nước, giấy có thể giữ 15-22% nước tính theo trọng lượng giấy). Dung môi di động thường là một dung môi hữu cơ bảo hoà nước di chuyển ừên tờ giấy theo mao dẫn kéo theo các chất trong dung dịch. Tốc độ di chuyển của từng chất không giống nhau và mỗi chất được đặc trưng bởi một trị số nhất định gọi là Rf. Phân tích thực phẩm Acid amin Page 6 XLIII. Trong đó: - a là khoảng cách chuyển dịch của chất phân tích - b là khoảng cách chuyển dịch của dung môi XLIV. Có ĩủiiều kiểu sắc ký giấy khác nhau, đó là sắc ký một chiều đi lên, sắc ký một chiều đi xuống, sắc ký vòng nằm ngang và sắc ký hai chiều. Loại giấy thuờng dùng là Whatman số 1 và Schleicher-Schull 2044 a và b, dung môi gồm các chất nhu 4 Butanol: 1 Acetic acid: 5 Nước (dùng cho chiều thư nhất); 3 Phenol: 1 Nước (dùng cho chiều thứ hai). 2) Sắc ký lớp mỏng XLV. Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên lý thuyết của sắc ký giấy, nghĩa là cũng dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: chất hấp phụ được tráng rộng trên một phiến kính tạo thành một lớp mỏng và pha di động là dung môi thích hợp. Dung môi di chuyển lảm dịch chuyển các chất trong mẫu thử. Các chất hấp phụ thường dùng là silicagel, alumin oxyt, sephadex ,v.v được kết hợp với thạch cao (gypse) để dán vào phiến kính 3) Sắc ký khí XLVI. Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng tính chất khó bay hơi của các acid amin nên có thể sử dụng chương trình nhiệt để chuyển chúng thành các dẫn xuất (thường là N-acetyl-amin). Cho tác dụng acid amin với cồn amylic và HBr khan, sau đó cho tác dụng hỗn hợp này với anhydrid acetic. Cột thường dùng là loại Chromosorb w (60-80 mesh) có một lớp polyetylenglycol 1% (carbơvvax 1564 hoặc 6000). Chương trình nhiệt giữa 125 c và 155 c, tốc độ chảy 60-240 mL/phút. XLVII. IV. Mồt vài nhưotip oháo cu thế XLVIII. A. Phân tích acid amin bằng phưong pháp sắc ký lỏng cao áp sau phản ứng tạo dẫn xuất vói l-íluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (thuốc thử Maríey) 1. Giói thiêu XLIX. Việc tạo dẫn xuất của acid amin kèm theo việc phân tích sắc ký lỏng cao áp có đảo pha (RP-HPLC) được xem là phương pháp thích hợp nhất để phân tích acid amin. Các bước tạo dẫn xuất không chỉ cần thiết cho sự tương tác vói pha không phân cực và ổn định, mà còn cần cho việc đo quang. L. Thuốc thử Marfey l-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide hoặc (S)-2-[(5- fluoro-2,4-dinitrophenyl)-amino]propanamide được sử dụng để tách và xác định cấu hình acid amin. Thuốc thử phản ứng hóa học với nhóm amino của đối hình acid amin để tạo ra dẫn xuất ổn định mà có thể tách bằng phương pháp RP-HPLC (hình 1). Dinitronphenyl alanine amid hấp thu mạnh bước sóng 340 nm (£ = 30000 M" 1 cm" 1 ), điều này cho phép đầu dò xác định được ở phạm vi subnmol. LI. Việc tạo dẫn xuất với thuốc thừ Martey cũng được dùng để định lượng 19 L-acid amin thường gặp. Ưu điểm của thuốc thử Maríèy là: 1. Có khả năng tạo sắc phổ trên bất kỳ thiết bị phân tích HPLC nào mà không cần phải tăng nhiệt độ cột phản ứng. 2. Những dung môi không tinh khiết khác khó dò được bước sóng 340 nm. 3. Phát hiện cả sự có mặt của proline khi chạy cột sắc ký đơn. 4. Tạo dẫn xuất acid amin ổn định. LII. Kỹ thuật đo đơn giản này đem lại cho những nhà phân tích acid amin một phương pháp hiệu quả và Tẻ tiền. Việc tạo dẫn xuất với thuốc thử Marfey còn có những ứng dụng trong các lĩnh vực hóa sinh, trong đó có việc xác định cơ chất và sản phẩm trong những phản ứng enzyme cùa acid amin. LIII. Hình 3: Phân tích thực phẩm Acid amin Page 7 Thuốc thử Marfey Ợ) và L,L- dẫn xuất từ L-acìd amin và thuốc thử LIV. (I I) 2. Nguyên liêu-Thiết biĩ 2.1 Thủy phân urotein • Ống nghiệm bằng thủy tinh chịu nhiệt kích thước 25-50 x 5 mm • Ống nghiệm thủy tinh có nắp khoen siết chặt • Dung dịch HC16N 2.2 Phản ứne thu nhân dẫn xuất • dd acid amin chuẩn • Bộ kit thử L-acid amin chuẩn LAA21 • Thuốc thử Marfey. Lưu ý: thuốc thử Maríey là dẫn xuất của l-fluoro-2,4- trinitrobenzene, chất nghi ngờ là có khả năng gây ung thư nên càn thận trọng khi sử dụng. • HPLC grade triethylamine, methanol, acetone và dimethyl sultbxide (DMSO) 2.3 Phân tích sắc kỷ: • Hệ thống vận chuyển dung môi: bất kỳ thiết bị phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp nào cũng có thể sử dụng để thu nhận dẫn xuất của acid amin. • Cột sắc ký: cột silicat Cg chuyển đổi pha, ví dụ nhu: LiChrospher 100 RP 8 (250 X 4.6 mm; 5 pm from Macherey-Nagel), Aquapore RP 300 (220 X 4.6 mm; 7 pm from Perkũi-Elmer), Nucleosil 100-C8 (250 X 4.6 mm; 5 pm from Macherey- Nagel), or Vydac C8 (250 X 4.6 mm; 5 pm from The Separations group). • Đầu dò UV/vis kèm theo ô chửa chất lỏng dài 0.5-1 cm, thể tích 3-5 JJ,L. Dần xuất của acid amin đuợc phát hiện ở 340 nm. • Tổng họp peak: các phàn mềm máy tính được dùng để tổng hợp và định lượng peak của acid amin • Dung môi: phải được chuẩn bị với HPLC grade và phải được loại khí •S Dung môi A: 13 mM triíluoroacetic acid (TFA) cùng với 4% (v/v) LV. tetrahydroíìưan ữong nước. LVI. ■S Dung môi B: Acetoniừile (50% v/v) trong dung môi A. 3. Phương pháp: 3.1 Thủy phân protein: LVII. ■S Lấy vào lọ thủy tinh nhỏ 50-500 pmol mẫu protein hoặc 20 pL dung dịch acid amin chuẩn chứa 2.5 pmol/mL mỗi 17 acid amin, sau đó lảm khô dưới áp suất nhẹ ừong thiết bị cô đặc SpeedVac. LVIII. •S Đặt những lọ thủy tinh mẫu ừên vào lọ thủy tinh có nút khoen chặt chứa 200 pL dung dịch HC16N. LIX. ■S Sục khí argon vào những lọ trên trong 5-15 phút rồi đậy nắp kín và không cho không khí lọt vào. LX. ■S ủ những lọ thủy tinh ở 110°c trong 24 giờ hoặc 150°c ừong 2 giờ ừong tủ ấm khô. LXI. ■S Chờ một thời gian cho quá trình thủy phân xảy ra xong, lấy những lọ thủy tinh khỏi tủ ấm, lảm nguội về nhiệt độ phòng và mở nắp từ từ. LXII. ■S Lấy lọ thủy tinh nhỏ ở trong ra, lau khô bề mặt ngoài bằng giấy mềm rồi lảm khô ở áp suất nhỏ. Phân tích thực phẩm Acid amin Page 8 3.2 Phản ứng thu nhân dẫn xuất: LXIII. ■S Thêm 50 pL hỗn họp theo tỉ lệ triethylamine : methanol: nước = 1 : 1 : 2 vào lọ đã làm khô rồi ừộn vortex thật đều, sau đó đem làm khô. LXIV. ■S Chuẩn bị dung dịch thuốc thử cho phản ứng tạo dẫn xuất (18.4mM) bằng cách cho 5 mg thuốc thử Marfey vào 1 mL dung dịch acetone. LXV. ■S Cho hỗn hợp acid amin đã làm khô hoặc mẫu protein đã thủy phân vào 100 pL triethylamine 25% v/v, rồi thêm vào 100 pL dung dịch thuốc thử Marfey và trộn vortex thật đều. LXVI. s ủ lọ thủy tinh đó ở 40°c trong 60 phút trong điều kiện khuấy trộn nhẹ và tránh ánh sáng để phản ứng tạo dẫn xuất xảy ra. LXVII. ■S Sau khi ủ, thêm vào hỗn hợp 20 pL dung dịch HC1 2N. Khi này phản ứng kết thúc. Làm khô hỗn họp dưới áp suất nhỏ. LXVIII. ■S Bảo quản hỗn họp ở -20°c trong bóng tối cho đến khi sử dụng. LXIX. ■S Thêm vào mẫu đã lảm khô lmL dung dịch dimethyl sulíòxide (DMSO) 50% LXX.v/v. 3.3 Phân tích sắc ký: LXXI. ■S Thêm dung môi A và dung môi B vào hệ thống phân tích sắc ký lỏng cao áp theo hướng dẫn của nhà sản xuất. LXXII. ■S Cân bằng cột chạy sắc ký và đầu dò với 90% dung môi A và 10% dung môi B. LXXIII. ■S Đem mẫu đi phân tích ở nhiệt độ phòng; nếu cần có thể pha loãng với dung môi A bằng cách thêm vào cột 20 pL (50-1000 pmol). LXXIV. ■S Rửa giải cột với hàm lượng dung môi A và B như bảng 2. việc phân tích dẫn xuất 2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide của 18 L-acid amin thường gặp và acid cysteic thu được kết quả trong 120 phút (hình 4). LXXVI. % Dung môi A LXXVII. % Dung môi B LXXVIII. 0 LXXIX. 90 LXXX. 10 LXXXI. 15 LXXXII. 90 LXXXIII. 10 LXXXIV. 15,1 LXXXV. 90 LXXXVI. 10 LXXXVII. 115 LXXXVIII. 50 LXXXIX. 50 XC. 165 XCI. 0 XCII. 100 XCIII. 170 XCIV. 0 XCV. 100 XCVI. XCVII. ■S Xác đinh những yếu tố ảnh hưởng đối với mỗi acid amin từ khu vực đỉnh của biểu đồ sắc phổ ở những hàm lượng 100, 250, 500 và 1000 pmol.s Khỉ quá trình phân tích sẳc ký kết thủc, rửa cột và bơm vào methanol đã loại khí 20% v/v để bảo quân. Trước khi sử dụng lại, làm sạch với 100% methanoỉ. Phân tích thực phẩm Acid amin Page 9 II. Bảng 2: Chương trình HPLC cho sự phân giải dẫn xuất acid amin với thuốc thử Maríiey. III. XCVIII. Hình 4: Sự tách dẫn xuất 2,4-dmịtrophenyl-5-L-alanỉne amid của L-acỉd amỉn bằng phương pháp HPLC. Thuốc thử Marfey tạo dẫn xuất từ ỉượng 20 ỊẲL hỗn hợp acid amm chuẩn. Thiết bị: cột LiChrospher ỉ 00 RP 8 (250 X 4.6 mm; 5 ịim ýrom Macherey-Nageỉ); mẫu chứa ĨOỒ pmoỉ dẫn xuất của 18 L-acid amm; dung môi A chứa 13mM acid trìfluoroacetỉc cùng tetrahydro/uran 4% v/v trong nước; dung môi B chứa acetonitriỉe 50% v/v trong dung môi A; tốc độ chảy ImL/phủt; đầu dò bước sòng 340 nm; cột rửa giải với lượng dung môi B trong dung môi A phủ họp. Dẩn xuất acid amm được biểu thị bằng những chữ cải, ví dụ acỉd cysteic được ký hiệu là CYA, còn cysteine là Cs. FFDA đặc trưng cho đinh của thuốc thử; đmh không cổ ký hiệu tượng trưng cho thuốc thử phụ cỏ liên quan, như được chỉ trong quả trình chạy sắc phổ riêng ỉẻ trong thuốc thử riêng. 4. Chú Ý: XCIX. S Đổ phân tích acỉd amỉn khỉ acỉd này đỏng vai trò là cơ chất hay sản phẩm trong phản ứng enzyme, việc tách protein từ acid nucleic là cần thiết. Thêm dung dịch acid perchloric 4M vào dịch cô đặc cuối cùng nồng độ IM và ủ trên đá trong ít nhất 15 phút. Khỉ thêm cùng một thề tích dung dịch KOH 2M ờ trạng thái lạnh, acid perchlorỉc chuyển thành muối KCỈO4. Sau khỉ ly tâm 15 phủt ở 4°c, tã thu chất nổi trên bề mặt, đem làm khô rồi sử dụng cho quá trình tạo dẫn xuất. C. ■S Việc tách hoàn toàn dung dịch HC1 ra khỏi hỗn hợp là rất quan trọng cho phản ứng giữa các acid amin và thuốc thử Marfey. CI. ■S Tỉ lệ giữa thuốc thử Marfey và tổng luợng acid amin không nên vuợt quá tỉ lệ 3:1 CII. ■S Trong suốt quá trình thu nhận dẫn xuất, màu của hỗn hợp phản ứng chuyển từ vàng sang cam rồi đỏ. CIII. ■S Trong quá trình acid hóa, màu của hỗn hợp chuyển sang vàng. CIV. •S Hỗn hợp acid amin sẽ giữ được tính chất ổn định trong hơn 1 tháng khi Phân tích thực phẩm Acid amin Page 10 [...]... lượng acid amin trong thực phẩm bằng phương pháp đảo pha trong phân tích sắc kí vói chất dẫn xuất mói butylthiocarbamyl và benzylthiocarbamyl 1 Giói thiêu: CIX Phân tích acid amin với phương pháp phân tích sắc ký lỏng đảo pha và chiếu uv thường được sử dụng đối với những dụng cụ có độ nhạy cao và nhanh hơn nhiều so với phương pháp phân tích acid amin bằng phương pháp trao đổi ion chuyên dụng Dần xuất acid. .. acid amin phenylthiocarbanyl (PTC) được sử dụng trong phân tích acid amin bằng phương pháp RP HPLC Đây là phương pháp tốt nhất cho phân tích những dẫn xuất acid amin bậc 2 proline và hydroxy proline Tuy nhiên, nhược điểm chính của nó là đòi hỏi 1 hệ thống hút chân không và tốn thời gian để loại những sản phẩm phụ được sinh ra trong quá trình và loại thuốc thử dư để tránh nhiễu đối với đỉnh phân tích. .. ổn định, có khả năng vay hơi cho phương pháp phân tích acid amin với RP HPLC và đầu dò uv Dần xuất sử dụng ừong phương pháp phân tích này rất đa dạng, ngoài phương pháp PTC còn có OPA (dansyl, dabsyl, 4- nhro phenyl thiocarbonyl (NPTC)) Với những dẫn xuất OPA, những sản phẩm acid amin bậc 2 proline, hydro proline không thể phát hiện bởi vi OPA không phản ứng với acid amin bậc 2 khi có mặt những tác... CCIX Hình 6: Phổ tia uv của hỗn hợp acid amin BZTC và acid amin PTC Dung dịch NaH 2P04 0.05 M Sự hạp thu của dung dịch ở 254 nm = 0 CCX.Hình 7: sắc phổ của các chất dẫn xuất proteỉn acid amin chuẩn khi phân tích trên cộtNova -pak (30 cmx 3.9 mm) Page 19 Phân tích thực phấm Acid amin C18.1.s = norỉeucme Lượng thêm vào là 0.625 nmoĩ CCXI (Ả) : acid amỉn BTC (B) : acid amỉn BZTC (C) : acìdamìn PTC Cyt:... và BZTC diễn ra như sau: Page 18 Phân tích thực phấm Acid amin 12 Quang phổ uv của hỗn hợp acid amin BTC vả BITC, sự hợp lại của 2 chất phản ứng được chỉ ra trong hình 5 Xmax của acid amin BTC vào khoảng 234 nm, nhưng bước sóng có tác dụng mạnh nhất vào khoảng 250 nm, nó có thể tránh được sự hấp thu phổ của các tạp chất và chất điện phân, ammonium acetate trong dung môi (16) 13 Phổ uv của hỗn hợp acid. .. chất rất phù họp cho phân tích RP-HPLC và đầu dò uv ở 254- 340 nm Nhược điểm của NPITC là sự là sự vượt mức thuốc thử không dễ bị loại bỏ dưới áp lực chân không Trong trường hợp này người ta thường dùng dung môi là toluene để trích ly nó 1 thuốc thử dễ bay hơi hơn trong phương pháp này là BITC, nó là dẫn xuất của 22 acid amin tiêu chuẩn BTC acid amin được phân tích bằng RP-HPLC và đầu dò uv phát hiện... dung dịch rửa và dung dịch tách rửa rơi vào bề mặt chất dẻo dung để trao đổi catỉon trong cột 8 Tốc độ của các giọt dung dịch rửa ữong suốt quá trình rửa không quan ữọng 9 Khi phân tích với sắc ký trao đổi ion và phương pháp chuyển hóa ninhydrin, phải làm khô dung dịch mẫu trong các máy bay hơi quay Hòa tan lại lần nữa trong chất đệm citrate Na 0.2 M (pH = 2.2) và đưa vào máy phân tích mino acid tự động.(LKB4150aỉpha,... xuất acid amin BTC, BZTC và PTC khi thủy phân đậu nành được chỉ ra trong hình 9 Trong chất dẫn xuất BTC vả PTC, chúng ta có thể phát hiện ra các dạng giống nhau của 16 acỉd amin, nhưng trong chất dẫn xuất BZTC, CCXIII cysteine và cystine thêm vào 16 acid arriin trên có thể bị phát hiện ra Chúng tôi cho rằng độ nhạy của chất dẫn xuất BZTC cao hơn BTC và PTC 19 Sắc phổ của chất dẫn xuất acid amin BTC và. .. giấy thu được từ dẫn xuất BTC, BZTC và PTC của BSA hydrosate được thể hiện ở hình 11 Mặt khác, ở bột đậu nành dẫn xuất BTC và PTC phát hiện được 17 acid amin, còn với BZTC phát hiện được 18 acid amin với sự xuất hiện củã cystine CCXXI A Page 21 Phân tích thực phấm Acid amin IX X naienilo n llme(mlní CCXXII CCXXIII Hình 11: Phổ sẳc hỷ của acid amìn cùa dịch thủy phân aỉbumỉn trong huyết thanh bò (A)... CLXXXI X 30.0 CXCIV 40.0 phút CXCIX VI Page 17 Phân tích thực phấm Acid amin CC Sau đó thực hiện một buớc rửa trong 20 phút với dung môi c để bảo vệ cột không bị hỏng Cả 2 loại tỉ lệ dung môi trên đều thích hợp cho mẫu dẫn xuất acid amin và dẫn xuất acid amin chuẩn 3.4 Đô nhay của các dẫn xuất BTC, BZTC VÀ PTC: CCI •S Độ nhạy của các chất dẫn xuất BTC, BZTC và PTC có thể phát hiện ở 0.05 aufs, đây là . nhiều so với phương pháp phân tích acid amin bằng phương pháp trao đổi ion chuyên dụng. Dần xuất acid amin phenylthiocarbanyl (PTC) được sử dụng trong phân tích acid amin bằng phương pháp RP HPLC. Đây. định, có khả năng vay hơi cho phương pháp phân tích acid amin với RP HPLC và đầu dò uv. Dần xuất sử dụng ừong phương pháp phân tích này rất đa dạng, ngoài phương pháp PTC còn có OPA (dansyl, dabsyl,. lương acid amin bằng phương pháp sắc kv: XL. Người ta có thể dùng nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, ở đây chỉ giới thiệu nguyên tắc của một số phương pháp thông dụng để phân tích acid amin. XLI.