Thu nhận trúng bò heo Để cải thiện quy trình Đông lạnh trứng trong Điều kiện việt nam

Nội dụng 2: Đông lạnh trứng bồ trưởng thành bằng phương pháp thủy tỉnh hóa trong cong raPP2 2.3.1.. Đề tài tiến hành nhằm mục tiêu thu nhận nguồn giao tử cái rứng bò và heo phục ‘vu cho

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRUONG DAL HQC SƯ PHẠM TP.ICM

BAO CAO NGHIEM THU

THU NHAN TRUNG BO, HEO DE CẢI THIỆN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TRỨNG TRONG DIEU KIEN VIET NAM

(CHU NHIEM DE TAL

‘ThS NGUYEN TH] THUONG HUY!

‘THANH PHO HO CHI MINH

‘THANG 05/2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM

BAO CAO NGHIEM THU

THU NIIAN TRUNG BO, HEO DE CẢI THIỆN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TRỨNG TRONG ĐIÊU KIỆN VIỆT NAM

'CHỦ NHIỆM ĐÈ TÀI

‘ThS NGUYÊN THỊ THƯƠNG HUYỆN

‘THANH PHO HO CHI MINH

THANG 05/2009

sơ quan

“Trương Văn Trí

+ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM

+ Viên Sinh học Nhiệt đới Tp HCM

CHUONG I TONG QUAN TALLIEU

1.1 Tình bình nghiên cứu về đông lạnh trứng,

1.1.1 Tình bình nghiên cứu ngoài nước

1-12 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam,

12 Sinh lý buồng trừng

1.21 Quá ình hình thành và phát tiễn nang trúng 1.22 Sự hình thành và phá tiến của trừng

123 Cấu tạo của trừng

1, Cơ sở hoa học của động lụnh rime

thủy ũnh hóa

1.3.3.1 Biển đối rong tế ảo động lạnh

1.3.3.2 Tính an toàn khi đông lạnh trứng trưởng thành

1-4, Ứng dụng của đồng lạnh trứng

4.1 Ở người

1.42 động vậc

'CHƯƠNG Hí NỘI DỰNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỦU

221 Nội dụng 1: Đông lạnh trứng heo trưởng thành bằng phương pháp thủy tỉnh hóa 2.1.1 Thủ nhận mẫu buồng tring

.2.1:2 Thu nhận và nuôi trửng Chuẩn bị,

2.1.3, Binh giá rừng và lựa chọn rồng chín đ đồng lạnh 21.4 Đông lạnh trứng bằng phương php thủy tinh héa trong vi git PPI) 3.15, Phương pháp giải đông các vỉ giọt được đồng lạnh

2.1.6, Bing lah trứng bằng phương pháp thủy tính hóa tong cong ra (PP2) 3.17 Đảnh gi ý ệ sống chết của trúng

23 Nội dụng 2: Đông lạnh trứng bồ trưởng thành bằng phương pháp thủy tỉnh hóa trong cong ra(PP2)

2.3.1 Thụ nhận mẫu buông trông

26.2.2 Thu nhận và môi trống,

3,33 Đông lạnh trứng theo phương pháp 2

`3, Nội dụng 3: Đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành bằng phương pháp Thủy tinh hóa

2.3.1-Thu nin budng tring

cquả nội dung 3

34 So ánh kết quả đông lạnh trứng bồ ở 2 giai đoạn bằng phương pháp hủy nh Ina tong cong ra

3.5, So sinh K&t qua déing lah ting bd v8 heo 4 trường thành bằng PP2 CHUONG 1V KET LUAN VA KIEN NGHỊ,

66 75

Bảng 2.1 Môi tường chuẩn bị th trứng

"Bảng 3,1, Kết quả thu nhận trứng heo Bing 32 uôi trừng heo

Bảng 33 Kết quả đông lạnh ũng heo bìng PPI Bảng 3.4 KẾt quả động lạnh trúng beo bằng PP2 Bảng 3.5, So sánh kết guả đồng ạnh trứng heo Bảng 36 Kế quả thú nhận trừng bò

Tình 1.1 Sự hình thành và phát tiễn nang trứng Hình 1-2 Câu trúc của buông răng và nang trứng Hình L3 TẾ bào trứng

Hình L4 Ảnh hưởng của tốc độ đông lạnh lên sự hình thành nh th đã Hình 2.1 Sơ đồ bổ t thí nghiệm nội ung 1 Hình 23: Mẫu buồng trúng heo

Tình 2.3 Thao tác chọc hút trứng từ buông trúng,

‘inh 24, Soi tìm và thủ trứng bằng hệ thông kính đảo ngược Hình 25 Sơ đồ bổ tr đĩa vi si đông lạnh Hình 26, Cách tạo ví giọt đông lạnh

Hình 27 Nhỏ re ti

Hình 28 Chuyển vì gi vào eryotube

Hình 29 Tháo tác đồ vị giạta khôi cryorube Hình 210 Sơ đồ bỗ trí đĩa vỉ giọt đông

Tình 211 Cộng rị chứa trứng

Tình? 12 Lấy cọngrạ chứa trứng ra khỏi bình nơ lòng Tình 2.13 Giải đông cọng rạ trong nước âm Tình 2.14 Cấtcọng rạ chứa trông

Hình 2.15 Chuyển trứng vào mối rường RĐ Hình 216 Sơ đồ bộ trí tị

"Hình 3.7 Trứng bồ sau khi [VM có lớp cumulus giãn nở (XI Hình 3.8 Trứng bồ sau khi [VM xuất hiện thé eye I (X400) Hình 39 Trứng sống sau giải đông (X10) Hình 3.10 Trứng c su giải đồng,

Biểu đỗ 31 Kế quá thủ nhận trông beo từ buồng trứng 4

Biểu đồ 32 KẾ quà thủ ỗi trứng heo từ đồng lạnh theo PPI 45

13 3 4 TY lệ sống, chết của tứng heo so với tổng số trừng thu hỏi được bảo quản theo

46 Biểu độ 3.5 Kết qua thu hai trứng từ đông lạnh theo PP2 49

"Biểu đỏ 3,6 Tỷ lệ sống, chết của trứng heo so với tổng số trứng thụ hồi được bảo quản theo,

Biểu đồ 37, Kế qui so ánh bảo quân rững heo (heo 2 phương phấp 50 Tiểu đỗ 3.8 Kéx qua thu nbn eng bo ct miu budng wing 32

Biểu đỗ 310 Kết uả thụ hỗi trứng bò chín au giải ôn 56 Biêu đỗ 311 Tỷ lệ trúng sông, chết so với tổng số trừng thụ hồi được bào quan theo PP2 57 Biểu đồ 312 Kếtqui th ting chu chin due bo quân theo PT 38 Biểu đồ 3.13 Tỷ lệ trứng sống, chết so với tôn số trồng thu hồi được bảo quản theo PPI 59 Biểu đỗ 314 Kết quả thu hồi rững chưa chín được bảo quản theo P2 60 Biểu đồ 3 15, Tỷ ệ trừng sống, chết so với tổn số trúng thu hồi được bảo quản theo PP2 6

Biểu đỗ 317 So sánh kết quả đồng ạnh trứng bò ở 2 gi đoạn khác nhan 6 Điệu 318 So nh kt ou dng tn ing 8 ea ng hah ng PP, 6

Fetal Calf Serum

Germinal Vesicle Giai đoạn tối

Germinal Veticle Brealadovvn _ Giai đoạn phá vỡ túi mim Intracellular lee Formation Sy inh thanh đánội bào Luteinizing hormone Hormone hosing thé hoa Metaphase I Kì giữa giảm phn I

Jn vitro Maturaration "Nuôi trường thành trong ông nghiệm

In Vio Fertilization ‘Thu tinh trong éng nghigm

Polymerase Chain Reaction

Polyethylene glycol

“Thủy tỉnh hóa trong vi giọt

“Thủy tỉnh hoa trong cọng rạ

Polyxinylpinolidone

là: "Thu nhận trừng bà, heo để cái thiện cả thiện quy trình đồng lạnh trứng rong điều kiện Việt Nam “

[Prins Panis cio AN Toe —|

sv rm triển của Công nghệ hỗ rợ sinh sản nói chung và ky thuật đông lạnh nói riêng, đã đem lại nhị ing img dung có ý nghĩa không chỉ về kinh tễ mà còn có ý nghĩa về khoa học Đề tài tiến hành nhằm mục tiêu thu nhận nguồn giao tử cái (rứng) bò và heo phục

‘vu cho quá trình bảo quản trứng bằng phương pháp thủy tỉnh hóa; đồng thời làm cơ sở cho

các nghiên cứu sâu hơn trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản

2 Nội dung chính

tội đơng 1: Buồng trông heo được thu nhận tại lò mỏ và chuyển nhanh về phòng thí ngiệm tong nước mổi nh lý, ng im tm 186 vs nh Sh oh tăng ng pong pcos hit Tring vena rụng mới trừng IYMH ø 'Ó,, hơi nước bão hòa sau trúng sang mỗi trường NẠP mô sp cho tới 42 - 44

16 Ce ng chin su hi ud được bảo an bing phone hip thy tinh bố won vi đợt + 10% EG để trong 4Š giây, tiếp theo cho vào dung dịch thủy tỉnh hóa chứa 20%: DMSO + 20% EG + IM sucrose dé trong 25 giầy, sau dé cho vio vỉ giọt hoặc cọng rạ (025ml) và nhúng trực tiếp vào ni lỏng (khoảng 25 ~ 40 giây kế từ khi trúng tiếp xúc với dung dịch bảo quân) Giải đông trừng theo 3 bước Nội dung 2: Buồng trứng bỏ được thu nhận tại lò mỗ và chuyển nhanh về phòng thí nghiệm trong nước muổi sinh lý Trứng được thu nhận bằng phương pháp chọc hút, chọn những trứng có ít nhất 3 lip cumulus cho vào nuôi trong môi trường C¿ (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG + EGF) Sau 22 - 24 giờ, chọn những

bộ sau khi được th nhận từ buồng trứng bằng phương pháp chọc hút, tiến hành bảo quản những

cong rạ Các trí au gti đồng được đánh giá sống chất bằng quan sắt hình thái dưới kính Biển vi soi nổi (hoặc kính vỉ thao tác) Tắt cả số ộu thu nhận được xử lý bằng phần mễn Excel ở độ tin cậy 955,

3 Kế quả chính đạt được

KẾt quả nội dung 1: Ba shu được 1733 trứng/8Ð buồng trứng, rung bình 21,66

“Chọn được 1189 tring 48 nuôi chín, tỷ lệ chín đạt 6542 + 0179⁄ (779 trừng)

“C6 305 trững được đông lạnh theo vi giọ, tý lệ ống đạt 46,15 + 56315; 386 trứng được đông

đông là 6541 + 3,69% 4; 365 trứng đồng ạnh bằng cọng ra, tỷ lễ trừng sống sau gấi

“Từ khóa: nuôi chín trứng, đông lạnh trúng, thủy tỉnh hóa

IMSe Pham Ven Phas IBA Do N; Herta steals HEME [University of Pedagogy HCMC

‘The development of the Assisted reproductive technology and freezing techonology thay brought many potential economical and scienti i¢ applications The goal of this study is collecting bovine and porcine oocytes which were then preserved by vitrification methods to

be materials for further studies in the field of assisted reproductive technology

2 Main contens

In the first experiment, porcine ovaries were obtained from shaughter house and transferred to the laboratory in 0.9% (w/v) saline solution The cumulus-oocyte complexes (COCs) were aspirated from 2 to 8 mm follicles with an 18-gauge needle attached to Sml syringe, Maturation culture was performed in IVMI medium under sterile mineral oil at subsequently cultured in TVM2 medium under same gas conditions for 20-22h, After 42-44h

by vitrification in microdrops or straws in two steps, () oocytes were incubated in the vitvfication solutions containing 10% DMSO + 10% EG in 45 seconds; (i) oocytes were and then were loaded into microdrops or straws (0,25ml) by mouth pipette and pipette Pasteur and the mircrodrops or straws were plunged directly into liquid nitrogen within 25 -

40 seconds after the exposure of eggs to preservation solution

In the second experiment, bovine ovaries were oblained from shaughter house and transferred to the laboratory in 0.9% (w/v) saline solution, The cumulus-oocyte complexes (COCS) were aspirated in the same way of porcine COCS Maturation culture was performed

in C3 (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG + EGF ) medium under

24h incubation, matured oocytes (with visible first body and expanded cumulus) were preserved by vitrification in straws, the last experiment, the immatures bovine oocytes were preserved by vitrification

in straws After thrawed, oocytes could be recovered after cryopreservation and were evaluated by morphological examination under a stereomicroscope (confidence level 95%) sults obtaines

In the first experiment, collected 1733 oocytes from 80 ovaries porcine, average 21.66 ocytes/ovary; 1189 oocytes were cultured, the rates of the metaphase I (MII) oocytes after vitrification in mierodrops, the rates of viability of oocytes are 46.15 # 5,63% 386 oocytes

‘were preserved by vitrification in straws, the rates of viability of oocytes are 47.54 + 0.60%

‘In the second experiment, collected 909 oocytes from 50 ovaries bovine, average 18.55 ocytes/ovary; 684 oocytes were cultured, the rates of the metaphase II (MII) oocytes after IVM are 84.92 + 0.63% (580 oocytes); 197 oocytes were preserved by vitrification in straws, the rates of viability of oocytes are 79,90 + 2.33% In the last experiment: 477 oocytes were preserved by vitrification in microdrops, the rates of viability of oocytes are 71.92 + 2.20%

365 oocytes were preserved by vitrification in straws, the rates of viability of oocytes are 65.31 #2698,

Keywords: in vitro maturation, cryopreservation, vitrification

PHAN MO DAU

1 Tính cắp thiết của đề tài

Sự phát tiễn của Công nghệ sinh sản nói chung và kỹ thuật đồng lạnh ni tiêng đã đem lạ nhiễu ễm năng ứng dụng có ý nghĩa không chỉ v kin tế mà côn có ý nghĩa về khoa học Đặc biệt, kỹ thuật đồng lạnh trứng ngoài việc ứng dụng trong điều ị vô sinh còn là nên tảng cho những nghiên cứu mới của nhân loại trong nhiều lĩnh vực: y sinh học nhằm thu nhận

tế bào gốc phí

tính nhân giống vật nuôi, bảo quan ng sen in vito, chuyển gen, sinh sản vô

6 nude ta tong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu được tiễn khai nhằm nhân nhanh đần bỏ để thực hiện "Chiến lược phát tiển chăn nuôi đến năm 2020 do Thủ tướng chính phủ để ra (16/1/2008) Tuy n

trứng không đủ để tiễn hành các thí nghiệm nu các nghiên cứu này còn gặp khó khan do ng

chín trứng, thụ tỉnh trong ống nghigm (in

ác kiếm soát khả năng nh sản ở heo mà cồn với sựgì tăng sử dụng heo trong ác ứng dụng về

công nghệ Y sinh học

sản nhằm bảo tồn các kiểu gen quý hiểm Đây lã một cuộc cách mạng không chỉ với

"Hiện nay nguồn trứng chủ yêu được bio quản bằng phương pháp đông lạnh, song tỷ

lệ trứng sống sau khi đông theo tổng kế của các chuyên gi th giới

chưa cáo (bồ 30%, người 10%) Chính điều này là làm tốn kém và hạn chế trong công việc

của nhiễu nước Một trong những tác nhân giới hạn thành công của kỹ thuật đông lạnh trứng

là xáy ra tổn thương lạnh tong suốt qu tình đồng lạnh Trứng rắtdễ tổn hương kh tiếp xúc

với nhiệt độ thấp của quả trình đông lạnh và để tránh điều này bằng cách sử dụng phương

Ppt nh hóa (Rofingvà cv, 1993; Marino và , 196)

Trên cơ sở đó, chúng tôi mạnh dạn thực hiện đẻ tài “Thư nhậm trứng bò, heo đễ cải thiện cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam"

2:Me iêu đề tài

- Thu nhận và nuôi trứng bồ, heo đến giai đoạn trưởng thành (In viưo Maturaradon_TVM)

- Thử nghiệm khả năng sống của trứng bồ, heo trưởng thành sau khi đông lạnh bằng phương pháp thủy tình hóa hư

iếp cận đề tài

+ Tiếp cận với nhu cầu đôi hỏi của xã hội và tằm quan trong của vấn để này trong cuộc sống: đồng thời các điều kiện về kiến thức, điều kiện phòng thí nghiệm cho phép ínng

‘dung Công nghệ Sinh học

+ Tiếp cận với các chuyên gia đầu ngành để học tập, trao đổi kỹ thuật, kinh nghiệm

“Tham gia lớp học về các kỹ thuật thu nhận, nuôi, đông lạnh trứng, thụ tỉnh trong ống nghiệm (Người Nhậ) và các cán bộ của viện đảm trách

+ Tra cứu các tài liệ liên quan trong và ngoài nước

+ Tiếp cận với các kỹ thuật hiện đại: hệ thống máy đông lạnh và giải đông trứng, kỹ thuật vi thao tác, PCR

.4 Phương pháp nghiên cứu

- Phường php trục quan (nghiên cửu trực tấp): thủ nhận rừng và xử lý trứng, đồng

lạnh trứng, giải đồng trừng, kiểm tra, đảnh giá ệ trừng sống sau kh rã đồng

+ Phường pháp ting hop

+ Phường pháp so sánh

5 Pham vi nghiên cứu

+ Trứng bồ từ các nguồn khác nhau: tử viện chăn mui quốc gia, lò mổ Vissam Tp, HCM

+ Trứng he từ lò mô Vissan Tp, HCM,

6 Nội dụng nghiên cứu

+ NỘI DŨNG 1 : Đông lạnh trứng heo trưởng thành bằng phương phíp thủy tnh hóa tang vỉ gio (PPL) va tong cong ra (PP2)

+ NỘI DNG 2 ; Đông lạnh trứng bò trướng thành bằng phương pháp thủy tỉnh hóa trong cong ra (PP2)

+ NỘI DNG 3 : Đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành bằng phương pháp thủy tỉnh

‘na tong vi git PPL) vat

+0 cặng tạ chứa 365 trừng bộ chưa trường thành

+ 305 tring heo di 1VM trong vi giot

+ 477 ting bd chara trang tanh trong vi got,

Kết quả đào tạo

(01 §V nghiên cứu khoa học đạt giả nhỉ cấp trường

"Đỗ Hoàng Hùng: Thứ nghiệm bảo quân trúng bồ, heo bằng phương pháp thủy tnh

vi giot (microdrop vitrification) - 2008

Kết quả bài báo, báo cáo đã công bố

01 bài đăng trong Hội nghị Khoa học, Dại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM, 200% (Bảo quản rừng bò bằng phương php thy tinh bóa rong cong ra)

+01 bai ding trong Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 2008 (Báo quản trừng bd bằng phương pháp thủy tỉnh hóa trong cọng rạ; đang chờ phần biện)

CHUONG I TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Tình hình nghiên cứu về đông lạnh trứng

1.1.1 Tình hình nghiên cửu ngoài nước

Khái niệm thủy tính hóa hay toàn bộ vật chất có trạng thi trong suốt giống thầy tính được mô tả đầu tên vào năm 1890, sau đồ được Luyet mô tả lại vào năm 1937 (Luyet, 1937) t6]

Vào nửa cưỗi thập kỹ 1940, Chang đã thực hiện những nghiên cứu đẫu tiên vẻ bảo

<a hôi thỏ ở nhiệt độ tấp [3] Đến năm 1949, Polp và ce phát hiện r glyserol cổ thẻ giữ

được sức sống của tinh trùng gia cằm khi nhiệt độ được hạ xuống -70'C [65] Phát hiện này

mở ra khả năng c thể bảo quản các loại tế bào và mô ở nhiệt độ thấp hơn, Smit (1952) đã

chỉ có 1% số phôi được bảo quản còn giữ được một phôi bào có khả năng tiếp tục phân chia

(761

6 -30°C va -50°C 06 tỉ lệ

[Nam 1976, Parkening wi cs tém hinh ding lh ting chs

sống dat 51 - 56%; 6 -75°C chi dat 18% trứng sống [60]

Mgt oat nghiện cứu ca tác giả Wiladsen (1977) 85], Transon (1977) [77], Massip (1979)l5 š cả tiến phương pháp đông lạnh và rã đông theo phương pháp giảm từng bước một, nhằm pha loãng các chất bảo quản lạnh, tăng nhanh tốc độ đông lạnh vả rã đông mà vẫn

"báo tồn sức sống của phôi, thu được kết quả tốt ở bò và chuột Những cải tiến này cũng hạn lạnh và rã đông theo phương pháp một bước (one - step method) do Leibo (1980) đề xuất đã

thực sự thúc đẫy việc sử dụng phôi cũng như tỉnh trừng đông lạnh rộng rấ trong sản xut Hiệu quả cho thấy khi sử dụng tỉnh đông lạnh thì sức sống của phôi đạt trên 80% và tỉ lệ thự thai đạt 50 = 60% [40]

"Đến năm 1985, Rall và Fahy đã công bổ phương pháp đông lạnh cực nhanh còn gọi là phương pháp thủy tỉnh hóa, bằng cách nhúng trực tiếp phôi chuột 8 tẾ bảo vào nitơ lỏng từ trữ lạnh phôi gia súc (bỏ) [66]- Phương pháp này không yêu cầu những dụng cụ làm lạnh đắt dom gian hơn phương pháp đồng lạnh thông thường Tờ đó, phương pháp thủy tỉnh hóa được châm

“Mặc dù, phương pháp đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tỉnh hóa được Rall va Fahy thực hiện thành công đầu tiên trên phôi bò vào năm 1985 [66] Tuy nhiên, quy trình này chỉ được Kuleshova vit Lopata ting dụng đầu tên trên trứng người vảo năm 1999 [37] và sau đỏ vài thắng, quy trình này cũng được thực hiện đầu tiên trên phôi người đang phát triển ở giai đoạn bằng kỹ thuật thủy tỉnh hóa ra đời [90]

Kỹ thuật đông lạnh bằng phương pháp thủy tỉnh hóa ấp dụng thành công trên trứng bd (Martino và es,1996) |S1] Trên chuột, tỷ lệ hình thái trúng sống sau quy trình đông lạnh và

xã đông bằng phương php thay tinh hoa 1a 885% (Nakagata, 1989) [55]; 80% (Shaw, 1991)

‘vi ã đồng là 85% (Ot0i,1998) [58]; 87% (Asada, 2002) [12]; 88% (Men, 2002) [53]; đặc biệt lạnh là 155 ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% dimethyl sulphoside (DMSO), vi dat 989%

"hi đăng 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% propylene glycol (PG) [17] Vio nam 2005, Fujihia thực hiện quy trình đông lạnh và rã đông trimg heo bing phương pháp thủy tình hóa sử dụng Cryotop, với nding độ EG trong

“dung dịch thủy tỉnh hóa là 30%, thu được tỷ lệ sống sau rã đông là 54 - 56% [24] Trong năm

ny Martins R.D vi es đã đông lạnh trứng bồ chư chín bằng phương pháp thủy tinh hoa, sir

74,6% [S0] Năm 2006, Cetin Yunus và Bastan Ayhan đã bảo quản trừng bò chưa trưởng

thành bằng phương pháp thủy ũnh hóa với các chất ảo quản khác nhau, ý lệ sống trên 205:

so với nhóm đối chứng 1a 79,6% (18)

Somfai và cộng sự (2006) khảo sát ảnh hưởng của Cytochalasin B trên quá trình thủy

tỉnh hóa trứng heo sử dụng phương pháp thủy nh hồa rên bễ mặt kim loại Họ sử dụng quy dịch thủy tính hó cuỗi cùng EƠ 35 với 5% PVP va tebalose 03M) 75]

Gaupta và cộng sự (2007) sử dụng quy trình thủy tỉnh hóa tương tự với quy trình trên

“Trong thử nghiệm sử dụng trứng giai đoạn túi mảm, kết quả được cải thiện khi kết hợp sử

dạng EG va DMSO, vì vậy họ sử dạng kết hợp 2 chất này tên đồi tượng trúng MIL Tuy đến bla<ocystsovới lồ đối chứng là20 1%) [38]

XMordó và có (2008) đồ bảo quản trúng bồ trưởng thành bằng phương pháp thy tinh

hóa bằng cọng rạ và cryoloop cho tỷ lệ trứng sống sau giải đông tương ứng là 88,4% và 94,5% [54]

112 Tình hình nghiên cửu ở Vit Nam

6 Vigt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bồ đã được tiến bình vào năm 1981 Phương

pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 12°C/phút) sau khi khử nước cục bộ ở nhiệt độ phòng

trên phôi bỏ đã thành công với 63.4% (39/59) phôi phát iển trong ông nghiệm sau 4§ giờ và 333% 0/20) B)

Năm 1990, con bê Charolais đầu tiền được sinh ra tử phôi đông lạnh nhập khẩu [2]

"Năm 2003, Lưu Công Khánh và cs đã bảo cáo thành công việc nghiên cứu ứng dụng phối bỏ đông lạnh bằng glyeero [5]

~ Ngây 24/05/2004, trường hợp em bể đầu tiên của Việt Nam ra đời từ trứng trữ lạnh tại bệnh viện Từ Dũ [90]

= 2008, Nguyễn Thị Thương HuyỄn và cs đã bảo quản thành công trúng bò bing phương pháp thủy tỉnh hóa trong cọng ra với tỷ lệ trứng sống so với tổng số trứng đem đông lạnh sau giải đông $8,83% [4],

- Hiện nay các nhà khoa học đăng nghiền cứu về việc bảo quản trứng ở động vật hữu nhũ, nhằm mục đích tạo ngân hàng bảo quản giao tử cái (ưứng) để phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn: IVE, ICSI,clonins, chuyển gen, thu nhận tế bào gốc phối 1.2 Sinh lý buồng trứng 12.1 Quá trình hình thành và phát tin nang trứng

Tình thành nang trứng là quá tình tiếp nỗi của các gai đoạn từ nang nguyên thủy phat win thành nang sơcắp và sau đồ thành nang thứ ấp, các nang này sẽ phát triển, tích lũy chín (Hình 11) Và quá mình phát iển này ở gia sú từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn trước rụng trứng mắt khoảng 180 này (Lusie và ca, 1957) 5]

Từ giải đoạn nguyên thủy đến giải đoạn ền rụng trứng đường kính nang trứng bồ Lăng 30 đến 400 lần (ừ S0 um lên 1S đến 20mm) Trong quá tình này trứng hình thành màng hát tiễn phối Sau khí ụng nang trừng sẽ ình thành thể vàng

“Số lượng nang trúng dự trữ trong buồng trúng ở các loài có sự khác nhau và thoái hóa clin trong quá trình phát triển của cá thể, càng lớn thì số nang trứng có hiệu quả căng íL Ở bò,

bề con lúc mới sinh ra có hơn 100000 nang trúng và số lượng này giảm dẫn theo độ tuổi

SU PUAT THIEN NANG NOKN

Sự di chuyển của các tế bào mằm vào cơ quan sinh dục- Sự gia tăng sổ lượng tế bio mim bằng nguyễn phân; Sự giảm vật liệu di truyền bằng giảm phân, Sự trưởng thành về cấu trúc

và chức năng của trứng Trong quá trình giảm phân của trứng có 2 giai đoạn trứng ở tạng thai ngừng tăng trưởng (block):

+ Giai đoạn trứng ở trạng thái ngũng tăng trường lẫn thứ nhất khi trứng bước vào giai đoạn prophase của giảm phân I, cho ra trừng sơ cấp ở giai đoạn túi mắm (Geminal Vesele GV) Các trứng sẽ vượt qua giải đoạn này khi có sự xuất hiện của đỉnh LH (LMeinizing hormone) tức khí cá thể đến tuổi trưởng thành sinh dục + Giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng tưởng lần thử hai: khí ở giai đoạn metaphase-M của giảm phân II (MU), cho ra trứng thứ cấp ở giai đoạn MU Trứng chỉ vược cqua được giải đoạn MU khi có sự thụ tỉnh của tỉnh trùng

Hình 13 Cấu mú củ

“Sự trường thành của trứng bao gồm nhàng biến đổi ở mức ế bảo để hỗ rợ cho sự thụ

nh và thời kỳ đầu của sự phát tiễn phôi tai (Simmd và co, 1989) [73L Sự trưởng thành tring bao gdm:

-# Sự trưởng thành về nhân

Qui trình trường thành trong nhân trải qua các giai đoạn: giai đoạn phá vỡ túi mắm, (Germinal Vesicle Breakdown GVBD), cô đặc nhiễm sắc thể, hình thành thoi vô sắc, phân các nang trưởng thành đạt kích thước từ 2 3mm, một số trứng có khả năng xảy ra hiện tượng

1986 |25]) Và khi trứng đạt đến giai đoạn metaphase IÍ sẽ đạt đường kính là 110m, Điều

tối ưu) không thể tiếp tục hay hoàn tắt quá trình giảm phân và sẽ không có khả năng trưởng

thành nhân Do đó, đây là cơ sở cho việc chọn nang để thu trúng cho việc nuối trưởng thành

in vitro nhấm đạt kết quả cao nhất

-# Sự trường thành về tế bào chất

“Sự trường thành của tế bào chất bao gồm sự thay đổi toàn diện cấu trúc để trứng tiến

từ giai đoạn túi mảm đến giai dogn metaphase I (Shamsuddin va ¢s., 1993) [70] Trong quá

trình này, các bảo quan được tổ chức lại chuẩn bị cho quá trình thụ tỉnh và tổng hợp protein

có kích thước nhỏ hơn 100mm, tỉ thể có dang cầu và định vị tại trung tâm trứng Nhưng khi

trứng có đường kính 100mm, t thể có hình trúng và đi chuyển ra xa vị tí trung tâm, chúng

có dạng hình túi và nằm tại vùng ngoại vi của trứng khi tế bảo đạt đến kích thước 100mm

“Các ti thể di chuyển đọc theo các vi ống được hình thành trong tế bào chất Tương tự, các túi mẫm sẽ di chuyển ra phía màng trong suốt khi trứng phát triển với kích thước hon 110mm, 'Bộ Golgi chịu trách nhiệm hình thành các thể hạt vỏ của màng ong suốt Và số lượng Golgi

vỏ trong suỗt quá tình trưởng thành của tế bào chất Cùng với sự thay dai vị tr, sự thay đổi cấu túc hạt vỏ là hai yếu tổ có ý nghĩa đặc biệt đổi với sự thự tỉnh của trúng Các thể hạt võ

trong suét thay đổi cấu trúc, tăng kích thước nội bộ và hạn chế sự thụ tỉnh đa tỉnh tring

“của trứng khí thụ tính, phân chía tế bào và phát triển đến giai đoạn phôi nang 3 Cau tao cia trimg inh L Tế bào trứng

Xung quanh trứng là lớp tễ bào cumolus (granulose cel) kết hợp một cách chuyên biệt với trứng, giữa chúng có khe nồi giúp đuy tr quá trình trao đổi chất của trứng Các lớp tế

bo cumulus nay vừa bảo vệ trứng, vừa cung cắp chất định đưỡng nuôi trứng Đặc biệt là khi trừng rụng, trúng không còn nguồn cung cắp chất dinh dưỡng nào khác ngoài ế bào hạt Tiếp vai tò

«quan trong trong thụ tỉnh Giữa màng trong suốt và màng tế bào chính là khoảng ˆkhông quanh noãn Trong màng tế bào chất là bảo tương và nhân chứa bộ nhiễm sắc thé don bội của loài Trứng chín là trứng đang ở giai đoạn metaphase Il v6i thé eye thứ nhất (Hình 1 3)

Mint 13 TE bao ting

1-3, Cơ sở khoa học của đông lạnh trứng

1.31 Các phương pháp đồng lạnh

Đông lạnh trừng à sự bảo quân thành công chức năng bình thưởng của ứng khỉ giảm nhiệt độ dưi mức phân ứng hóa học bình thưởng xây ra 37C, 5:CO; (điễu kiện

sinh lý) xuống - 196'€ (nhiệt độ không sinh lý))

Đông lạnh trứng có thể phân loại theo bai cách chung là đông lạnh cân bằng tequiibdum" với phương pháp đồng lạnh chậm (slow fte ving) hay đông lạnh không cân

‘bing “nonequilibrium” vi phuong phip déng lạnh nhanh (rapid freezing) và phương pháp

thủy tỉnh hóa (viuiÑeaion), ty theo tốc độ làm lạnh và chất bảo guản đông lanh sử dụng

“Tuy nhin, bản chất của các phương pháp này à giỗng nhau, cụ th là đều có mục đích chung

mẽ nồng độ chất tan ở cả nhiệt độcao và nhiệt độ thấp

-# Phương pháp thủy tỉnh hóa (Vitriicaion)

“hủy tỉnh hóa là quá tình lầm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thôi gian rắt nhanh

“Trong suỗt quá tình hạ nhiệt độ, toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài ế bào chuyển thành tỉnh thể đã bên rong mẫu tế bào, cũng như mỗi trường bên ngoài rong quá tình lầm lạnh [50,5]

Phương pháp này loại trừ hạn chế của quả trình đông lạnh chậm là cn thiết bị phức tạp Một thuận lợi nữa của phương pháp này là khả năng sống của tể bào cao nễu điều kiến tối wu đo không có ỉnh thể đá ngoại bào Gn đây hơn, những phương pháp thủy tỉnh hóa cải tiến đã được phát tiễn, có khả năng lâm lạnh và làm ẩm cực nhanh nhờ giảm thiểu thể ích thương do đồng ạnh

Trong phương pháp thủy tỉnh hóa, tế bào cẳn được xử lí theo các bước đông lạnh thông thường như cần bing trong dung địch bảo vệ lạnh pha loãng, ngâm trong dung dich

gian tiếp xúc trong dung dịch của phương pháp thủy tỉnh hóa không chỉ phụ thuộc vào dung

dịch bảo vệ đông lạnh mà còn phụ thuộc vào nhiệt độ, cả tính thẩm của tế bảo và độc tính của địch chất bảo quản thấm có nồng độ rất cao ở nhiệt độ phòng Bởi vì sự hiện diện với nông tại nhiệt độ này mà thay vào đố chỉ được cân bằng đông lạnh trong khoảng thời gian rắt ngắn trước khi chúng được nhúng trực tiếp vào nitø lỏng [48]

Khác với các phương pháp đông lạnh chậm và đông lạnh nhanh, trong phương pháp đông lanh cục nhanh, th tích của dung địch đông lạnh nhanh được giảm đến mức tối thiểu sử

‘bdo quin lạnh (cryotube hay eryoloop), Sng mao din mé (cong ra ha “open pulled straw”),

xà rã đông trúng với thể tích tối thiểu cẫn cho đông lạnh nhanh Phương pháp đông lạnh cực hạn có thể vượt qua nhanh chóng trước khi tế bào bị tổn thương Tuy nhiền chất bảo quản cấu túc di truyền cho tế bào Có lẽ đây là lý do ti sao phôi sau trữ lạnh có cấu trúc và phát triển rắt tốt khí nuôi trong éng nghiệm nhưng tỷ lệ thụ thai sau chuyển phối vẫn còn rất thấp Người ta cho rằng thành công của phương pháp phụ thuộc vào loại và cách dùng chất bảo

quản lạnh, cũng như thời gian tiếp xúc với chất bảo quản lạnh trước khi chuyển thành dạng

kính Qui trình rã đông cũng phải thực hiện thật nhanh để hạn chế hiện tượng chuyển dạng từ kính sang nước đá Hiện tại tuy chưa thể áp dụng kỹ thuật này vào thực

tổ những tiềm năng của nó ắtlớn vinh đơn giản và những ưu điểm so với kỹ thuật làm lạnh chậm dang duge sit dung (11, 13, 48) 1.3.2 Chat bio qui lank (Cryoprotective Adlitive CPA)

“Các chất bảo quản lạnh được sử dựng trong kỹ thuật thủy tính hóa gằn giống như trong kỹ thuật đồng lạnh chậm trước đây, nhưng nồng độ sử dụng cao hơn Trong một dung

«qua mang té bào (permeable cryoprotectan) để khử nước bên tong tẾbào và một chất bảo vệ đồng lạnh không có khả năng thắm qua màng tế bào (non-permeable cryoprotectant) lim bi

trọng, giúp quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn [I 1, 13]

1.32, 1 Các chất bảo quản thường sử dụng cho phương pháp thủy tình hóa

“+ Chit bio quản lạnh có khả năng thẳm thấu qua màng tế 10: ethylene glycol (duge

sử dụng phd bién nit), propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) va 1,2 - propanediol (PrOH)

+ Ethylene glycol (EG): Phd bidn nhit va al due sr dung tong guy tinh thy nh hóa Chất này ít ảnh hưởng bởi nhiệt trong cơ chế vận chuyển qua mang, de xuất hiện vào khoảng 380C EG có độc tính thấp với phôi chuột, đặc biệt là phí

Xhuch tấn nhanh, cân bằng nhanh chống với ế bào gua màng trong suốt và màng tẾ bào, Sam Xhi đông lạnh trừng và phi bằng phương pháp thủy tỉnh hóa bằng EG đã cổ sự mang tha binh thường trên động vật và người [TT

+ Dimethyl sulf0xide (DMSO): DMSO được phát hiện vào năm 1959 như là một chất bảo quân higu quả Chất này xuyên qua màng dễ đăng hơn glycrol nhưng tính độc của ổ li

ao hơn ở nhiệt độ cao

+ Propylene glycol (PG): cing la mot chi ‘ong ty nhu glycerol, nhung nồng độ của

1 duge yéu cu thi ham rong chất đông lạnh, và độc om glycerol.

-# Chất bảo quản lạnh không có khả năng thắm qua màng té bao: sucrose, trehalose, lueose và galaetose

Các saeehaide khác nhau thường được sử dụng, bao gồm mono, di: và trisaccharides Cac monosaccharide gdm fructose, glucose, va galactose, Cae disaccharide thấm lọc để giảm bớt sốc thẩm thấu, giúp đẫy nước ra khỏi t bào Người ta đã chứng minh ces, 1999) (37], Trahelose đã được xem là chất bổ sung của chất bảo quin đông lạnh rắt có hiệu qua (Begin va cs., 2003) [14] Ca sucrose va trehalose ite ché ming té bào bị biển đổi bởi nhiệt độ, ôn định độ bên của enzymme và ming té bio, Trong mot sé trudng hop, trehalose còn là một chất bảo vệ tốt hơn cả suerose |LI]

"Để đạt tỷ lệ đông lạnh cao, đôi hồi sử dụng chất bảo quản đông lạnh nông độ cao để làm giảm tỉnh thể đá, Kết quả là với nông độ cao có thể dẫn đến sắc thẩm thấu và gây độc

"báo quản đồng lạnh, (i) Tăng tốc độ làm lạnh và rã đồng [54]

“Trong thành phần môi trường thủy tính hóa hiện nay, người ta thường sử dụng ethylene glyeol và một chất bảo vệ đông lạnh khác cũng có khả năng thắm qua màng tế bào năng thắm thấu qua màng tế bào cao hơn so với khi chỉ sử dụng từng chất riêng lẻ, vừa giảm cao [60]

1.3.2.2 Dung dich dém và các đại phân từ

Dung dich chất bảo quản chứa nhiễu hợp chất khác nhau có tác dụng bảo vệ tế bào trong suốt quá trình đồng lạnh và rã đông Chẳng hạn như những hợp chất gồm citrate, noãn hoàng trừng, Dung dich bảo quản đông lạnh thường được

tạo bằng cách thêm vào một lượng các hợp chất làm thành dung dịch sinh lý giống với môi trường cấy giao từ và phôi

+ Dung dich dm

Dung địch thủy tỉnh hóa là dung địch chất bảo quản dông lạnh mà không bị đông đá khi làm lạnh đến nhiệt độ rất thấp với ốc độ làm lạnh cao Vì vậy môi trường đệm cơ bản sử cdụng cho thủy tình hóa là đệm muỗi photphat hay đệm HEPBS

-# Các đại phân tử

Các hợp chất đại phân từ được thêm vào dung dịch chất bảo guản đông lạnh polyeinylpirrolidone (PVP) nhưng không thành công trong trong đông lanh phôi và gây độc như chất bổ sung (Rall va Fahy, 1985), hydroxyethyl starch (HES), EieolL Ngoài ra, còn có

bò mang thai -Fetal Bovine Serum (FBS) Một loại ít phổ biển khác là các protein giảm nhiệt

“Thermal Hysteresis Proteins(THP) |55, 66, 86]

“Trong tự nhiên những tế bào chứa hàm lượng protein cao sẽ hữu ích trong quá trình thủy tỉnh hóa Thủy tỉnh hóa ngoại bào cần nông độ chất bảo quản cao hơn nội bào Việc diy mạnh thủy tỉnh hóa ngoại bào với nông độ chất bảo quản đông lanh giỗng như thủy tỉnh ngăn cản sự hình thành tỉnh thể đá trong suốt quả trình đông lạnh và rã đông.Vì th, các đại ngoài, từ đó lâm giảm độc cho tế bào J55, 66]

1-33 Các âu ổ ảnh hướng dẫn chất lượng trúng sau Khi bo quản bằng phương

pháp thủy tỉnh hóa

“Quá trình đông lạnh gây ra nhiễu tổn thương trong cu trúc và chúc năng của trứng

“Trong đó, ôn thương lạnh và độc ính của các chất bảo quản là những bắt lợi chính quyết định đến sự bảo quản rồng thành công, Do đồ, để ống sau đông lạnh, rồng phải tri qua

một chuỗi có và giãn nỡ thể tích Trứng dễ bị tổa thương bởi quy ình đông lạnh: sự hình thành tính thể đá, thầm thấu khi loại bỏ chất bảo quản đồng lạnh khỏi tế bào Vì vậy, việc đồng lạnh chúng là rất khó (Vineent và Johnson, 1992) Tuy &n, ửi sử dụng phương pháp thủy tỉnh hóa trắnh được sự hình thành đã nội bào Tnacslular le Fomadon HE) - ảnh lối «ng pha rin (RaI và Eahy, 1985, Vajta và Kuwayama, 2006) |6, 7981]

"Bên cạnh đó, phương pháp thủy tỉnh hóa đường như đe dọa đến sự ống sau đồng lạnh

do nồng độ chất bảo quản đồng lạnh ắt cao và ếu tổ nhiệt độ thực hiện có thể gây độc cho tế Đào (HIoamisigl và +, 1996) Ngoài ra, chất lượng trừng sá thủy ỉnh hóa cồn phụ thuộc các yếu tổ như những biển đổi hình dạng, cấu trúc của trững do quả tình đông lạnh và rã động gây rai đặc điểm và giai đoạn phát triển của trừng thực hiện đông l Filler B.1, 1996) Kết quả của nhiều nại ` cứu vềsự sống của trững sau đông lạnh có th bị (Bernard A va

te dng boi rạng thi trưởng hành của chúng, chất lượng hay các yéu 16 If sinh rong quỷ trình đông lạnh đã sử dụng Ví dụ, khỉ trưởng thành, chất lượng và kích thước rững là đặc điểm quan trọng ảnh hưởng đến kết quả đông ạnh [1529]

Phương pháp thủy tỉnh hỏa đã được áp dụng trên phương diện lâm sàng (Kuledhova

à Lopata, 2002), Một vải điễu cần ưu ý có th dẫn ti ý ệ thành công thấp là chất lượng itơ lòng, thời gian thao tác, tốc độ đông lạnh, ảnh hưởng chất bão quản đồng lạnh [37]

1.3311 Biến đối rong tế bảo đồng lạnh

$ Sự hình thành nh thể để

“Sự hình thành tỉnh thể nước đá trong và ngoài tế bào là yếu tổ ảnh hưởng rắt lớn đến

sức sông của tế bảo trong đông lạnh Tốc độ làm lạnh chính là yếu tổ quyết định dạng tỉnh thể

nước đá hình thành Khi làm lạnh với tốc độ thích hợp thì tinh thé nước đã hình thành có cdạng sáu cạnh, hình dạng của nó sẽ là hình cây thông không đồng dạng và hình cẳu khí tốc độ làm lạnh được đẫy lên (Hình 24) |55, 60]

Với tốc độ làm lạnh đạt đến 20.000” Cigidy, nước nguyên chất tạo băng võ định hình

mà không cổ dạng tính thể Tuy nhin, quá tình làm ẩm ong gii đồng sẽ xảy m guá tình

ti tạo tính thể nước đồ từ nhỏ đến lớn Vì vậy, tốc độ nâng nhiệt chậm trong quá tình giải đông sẽ gây bắt lợi cho tế bào 55, 60

VIEN

6 moi trường đẳng trương (áp lực thấm thấu ở khoảng 300mOm/kg), tnh thể đá thường được hình thành ở nhiệt độ -Š đến -15C Tuy nhiên, tình thể nước đá chỉ được hình thì tỉnh thể đá cảng tăng Tuy nhiên, ở nhiệt độ khoảng -130C, ắt cả các chất liệu trong dung địch đều ở đạng bạt kết tỉnh hay dang thay tinh, Qué tinh này gọi là sự kết tnh hay hiện tượng thủy tỉnh hóa (vizification) Hiện tượng này xảy ra khi trong môi trường đông lạnh có 60]

8 Sự khử nước

“Sự khử nước của tế bào là rất cần thiết trong quá trình làm lạnh Thông thường các tễ bào sẽ có thể bị tốn thương ở nhiệt độ 15 đến -Đ0'C, Một khi tế bào không được khử nước thì cấu trúc đã nội bào sẽ bình thành nếu nhiệt độ xuống dưới 0C Tốc độ khử nước của tế bào

tỷ lệ điện tích bỂ mặu thể tích tế bào (S/V) Những yếu tổ này thay đổi ty thuộc vào loại tế bào, vì vậy, chúng đóng vai trò quyết định trong xác định quả trình đồng lạnh thích họp nhất .$ Độ pH của dụng dịch

"Độ pH của dung dịch sẽ giảm theo nhiệt độ Cân bing acid - base của môi trường biễn đổi theo hướng tăng lục ion, làm cho ede phan tr protein hoa tan trong moi trường đễ bị kết trọng trong việc kiểm soát biến đổi acid -base của dung dich, Glycerol va các glycol hoạt hợp nhất để duy tì hoạt động sinh lý của tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ mà tế bảo được bảo với độ pH lớn hơn 9,

9 Sự hình thành bọt khí

“Trong quá trình bảo quản lạnh, tế bào bị tốn thương và có thể chết vì nhiễu cách khác nhau do sự hình thành tỉnh thể đá Thể tích nước bị đông lạnh sẽ tăng lên (tỷ trọng của nước xuống Kích thước của bọt khí thay đối tử 25 - 100um và tỷ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh, trong khi số lượng bọt khí tỷ lệ thuận với tốc độ làm lạnh

‘Bén cạnh các khí hòa tan theo nông độ, môi trường nuôi cấy còn sử dụng CO; làm

đệm nhằm cân bằng acid - base Khi làm lạnh thì các khí này không còn ở dạng hòa tan mà bọt khí có thể được hình thành và có thé phát tin thành không bào rất lớn trong nội bào, làm trong môi trường sử dụng đệm bicarbonate, vì vậy, sử dụng mỗi trường PBS có thể bạn chế

số lượng bọt khí [7 9|

1.3.3.2 Tính an toàn khi đông lạnh trúng trưởng thành,

"Nghiên cứu sử dụng trúng trường thành cho thấy khả năng sông của trúng sau đông lạnh và rã đông bị ảnh hưởng bởi một số các nhân tổ, Giữa các nhân tổ hình thấi, sự có mặt hay vắng mặt các tế bào hạt cumulus tong suốt quá trình đông lạnh có thể tác động trực tiếp lên khả năng sống của trừng sau rã đông Hơn nữa, tổn hại tế bào sau rã đông gắn ngưỡng sây chết sẽ ảnh hướng tới khả năng phát triển của chúng Trứng trưởng thảnh không đồng nhất trong sự phân bổ và tổ chức các bảo quan trong bảo tương có thể ảnh hưởng đến kết quả ccủa quy trình đông lạnh,

“Trứng ở giai đoạn metaphase II dễ bị tốn thương lạnh do thoi vô sắc nơi nhiễm sắc thể bất đầu xếp thẳng hàng rất nhạy cảm với nhiệt độ thấp, Làm lạnh trứng trong thời gian ngắn ở

ra nhanh chồng ở nhiệt độ thắp hơn

OC Sw sip xép các vi sợi thoi vô sắc thích hợp là điều cần thiết để tách và sắp xếp đúng ngoài Sự đút gãy bộ xương tễ bào dẫn tới bộ xương t bào bắt bình thường, giữ lại thể cực thứ hai, thay đổi cầu tạo và các báo quan (64, 80]

“Các vi ống của trừng có thể bị tổn thương do chất bảo quản đông lạnh và sự thay đổi ccủa nhiệt độ (Pickering và cs, 1990; Van Blerkom và Davis, 1994) [64, 80] Trứng tiếp xúc cùng với trứng (Aman và Parks, 1994) [11] Tỏn thương thoi vô sắc giảm phân (meiotic trừng (Eroglu va es„ 1998) [23] Liên quan đến khả năng thụ tỉnh không chí do tổn thương thơi vô sắc mà còn do khả năng bất thường của nhiễm sắc thể (Aman và Parks, 1994) [11] Hơn nữa, theo mô tả đầu tiên trên trứng chuột do tác giả Magisrini va Szollosi (1980) (48), các vi ống và thoi vô sắc giảm phân của trứng của tắt cả các loài động vật có vú không tập

trung và không kết hợp khi trứng tiếp xúc với nhiệt độ gần 0C trong khoảng vài phút (Parks

với các chất bảo quản đông lạnh khác nhan Johnson va Pickering (1987) cho thấy trường họp [81] Vineent và cs (1990) cũng phát hiện rà DMSO có ảnh hưởng lên trúng Tuy nhiên, họ

đã kết luận tổn thương là do nhiệt độ, tại nhiệt độ nào đó chất bảo quản đông lạnh không thể [81] Cong bố của Shaw va Trounson (1989) cho rằng propylene glycol gay ra hoạt hóa trinh: sản (pahenogenetic) trên trừng chuột là sự hoạt hóa nhân tạo phong tỏa trạng thái dũng ở chỉ có khi tỉnh rằng xâm nhập vào trứng) Dòng Ca” tăng làm giải phóng các thể vỏ hạt của trứng, và trừng tp tục quá trình giảm phân để hình thành th cực thứ 2

White vi Yue (1996), Gook và cs (1995) cũng đã chứng mính trứng người cũng gặp phải hiện tượng trên sau rã đồng Xơ cứng màng trong hay hoạt hóa trứng gây ra bởi sự giải phóng, phóng ra ngoài thành bảo tương trong suốt phản ứng màng trong suốt Đây là phán ứng thông, thường, xây ra khi nh trùng xâm nhập vào trứng để thụ tỉnh và ngân hiện tượng thụ tỉnh đa hạt võ trước trưởng thành (Schalkoff va cs, 1989) và pha vO ede vi soi (Vincent va es 1992), [26, 69, 83, 84, 87]

DMSO cing tỏ ra là nguyên nhân gây xơ cứng ming trong suốt và giảm các hạt võ

trong trứng chuột (Vincent va ¢s,1990), Nhiing nghiên cứu sau này cho thấy rằng trứng tiếp

xúc với DMSO ở nhiệt độ 20 - 37°C phủ nhận tác động trên màng trong suốt, ý lệ thụ tỉnh và

tổ thức thoi vô sắc Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng tự bản thân trứng gây ra Xơ cứng màng, trong suốt |82] 1.4 Ứng dụng của đông lạnh trứng

Dong lan trứng là một phương pháp dùng để lưu ữ các tế ào trứng tong thời dồi và đang được quan tâm nhiều v phương pháp này có nhiễu ứng dụng ở cả người và động vật

141 Onguin

"Đứa bề đầu iên wen th giới ra đời từ trứng đông lạnh được ghỉ nhận vào năm 1986

“Cho đến năm 2004, thông kế cho thầy tên thể giới có khoảng 40 bể đông lạnh trừng ra đồi và

trên dưới 60 trường hợp thai đang tiến triển Tỷ lệ thai lâm sàng tò các chu kỳ trửng đông

lạnh hiện còn khí thắp và không én định Người ta ước tính cẩn phải rồ đồng khoảng 100 trừng thì mới có một trường hợp mang thái thành công Nguyên nhân của hành công thấp có hân chỉa và xắp trên mặt phẳng xích đạo, (2) Tổn thương của các cầu trc nội bào do

cquá tình trữ lạnh+ã đồng: (3) Trứng là một tế bào có kích lớn, với lượng nước ben trong chiếm khá nhiề [26]

Phương pháp đông lạnh trúng thường được sử dụng cho những trường hợp sau: Phụ

"nữ còn tẻ hoặc không có bạn tình mà trứng của họ có nguy cơ bị phá hủy nặng n đo chiều

xạ, hớa tị iệu; Lập ngân hàng trúng hỖ trợ cho các chương trình bệnh nhân không cổ noãn;

“Trong những tường hợp không có tỉnh tring d& thụ tỉnh cần lưu trừ trứng, Phụ nữ muỗn tì

ở những nước mà đông lạnh phôi không được phép thực hiện [90] 3 Ở động vật Bio quản giao tử cái (rứng) làm eơ sở cho các nghiên cứu, ứng dụng sâu hơn: Ding cho ede nghiên cứu về TVP để cải thiện hiệu quả thụ nh trong ông nghiệm; Việc đồng lạnh trúng giúp vận chuyển dễ dàng, hạn chế lây lan dịch bệnh, Thiết lập ngân hàng để lưu trữ nguồn dĩ truyền của những động vật có nguy cơ tuyệt chủng hay quý hiểm; Trao đổi mua bán

42 dang, de bigt là những loài cógiát kinh tế cao [3/6]

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung 1: Đông lạnh trứng heo trưởng thành bằng phương pháp thủy tỉnh hóa

“Thủ và nuôi trứng

Hin 2.1 Szđổ tínghiện nội ng

3.1.1 Thu nhận mẫu bung trứng

Chuẩn bị

- Hắp vô trùng nước muối sinh ý (09%), nước cắt kéo, kẹp

- Bồ sung penieilin (I001U/ml) và sreptomycin (0,lmyg/ml) vào nước muỗi sinh lý trước khi sử dụng, để rong bình giữ ấm khoảng 33 - 35C,

Tiến hành

bù 1g kéo thủ nhận buồng trú 1g ở phía hai bên tử cung ngay Khí heo vừa được md, rửa sạch cho vào nước muối sinh lý chuyển nhanh về phòng thí nghiệm (PTN) trong khoảng 2-3 giỡ Tại PTN, chọn những buồng trứng có các nang nổi đều, kích thước trung bình