nghiên cứu phát triển que thử nhanh sử dụng hạt nano vàng hình sao để phát hiện virus rubella

- Xác định được các điều kiện thích hợp tạo que thử nhanh - Xác định được đặc tính que thử nhanh phát hiện virus rubella • Nội dung của đề tài, các vấn đề cần giải quyết: - Nghiên cứ

TỔNG QUAN

Dịch tễ học bệnh Rubella trên thế giới và trong nước

Rubella, còn được gọi là bệnh sởi Đức hoặc bệnh sởi ba ngày, là một bệnh nghiêm trọng và rất dễ lây lan ở người do vi rút rubella gây ra [16] Bệnh do vi-rút này lây lan từ người này sang người khác qua các giọt tiết ra từ dịch tiết đường hô hấp của người nhiễm bệnh, tiếp xúc với các mô bị nhiễm vi-rút Rubella, tiếp xúc với nước tiểu của trẻ em bị nhiễm và dùng chung cốc của người bị nhiễm Rubella [4] Nếu phụ nữ mang thai bị ảnh hưởng bởi loại vi-rút này, con của họ có thể sẽ bị dị tật bẩm sinh gọi là Hội chứng Rubella bẩm sinh (CRS) CRS dẫn đến dị tật, thai chết lưu, chậm phát triển trí tuệ, bệnh tim, tiểu đường, viêm não, nhẹ cân và điếc [4]

Có tới 50% người nhiễm rubella không có triệu chứng Người bệnh phát ban màu hồng hoặc đỏ từ ngày 14 đến ngày 17 ngày sau khi tiếp xúc với nguồn bệnh Các triệu chứng của bệnh bao gồm: sốt nhẹ, mệt mỏi, nhức đầu, viêm não, sảy thai, ngứa, khó chịu, viêm khớp, đau cơ, đau khớp, viêm đa khớp và chán ăn Vắc xin MMR (sởi, quai bị và thủy đậu) là vắc xin được khuyên dùng nhiều nhất để ngăn ngừa và tiêu diệt Rubella [15] Theo khuyến nghị của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh, trẻ em nên được tiêm vắc-xin MMR hai lần Liều vắc-xin đầu tiên được khuyến nghị tiêm cho trẻ từ 12 đến 15 tháng tuổi và mang lại khả năng miễn dịch cao hơn 95% Liều vắc-xin thứ hai được khuyến nghị tiêm cho trẻ từ 4 đến 6 tuổi và cung cấp khả năng miễn dịch vĩnh viễn đối với vi-rút [12]

1.1.1 Tình hình bệnh Rubella trên thế giới

Rubella xảy ra trên toàn thế giới Trước khi vắc-xin phòng Rubella được giới thiệu vào năm 1969, các đợt bùng phát dịch thường xảy ra cứ sau 6–9 năm ở Hoa Kỳ và 3–5 năm ở Châu Âu, chủ yếu ảnh hưởng đến trẻ em trong độ tuổi 5–9 [31] Đại dịch toàn cầu gần đây nhất xảy ra từ năm 1962 đến năm 1964 Trong thời gian này ở Hoa Kỳ, có 12,5 triệu trường hợp mắc phải bệnh Rubella Ngoài ra còn có 11.000 thai nhi tử vong và 20.000 trẻ sơ sinh được sinh ra với các dị tật CRS,

2100 trong số đó đã chết Kể từ khi bắt đầu tiêm vắc-xin định kỳ, bệnh rubella đã giảm 99% ở những quốc gia có tỷ lệ chủng ngừa cao [8] Bùng phát bệnh rubella xảy ra ở nhiều nam thanh niên ở Anh vào năm 1993 và năm 1996, bệnh lây truyền

2 sang phụ nữ mang thai Các đợt bùng phát dịch thường xảy ra ở các nước đang phát triển nơi chưa được tiếp cận vắc xin [10] Các biến chứng gặp phải trong thai kỳ do nhiễm rubella (sảy thai, thai chết lưu, hội chứng rubella bẩm sinh) phổ biến hơn ở Châu Phi và Đông Nam Á với tỷ lệ 121 trên 100.000 ca sinh so với 2 trên 100.000 ca sinh ở Châu Mỹ và Châu Âu [6] Tại Nhật Bản, 15.000 trường hợp mắc bệnh Rubella và 43 trường hợp mắc hội chứng Rubella bẩm sinh đã được báo cáo bởi Cơ quan giám sát dịch tễ học quốc gia về các bệnh truyền nhiễm từ ngày 15 tháng 10 năm 2012 đến ngày 2 tháng 3 năm 2014, trong đợt bùng phát bệnh rubella 2012–2013 tại Nhật Bản Chúng chủ yếu xảy ra ở nam giới ở độ tuổi 31–51 và thanh niên ở độ tuổi 24–34 [25]

Rubella được ngăn ngừa bằng các chương trình tiêm chủng sử dụng vắc- xin từ vi rút sống giảm độc lực Hai vắc-xin vi rút sống giảm độc lực chủng RA 27/3 và Cendehill có hiệu quả phòng bệnh cho người lớn Tuy nhiên, việc sử dụng chúng cho phụ nữ trước tuổi dậy thì không làm giảm đáng kể tỷ lệ mắc CRS ở Anh Việc giảm chỉ đạt được bằng cách tiêm chủng cho tất cả trẻ em [31] Các chương trình tiêm chủng diễn ra khá thành công Cuba tuyên bố loại bỏ căn bệnh này vào những năm 1990 Vào năm 2004, Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh đã thông báo rằng cả hai dạng Rubella và Rubella bẩm sinh đã được loại bỏ khỏi Hoa Kỳ [14] Tổ chức Y tế Thế giới tuyên bố Úc không còn bệnh rubella vào tháng 10 năm 2018 [9] Ngày 22 tháng 1 năm 2014, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Y tế Pan American đã tuyên bố và chứng nhận Colombia không còn bệnh Rubella và trở thành quốc gia Mỹ Latinh đầu tiên loại bỏ căn bệnh này trong biên giới của mình [25] Ngày 29 tháng 4 năm 2015, Châu Mỹ trở thành khu vực đầu tiên của WHO chính thức không còn căn bệnh này Rubella là căn bệnh thứ ba được loại bỏ ở Tây bán cầu bằng vắc-xin sau bệnh đậu mùa và bệnh bại liệt [7] Tuy nhiên, bệnh Rubella vẫn phổ biến ở một số khu vực trên thế giới Susan E Reef, trưởng nhóm nghiên cứu bệnh Rubella tại bộ phận tiêm chủng toàn cầu của CDC cho biết không có khả năng bệnh này sẽ bị loại trừ trên toàn thế giới trước năm 2020 [7]

Hình 1.1 Các quốc gia có vắc xin Rubella trong chương trình tiêm chủng quốc gia và dự kiến đưa vào sử dụng năm 2020 [30]

1.1.2 Tình hình bệnh Rubella ở Việt Nam

Bệnh xuất hiện từ nhiều năm nay ở Việt Nam, thường phát triển mạnh vào dịp đông xuân Dịch Rubella ở Việt Nam thường xảy ra 4-5 năm một lần Năm

2011, Việt Nam xảy ra đại dịch rubella lớn trên toàn quốc Trong thời gian xảy ra dịch bệnh rubella, nhiều trẻ sinh ra mắc hội chứng rubella bẩm sinh (CRS) [37] Trong thời gian khảo sát từ tháng 5 năm 2011 đến tháng 3 năm 2012 tại Hà Nội,

113 trẻ sơ sinh được xác định mắc CRS (đặc điểm lâm sàng và dương tính IgM rubella) Tuổi trung bình của trẻ khi chẩn đoán là 38,4 ngày (từ 1-152 ngày) và 61% là nữ Biểu hiện lâm sàng của CRS bao gồm nhẹ cân 56°C), tia cực tím và pH quá cao (pH < 6,8 hoặc > 8,1) Không giống các Togavirus khác, vi rút Rubella không có vật chủ là động vật không xương sống và các động vật chân khớp Vi rút Rubella chỉ có duy nhất một type kháng nguyên, không phản ứng chéo với các thành viên khác trong nhóm Togavirus [21]

1.2.3 Cấu trúc hệ gen và chức năng

Hệ gen của vi rút Rubella là RNA sợi đơn, phân cực dương Bộ gen có chiều dài khoảng 10 Kb và chứa hai khung đọc mở (ORF) [27] ORF gần đầu 5’ là 6345 nucleotide mã hóa các protein không cấu trúc của vi rút, p150 và p90, trong khi ORF 3 ′ là 3189 nucleotide mã hóa các protein cấu trúc, capsid (C), E2 và E1 [24]

Do đó, thứ tự gen cho vi rút Rubella là 40S RNA là 5’-p150-p90-C-E2-E1-3’ Trình tự nucleotide hoàn chỉnh của vi rút đã được xác định cho ba chủng, Therien, M33 và RA27/3 [35] Phân tích trình tự nucleotide và axit amin suy luận cho thấy mức độ tương đồng cao giữa các chủng, từ 97,2 đến 99% và 97,6 đến 98,9% ở mức nucleotide và axit amin tương ứng Bộ gen có hàm lượng G + C cực kỳ cao là 69,5%, cao nhất so với bất kỳ loại vi rút ARN nào được biết đến cho đến nay và điều này chắc chắn đã góp phần vào một số khác biệt trong trình tự gen vi rút được báo cáo [10]

Hình 1.3 Sơ đồ mô tả quá trình dịch mã tạo nên các protein cấu trúc và phi cấu trúc của vi rút Rubella [13]

Một polyprotein chưa hoàn chỉnh là p200 được dịch mã từ đầu 5’ của hệ gen RNA vi rút Rubella và qua phân cắt Cis tạo thành 2 protein phi cấu trúc p150 và p90 Các protein cấu trúc được tổng hợp từ một tiểu hệ gen RNA 24S dịch mã từ đầu 3’ Một polyprotein chưa hoàn chỉnh là p100 được dịch mã từ tiểu hệ gen RNA và qua một số lần phân cắt, phiên mã muộn, biến đổi để cuối cùng tạo ra các protein thành thục là C, E1 và E2 [13]

1.2.4 Cơ chế nhân lên của vi rút Rubella

Vi rút bám vào bề mặt tế bào thông qua các thụ thể cụ thể và được tiếp nhận bởi một endosome đang được hình thành Ở độ pH trung tính bên ngoài tế bào, protein vỏ E2 bao phủ protein E1 Độ pH giảm bên trong endosome giải phóng miền bên ngoài của E1 và gây ra sự hợp nhất của vỏ vi rút với màng endosomal [18] Do đó, capsid đến bào tương , phân hủy và giải phóng bộ gen Đầu tiên (+)ssRNA chỉ hoạt động như một khuôn mẫu để dịch mã các protein phi cấu trúc, được tổng hợp dưới dạng một polyprotein lớn và sau đó được cắt thành các protein đơn lẻ Trình tự của các protein cấu trúc được sao chép bởi RNA polymerase của virus thông qua một (-)ssRNA bổ sung làm mẫu và được dịch mã thành một mRNA ngắn riêng biệt RNA ngắn này được đóng gói bổ sung trong một virion [24] Sự dịch mã của các protein cấu trúc tạo ra một polypeptide lớn (110 Dalton ) Sau đó, chất này được cắt nội phân giải thành E1, E2 và protein capsid E1 và E2 là các protein xuyên màng loại I được vận chuyển vào mạng lưới nội chất (ER) với sự

7 trợ giỳp của chuỗi tớn hiệu N-terminal Từ ER, phức hợp dị thể E1ãE2 đến bộ mỏy Golgi , nơi xảy ra sự nảy chồi của virion mới Mặt khác, protein capsid ở trong tế bào chất và tương tác với ARN bộ gen, cùng nhau tạo thành capsid [18]

Hình 1.4 Cơ chế xâm nhiễm và tái bản của vi rút Rubella

1.2.5 Cách thức lây truyền bệnh Rubella

Bệnh hiện diện khắp nơi trên thế giới, hay xảy ra vào mùa đông và mùa xuân Tất cả mọi người, mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh Rubella, trong đó đối tượng dễ gặp nguy hiểm nhất là phụ nữ mang thai, đặc biệt trong 3 tháng đầu Những người đã bị Rubella lúc còn nhỏ được miễn dịch, không bị nhiễm bệnh lại [22]

Lây truyền qua đường hô hấp: ổ chứa vi rút gây bệnh Rubella duy nhất là người và người đang mắc bệnh là nguồn truyền nhiễm duy nhất Khi người bệnh ho, hắt hơi và khạc nhổ có thể làm bắn các giọt dịch tiết đường mũi họng chứa vi rút ra ngoài môi trường, nếu những người xung quanh hít phải vi rút có thể bị lây bệnh Trẻ mắc hội chứng Rubella bẩm sinh sẽ đào thải nhiều vi rút trong dịch tiết hầu họng, trong nước tiểu và đó là nguồn truyền nhiễm cho người tiếp xúc Tất cả mọi người chưa có miễn dịch với vi rút Rubella đều có thể bị mắc bệnh Tùy thuộc nồng độ kháng thể mẹ truyền qua rau thai mà trẻ sơ sinh có kháng thể của mẹ được bảo vệ khoảng 6 – 9 tháng Kháng thể IgM và IgG xuất hiện 2 – 4 ngày sau khi xuất hiện ban, đạt nồng độ cực đại sau 2 tuần IgM giảm dần, trở về âm tính sau 1 – 2 tháng nhưng cũng có thể kéo dài ở khoảng 3 – 5% số bệnh nhân, trong khi IgG thì tồn tại suốt đời [9]

8 Lây truyền từ mẹ sang con: Thời gian 12 tuần đầu thai kỳ là thời gian nguy hiểm nhất khi nhiễm Rubella ở người mẹ, vi rút Rubella từ máu của mẹ chuyển qua rau thai vào thai nhi trong giai đoạn khởi phát và toàn phát của bệnh [9] Vi rút này có khả năng phá hủy hay làm chậm sự phát triển của phôi thai và đây là nguyên nhân gây ra những dị tật bẩm sinh cho thai nhi Tùy vào thời điểm nhiễm bệnh, tỷ lệ con bị hội chứng Rubella bẩm sinh rất thay đổi: 80% khi thai dưới 12 tuần, 54% khi thai được 13 - 14 tuần, 35% ở tuổi thai 13 - 16 tuần, 10% khi thai

16 tuần và sau 20 tuần thì tỷ lệ này không đáng kể [34]

1.2.6 Các biến chứng khi mắc bệnh Rubella

Vi rút lây truyền từ người sang người qua đường hô hấp Trong các nghiên cứu tình nguyện, nhiễm trùng có thể được gây ra bằng cách đưa khí dung vào niêm mạc mũi họng Đường hô hấp trên và mô bạch huyết ở mũi họng dường như là những vị trí đầu tiên của sự nhân lên của vi rút, và sau đó vi rút sẽ lây lan đến các hạch bạch huyết trong khu vực [12] Các triệu chứng lâm sàng của nhiễm trùng mắc phải sau phẫu thuật thường nhẹ và nhiều trường hợp nhiễm trùng không có triệu chứng Biểu hiện lâm sàng đầu tiên của bệnh ban đầu thường là sự xuất hiện của phát ban dạng lớn khoảng 16 đến 20 ngày sau khi tiếp xúc Ban đầu tiên xuất hiện trên mặt, sau đó lan dần ra thân và sau đó lan ra tứ chi Các triệu chứng khác thường bao gồm sốt nhẹ, nổi hạch, đau họng và tình trạng khó chịu chung Nổi hạch có thể đặc trưng, liên quan đến các nút sau cổ tử cung và nút chẩm, có thể tồn tại sau khi hết phát ban

Các kỹ thuật xét nghiệm phát hiện vi rút Rubella

Hiện nay, việc chẩn đoán nhiễm vi rút rubella có nhiều phương pháp khác nhau Mỗi phương pháp có ưu, nhược điểm riêng thông qua việc phát hiện trực tiếp vi rút hay việc phát hiện kháng thể trong huyết thanh, huyết tương… Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng để chẩn đoán bệnh rubella bằng cách phát hiện vi rút thường bao gồm bệnh phẩm ngoáy họng (TS), dịch miệng (OF) hoặc dịch tiết mũi họng và bằng cách phát hiện kháng thể trên mẫu huyết thanh hoặc huyết tương Vi rút cũng được tìm thấy trong các mẫu bệnh phẩm khác, bao gồm cả mẫu mô đục thủy tinh thể và nước tiểu Nước tiểu và dịch họng hầu hoặc dịch miệng tương đương với nhau như nguồn RNA của vi rút, nhưng việc dễ dàng lấy được dịch họng hầu hoặc dịch miệng khiến những mẫu này trở thành những mẫu chính được thu thập Nước tiểu thường là nguồn lây nhiễm vi rút từ bệnh nhân mắc hội chứng rubella bẩm sinh

Thời điểm lấy mẫu xét nghiệm rất quan trọng đối với bệnh rubella IgM đặc hiệu với vi rút rubella chỉ hiện diện trong huyết thanh ở khoảng 50% các trường hợp mắc bệnh rubella vào ngày phát ban Tuy nhiên, vào thời điểm 5 ngày sau khi phát ban, hầu hết các trường hợp rubella có IgM đặc hiệu với rubella có thể phát hiện được Hầu hết các trường hợp rubella dương tính với vi rút vào ngày phát ban và có thể dương tính từ 7 đến 10 ngày sau khi phát ban Vì bệnh rubella là một bệnh nhẹ trong thời gian ngắn, nên cần phải cố gắng đặc biệt để lấy mẫu vào ngày phát ban hoặc ngay sau đó Bệnh nhân bị hội chứng rubella bẩm sinh (CRS) và

10 nhiễm rubella bẩm sinh (CRI) có IgM và vi rút dương tính trong nhiều tháng Do đó, thời gian lấy mẫu là ít quan trọng hơn đối với những người bị nghi ngờ có hội chứng rubella bẩm sinh và nhiễm rubella bẩm sinh

Một số phương pháp phát hiện nhiễm vi rút rubella:

1.3.1 Phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp phát hiện vi rút rubella bằng kỹ thuật sinh học phân tử: Khuếch đại RNA của vi rút rubella trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm bằng cách sử dụng kỹ thuật RT-PCR Các xét nghiệm có thể phát hiện từ 3 đến 10 bản sao RNA của vi rút rubella một cách đáng tin cậy vì nhiều mẫu có một lượng nhỏ RNA của vi rút rubella Các xét nghiệm Real time RT-PCR và PCR lồng ghép thường có độ nhạy cao Việc xác định trình tự axit nucleic của vi rút rubella được khuếch đại trực tiếp từ mẫu vật hoặc từ tế bào nuôi cấy mô bị nhiễm hiện có thể cung cấp thông tin hữu ích về vắc xin so với vi rút hoang dã, về nguồn gốc có khả năng xuất hiện của các trường hợp rubella và hội chứng rubella bẩm sinh nhập khẩu

1.3.2 Phương pháp nuôi cấy tế báo

Phương pháp phát hiện vi rút rubella qua nuôi cấy tế bào: Không có loại tế bào nào tạo ra đám hoại tử tế bào (CPE) một cách đáng tin cậy trong một lần nuôi cấy vi rút hoang dại Tuy nhiên, sự phát triển của vi rút hiện có thể được xác định trong trường hợp không có CPE bằng cách sử dụng RT-PCR, IFA và các xét nghiệm đo màu miễn dịch (ICA) để phát hiện ARN hoặc protein của vi rút

Phương pháp phát hiện vi rút rubella bằng kĩ thuật miễn dịch (ELISA): Phát hiện IgM đặc hiệu với vi rút rubella bằng ELISA trực tiếp hoặc ELISA IgM gián tiếp là xét nghiệm chẩn đoán phổ biến nhất đối với trẻ sau sinh gần đây Nếu có huyết thanh giai đoạn cấp tính và giai đoạn dưỡng bệnh, thì IgG đặc hiệu gia tăng gấp bốn lần (thường bằng ELISA) cũng được chẩn đoán là nhiễm rubella sau sinh Các xét nghiệm ái lực hiện đã được phát triển để phục vụ cho việc phân loại trường hợp nghi ngờ trong một số tình huống nhất định (ví dụ: mẫu huyết thanh đầu tiên được thu thập vài tháng sau khi có triệu chứng lâm sàng) IgG kháng rubella có ái lực thấp chứng tỏ bệnh nhân mới nhiễm trùng gần đây Các xét nghiệm ái lực là không phổ biến và hiệu suất khác nhau Các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm

11 hỗ trợ giám sát bệnh rubella và hội chứng rubella bẩm sinh thì xét nghiệm IgM đặc hiệu đối với vi rút rubella, các trường hợp nghi ngờ thì được hỗ trợ bằng các kỹ thuật khuếch đại RNA vi rút rubella Tuy nhiên, với mục tiêu loại trừ rubella ở năm trong sáu khu vực của WHO trong sáu năm tới, các chương trình kiểm soát sẽ chuyển sang các nước đang phát triển và các phương pháp kiểm tra trong phòng thí nghiệm hỗ trợ các chương trình này dự kiến sẽ thay đổi Cụ thể, các kỹ thuật phân tử tiên tiến và chẩn đoán tại điểm chăm sóc cho bệnh nhân nghi mắc rubella có thể được sử dụng Vì các triệu chứng lâm sàng của bệnh rubella sau sinh và hội chứng rubella bẩm sinh là khác nhau đáng kể, nên không có gì ngạc nhiên khi có sự khác biệt đáng kể trong phản ứng miễn dịch của những bệnh nhân mắc các bệnh này Những khác biệt này có thể được quan sát thấy trên Western blots, trong đó các kháng thể trong huyết thanh của bệnh nhân mắc hội chứng rubella bẩm sinh thường thể hiện phản ứng khác nhau với protein rubella so với phản ứng của bệnh nhân rubella sau sinh

1.3.4 Phương pháp ngưng kết hồng cầu

Một số phương pháp phát hiện khác như các xét nghiệm ngưng kết miễn dịch phát hiện các kháng thể đặc hiệu với rubella nhưng không tương quan với khả năng miễn dịch Thử nghiệm miễn dịch thường được thực hiện thương mại Xét nghiệm ức chế hemagglutinin (HI) từng là xét nghiệm tiêu chuẩn để tìm kháng thể đối với vi rút rubella và nhiều xét nghiệm hiện tại đã được hiệu chuẩn bằng xét nghiệm HI Tuy nhiên, xét nghiệm này không còn là xét nghiệm chẩn đoán thông thường Các xét nghiệm trung hòa đối với kháng thể đặc hiệu của vi rút có ưu điểm hơn các xét nghiệm khác như ELISA vì chúng đánh giá chức năng sinh học của kháng thể và có thể được sử dụng với bất kỳ chủng vi rút nào Đối với một số vi rút (ví dụ: bệnh sởi), xét nghiệm trung hòa đã được phát triển như một xét nghiệm tiêu chuẩn để xác định khả năng miễn dịch

1.3.5 Phương pháp sắc ký miễn dịch

Kỹ thuật sắc ký miễn dịch cũng được sử dụng để phát hiện kháng nguyên vi rút Rubella Hiện nay dạng que thử đã được thiết kế dựa trên nguyên tắc sắc ký miễn dịch để phát hiện kháng nguyên vi rút Rubella trong mẫu huyết thanh như que thử Rubella IgG/IgM Rapid Test của hãng CTK Biotech Đây là que thử phát

12 hiện nhanh để phân biệt giữa những bệnh nhân có nguy cơ được bảo vệ khỏi với nhóm bệnh nhân đang bị nhiễm rubella Ưu điểm của que thử dạng này là:

- Có thể phát hiện đồng thời kháng thể IgM/ IgG kháng vi rút rubella cho kết quả trong thời gian ngắn

- Có khả năng phát hiện được nồng độ kháng thể IgG kháng rubella cao (≥250

IU / mL) và thấp (15-250 IU / mL), không cần xét nghiệm ELISA

- Thời gian kiểm tra mười phút làm giảm thời gian quay vòng kết quả

- Được tiêu chuẩn hóa với Tiêu chuẩn quốc tế số 1 của WHO về globulin miễn dịch chống rubella (RUBI-1-94)

Hình 1.5 Kit xét nghiệm kháng thể IgG/IgM vi rút Rubella của hãng SD Bioline (Hàn

Ngoài ra, có 1 bộ Kit khá ưu việt được thiết kế cũng dựa trên nguyên tắc sắc kí miễn dịch Bộ xét nghiệm nhanh CDIATM Rubella IgG/IgM là một xét nghiệm miễn dịch sắc ký nhanh để phát hiện định tính các kháng thể (IgG và IgM) kháng rubella trong máu toàn phần, huyết thanh và huyết tương để hỗ trợ chẩn đoán nhiễm vi rút rubella Xét nghiệm dựa trên phương pháp sắc ký miễn dịch và có thể cho kết quả trong vòng 15 phút Thiết bị kiểm tra bao gồm: 1) miếng đệm cộng hợp màu đỏ tía chứa các kháng nguyên vỏ của vi rút rubella tái tổ hợp cộng hợp với hạt nano vàng và cộng hợp giữa IgG thỏ - hạt nano vàng 2) dải màng nitrocellulose chứa hai vạch thử nghiệm (vạch T1 và T2) và vạch kiểm soát (vạch C) Vạch T1 được phủ trước kháng thể có chức năng phát hiện IgM kháng vi rút rubella, dải T2 được phủ kháng thể có chức năng phát hiện IgG kháng vi rút rubella và dải C được phủ trước kháng thể dê kháng IgG thỏ Khi một lượng mẫu thử thích

13 hợp được phân phối vào giếng lấy mẫu của que thử, mẫu sẽ di chuyển bằng tác động của mao quản trên màng IgG kháng vi rút rubella, nếu có trong bệnh phẩm, sẽ liên kết với cộng hợp kháng nguyên vi rút rubella- hạt nano vàng Sau đó, phức hợp được kháng thể phủ sẵn trên vạch T2 bắt giữ, tạo thành vạch T2 màu đỏ tía, cho thấy kết quả xét nghiệm vi rút rubella IgG dương tính và đánh giá kết quả có thể là nhiễm trùng gần đây hoặc tái phát IgM kháng vi rút rubella nếu có trong bệnh phẩm sẽ liên kết với cộng hợp kháng nguyên vi rút rubella - hạt nano vàng Sau đó, phức hợp được kháng thể phủ trên vạch T1 bắt giữ, tạo thành vạch T1 màu đỏ tía, cho thấy kết quả xét nghiệm kháng thể kháng IgM dương tính và gợi ý nhiễm trùng mới Sự vắng mặt của bất kỳ vạch T nào (T1 và T2) cho thấy kết quả âm tính Thử nghiệm có chứa vạch nội kiểm (vạch C) Nếu không xuất hiện vạch

C, kết quả thử nghiệm không hợp lệ và mẫu phải được thử lại bằng thiết bị khác

Bảng 1.1 Một số kit chẩn đoán Rubella thương mại

STT Tên kit Tên hãng Quốc gia Độ nhạy Độ đặc hiệu

SD BIOLINE Hàn Quốc IgG - 99.14 %,

RUBELLA IGG/IGM Bioland Hàn Quốc >93,3% >91,1% IgG, IgM

3 Rubella IgG Cassette Accu-Tell Trung Quốc 99.20% 96.20% IgG

Rubella IgG/IgM Test – whole blood/serum/plasma

IgG/IgM Rapid Test CKBiotech Mỹ 99% 96,5% IgG, IgM Ở thời điểm hiện tại, chưa có que thử thương mại nào phát hiện vi rút rubella trên toàn thế giới Vì vậy, việc phát triển một xét nghiệm như vậy có tầm quan trọng lớn trong thực tiễn Trong báo cáo này, em xin trình bày phương pháp phát

14 triển và mô tả đặc tính của que thử dựa trên phương pháp sắc kỹ miễn dịch dòng chảy bên để phát hiện nhanh vi rút rubella.

Phát triển que thử nhanh phát hiện vi rút Rubella

Hình 1.6 Nguyên lý của que thử

Que thử phát hiện nhanh vi rút Rubella là dụng cụ xét nghiệm sắc ký miễn dịch định tính bằng phương pháp dòng chảy một chiều để phát hiện sự có mặt của vi rút Rubella trong dịch hầu họng: kháng thể có nguồn gốc từ thỏ kháng vi rút Rubella (KT) được gắn cộng hợp với các hạt nano vàng hình sao và cố định trên miếng cộng hợp Kháng thể được cố định lên vị trí kiểm tra của que thử (vạch T) Trong quá trình xét nghiệm, nếu mẫu dịch chiết mẫu dịch tiết đường hô hấp có chứa kháng nguyên vi rút Rubella thì sẽ tạo thành phức hợp vi rút Rubella - KT - hạt nano vàng, phức hợp này thấm theo màng di chuyển nhờ các mao dẫn gặp và bị bắt giữ tạo vạch màu với kháng thể thỏ kháng vi rút Rubella tại vạch kiểm tra (KT - vi rút Rubella - KT - hạt nano vàng) Sự có mặt của vạch màu xanh lam ở vạch T trên que thử cho biết kết quả dương tính, ngược lại trong trường hợp không có vạch màu là kết quả âm tính Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, một vạch màu xanh lam luôn xuất hiện tại vạch kiểm chứng (Protein A -

KT - hạt nano vàng) để khẳng định rằng các thành phần que thử hoạt động bình thường Như vậy, khi xuất hiện cả hai vạch ở vạch kiểm tra và vạch kiểm chứng

15 chứng tỏ mẫu dương tính với vi rút Rubella, khi chỉ có một vạch ở vị trí kiểm chứng kết luận mẫu âm tính với vi rút Rubella

1.4.2 Thành phần cấu tạo que thử

Hình 1.7 Cấu tạo của que thử

Về cơ bản, cấu tạo của một que thử gồm có các thành phần:

- Thanh nhựa đỡ: phần hỗ trợ và là đế cho các thành phần khác gắn lên

- Miếng thấm mẫu: nơi tiếp nhận dịch mẫu

- Miếng cộng hợp: vật liệu mang các hạt cộng hợp giữa các marker (hạt nano vàng, liposome,…) và kháng nguyên hoặc kháng thể

- Màng nitrocellulose: nơi diễn ra phản ứng hiện màu que thử, có chứa vạch kiểm tra và vạch kiểm chứng;

- Miếng hút: duy trì và tạo động lực cho dòng chạy mẫu đồng thời ngăn chặn sự chảy ngược của dòng

1.4.2.1 Đặc tính miếng thấm mẫu

Chức năng của miếng thấm mẫu là vận chuyển mẫu đến các thành phần khác của que thử một cách trong suốt, liên tục và đồng nhất Ngoài ra miếng thấm mẫu cũng giúp loại bỏ cặn hoặc các yếu tố gây nhiễu trong mẫu, đồng thời ổn định pH của mẫu Khi được ủ với các thành phần như protein, chất tẩy rửa, các chất tăng cường độ nhớt, muối, miếng thấm mẫu cũng có thể được sử dụng để:

- Tăng độ nhớt của mẫu

- Tăng khả năng hòa tan của mẫu vào thuốc thử

- Ngăn cản liên kết không đặc hiệu giữa cộng hợp và chất phân tích với bất kỳ vật liệu nào trên que thử

- Biến đổi bản chất hóa học của mẫu sao cho tương thích với sự hình thành phức hợp miễn dịch tại vạch xét nghiệm

- Thúc đẩy dòng chảy đều của mẫu dọc theo màng

Sự có mặt của protein bổ sung (chẳng hạn như albumin), chất tẩy rửa và chất hoạt động bề mặt (chẳng hạn như SDS hoặc TWEEN® 20 ở nồng độ rất thấp) có thể thúc đẩy quá trình tái hòa tan của chất liên hợp, làm giảm sự liên kết không đặc hiệu của chất liên hợp và có thể giảm thiểu sự hấp phụ của chất phân tích với màng Bằng cách thêm các chất chặn vào miếng đệm mẫu, có thể loại bỏ việc chặn màng Cách tiếp cận này có thể dễ dàng hơn nhiều và tiết kiệm chi phí hơn đáng kể so với việc cố gắng chặn màng trực tiếp Trừ khi kháng thể (hoặc kháng nguyên) được liên kết cộng hóa trị với hạt dò, không nên làm khô đệm chạy vào miếng liên hợp khi có protein chặn hoặc chất tẩy rửa Các protein ngoại sinh, đặc biệt là khi có chất tẩy rửa, có thể thay thế kháng thể hoặc kháng nguyên khỏi hạt dò trong quá trình bảo quản kéo dài Do đó, miếng thấm mẫu có thể là vị trí duy nhất trong thiết bị thử nghiệm ngoài màng nơi có thể thêm các tác nhân ngăn chặn và phân giải một cách an toàn

Một số thử nghiệm yêu cầu các mẫu thể hiện sự thay đổi lớn về thành phần hóa học Ví dụ, nước tiểu của con người có thể có độ pH trong khoảng từ 5 đến

10 Sự khác biệt về độ pH và cường độ ion có thể thay đổi tính đặc hiệu và độ nhạy của thuốc thử và thúc đẩy các mức độ liên kết không đặc hiệu khác nhau của thuốc thử phát hiện do thay đổi mật độ điện tích Việc thêm nồng độ muối đệm tương đối cao vào miếng mẫu (ví dụ: bằng cách xử lý trước với dung dịch đệm borat 1M, pH 9,5) có thể giảm thiểu sự biến đổi bằng cách kiểm soát độ pH và cường độ ion của dung dịch thoát ra từ miếng thấm mẫu

Có hai loại vật liệu thường được sử dụng làm thấm mẫu: màng lọc sợi cellulose và lưới dệt

Các mắt lưới dệt, đôi khi được gọi là màn chắn, thường hoạt động rất tốt để phân phối thể tích mẫu đồng đều trên đệm liên hợp Chúng cũng thường có độ bền kéo tốt và xử lý tốt, ngay cả khi bị ướt Các mắt lưới có thể tích giường rất thấp, nghĩa là chúng giữ lại rất ít thể tích mẫu, thường là 1 – 2 μL/cm2 Mặt khác, sẽ không thực tế nếu xử lý chúng với mục đích nạp vào chúng đủ chất hòa tan để thay

17 đổi hàm lượng protein, độ pH, cường độ ion hoặc độ nhớt của mẫu thử Lưới cũng có thể đắt so với các phương tiện xốp khác và khó xử lý thông qua máy cắt dải

Bộ lọc cellulose có các đặc tính gần như ngược lại với lưới dệt Chúng dày (> 250 μm), yếu và tương đối rẻ Bộ lọc cellulose cũng có thể tích lớn (> 25 μL/cm2) Giấy có thể rất khó xử lý, đặc biệt là khi bị ướt Bộ lọc cellulose là vật liệu được sử dụng phổ biến nhất để tạo miếng thấm mẫu vì chúng có thể được nạp nhiều loại chất chặn, chất giải phóng thuốc thử, chất điều chỉnh pH và cường độ ion và chất tăng cường độ nhớt Khi sử dụng miếng thấm là cellulose, phải cẩn thận để đảm bảo tiếp xúc đầy đủ và nhất quán với vật liệu đệm liên hợp bên dưới Việc không tiếp xúc tốt và nén đầy đủ có thể dẫn đến việc truyền chất lỏng vào đệm liên hợp bị gián đoạn hoặc không nhất quán

1.4.2.2 Đặc tính miếng cộng hợp (conjugate pad)

Miếng cộng hợp thực hiện nhiều nhiệm vụ, nó là nơi cố định cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng và khi có dòng mẫu từ miếng thấm mẫu chuyển tới, nó giải phóng cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng theo mẫu vào vàng Yêu cầu đối với miếng cộng hợp cần có là:

- Khả năng liên kết đặc hiệu thấp: Nếu cộng hợp hoặc chất phân tích liên kết chặt chẽ với miếng cộng hợp, nó sẽ không tạo thành phức hợp miễn dịch tại vạch kiểm tra, do đó giảm cường độ tín hiệu và độ nhạy

- Ổn định đặc điểm dòng chảy: Đặc tính dòng chảy không ổn định có thể gây ra các vấn đề nghiêm trọng hiệu suất Nếu vật liệu miếng cộng hợp không duy trì đều dòng mẫu vào màng thì cộng hợp có thể chuyển lên màng nhưng sẽ tạo thành các vệt tín hiệu không đồng đều tại vạch kiểm ta và vạch kiểm chứng

- Thể tích trống thích hợp: Khi nạp cộng hợp vào miếng cộng hợp thì lượng phức hợp trên mỗi que thử phụ thuộc vào thể tích trống của vật liệu Nếu thể tích trống thay đổi đáng kể thì biến đổi cường độ tín hiệu có thể quan sát thấy khá rõ dù các thành phần khác giữ cố định

- Độ ly giải thấp: Các hạt tự do trong vật liệu làm miếng cộng hợp nếu không dễ dàng ly giải khỏi vật liệu thì có khả năng gây tắc nghẽn tại vùng tiếp xúc của miếng cộng hợp và màng

18 Miếng cộng hợp có ảnh hưởng rất lớn đến độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử Các vật liệu thường được sử dụng làm miếng cộng hợp bao gồm: sợi thủy tinh, sợi cellulose, polyester và polypropylene

Bảng 1.2 Đặc tính của các vật liệu chế tạo miếng cộng hợp

Vật liệu Mô tả Ưu điểm Nhược điểm

Dày 100 - 500pm, có thể bao gồm các chất kết dính để giữ các sợi lại với nhau

Thể tích hấp phụ lớn, liên kết đặc hiệu thấp

Tính bền kém, khó cắt và khó xử lý

Dày 300 - 1000 pm, sợi nhỏ gọn, mật độ phù hợp

Liên kết không đặc hiệu rất thấp, thường rất đồng đều

Thể tích hấp phụ cao (>50pl/cm 2 ), rất yếu khi bị ướt

Polyester Dày 100 - 300 pm, kỵ nước

Liên kết không đặc hiệu thấp, độ bền cao và dễ xử lý

Thể tích hấp phụ thấp và đôi khi thay đổi (