Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Ứng dụng phương pháp LC-MS

Chen cùng nhóm nghiên cứu đã định lượng Aflatoxin trong sữa bang UHPLC-MS/MS với phương pháp xử ly mẫu có dùng cột IAC, 50 ml sữa táchbéo được cho qua cột mà không dùng dung môi chiết..

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRUONG ĐẠI HOC BACH KHOA —DHQG -HCMCán bộ hướng dẫn khoa học : TS Trần Thi Kiểu Anh

Chữ ký :

Cán bộ chấm nhận Xét Ì : - 6E sE9E9E2E2E SE SE EEsEseskeerereed

Chữ ký :Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bach Khoa, DHQG Tp HCM ngay tháng năm

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vi của Hội đông châm bảo vệ luận văn thạc si)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi

luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TONG QUAN 5-5521 E525 1115151511 23111115 11111111511 1111 111110111 91.1 So lược về AflafOXỈH: 5-52 S239 E821 E915 5111111115111 1115151111111 Te 9L.1.1 Giới thiệu về AflafOXin te St 3 S888 188511885118 551 1851111115 118 EEeErersrd 91.1.2 Tính chất vật lý ccccccccccsccscccscscsssscscscscsssscscscscsssscscssscsssssscssessssessessessesees 101.13 Nguồn gốc phát sinh -¿ - + + 2 SE+E+E+E£EEEE£E£E+EEEEEEEErErrerersred 111.1.4 Giới hạn tối đa cho phép của Aflatoxin trong Sữa 5s zssss£ss£+ssss2 121.1.5 Hiện trạng nhiễm Aflatoxin trong sản phẩm cho người và động vật 13

1.1.3.] ]NØOài DƯỚC CC G CƠ 0001003 90H HH KH SH KH 1v cv st 131.1.5.2 — TTONØ nHƯỚC - c QC 0600506095000 6003 60 10 KV kv Kk ky à 151.1.6 Phương pháp xác định AfÏafOXIH - cc c5 << S2 161.1.6.1 Phương pháp xử lý mẫu - - + + £+*+E+*+E+E+E£E£££££££z£exeerered l61.1.6.2 Các phương pháp phan tích định lượng - << << <<<<<<< 20

1.17 Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký -5- 252 255+s+£s£ccszs2 23

].].7.I Dinh nøhĩa - G - CG G0 E31 6590 185 609 115 653 16 165 15 1813 ky sxe 231.1/72 Phân loại -5- 5C SE SE 1E 1115111111511 1111511 111111111 ck 23

1.1.7.3 Nsuyên lý hoạt động của cột sặc SA 241.1/74 Giới thiệu chung về sắc ký lỏng - - + 5-5-5 2 2£2+E£E+E+Ez£E£Ereresreei 281.1.7.5 Các bộ phan cơ bản của hệ thông HPLC -.- 252 2e ++E+s£+Ese£+Ezs=2 281.18 Sắc ký lỏng đầu dò khối phô - - + 252 +S+S+E£2£E£E+E+E£E£E£ErEzEreerersred 321.1.8.1 Cấu tạo chung của hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ 321.1.8.2 Các hệ thống tách khối - - - + 2E +E+E+E£EEEE£E£ESESEEEEEEEErkrrrreee 35CHƯƠNG 2: DOI TƯỢNG — PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 5-5: 392.1 ĐÓI TƯƠNG — MỤC TIỂU — NOI DUNG NGHIÊN CỨU: - se szs s2: 39

2.1.1 Đối tUONG ceeccccceccccccccceccescssssescesscsscseesessssssesessesssssessessesesesssssssesessessscssesssesseesees 39

2.12 Mục đích 5< E319 E3 1515 111515111111 1111511 111111111 cX 39

2.1.3 Y nghĩa thực tiễn ©E- + SE SE SE E#E9EEEEEE 1915151111 11511 1111k 392.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 2 22 S22 SE£E£E+E£££E£E£EzEersrrered 39

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM -©- - 2E SE EE£E+EEEEEESEEEEEEEEEEEE1E1111515 11.2 cEeU 40

3.1 KHẢO SÁT CAC THONG SỐ LC-MS/MS 2-5-5252 2E+£££EzEzrresrred Al3.1.1 Khao sát các thông số của đâu dò - + ¿26 +2 SE SE£E£E+EEEEE£ErEeErsrersred 413.1.2 Khảo sát các thông số LỤC - + 2 6 +E+E+EEESEEE£ESEEEEEEEEE5E1 E5 52121711 2xx 423.1.2.1 Khao sát thành phan pha động + +22 £+eEE+EE+E+EE+E+EE+E+EEeEsezszssz 423.1.2.2 Khảo sát nỗng độ acid acetic thêm vào ¿25s £+e+£+E+E£eE+EEeE+erssss 42

3.1.2.3 Khao sát độ lặp lại của thời gian lưu và điện tích - 42

3.2 KHẢO SÁT CÁC YÊU TÔ ANH HUONG DEN HIEU SUAT THU HOI CUAPHƯƠNG PHÁP ¿G252 SE SE2EE9EEEEEEE£E9EEEEEEEEE1913E1 1121115151115 1115150111110 43

3.2.1 Khảo sát lượng muối - ¿+ + %+£+E+E£E#EEEEEE£E£EEEEEEEEEEEEEEEEEEErkrrrrees 433.2.2 Khảo sát thé tích dung môi chiết - - + 22 2 2££+*£E+E££££££E£E+Ez£zcze: 433.2.3 Khảo sát thời øian lắc - Set te S33 ES3 1315815581158 1555811581513 EEEEEEEEsereeree 433.3 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP + 256556 2E EEEE£E£E2EEEEEEEEEEEErrrrkred 433.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp - 2= +ss+ss++s£zsczsezsczs: 43

3.3.2 Khao sát gidi han phát hiện (LOD) và gidi han định lương (LOQ) của phươngpháp 44

3.3.3 Xác định độ chính xác của phương pháp «5 << +sssssexs 443.3.3.1 DO CHUM (pT€CISIOI)) GG G9101 11g vớ 453.3.3.2 DO đúng Gà 48

3.4 ÁP DỤNG PHƯƠNG PHAP ĐÃ DANH GIA DE XÁC ĐỊNH AFLATOXIN M,TREN MAU SUA THUG o.cecceecsessessessssssssssessesecsecseesssueauesnsseeseesecsecuesuesnesteaeeseeneeneanen 50

CHƯƠNG 4: KET QUA VA BAN LUAN vececccccccccsssscescssssssceseessssecesesssssscesessessssssesssesseeses 504.1 KHẢO SÁT CAC THONG SO LC-MS/MS 55c cccccierrierrrrrrrrrrree 504.1.1 Khao sát các thông số LC-MS/MS - ¿25 552 S2 +E£E+EzE£E£EzEzeerrsred 504.1.2 Khảo sát các thông số LC wes ecesesesseesssesnesssesseesneesesssesncenccusennceneeneeneenseenes 544.1.2.1 Khao sát thành phần pha dOng ccccccccccsccssessessescessessescesecscesscseesseseeseeseesees 544.1.2.2 Khao sát nông độ acid acetic thêm VàO - << << 5< S s11 £s 55

4.1.2.3 Khao sát độ lặp lại cua thời gian lưu và điện tích - - - - << << << 56

42 KHAO SÁT CÁC YÊU TO ANH HUONG DEN HIEU SUAT THU HOI CUAPHƯƠNG PHÁPP ¿©- S2 SE SE2EE9EEESEEEEE9E5EEEE 31151151121 11515 111111151112 11 11x06 57

4.2.1 Khảo sát lượng muối - ¿2© + 2 E+E+E+E£EEEE£E£E+E£EEEE£EEEEEEEEEErErErrrrerered 574.2.2 Khảo sát thé tích dung môi chiẾt, - - + 2 2s £+£2£E+E£E+Ez££££EzEzEz sẻ 584.2.3 Khao sat thời gian Ra 594.3 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP - - + 22 E S2 SE£E£E£E+E£EE£E£E£EzEeEzrererkreee 604.3.1 Khoảng tuyến tính của phương pháp và ảnh hưởng của nền mẫu 60

4.3.2 Khao sát siới han phát hiện (LOD) và øiới han định lượng (LOQ) của phươngpháp 61

4.3.3 Xác định độ chính xác của phương phấp - - 5< << < << s1 << << s+ 63

44 KẾT QUA PHAN TÍCH MAU THỰC - + 2 2£ 2£2££+E+E+£z££szxzceẻ 66CHƯƠNG 5: KET LUẬN VA DE NGHỊ . +-2- 5 252 SE2E+E2E£E£E£E£ESEEErzrkrkrree 685.1 KẾT LUẬN -.- E1 E2 E23 15151511 13151115 111101151101 11 111111 r 685.2 DE NGHI ceececcccccccccecccsccescesccsscesceseesscssecsesssssscsessessscssessessssesssssssasssessesssesssesacsacesees 69

DANH MỤC CHỮ VIET TATAFMI (Aflatoxin Mi) Độc tố Aflatoxin M,

AOAC (Association of Official Hiệp hội các nhà hóa phan tíchAnalytical Chemists) chính thức

CV (Coefficient of variation) Hệ số biến thiênELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Thử nghiệm miễn dịch găn menFAO (Food and Agriculture Organization Tổ chức Luong thực và NôngOf the United Nations) nghiệp Liên Hiệp QuốcHPLC (High pressure liquid chromatography) Sac ký lỏng hiệu năng cao

IAC (immunoaffinity column) Cột miễn dich

ISO (International Organization for Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế

Standardization)

IUPAC (International Union of Pure and Liên minh Quốc tế về Hóa hocApplied Chemistry Nomenclature) thuần túy va Hóa hoc ứng dụngLC-MS/MS (Liquid chromatography— Sắc ký long ghép 2 lần khối phố

mass spectrometry)

LLE (Liquid liquid extraction) Chiét long — long

LOD (Limit of detection) Gidi han phát hiệnLOQ (Limit of quantitation) Giới hạn định lượng

MRL (Maximum residue limit) Giới hạn tồn dư tối đa cho phépP-HPLC (Reversed phase high pressure Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo

DANH SÁCH CAC BANGBang 1.1 Giới hạn cho phép Aflatoxin M, trong sữa và các sản phẩm từ sữaở một SỐ QUOC BỈa . cc- c2 1122112112111 11 1111115111 111 11 1k xc trang 10Bảng 1.2 Các nghiên cứu về sự hiện diện của Aflatoxin M, trong sữa thô

O MOE ân, nưaidiiidđdiidd 11

Bang 1.3 Dữ liệu về các nghiên cứu sự hiện diện cua Aflatoxin trong sữa ở các

nước Đông Á c c1 SH HH TH TH TK ng KT nà nh Hy và 12Bang 1.4 Dữ liệu vé các nghiên cứu sự hiện diện cua Aflatoxin trong sữa ở các

nước Trung Đông, Châu Phi và Mỹ Latin - 13

Bang 1.5 Phân loại các phương pháp sắc ký COt 0 ce cee ceeceeeceeeeeeeeeeeaeeen 22Bảng 3.1: Chương trình gradient nồng độ - -c-cc-ccccccccsc* se: 40Bang 3.2 : Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 48Bang 3.3 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC 2002) 48Bang 3.4: Quy định về độ thu hồi của hội đồng châu Âu - 48Bảng 4.1 Kết quả khảo sát các chương trình dung môi khác nhau 54Bang 4.2 Kết quả nồng độ acid thêm vảo - c- S222 s2 55

Bang 4.3 Độ lặp lại của diện tích peak, thời gian lưu và tỉ lệ 2 ion 5S

Bảng 4.4 Khoảng tỉ lệ ion cho phép dé định danh mẫu dương tính 56Bảng 4.5 Kết quả khảo sát lượng muối thêm vảo -c <<: 57Bang 4.6 Kết quả khảo sát thé tích dung môi chiẾt - -. << << 5: 58Bang 4.7 Kết quả khảo sát thời gian lắc 5 phút, 10 phút, 15 phút và 20 phút 59Bang 4.8 Độ thu hồi của Aflatoxin M, trong sữa thô tại nồng độ 0,025 ug/L 62Bảng 4.9 Kết quả lặp lại 7 lần ở nỗng độ 0,05 ppb - 2-2 63Bảng 4.10 Kết quả phân tích 7 lần lặp lại ở nồng độ 0,25 ppb - - 63Bảng 4.11 Kết quả lặp lại 7 lần ở nồng độ 0,5 ppb - -.-<-<<< ees 63Bảng 4.12 Kết quả lặp lại 7 lần ở nồng độ 2 ppb - - << <s: 64Bảng 4.13 Kết quả phân tích Aflatoxin trong mẫu thực ‹-. - 66

DANH SÁCH CÁC HÌNHHình 1.1 Công thức cau tạo Aflatoxin My - ccc c2 trang 7Hình 1.2 Các loại Aflatoxin phố biến - c- c2 222cc sen 8Hình 1.3 So sánh hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích bằng chiết lỏng — lỏng

và dùng IAC c0 011211111111 1k nnk TT nh nga 16

Hình 1.4 Sơ đồ các thành phan chính của một hệ thống HPLC 19Hình 1.5 Quá trình tách sắc ký trên cột của hai chất A và B 23Hình 1.6 Trình bày sơ đồ một hệ thống sắc ký lỏng -. 25- 25255252 5s2s+c+2 27Hình 1.7 Nguồn ion hóa ESÌ -c c2 222211121112 1111 111 1181 1kg 31Hình 1.8 Nguồn ion hóa hóa học ở áp suất thường . -<- 32Hình 1.9 Nguồn ion hóa quang học tại áp suất khí quyền - 33Hình 1.10 Trinh bay ứng dụng của 3 nguồn ion hóa cho các hop chất có độ phân cực

khác nhau CC QC 2020202 2 0 0 ng HE HH ng ng nh sa 33

Hình 1.11 Thiết bị phân tích tứ Cực - ‹ cc c2 2111122112211 ee 34Hình 1.12 ThiẾt bị 3 tỨ CỰC - - c2 1211221112111 111111111 1112 va 34Hình 1.13 Mô hình đầu dò TOE . - c7 c2 2211211121113 1 15x12 35

Hình 1.14 Mô hình bay ion -. .cc C22212 121111 vs srêg 36

Hình 3.1 Qui trình phân tích mẫu dự kiến . -cc< << << 39Hình 3.2 Biểu diễn mdi liên hệ độ chính xác theo độ đúng và độ chụm 43Hình 4.1 Kết quả phố quét fullsCan - ¿5-5 2 S2 2*+E+E££E+E£EeE£E+EeEzxexererreree 50Hình 4.2 Kết quả khảo sát giá trị fragmentor thay đổi từ 60 — 110 V 50Hình 4.3 Kết quả khảo sát các giá tri fragmentor thay đôi 100, 105 110,

II” 'ˆ 51

Hình 4.4 Kết quả khảo sát giá tri CE thay đổi từ 5- 30 eV 52Hình 4.5 Kết quả khảo sát giá tri CE thay đổi từ 15 — 25 eV 52Hình 4.6 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu lên đường chuẩn 60Hình 4.7 Sac ký đỗ mẫu spike 0,02 ppb - -cc-cc cv sa 61Hình 4.8 Sac ký đỗ mẫu spike 0,05 ppb cee cece ccc eeceecceccuseuceuseuscusccneces 61Hình 4.9 So đồ qui trình xử lý mẫu eee c2 2 2222121122 65

CHƯƠNG 1: TONG QUAN1.1 So lược về Aflatoxin:1.1.1 Giới thiệu về Aflatoxin: [1]

Aflatoxin M, con có tên gọi là methoxycyclopenta[clfurol3ˆ ,2ˆ :4,5]furo[2,3-h][IJbenzopyran-l,lI-dion hay 4hydroxyAflatoxin Bị,

2,3,6a,9a-Tetrahydo-9a-hydroxy-Công thức phân tử: C¡;H¡zO;

Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công thức cầu tạo Aflatoxin M¡- Aflatoxin là một trong những mycotoxin thường gặp nhất, được sinh ra chủ yếu bởi hai

loại mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus.- (C66 loại Aflatoxin pho biến nhất:

0 ae 0 id ìrt Lid [ [| | ]

i) ibe, ile < OCH, :8“ “oO OCH,Aflatoxin B, Aflatoxin B,

Độc tính của Aflatoxin:| 5-9]

Các Aflatoxin được phân lập đầu tiên và được nhận diện như là tác nhân gây bệnh hoại tử gannăm 1960, hơn 100.000 con gà tây chết ở Anh và Mỹ được cho ăn đậu phộng nhiễm mốc.Đối với động vật: tác hại của Aflatoxin là gây giảm tăng trọng, chán ăn, sa trực tràng, phù nềbụng, giảm khả năng sinh sản, say thai và giảm khối lượng sơ sinh Một số bang chứng cũngcho thay Aflatoxin ảnh hưởng đến vi dạ cỏ, dẫn đến giảm sự phân giải chất xơ, sản xuất acid

béo bay hơi và hình thành amoni Aflatoxin gay ra các tình trạng bệnh móng, khớp trên bò sữa,

lông thô, xanh xao, gan nhiễm mỡ, tiêu chảy, ức chế miễn dịch, Trong trường hợp nhiễm cấptính còn có các triệu chứng thần kinh như đi lòng vòng, tai co giật, nghién rang, chảy bọt ởmiệng, hôn mê và mất điều hòa

Đối với con người: bệnh do nhiễm Aflatoxin cấp tính đã được thông báo ở các nước, với cácbiểu hiện chủ yếu là suy chức năng gan cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan Một loạt các nghiêncứu cho thay tỷ lệ mac ung thư gan nguyên phát tăng ở những vùng có tỷ lệ phơi nhiễm cao vớiAflatoxin, nhưng cơ chế tác động của Aflatoxin gây ung thư gan ở người như thế nào vẫn cònnhiều tranh cãi Tuy nhiên, đã tìm thấy sự gắn kết của Aflatoxin với ADN của tế bào gan ởnhững bệnh nhân bị ung thư gan nguyên phát, phức hợp này còn được tìm thấy trong máungoại vi, trong máu nhau thai và máu dây rốn của các sản phụ có phơi nhiễm với Aflatoxin.Bên cạnh đó còn có sự liên quan giữa phơi nhiễm Aflatoxin với sự đột biến gen ở các bệnhnhân này, mà nhiều nhất là sự đột bién gen p53 — một gen kiểm soát sự chết tế bào theo chươngtrình Khi đột biến gen này sẽ làm đời sống tế bao tăng lên kéo theo nguy cơ tế bào sẽ chuyển

thành ác tính Ngoài ra, Aflatoxin còn được chứng minh là có ảnh hưởng tới sự còi cộc, kém

phát triển ở thai nhi và trẻ em.1.1.3 Nguồn gốc phát sinh :[5-7, 10-12]Các sản phẩm thực phẩm dé bị nhiễm độc tố Aflatoxin bao gdm ngu cốc (ngô, lúa, kê, gạo, lúamì), hạt có dầu (lạc, đậu tương, dầu hướng dương, bông), gia vi (6t, hạt tiêu đen, rau mùi, bộtnghệ, gừng), hạt cây (hạnh nhân, hồ trăn, óc chó, dừa) và sữa Aflatoxin là độc tố tự nhiên chủyếu được sản xuất bởi hai loại nắm mốc: Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus Trongđó, Aspergillus flavus là phố biến rộng rãi trong tự nhiên và thường được tìm thay khi các loạingũ cốc được phát triển trong điều kiện nóng âm Loại nắm này có trong đất, thực vật phân

hủy, co khô, hạt trải qua sự suy giảm vi sinh và xâm nhập tat cả các loại chat nên hữu co bat cứ

khi nào và bất cứ nơi nào các điều kiện thuận lợi cho sự tăng trưởng của nó Điều kiện thuận lợibao gdm độ âm cao và nhiệt độ cao Có ít nhất 13 loại Aflatoxin khác nhau được hình thànhtrong tự nhiên với Aflatoxin Bị được coi là độc nhất.

Aflatoxin B, sau khi bò ăn vào thì khoảng 0,3 — 6,2 % được bài tiết qua sữa dưới dang

Aflatoxin M, Aflatoxin M, được phát hiện sau khi bò ăn Aflatoxin Bị va đạt hàm lượng cao

nhất sau 2-3 ngày, không phát hiện sau 3 ngày không ăn thức ăn nhiễm Aflatoxin.1.1.4 Giới hạn tối đa cho phép của Aflatoxin trong sữa

Vì các tác hại rất nguy hiểm mà độc tổ này gây ra cho người va động vật nên giới hạn cho phépcủa Aflatoxin trong thực phẩm rất thấp, đặc biệt đối với sữa là 0,5 „g/kg theo qui chuẩn quốcgia đối với giới han 6 nhiễm độc tô vi nam trong thực phẩm (QCVN 8-1:2011/BYT)

Bảng 1.1 Giới hạn cho phép Aflatoxin M, trong sữa và các sản phẩm từ sữa ở một số quốc gia

[15].

Quốc gia Ham lượng AFMI cho phép (ug/L)

Phap 0,05 : Sữa cho người lớn

0.03 : Sữa cho em bé

Thổ Nhỉ Kỳ 0,05: Sữa và các sản phẩm từ sữa

0.25: Phô maiCH Czech 0,1: Sữa cho em bé

0,5: Sữa cho người lớnBỉ 0.05: Sữa

Mỹ 0,5: Sữa

Thụy Sỹ 0,05: Sữa và các sản phẩm từ sữa

0.25: Phô maiHà Lan 0.02: Bơ

0.2: Phô maiĐức 0.05: Sữa

Úc 0.05: Sữa

1.1.5 Hiện trạng nhiễm Aflatoxin trong sản phẩm cho người và động vật:

1.1.5.1 Ngoài nước:Năm 2007, tại Lahore, Pakistan, Khushi Muhammad và cộng sự đã phân tích 84 mẫu sữa thô,

kết quả là 81% nhiễm Aflatoxin M, vượt quá giới han cho phép [13] Theo Hikmet MavusBuldu năm 2008 đã phân tích 90 mẫu sữa thô tại nguồn ở Thổ Nhỉ Kỳ, cho kết quả là 100%mẫu đều dương tính với Aflatoxin M¡ với nồng độ từ 5-80 ng/L [5] Năm 2011, tại tỉnh Gilan(phía Bac Iran), Reza Kazemi Darsanaki và cộng su đã phan tích 90 mau sữa nguyên liệu, kếtquả có 56 mau trong tổng số 90 mẫu nhiễm Aflatoxin M, nông độ từ 2,1-131 ng/L [14] Bảng

1⁄2— 1.4 trình bày một số kết quả phân tích Aflatoxin trong sữa trên thé giới.Bang 1.2 Các nghiên cứu vé sự hiện diện của Aflatoxin M, trong sữa thô ở một số nước [6]

Số mẫu sữa phân | % số mẫu nhiễu Aflatoxin M, vượt quáQuốc gia tích mức 50 ngi]

Argentina 56 0Hy Lap 166 1.8Indonesia 342 21

Italia 296 1.7UAE 59 56Thai Lan 310 84Iran 100 78

Bang 1.3 Dữ liệu về các nghiên cứu sự hiện diện cua Aflatoxin trong sữa ở các nước Đông A

[7]

Quốc gia Mẫu Nhiễm (¿g/L) Số mẫu Hàm lượng | Đối tượng

dương nhiễm có (ug/L) mautính/tổng hàm lượng

số mẫu > MRL

(ug/L)Trung Quoc | 135/135 0.008 I8(13%)(0- | Sữa va

0.16) 79 các san(0.16 to 0.5) | phẩm từ

sữa

Trung Quốc | 43/72 Mùa Mùa đông | 0.01-0.42 | Sữa

xuân(0.029), I13>0.05Mùa hè(0.032),

Mùa thu(0.032),Mùa

đông(0.124)Trung Quốc | Sữa UHT UHT Sữa

109/179 20%>0.05 | 51.9%(0.00tiệt trùng Pasteurized | 6-0.16)UTH 65%>0.05_ | Pasteurized84/153, tiệt 96.2%(0.02trùng 3-0.154)Pasteurized

4/26)Hàn Quốc | 48/100 2>0.05 0.002-0.08 | Sữa thôIndonesia 113/113 48 < 0.005 g/l, |0>0.025 0.006-0.015 | Sữa tươi

65 (0.005- and 0.050.025)

Thái Lan | 150/150 Tat cảcác |LOD-— Sữa tươi

mẫu<0.5_ | 0.114

Nhat 298 Trung binh 0 Sữa thô

0.085

Bang 1.4: Dữ liệu vê các nghiên cứu sự hiện diện cua Aflatoxin trong sữa ở các nước TrungĐông, Châu Phi và Mỹ Latin [7|

Quốc gia Mẫu dương Nhiễm Sô mẫu Hàm lượng Đôi tượng

tính/tổng số (ug/L) | nhiễm có (ug/L) maumau ham lượng >

MRL(ug/L)

Brazil 25/36 0.062 0.011-0.161 | Sữa

119/125 0.031 33 mau 0.01-0.2 Sữa83 (26.4%)>0.0 | 0.008-0.437 | Sữa

5 0.02-0.76Sữa 0.001-0.11783%=0.003

Morocco 39/44 0.0186 3(7 4%) 0.001 - 0.1 Sữa tiệt trùng

13/48 >0.05 0.01-0.100 Sữa nguyên

4>0.05 liệuKuwait Stra 176/321 Phô mai | Sữa tươi 8 0.0049- Sản phẩm

Phô mai 32/40 | 0.088 >0.05 0.0687 sữa

4>0.05 LOD-0.088Phô mail > | 0.024-0.0040.25 Phô mai

0.024-0.452,0.02-0.765Syria 101/126 52% > 0.05 0.020-0.765 SữaAI Cập 175 25>0.05 <0.018-> Sữa

15>0.05 0.25

Lebanon 100/138 Sữa II>0.05 | 0.0012-0.315 | Sữa va sữa

Sữa chua chua42/44 4>0.05

trường và mâu do cơ sở xuât mang tới đăng ký kiêm nghiệm Việc bảo quản không tôt các loạithực phầm như lạc, ngô, một sô hạt có dâu, lúa mi, gạo, săn, sữa v.v thường dân đến tìnhtrạng sinh nam moc Những nâm moc ây tạo ra một loại độc tô vi nam là Aflatoxin Bị.

Trong thực tế chăn nuôi bò sữa ở khu vực Thành Phố Hỗ Chí Minh, bò được nuôi dưỡng từ cácnguồn phụ phế phẩm như: xác mì, hèm bia, bã đậu mà các loại này là môi trường rất thuận lợiđể nắm mốc phát triển Nhiều nghiên cứu cho thấy bò sữa ăn phải Aflatoxin từ thức ăn thì phầnlớn Aflatoxin được bài tiết khỏi cơ thé là qua đường sữa và chuyên hóa từ dạng B, thành dang

Aflatoxin M, [8, 9].Aflatoxin đang ngày cảng được chu ý do các tác tac hai ma nó gây ra cho động vật va con

người Aflatoxin không bị phân hủy trong quá trình xử lý (thanh trùng hay đun nấu) và bảoquản sữa hay các quá trình chế bién các sản phẩm từ sữa [12, 15, 16] Do đó, nếu nguồn sữa thôbị nhiễm độc tổ thì sau đó Aflatoxin vẫn có khả năng hiện diện trong các sản phẩm từ sữa như:bơ sữa, phô-mát, sữa chua Các tác động đến kinh tế của Aflatoxin trực tiếp: cây trồng bịmất mùa, ảnh hưởng đến vật nuôi và sức khỏe con người: gián tiếp: phải mất chi phí định kytrong việc kiểm soát chất lượng, nghiên cứu, đóng gói và bảo quản hàng hóa Do đó, việc kiểmsoát ham lượng Aflatoxin trong thực phẩm và nhất là trong sữa là rat quan trọng

Ngoài ra, giới hạn cho phép của Aflatoxin trong thực phẩm rất thấp, đặc biệt đối với sữa là 0,5ug/L theo tiêu chuẩn Việt Nam Do đó việc lựa chọn phương pháp LC-MS/MS để phân tíchAflatoxin M, trong sữa thô là phù hợp vì các ưu điểm của kỹ thuật này: độ chọn lọc cao, độnhạy cao và đặc biệt là giới hạn phát hiện thấp

1.1.6 Phương pháp xác định Aflatoxin:1.1.6.1 Phương pháp xử lý mẫu:

Dùng cột SPE

Những cải tiến đáng kế trong việc làm sạch mẫu trong phân tích Aflatoxin là sử dụng cột chiếtpha rắn (SPE) Các mẫu phân tích được cho qua một cột chứa C-8 hoặc C-18, các chất phântích sẽ bị giữ lại trong cột Các chất ban được rửa bỏ bằng nước Cuối cùng, các chất phân tíchđược rửa giải bằng dung môi phân cực là methanol hay acetonitrile Ưu điểm của nó là tiêu thụít dung môi hơn và khả năng tự động hóa Một thí nghiệm đã được tiễn hành bởi Bil và cộngsự năm 1987 [17], phân tích các mẫu pho mát được chiết xuất với hỗn hợp acetone nước (3 +

Acetone bay hơi trong chân không va pha nước được đưa qua một cột C-18 dùng một lần Saukhi cột được rửa băng hỗn hợp acetonitrile-nước (1 + 9), độc tố được tách rửa băng acetonitrile.Cuối cùng thì việc định lượng được thực hiện bởi phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hop hoặcbăng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo cột C18 với đầu dò huỳnh quang Độ thu hồi được lớnhon 90%, hệ số biến đổi là 6% Giới han phát hiện của phương pháp khoảng 10 ng/kg Manettavà cộng sự đã sử dụng cột C-8 trong quá trình làm sạch, sau đó phân tích bang phương phápHPLC với đầu dò huỳnh quang, dùng pyridinium hydrobromide perbromide dé tạo dẫn xuất saucột để xác định Aflatoxin trong sữa và pho mát [18] Giới hạn phát hiện trong sữa và pho mát là1 ng/kg và 5ng/kg Khoảng tuyến tính của đường chuẩn là 0,001-0,1 ng/kg Độ thu hồi trungbình của Aflatoxin M, từ sữa và phô mai ở nồng độ 25-75 ng/kg và 100-300 ng/kg, tương ứng,

là 90 và 76%.Dùng cột miễn dịch (IAC-immunoaffinity column):

Cột ái lực miễn dịch đã trở nên ngày càng phố biến cho mục đích làm sạch mẫu vì những ưuđiểm như chọn lọc và rat dé sử dụng Chúng có thé được dùng để lọc các mẫu bị nhiễm cácAflatoxin khác nhau Các phân tử chất phân tích (Aflatoxin) liên kết chọn lọc kháng thể trongcột Các thành phan khác trong nền mẫu không tương tác với kháng thé và có thé được rửa bỏ.Chất phân tích có thể được tách rửa với một dung môi gây biến tính kháng thể Sử dụng cột áilực miễn dịch cho độ thu hồi cao [19, 20]

Maria Helena Iha và các đồng nghiệp đã dùng cột ái lực miễn dịch để làm sạch mẫu trong quátrình phân tích Aflatoxin M, trong các sản phẩm từ sữa Dung dịch HzO:MeOH (55:45) đượcdùng làm dịch chiết, sau đó cho dịch chiết này qua cột IAC Cac tạp chất trong cột được rửabăng nước, sau đó Aflatoxin trong cột được rửa giải băng MeOH và định lượng băng HPLCđầu dò huỳnh quang Giới han phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp lần lượt là 3

ng/kg va 10 ng/kg, RSD < 10% [21] Chen cùng nhóm nghiên cứu đã định lượng Aflatoxin

trong sữa bang UHPLC-MS/MS với phương pháp xử ly mẫu có dùng cột IAC, 50 ml sữa táchbéo được cho qua cột mà không dùng dung môi chiết Phương pháp này cho khoảng tuyến tínhrộng (r > 0.997) ở nồng độ 0.05—500 zg/1, LOD là 0,18 ng/l, RSD < 15% [20]

Nhược điểm chính của phương pháp là mat nhiều thời gian trong quá trình xử lý mẫu, cột có độchọn lọc cao nên không thé dùng kết hop phân tích với chất khác góp phan làm chi phí cho cột

cao Ngoài ra thì việc dùng cột miễn dịch cũng có một nhược điểm nữa là đối với các nền mẫuphức tạp thì các tạp chat trong nền mẫu sẽ cạnh tranh với chat cần phân tích dé liên kết vớikháng nguyên làm ảnh hưởng đến kết quả phân tích [21].

Chiết lồng — lỏng (Liquid Liquid Extraction-LLE):Việc tách lỏng-lỏng là một quá trình dựa trên các phân bố của hợp chất hữu cơ giữa pha nướcvà dung môi hữu cơ (có thể hòa tan hoặc không hòa tan với nước như acetone, chloroform haymethanol) Methanol và nước đã được sử dụng để phân tích Aflatoxin trong sữa nước [23].Phương pháp này đã được sửa đổi bởi McKinney (1972) và những người khác [24].Stubblefield và Shannon (1Ø74) chiết với acetone và nước [25] Các nghiên cứu khác đã chứngminh phương pháp và nó đã trở thành một phương pháp AOAC chính thức đối với AflatoxinM, [26] (AOAC là chữ viết tắt của Hiệp hội chính thức phân tích hóa học) Chiết Aflatoxin từsữa nước băng chloroform và sau đó được làm sạch trong một cột silicagel nhỏ, cudi cùng đượcphân tách bang kỹ thuật TLC với đầu dò huỳnh quang được thực hiện bởi Stubblefield [27].Sau khi sửa đối, phương pháp này đã được áp dụng cho xác định Aflatoxin trong phô mai,trong đó dùng TLC hai chiều đã để cải thiện khả năng tách Aflatoxin từ nền Một nghiên cứucủa IUPAC đã đánh giá phương pháp [28] và nó đã trở thành phương pháp chính thức dé táchchiết Aflatoxin M, trong sữa va pho mat [29]

Các hỗn hop khác: methanol - nước [30] acetone - nước va acetone -chloroform - nước [31] đã

được sử dụng dé tach các độc tổ Aflatoxin.Năm 2011, HaoWang và các đồng nghiệp đã dùng acetonitrile để chiết Aflatoxin M, từ sữa.Phương pháp có LOD là 0,005 ug/kg, LOQ là 0,02 ug/kg với hiệu suất thu hồi trung bình 88.8

-100,6 % và %RSD < 15% [32].

Năm 2013, Luca Campone và các đồng nghiệp đã dùng phương pháp chiết long — lỏng với thétích nhỏ dé chiết Aflatoxin M, từ sữa với acetonitrile làm dịch chiết, kết qua cho ra một phươngpháp chiết đơn giản chi phí thấp, dé vận hành và tiện lợi về mặt thời gian [33]

Cũng trong năm 2013 tại Parma, Italy, Biancardi và cộng sự đã dùng ethyl acetate để chiếtAflatoxin M, từ sữa với độ thu hồi trung bình là 95%, khoảng tin cậy là 1,9%, CV là 4,5% [34]

Gan đây nhất tháng 10/2015, Nicolás Michlig và các đồng nghiệp đã dùng phương phápQuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe - nguyên lý là chiết lỏng — lỏngnhưng có thêm bước làm sạch) để chiết Aflatoxin M, trong sữa Với hiệu suất thu hồi 70-95 %,

% RSD < 15 %, LOD là 0.002 ng/ L, LOQ là 0.007 pg/ L) [35].

Muối được cho vào trong quá trình chiết tach [33, 34, 35] để tăng khả năng chiết tách vì làmtăng độ mạnh ion nên trong luận văn này chúng tôi thêm muối vào quá trình chiết

Trong tất cả các dung môi được trình bày thì ethyl acetate được xem là thân thiện với môi

trường và giá thành rẻ hơn so với các dung môi còn lại.

Phương pháp này có ưu điểm là rẻ tiền, thiết bị đơn giản, qui trình xử lý nhanh do đó trong luậnvăn này chúng tôi chọn phương pháp chiết lỏng — lỏng bang ethyl acetate

1.1.6.2 Cac phương pháp phan tích định lượng:

Sắc ký lớp mong (Thin-layer chromatography-TLC):Sắc ký lớp mỏng cũng được biết đến như sắc ký phẳng va là một trong những kỹ thuật được sửdụng rộng rãi trong phân tích Aflatoxin TLC là một kỹ thuật sắc ký được sử dung cho việctách, đánh giá độ tinh khiết

Sắc ký lớp mỏng bao gồm một pha tĩnh cố định trên một tam thủy tinh hoặc nhựa và dung môinhư là một pha động Các mẫu là chất lỏng hoặc là được hòa tan trong dung môi dễ bay hơiđược cham trên tam sắc ký được đặt thắng đứng trong một bể chứa dung môi và dung môi dichuyền lên các tam bang mao dẫn Khi dung môi di chuyên đến một giới hạn nhất định của phatinh, tam sắc ký sẽ được lấy ra khỏi bé chứa dung môi Sự phân tách sau đó được quan sát bằngánh sáng cực tím hoặc bằng cách phun thuốc thử thích hợp

Hàm lượng Aflatoxin của dung dịch mẫu có thể được xác định băng cách cho chuẩn chạy songsong với mau Các thành phần khác nhau trong một hỗn hop di chuyên trên tam sắc ký ở mứcđộ khác nhau do sự khác biệt trong sự phân bố của chúng trong pha động và pha tĩnh Giá tri Rycho mỗi điểm được tính toán là ty lệ của khoảng cách (cm) từ đầu đến trung tâm của điểm mẫuvà khoảng cách (cm) từ đầu đến vị trí giới hạn (điểm dừng của dung môi) Ry là viết tắt của“ratio of fronts” hay “retardation factor” Rr là đặc trưng cho một hợp chất theo pha động dichuyển trên pha tinh Đối với mục đích nhận danh, giá tri Ry của chuẩn được so sánh với mẫu.Dùng phương pháp TLC dé bán định lượng dựa trên sự phát quang của chat phân tích dưới đènUV, so sánh màu sắc của chất phân tích trong mẫu và dãy chuẩn có nông độ biết trước

Một số phương pháp đã được phát triển cho việc dùng TLC xác định các độc tô Aflatoxin [36].Tam silica (pha tĩnh) được sử dụng chủ yếu Pha động chủ yếu là hỗn hop dung môi củachloroform và một lượng nhỏ methanol hoặc acetone Ngoài ra, một số hỗn hợp dung môi hữu

cơ ít độc hại cho môi trường (ví dụ như toluene/ethyl acetate-hoặc acetone/iso-propanol) cũng

được sử dụng [36] Aflatoxin là chat phát quang mạnh (phát hiện ở x= 365 nm hoặc phát xạ A= 430 nm) do đó có thé dé dàng được phát hiện bởi đầu dò huỳnh quang Sắc ký lớp mỏng làphương pháp AOAC chuẩn dé phân tích Aflatoxin từ năm 1971 [37]

Một ứng dụng điển hình của TLC trong phân tích Aflatoxin là của Van Egmond và các đồngnghiệp (1978) Các tác giả xác định Aflatoxin M, trên tâm sắc ký mỏng từ phản ứng của

Aflatoxin M, với axit trifluoroacetic (TFA) với pha động là chloroform-methanol-acetic

acid-nước (92 + § + 2) Nhưng phương pháp này thường không được dùng để định lượng do hạn chếvề độ chính xác [38, 39].

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Presure liquid chromatography - HPLC):

Phuong pháp này ngày càng được su dung rộng rãi do tính chính xác, độ nhạy, độ chọn lọc, thu

hồi và độ tin cậy cao hơn so với phương pháp TLC Phương pháp HPLC đã được dùng dé phân

tích tat cả các độc tô nâm mộc quan trọng trong ngũ côc và các nông sản khác.

Pump Port Column Oven Detector Display

Hình 1.4 Sơ đồ các thành phan chính của một hệ thong HPLC

[http://lab-training.com/landing/free-hplc-training-programme-5/]|

Trong HPLC, mot pha dong (chat long hoặc dung môi) được su dụng để di chuyển mẫu quacột, pha tĩnh cố định trong cột Các chất phân tích sẽ phân bố khác nhau trong pha động và phatĩnh dẫn đến sự tách các hợp chất

Hai cột thường dùng trong HPLC là cột pha thường và cột pha đảo Trong sắc ký bình thường,

một pha tinh cực phân cực ví dụ: gel silica và một dung môi không phân cực ví dụ hexane được

sử dụng Trong khi sắc ký pha đảo (RP-HPLC) thì cột sẽ chứa pha tĩnh không phân cực (như

cột C-8 hoặc C-18 hydrocarbon) và pha động phân cực (nước, methanol hoặc acetonitrile).

Các dau dò thường dùng là đầu dò UV (Ultraviolet), đầu dò DAD (Diode Array Detector), đầudò huỳnh quang FLD (Fluorescence detector) và đầu dò khối phố MS (Mass Spectrometry).Aflatoxin được dẫn xuất tạo thành hop chất phát huỳnh quang và được phát hiện bang dau dòhuỳnh quang Độ nhạy phương pháp cao, giới han phát hiện có thé trong phạm vi của

microgram/kg.

Sự lựa chon của đầu đò thường phụ thuộc vào tính chất của mẫu RP-HPLC thường được thựchiện để xác định độc tố Aflatoxin trong thực phẩm và dẫn suất được thực hiện với các axit

mạnh hoặc chất oxy hóa ví du Bro, I, hoặc axit trifluoro-acetic Hệ thông HPLC cho kết quảdưới dang sắc ký đô Một sắc ký đồ cho hai loại các thông tin phân tích: định tính (dựa vào thờigian cua chat) và định lượng (dựa vào diện tích cua peak) Tuy nhiên thì việc dung đầu dò UVhay huỳnh quang này cũng có mặt hạn chê:

e Phải tạo dẫn xuất dé tăng độ phát quang của chat phân tích.e Việc xác định hợp chat chỉ dựa vào thời gian lưu nên đôi với nên mẫu phức tạp sẽ dễ tạo

mẫu dương tính giả do có hop chất nào đó trong nên mẫu trùng thời gian lưu với chatcân phân tích

Phương pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay):

Phương pháp nay được dùng để phân tích Aflatoxin vi có các ưu điểm: đơn giản, dé sử dung,

nhạy và khả năng tương thích của nó Nó được chia làm 2 loại:

e Cạnh tranh trực tiếp với enzyme liên kết miễn dịch: kháng thé đặc biệt được phủ lên mộtpha ran như một tam microtiter

e Canh tranh gián tiếp với enzyme liên kết miễn dịch: liên hợp protein-độc tố được phủlên tâm microtiter

Trong thực tế thì ELISA cạnh tranh trực tiếp được dùng nhiêu hơn Phương pháp này phát hiệnvà định lượng các kháng nguyên (Aflatoxin) trong mẫu băng cách sử dụng một loại enzyme vàkháng thể đặc hiệu Các liên kết enzyme dựa trên phản ứng kháng nguyên-kháng thể |40].Kháng nguyên sản xuất kháng thể khi được đưa vào máu âm động vật Trong khi đó, kháng thêlà các glycoprotein được sản xuất như là kết quả của một phản ứng miễn dịch Kháng thé đốivới Aflatoxin được phủ ở các giếng trong dải microtiter Aflatoxin tự do và Aflatoxin enzymeliên hợp cạnh tranh các kháng thể trong giếng

Bước rửa dé loại bỏ bat ky enzyme liên hợp không ràng buộc Sau đó chất nên hoặc thé nhiễmsắc được thêm vào các giếng và ủ Các enzyme liên hợp chuyển đổi nhiễm sac không màuthành màu xanh Dung dịch ngừng phản ứng được cho vào dẫn đến sự thay đổi màu sắc từ xanhsang mau vàng Sau đó, các giéng này được đưa vào máy quang phố dé đo ở bước 450 nm.Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là dễ bị nhiễm mẫu chéo và có khả năng cho mẫudương tính giả [41] nên thường dùng dé phân tích sàng lọc trước khi định lượng băng LC-MSSắc ký lỏng ghép khối phố:

Sắc ký lỏng với đầu dò khối phố (LC-MS) gần đây được phát triển trong việc phát hiện các độctố Aflatoxin và là một trong những kỹ thuật tiên tiễn nhất Trong LC-MS, mẫu đi vào buôngion hóa thông qua một máy phun sương Có một số kỹ thuật ion hóa, cụ thể là electrospray,nhiệt phun, hóa chất và nguyên tử bắn phá nhanh Phân mảnh diễn ra trong buồng va cham.Các mảnh vỡ sau đó đi vào vùng chân không sâu và đầu dò sẽ đọc các tín hiệu này Do phương

pháp này định danh và định lượng dựa trên các mảnh ion của phan tử (cùng với thời gian lưu)

nên có các ưu điểm hoan toàn có thé đáp ứng được yêu cầu trong phân tích độc tố như: độnhạy, độ chọn lọc, độ chính xác cao đáp ứng được yêu cầu MRL thấp Hơn nữa, theo Ủy banChâu Âu 2002/657/EC (2002) thì một phương pháp xác định dựa trên khối phố (MS) sẽ là phùhợp nhất do khả năng cung cấp day đủ thông tin [39].Bên cạnh đó các nhược điểm của phươngpháp này là: chỉ phí đầu tư ban đầu đắt tiền, đòi hỏi kỹ thuật của người sử dụng

Trong luận văn này chúng tôi chọn phân tích Aflatoxin M, trong sữa bang phương pháp

Người ta phân loại các phương pháp sắc dựa vào cơ chế hoạt động sắc : hấp phụ, phân bó, traođổi ion và vào tính chất của pha tĩnh cũng như phương pháp thé hiện sac ký Ví du:

- Phương pháp sắc ký lỏng ran trên cột, phương pháp sắc ký phân bố khí lỏng trên cột.- Phương pháp sắc ký phân bó lỏng lỏng trên bản phăng hai chiêu

- Phương pháp sắc ký phân bồ lỏng lỏng pha ngược áp suất cao trên cột Cơ chế sắc ký có nhiều nhưng dé thực hiện quá trình sắc ký thì chỉ có hai dạng: dạng cột vàdạng bản phẳng (bản kính, polime, kim loại, giấy)

Trong sắc ký cột, pha tĩnh được giữ trong một cột ngăn và pha động được cho chuyền động quacột bởi áp suất hoặc do trọng lực Trong sắc ký bản mong, pha tinh được phủ trên một mat

phăng thủy tinh hoặc kim loại Thường để đơn giản hóa, tuy không chính xác người ta gọi tắtcác phương pháp sắc ký: sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký lớp mỏng, sắc kýgel Trong số các phương pháp sắc ký được biết, quan trọng nhất là sắc ký hấp phụ, sắc kýphân bồ và sac ký trao đổi ion Dưới đây sẽ giới thiệu một số phương pháp sắc ký này nhamvào hai mục đích: chuẩn bị mẫu cho chất phân tích và dùng làm cột phân tích một hỗn hợpchất.

Bảng 1.5 Phân loại các phương pháp sắc ký cộtPhân loại chung Phương pháp cụ Pha tinh Kiểu cân bang

thểSac ký lỏng(LC) |- Lỏng-lỏnghoặc | - Long được phủ | - Phân bố(Pha dong: lỏng) | phân bố trên - Phân bồ giữa

- Pha lỏng liên kết | một chất ran chất- Lỏng-rắn hoặc - Chất hữu cơ lỏng và bề mặt liênhap phụ trao doi được gắn kết

trên một bề mặt - Hap phụ

10n ⁄ Res

ran Trao đôi ion

- RắnNhựa trao đổi ionSac ký khí(GC) | Khí-lỏng Lỏng được phủ Phân bô giữa khí(pha động: Khí) - Khí - pha liên kết | trên và

- Khí - rắn một chất rắn lỏng

- Chất hữu cơ - Phân bồ giữa

được liên lỏng và

kết trên một bể bề mặt liên kếtmặt rắn - Hap phụ- Rắn

Sac ký lỏng siêu | Pha lỏng: chất Chất hữu cơ được | Phân bô giữa chat

tới hạn lỏng siêu liên lỏng

tới hạn kết trên một bề siêu tới hạn và bề

(supercritical Log mat

fluid) mat ran liên kết

1.1.7.3 Nguyên lý hoạt động của cột sắc ký:Sắc ký là một kỹ thuật tách trong đó các cầu tử cần tách trong một hỗn hợp mẫu được vậnchuyền bởi pha động đi qua pha tĩnh Mẫu đi vào tướng động được mang theo dọc hệ thống sắcký (cột, bản phang) có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp Pha động có thé là pha lỏng hoặc khí,

pha tĩnh có thể là một lớp phim được phủ trên bé mặt của chất mang trơ hoặc một bề mặt rắn.Sự tương tác xảy ra giữa các cau tử với pha tĩnh nhờ đó các cau tử sẽ phân bố giữa pha động vàpha tĩnh Sự ái lực khác nhau của các chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển với những vậntốc khác nhau trong pha động của hệ thống sắc ký Kết quả là chúng được tách thành những dảitrong pha động và vào lúc cuối của quá trình các cầu tử lần lượt hiện ra theo trật tự tương tácvới pha tĩnh Cau tử di chuyển chậm (tương tác yếu) ra trước, cau tử bị lưu giữ mạnh hơn ra saudưới dạng các tách riêng rẻ (hoặc bậc thang) tùy thuộc vào cách tiễn hành sắc ký và được hiểnthị dưới dạng sắc ký đồ.

Thời gian

Hình 1.5 Quá trình tách sắc ký trên cột của hai chất A và BMẫu chứa A và B được tiêm vào cột Khi cho một chất rửa giải bắt đầu chảy qua cột, phần củamẫu được hòa tan trong pha động được di chuyén tại phan đầu của cột (tại thời điểm to) Ở đâycác cau tử A và B tự phân bố giữa hai pha Tiếp tục cho pha động di qua cột thì nó sẽ day phan

hòa tan này chạy xuống dưới và một sự phân bố mới giữa pha động và pha tĩnh sẽ xảy ra (thờiđiểm t1) Đồng thời sự phân bố giữa dung môi mới và pha tĩnh cũng diễn ra tại vị trí của mẫulúc đầu Việc thêm tiếp dung môi sẽ mang các phân tử hòa tan chạy xuống cột trong một loạtliên tiếp các chuyển biến giữa hai pha Bởi vì sự di chuyển của chất tan chỉ xảy ra trong phađộng, nên tốc độ trung bình của sự di chuyển chất tan phụ thuộc vào phan thời gian chat tan aynằm trong pha đó Phần thời gian này là nhỏ đối với chất tan bị lưu giữ mạnh bởi pha tinh (cầutử B trong ví dụ trên) và lớn đối với chất tan (cầu tử A) có sự lưu giữ trong pha động mạnhhơn Sau một thời gian các phân tử chất A và B dần dan được tách khỏi nhau Nếu đặt mộtdetecto có khả năng phát hiện được các chất tan (cau tử A và B) tại cuối cột tách và tín hiệu củanó được vẽ lại như một hàm của thời gian (hoặc thể tích được thêm vào) thì một loạt đối xứngsẽ được ghi lại và được gọi là sắc ký d6 Vi trí của các peak theo thời gian được dùng dé nhậndiện định tính và diện tích của peak được dùng cho phép phân tích định lượng của cấu tử đang

xét.Các đại lượng đặc trưng:

Thời gian lưu thực tạ (Retention Time): Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khibơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá tri cực đại Thời gian lưu cua mỗi chấtlà hăng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắcđã chọn Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

Bản chất sắc ký của pha tĩnh.Bản chat, thành phan, tốc độ của pha động.Cau tạo và bản chất phân tử của chất tan.Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động.Trong một phép phân tích nếu thời gian lưu nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu thời gian lưu quálớn thì bị doãng và độ lặp lại của rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiềuvan dé khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém

Hệ số dung lượng K? (Capacity Factor): Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năngphân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chat tan trongpha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng

K'= (tR -t0)/ t0

Nếu K’ nhỏ thì tạ cũng nhỏ và sự tách kém Nếu K’ lớn thì bị giãn Trong thực tế K’ từ 1-5 làtối ưu.

Độ chọn lọc a: Độ chon lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thông sắc ký, khi 02 chất A, B cóK’, và K’, khác nhau thì mới có khả năng tach, mức độ tách biểu thị độ chọn loc

a = K’g/K’, Với điều kién K’g > K’,

với œ càng khác | thì kha năng tách càng rõ ràng

Số đĩa lý thuyết N: Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiệnsắc ký nhất định Mỗi dia lý thuyết trong cột sic ký giỗng như là một lớp pha tinh có chiêu caolà H Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó mộtcần băng nhiệt động học được thiết lập giữa nông độ trung bình của chất tan trong pha tinh va

pha động.

Bê dày H phụ thuộc vào nhiêu yếu tố:

Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh.Tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động.Hệ số khuyếch tán của các chat trong cội.Vì vậy với một điều kiên sắc ký xác định thì chiêu cao H cũng hang định đối với một chat phântích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định

Số đĩa lý thuyết N được tinh theo công thức sau:

N =5,54 ( tr/ W 95) 2Trong do :

tạ: Thời gian lưu của chat phân tích.Wo os: Độ rộng tại điểm 1/2 của Trong thực tế N năm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ.Độ phân giải R (Resolution): Độ phân giai là đại lượng biểu thị độ tách của các chat ra khỏinhau trên một điều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của 2 peak cạnh nhau phải được tính theo

công thức sau :

R = 2(t’pp- f'RA)/CWA+ Wp)Trong thực tế nếu các cân đối thi độ phân giải tôi thiểu để 2 tách là R =1,0 Trong phép địnhlượng R=1,5 là phù hợp Nêu R nhỏ thì các chưa tách han, việc tính toán diện tích sẽ không

chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo ba cách sau:

Làm thay đổi K’ băng cách thay đối lực rửa giải của pha động (thay đổi độ phân cực nếulà RP - HPLC, thay đôi cường độ ion nếu là IE- HPLC )

Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột băng cách dùng cột dài hơn hoặc cột có kích thước

1.1.7.4 Giới thiệu chung về sắc ký long:Sắc ký lỏng cột là một trong những nhánh của phân tích công cụ phát triển nhanh nhất, được ápdụng cho nhiều loại mẫu hơn bất kì kỹ thuật tách nào và có khả năng phân tích những hỗn hợpmẫu cực kì phức tạp trong hóa học và trong sinh học Nghiên cứu kỹ thuật tách băng LC là cânthiết vì nó sẽ tiép tục đóng một vai trò quan trọng trong tat cả những lĩnh vực của phân tích hóahoc, mặc dù có những tiên bộ hon nữa trong các thuốc thử chọn loc và những cải tiễn trong cáckỹ thuật vật lí đo lường Với sự phát triển trong suốt những thập niên qua về thiết bị và sự nhôicột, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nỗi lên như một phương pháp được ưa thích cho kỹthuật tách và phân tích định lượng của rat nhiều loại mẫu Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả vàcó thé dò tìm lượng mẫu nhỏ đến 200 pg Những cơ hội áp dụng HPLC hau như không giới hando HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiêu trong khoa hoc và công nghiệp

Sac ky long dựa trên hiện tượng: dưới cùng một điều kiện, mỗi câu tử trong một hỗn hợp tươngtác với môi trường xung quanh khác với tất cả các câu tử khác Khi được sử dụng như mộtcông cụ phân tích, LC có thé xác định các câu tử trong một hỗn hợp và lượng của chúng trongmẫu Khi kết hợp với những kỹ thuật phân tích khác thì có thé nhận diện định tính các câu tửtrong mẫu

1.1.7.5 Các bộ phận cơ bản của hệ thong HPLC:Hỗn hợp can phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hop, tiêm một thé tích chính xác

vào bộ phận tiêm mẫu và được mang vào cột bởi một dòng chảy liên tục của cùng dung môi

(pha động) trong đó mẫu được hòa tan Sự tách diễn ra trong cột có chứa những hạt xốp có diện

tích bề mặt lớn (pha tĩnh) Các cầu tử trong mẫu liên tục tương tác với pha tĩnh Pha động (còngọi là chất rửa giải) được bơm qua cột được nhéi chặt các hạt sắc ký Với việc chọn pha độngvà vật liệu nhôi cột thích hợp, các cầu tử trong mẫu sẽ di chuyển dọc trên cột với những tốc độkhác nhau Khi những cầu tử lần lượt thoát ra khỏi cột và đi vào detector thích hợp, ở đây tínhiệu được ghi lại, xử lí và chuyển ra ngoài một sắc ký đỗ, cho biết sự hiện diện của mỗi cau tửdưới dang một pic Khi đó lượng cầu tử có trong mẫu được tính toán dựa vào chiều cao hoặc

diện tích của peak của nó.

Bình chứadung mỗi

môi của 04 kênh là 100 % Tuy nhiên, chúng ta ít khi sử dụng 04 kênh dung môi cùng một lúc

mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 03 và 02 kênh dé cho hệ pha động luôn được pha trộn đồngnhất hon, hệ pha động đơn giản hơn dé quá trình rửa giải 6n định

Hệ thống bơm: Chức năng chính của bơm là vận chuyển pha động đi qua cột tách với một tốcđộ xác định Bơm cần đáp ứng một sỐ yêu cầu khá cao về tính năng như sau:

Phía trong bơm không bị tan công bởi bat kỳ loại dung môi nào được sử dụng.Một khoảng rộng của tốc độ dòng có thé chọn lựa và dé thay đổi tốc độ dòng.Dé thay đổi từ việc sử dung dung môi này đến loại dung môi khác

Dễ bảo dưỡng và sửa chữa.Một số loại bơm thông dụng như sau:

Bơm tốc độ dòng hăng định (constant flow pump): Đây là bơm kiểu syringe đây dung

môi liên tục, khi hết dung môi trong ông bơm (khoảng 250 ml) thì dừng lại dé nạp lại.

Bơm kiểu piston thi day hút luân phiên Loại này được dùng pho biến vì có nhiều ưuđiểm

Hệ thống tiêm mẫu: Phương pháp tiêm mẫu đâu tiên mượn kỹ thuật tiêm mẫu trong GC, trongđó dùng syringe tiêm mẫu qua một đệm cao su tự hàn kín được đặt tai đầu của bộ tiêm mẫu ởđâu cột tách Một phương pháp nữa (stopped flow) là người ta dừng bơm và dùng syringe tiêmmẫu vào cột tách thông qua một cái khóa Phương pháp pho biến hiện nay là dùng van tiêmmẫu có một vòng mẫu (sample loop) có dung tích khác nhau từ 5 đến 500 pl Phương pháp nàyrat dễ sử dụng, dé tự động hóa và cho độ chính xác rat cao, mặc dau tương đôi đắt tiên Vớiphương pháp này mau dau tiên ở áp suất khí quyền được tiêm bang xilanh vào vòng mẫu Sauđó chuyển van từ vị trí nạp mẫu (load) đến vị trí tiêm mẫu (inject) nỗi vòng mẫu vào vị trí củadòng chảy của pha động, ở đây lượng mẫu chính xác trong vòng mẫu sẽ được vận chuyển vào

cột tách.

Cột sắc : Cột pha tĩnh thông thường làm bang thép không rỉ, chiêu dài cột khoảng 10-30cm,đường kính trong 1-10mm, hạt chất nhôi có ÿ = 5-10 um (ngoài ra còn có một số trường hợpđặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt ) Với chat nhôi cột có d = 1.8 -5 um có thé dung cotngan (3-10 cm) và nhỏ (đường kính trong 1-4.6 mm) loại cột nay có hiệu năng tach cao

Chất nhôi cột tùy theo loại cột và kiểu sắc ký Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha

thuận) hoặc là silicagel đã được silan hóa hoặc được bao một lớp mong hữu cơ (pha đảo), ngoài

ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxit, polyme xốp, chat trao đối ion

Cot pha thuận (NP): Silicagel trung tính Cột này là loại cột dùng dé tách các chất phâncực hay phân cực trung bình Trên bé mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm phân cực: -OH, -

CN, - NH) Pha động dung cho loại này là các dung môi không phân cực hay it phân cực như :methanol, ethanol, ethyl acetate

Cot pha dao (RP) : Silicagel đã alkyl hóa Dung dé tách các chat không phân cực ítphan cực, các chất phân cực có thé tạo cặp ion Trén bé mat hoat động các nhóm OH đã bi alkylhóa tức là thay thế nguyên tử H bang các mạch carbon thang (C-8 hay C-18 tương đương RP-8hay RP-18) hay các mach carbon vòng (phenyl-tương đương cột phenyl) vì thé nó ít phân cực

Pha động dùng trong loại nay là các dung môi phan cực như: methanol, acetonitril, nước hay

các loại dung dịch đệm, hỗn hợp của các dung môi-đệm.

Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độphòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (oven column)

Detector: là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắcký đồ dé có thé định tính và định lượng Có các loại detector:

Detector UV-VIS: đây là loại thông dụng nhất Nguyên tắc là cho pha động từ cột đi quamột ống đo (flowcell) nhỏ có một chùm bức xạ đơn sắc UV/VIS chiếu qua Sự hấp thu bức xạcủa chất tan là một hàm phụ thuộc tuyến tính vào nông độ C của nó theo định luật Lambert-

Beer: D = elCTrong đó:D: là đại lượng mật độ quang:

I: là chiều dài của cell;c: là hệ số hap thu phân tử và là hằng số cho một chat tan và bước sóng

Detector huỳnh quang: để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũngnhư các dẫn xuất có huỳnh quang Những hợp chất như vậy thường có vòng liên hợp như cáchợp chất vòng thơm có nhiều nhân Nhiều hợp chất không có pho huỳnh quang có thé chuyềnsang các dẫn xuất có phố này nhờ xử lý với những thuốc thử thích hop Đây là loại detector có

độ chọn lọc cao.

Detector chuỗi photodiot (Detector Diod Array): trong detector chuỗi photodiot, chùmtia đa sắc sau khi đi qua mẫu được tán xạ bởi bộ cách tử được cố định rồi rơi vào một chuỗi cácphotodiot Mỗi photodiot đo một dải hẹp các bước sóng trong quang phố, như vậy nó là bộ thunhận số liệu song song, nghĩa là tất cả các điểm được đo đồng thời Hệ thống này có một số

thuận lợi như sau:

Bởi vì là bộ thu nhận số liệu song song nên việc xử lý và lưu trữ quang phố có thể được

thực hiện trong khoảng 0.5 s so với vài phút trong detector UV.

Vì không có bộ phận di chuyền có thé bị làm mài mòn nên những sai số khi thiết lập lạimột bước sóng cần chọn được giảm xuống và thiết bị cũng ít đòi hỏi bảo dưỡng như thiết bị

khác.

Nhờ khả năng thực hiện những phép đo nhiều bước sóng cùng một lúc và tốc độ thunhận số liệu nên những kỹ thuật lay trung binh số liệu khác nhau có thé được sử dụng để làm

giảm tiếng ôn và tăng độ nhạy.Khi được sử dụng như một detector trong HPLC, mặc du đắt tiền hơn so với loại UV truyềnthống nhưng nó cũng có những ưu điểm đáng kế:

Quang phổ của mỗi peak trong sắc đồ có thé được lưu giữ và lần lượt so sánh với phốchuẩn giúp tiện lợi trong việc nhận diện các peak

Bước sóng tối ưu cho việc dò tìm cũng dễ dàng được tìm thấy và những thay đổi củabước sóng trong quá trình đò tìm cũng có thể được chương trình hóa để xảy ra tại những điểmkhác nhau trong sắc do

Nó cũng cung cấp độ nhạy cực đại cho các peak.Ngoài ra còn các loại đầu dò khác như: detector đo chỉ số khúc xạ (Refrative index detector),ELSD (detector tán xạ bay hơi), detector điện hóa, detector chiết suất vi sai Trong số đó thìphải kế đến một detector rất quan trọng và được sử dụng ngày càng nhiều bởi vì các ưu điểmcủa nó như: không cần tạo dẫn xuất trước khi chạy mau, định lượng tốt trong các nền mẫu phứctạp, có thé phân tích nhiều hợp chất trong một lần chạy đó là detector khối phô (MS)

Detector khối phố (MS): đo chính xác khối lượng phân tử chất đó sau khi chuyền chấtthành trạng thái hơi rồi thành ion băng phương pháp thích hợp Dé phân tích bang phương phápkhối pho phải tiễn hành qua các giai đoạn sau:

Nạp mẫu và làm bay hơi mẫu

lon hóa mẫuChọn lọc các Ion

Thu nhận tín hiệu và biễu diễn dưới dạng sắc ky đỗSắc khối phố được ứng dụng vào các lĩnh vực sau:

Xác định khối lượng nguyên tử và khối lượng phân tử, thành phần cấu tạo.Quá trình đồng nhất

Xác định công thức cau tạo.1.1.8 Sắc ký lỏng đầu dò khối phố: [43, 44]1.1.8.1 Cấu tạo chung của hệ thống sắc ký lỏng ghép khối pho:Mẫu sau khi đi qua cột của phần LC sẽ được phun ra dạng sương thông qua bộ phận gọi lànebulizer sau đó đi vào đầu dò Tại đây diễn ra quá trình ion hóa, tách khối chọn các ion có m/z

xác định phân mảnh các ion này roi sau đó đi đên bộ phận đọc tín hiệu và được biéu diễn dưới

dạng sắc ký đô.

Các kỹ thuật ion hóa thông dụng:

Ky thuật ion hóa phun điện tử (Electronspray lonization-ESL):

Nebulizer phun chất phân tích và dung môi ra dưới dạng các hạt nhỏ (hình 1.7) Dưới tác dụngcủa nhiệt độ cao từ dòng khí N; đã được gia nhiệt, dung môi sẽ bi bốc hơi làm cho thể tích cáchạt này nhỏ dần làm mật độ ion chất phân tích tăng Do sự đây nhau của các ion cùng dấu (lực

tinh điện), các hạt này sẽ vỡ thành các hạt nhỏ hơn mang điện tích Sau đó các ion dương hoặcâm tạo thành được đưa vào bộ phận tach ion Dung môi và khí NÑ› được bơm chân không hút rangoài.

Nebulizing gas

| | | Heated nitrogen drying gas

rEluent spray — ;s£

»%e°

Entrance todielectric capillary

Hình 1.7 Nguồn ion hóa ESITrong kỹ thuật này thì ion được tao trong pha dung dich, thích hợp cho chat không bên nhiệt,chất phân cực và khối lượng phân tử lớn

Kỹ thuật ion hóa hóa học tại ap suất thường (Atmospheric Pressure Chemical

Ionization-APCD :

Chat phân tích cùng với pha động từ sắc ký long được phun ra tir nebulizer thành các hat nhỏvà được làm bay hơi bằng thiết bị gia nhiệt (hình 1.8) Các phân tử pha động được ion hóa bởicác điện tử từ vùng phóng điện (corona discharge) và các phân tử chất phân tích được ion hóabởi các ion pha động Sau khi được ion hóa các ion sẽ bị hút vào capillary và đi vào hệ thôngkhối phố APCI thích hợp đối với các chất ít phân cực, hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ,chất bền nhiệt lon được tạo trong pha hơi

b

Corona needle

+2,000 V

lons (singly, charged)/ _ End Cap/End Plate

ít | -3500V

SS Heated nitrogen

drying gasCapill

-aioov"

nebulizer gas

Hình 1.8 Nguồn ion hóa hóa hoc ở áp suất thườngKỹ thuật ion hóa quang hoc tại áp suất khí quyền (Atmospheric Pressure

Photoionization-A PPI) (hinh 1.9):

Đèn Krypton tạo ra các photon ở 10.0-10.6eV Các mức năng lượng nay đủ cao dé ion hóanhiều dải rộng các hợp chất hữu cơ nhưng cũng thấp đủ để tối thiểu hóa sự

hình thành ion của không khí và các dung môi thông thường trong HPLC như nước, methanol,

và acetonitrile Do nó có tính năng trực tiếp ion hóa quang học của chat phân tích, APPI khôngbị giới hạn bởi pha khí, chất acid-bazơ Nguén ion hóa quang học có thé ion hóa các hợp chatkhông thể bị ion hóa khi sử dụng các kỹ thuật áp suất khí quyền khác Tuy nhiên, mức nănglượng thấp cho thay nguôn ion hóa quang học tạo thành mảnh rất nhỏ Nó tạo ra các ion phântử đặc trưng hoặc các phân tử bị proton hóa và vài sản phẩm cộng hợp

Đối với phân tích các hợp chất ion hóa kém bởi ESI và APCI như Polyaromatic Hydrocarbons(PAH), thì APPI cung cấp một lựa chọn hữu ích

độ lớn của các điện áp các ion chỉ có khôi lượng nhat định được phép vượt qua toàn bộ chiêu

dai của tứ cực, di ra khỏi tứ cực và vào một máy dò, các ion khác bị lệch lên quỹ dao mà làm

cho chúng va chạm với các que và đi ra khỏi thiết bị phân tích

TODETECTORquadrupole rods

exit slit

IONS (to detector)

resonant ion(detected)

non-resonance ion

(not detected)

Hinh 1.11 Thiét bi phân tích tứ cựcThiết bị 3 tứ cực:

| | Quad Mass Filter (Q1) Quad Mass Filter (Q3)

\ Octopole 1À lui | — [Maal ||

nơi chúng bị phân mảnh thường được gọi là tứ cực thứ hai (Collision Cell) Các ion được hình

thành trong buông va chạm sau đó di chuyển đến tứ cực thứ ba cho một giai đoạn lọc thứ hai đểcho phép cô lập và kiểm tra nhiều tiền thân của ion sản phẩm (hình 1.12)

Một trong những lợi ích quan trọng nhất của phân tích tứ cực là có thể quét khối dãy rộngnhanh chống cho nó khả năng đo quang phố chất lượng

Hệ thống phân tích thời gian bay (Time-of-Flight: TOF):Các nguyên tắc cơ bản của phân tích khối lượng sử dụng thời gian bay của máy phân tíchkhối lượng tương đối đơn giản so với rất nhiều các thiết bị phân tích khối lượng điển hình

khác lon được tạo bằng cách vỡ ra trong các nguôn ion và phải chịu một điện thế gia tốc.Các ion sau đó 'trôi' hoặc 'bay' xuống một ống có chiều dài xác định Các ion có khối lượngkhác nhau nhưng được gia tốc giống nhau sẽ có thời gian đi tới đầu dò khác nhau Thờigian bay của ion phụ thuộc vào khối lượng ion, năng lượng động học và điện tích của ion

¥acuum chamber ~ time measurement

-Hình 1.13 Mô hình đầu dd TOFKỹ thuật này có thể phân tích các chất có khối lượng phân tử lớn và nhỏ (không bị hạn chế vềkhối lượng của ion)

Hệ thống phân tích bay ion (Ion Trap):Hệ thông phân tích bẫy ion sử dụng điện trường dao động (RF) để ion bẫy một cách có kiểmsoát (hình 1.14) Việc xây dựng một tứ cực bẫy ion khối phố kế điển hình bao gồm một vòngđiện cực vòng với một mặt trong hyperbol va hai điện cực hyperbol phổ biến Các ion sẽ đượcgiữ lại trong buông bay ion Dưới tác dụng của của điện thế thích hợp được áp vào các ion nàysẽ di chuyển đến đầu dò Các ion còn lại trong bay được chọn lọc dựa vào sự khác nhau củam/z, sau đó các ion này được bắn phá để tạo ion con và tiếp tục chọn lọc ion con dựa vào m/zcủa ion con Ưu điểm của phương pháp này là có thé phân tích khối pho nhiều lần (nhiều lầnMS) độ nhạy cao, độ phân giải cao, dùng tốt trong phân tích axit déoxiribonuclei Tuy nhiên,nhược điểm của phương pháp 1a: tạo ra quang phô không bình thường nếu ion ở trong bay quádai, bay dé bị bão hòa, khó áp dung cho các hợp chat có khối lượng phân tử nhỏ

CHUONG 2: DOI TUONG — PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 DOI TUONG —- MỤC TIỂU - NOI DUNG NGHIÊN CỨU:2.1.1 Đối tượng:

- Đối tượng nghiên cứu: Aflatoxin My- Phạm vi nghiên cứu: Mẫu sữa tươi được lây tại khu vực thành phố Hồ Chí Minh Thời gian

nghiên cứu: tháng 08/2015-06/20162.1.2 Mục dich:

- Khảo sát các điều kiện thích hợp dé phân tích dư lượng Aflatoxin M, trong sữa tươi đáp ứngđược yêu cầu MRL thấp

- Đánh giá phương pháp đã xây dựng

- Áp dụng quy trình vào phân tích mẫu sữa vùng TP.HCM2.1.3 Y nghĩa thực tiễn:

- Áp dụng quy trình đã nghiên cứu vào phân tích tại Phòng Thí nghiệm và Phân tích chăn nuôi,

Phân Viện Chăn nuôi Nam bộ.

2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:- Đề đạt mục tiêu và nội dung nghiên cứu trên, các phương pháp nghiên cứu được sử dụngtrong dé tài này là:

e Phương pháp thu thập tài liệu: dựa trên các nghiên cứu có liên quan đã được công

bốe Phương pháp thực nghiệm: Kỹ thuật chiết mẫu lỏng — lỏng và kỹ thuật LC-

MS/MS để phân tích Aflatoxin M, và áp dụng quy trình phân tích trên mẫu thực.e Phương pháp phân tích số liệu: Sử dụng các phương pháp thông kê dé đánh giá số

liệu phân tích và kiểm soát chất lượng

- Micropipet (2-20 yl, 20-200 1, 100-1000 1, 5 ml)- Pipet thuy tinh (8 ml, 10 ml, 20 ml)

- Đầu loc nylon 0.45 zm- Hệ thống thôi Na

- Bình định mức (5 ml, 10 ml)

Hóa chất, chất chuẩn:- Chất chuẩn: Aflatoxin M; lọ 1 ml 10 ppm (Sigma-Aldrich Mỹ)- Hóa chất:

Acetonitrile (Barker)Methanol (Merck)

Nước cat 2 lần, khử ion, loc qua giấy loc 0.45um

Acid formic (HPLC grade - Merck)Acid Acetic (HPLC grade — Merck)

Muối NaCl (Merck)Chuan bi dung dich chuan:- Pha dung dịch chuẩn làm việc từ dung dich chuẩn gốc 10 ppm trong acetonitrile:Hút 100 jl dung dich chuẩn gốc 10 ppm vào 900 pl acetonitrile ta thu được dung dich chuẩn 1ppm Hút 10 pl dung dịch chuẩn 1 ppm vào 990 ul acetonitrile: nước (2:8) ta thu được dungdich chuẩn 10 ppb Tiến hành tương tự cho các nông độ 1 ppb, 0,1 ppb và 0.01 ppb

Qui trình phân tích mẫu dự kiến: