- Phân loại và cấu tạo virus cúm.- Các cơ chế ngăn chăn sự sinh sản của virus cúm.2 Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu :- Cấu trúc protein.. Các phương pháp Steered Molecular Dyna
Lịch sử về dịch cúm
Tổng quan về dịch cúm trên thế giới
Các triệu chứng đầu tiên về cúm được ghi nhận bởi nhà vật lý người Hy Lạp Hippocrates cách đây khoảng 2400 năm Trận dịch cúm đầu tiên được ghi chép rõ ràng trong lịch sử là trận đại dịch năm 1580, bắt đầu từ châu Á và nhanh chóng lan sang châu Phi và đến Châu Âu Tại Roma hơn 8000 người chết, và tại nhiều thành phố của Tây Ban Nha dân số gần như bằng không sau đại dịch Từ đó đến nay, nhiều đại dịch cúm lớn nhỏ đã liên tiếp xảy ra và để lại nhiều hậu quả nghiêm trọng
Một số đại dịch cúm lớn trong lịch sử đã lấy đi nhiều mạng người và để lại nhiều thiệt hại khủng khiếp cho nền kinh tế thế giới, các đại dịch cúm là được trình bày như bảng 1 bên dưới:
Bảng 1: Danh sách các đại dịch cúm xảy ra trong lịch sử thế giới
Năm Tên đại dịch Số người chết Loại cúm
Tổng quan về dịch cúm tại Việt Nam
Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn Đây là lần đầu tiên dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam, có tới hàng chục triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề tới nền kinh tế quốc dân Tính đến tháng 10/2008, dịch cúm gia cầm liên tục tái bùng phát hàng năm tại nhiều địa phương trong cả nước, có thể phân chia thành các đợt dịch lớn như sau: Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 và 30/03/2004: Dịch cúm xảy ra ở các tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng hai tháng đã xuất hiện ở 57/64 tỉnh thành trong cả nước Có 3 người được xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 và cả 3 đã tử vong trong đợt dịch này Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: Dịch cúm tái phát tại 17 tỉnh, thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng 11/2004 chỉ còn một điểm phát dịch Có tới 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1, trong đó có 9 ca tử vong Đợt dịch thứ 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: Dịch cúm gà xảy ra trên 36 tỉnh thành trong cả nước Vào những tháng cuối năm 2005, dịch cúm gà xảy ra trong tháng 10/2005 lan nhanh trong gần 40 tỉnh thành và giảm dần trong tháng 12/2005
Sau một năm (2006), do áp dụng chương trình tiêm chủng rộng rãi cho các đàn gia cầm trong cả nước, cùng với các biện pháp phòng chống dịch quyết liệt, dịch cúm A/H5N1 không xảy ra ở Việt Nam Mặc dù vậy, đến 06/12/2006 dịch cúm gia cầm A/H5N1 đã tái bùng phát ở Cà Mau, sau đó lan sang các tỉnh Bạc Liêu, Hậu Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ
Trong năm 2007, dịch cúm tái phát tại Hải Dương vào ngày 17/02/2007 và được khống chế sau 1 tháng Tuy nhiên, đến ngày 01/05/2007 dịch cúm tiếp tục tái phát tại Nghệ An, sau đó lan sang nhiều tỉnh, thành phố trong cả nước Theo báo cáo của cục thú y (bộ nông nghiệp và phát triển nông
17 | P a g e thôn) đến ngày 10/06/2007 dịch cúm đã xảy ra trên 16 tỉnh, thành phố (Nghệ An, Quảng Ninh, Cần Thơ, Sơn La, Nam Định, Đồng Tháp, Hải Phòng, Bắc Giang, Ninh Bình, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Quảng Nam, Hưng Yên, Thái Bình và Phú Thọ), và chỉ được khống chế hoàn toàn vào 8/2007
Dịch cúm lại tiếp tục tái bùng phát ở một số tỉnh phía Bắc vào tháng 3/2008 Cho đến tháng 6/2008, dịch cúm gia cầm A/H5N1 về cơ bản đã được khống chế trên toàn quốc.
Phân loại và cấu tạo virus cúm
Phân loại virus cúm
Virus cúm là loại virus RNA bao gồm ba loại là virus cúm A, B, C Ba loại virus cúm này là ba trong số năm chi thuộc họ Orthomyxoviridae, trong đó:
Virus cúm C khá phổ biến, lây nhiễm ở cả người và động vật nhưng hiếm có dấu hiệu bùng phát thành đại dịch
Virus cúm B hầu như chỉ lây nhiễm ở con người và gây ra các bệnh cúm thông thường
Virus cúm A chịu trách nhiệm gây nên các trận đại dịch, lây nhiễm ở cả người và vật nuôi
Các virus cúm A là tác nhân gây nên các bệnh nguy hiểm và nghiêm trọng nhất cho con người trong ba loại cúm đã được đề cập đến.
Cấu tạo virus cúm
Dưới kính hiển vi điện tử virus cúm có hình cầu không đều với đường kính từ 80 – 120 nm (như trong hình 2.1)
Hình 2.1: Hình ảnh virus cúm dưới kính hiển vi điện tử
ARN đơn chuỗi (gồm có 8 đoạn với cúm A, B hoặc 7 đoạn với cúm C) cùng với các nucleoprotein (NP) tạo nên nucleocapsid đối xứng xoắn Vỏ bao ngoài của virus là lớp lipid kép, từ đó có các cấu trúc glycoprotein nhô ra là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Mặt trong của vỏ lipid được phủ bởi các phân tử protein khuôn (matrix protein) có chức năng chưa rõ hết nhưng liên quan đến sự hợp đoàn virus và ổn định vỏ lipid Giữa các loại cúm khác nhau thì có sự khác biệt về thành phần của protein này và cấu trúc ARN
Hình 2.2: Hình ảnh minh họa cho thành phần cấu trúc virus cúm a) Hemagglutinin (HA) Còn có tên gọi khác là heamagglutinin, là một loại glycoprotein kháng nguyên được tìm thấy trên bề mặt của virus cúm (cũng như là những loại vi khuẩn và virus khác) Cái tên “hemagglutinin” có nghĩa là khả năng làm đông tụ (agglutinate) hồng cầu (erythrocytes) trong ống nghiệm Hiện nay, đã có hơn 16 loại HA đã được phát hiện, trong đó H1-H3 được tìm thấy trong virus gây cúm ở người Ở virus, HA có hai nhiệm vụ chính, một là kết nối virus với tế bào chủ thông qua các thụ thể chứa trong axit sialic của tế bào, hai là một khi virus bám được vào tế bào chủ thì HA sẽ tạo điều kiện để bộ gen xâm nhập vào tế bào chủ thể bằng cách tạo sự hợp nhất của màng tế bào vật
20 | P a g e chủ với màng của virus Cấu trúc HA có hình dạng như một xylanh dài 13.5 nm bao gồm ba monomer giống nhau xoắn α vào với nhau, ba khối cầu ở đầu chứa vị trí gắn với axit sialic [30]
Hình 2.3: Cấu trúc phức hợp của protein hemagglutinin và axit sialic b) Neuraminidase (NA) Là một enzyme bản chất là glycoprotein và mang tính kháng nguyên có trên bề mặt virus cúm Neuraminidase có vai trò hỗ trợ giải phóng virus khỏi tế bào vật chủ Neuraminidase cắt liên kết giữa gốc axit sialic tận cùng khỏi phân tử carbonhydrate của tế bào và virus, từ đó nó ngăn cản sự kết tập virus và cho phép phóng thích các hạt virus khỏi tế bào bị nhiễm Cho đến nay, có 9 phân nhóm NA đã được xác định, chủ yếu là virus gây cúm ở chim Chỉ có N1 và N2 phát hiện là virus gây cúm ở người Neuraminidase có cấu trúc dạng nút lồi hình nấm trên bề mặt virus cúm Nó có một đầu gồm bốn bán đơn vị hình dạng gần giống hình cầu trên cùng mặt phẳng và đầu kia là một vùng kị nước gắn vào bên trong màng virus [31]
Hình 2.4: Cấu trúc phức hợp giữa protein neuraminidase protein và axit sialic
Từ hai loại protein, virus cúm A được chia thành các phân nhóm nhỏ hơn do sự tổ hợp của 16 loại HA và 9 loại NA Ví dụ, cúm heo gây bởi virus H1N1, trong đó H là viết tắt của hemagglutinin, N là viết tắt của neuraminidase và 1 là chỉ số phân loại protein Danh pháp đầy đủ của một virus cúm là xác định thông qua hình bên dưới
Hình 2.5: Danh pháp của một virus cúm
Trong đó vị trí đầu tiên cho biết chủng virus, nó cho biết cấu trúc gen mà chủng virus này mang Thứ hai là vị trí nơi đại dịch do virus này bùng phát Thứ ba là thay đổi virus được trích xuất
Thứ tư là năm trích xuất được virus Và cuối cùng là hai loại protein xuyên màng Hemagglutinin và Neuraminidase của virus này c) Kênh ion M2 Là một protein xuyên màng có vai trò giải phóng RNA của virus vào môi trường nội bào khi axit từ môi trường nội bào thông qua M2 thâm nhập vào virus Là một homotetramer protein gồm bốn protein giống nhau tạo thành một kênh dẫn proton Mỗi nhánh như vậy có 97 residue xuyên qua lớp vỏ lipid của virus, gồm một đầu amine tự do hướng ra ngoài và một đầu carboxyl hướng vào trong tế bào virus [32]
Hình 2.6: Cấu trúc protein kênh ion M2 trong màng lipid của virus cúm d) Vỏ lipid Được lấy từ tế bào bị lây nhiễm khi một virus mới hình thành e) Protein matrix M1 Giúp bao bọc các RNA của virus khi chúng mới được tạo thành và vận chuyển chúng đến màng tế bào, nơi một virus mới sẽ hình thành f) Nhân RNA Mang thông tin cấu trúc để tạo thành các virus mới Trong đó RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) là tổng hợp cả hai hệ gen RNA và mRNA Cấu trúc của chúng được xác định chính là phức hợp heterotrimeric bao gồm các thành phần PA, PB1 và PB2 Các thành phần này cung cấp những thông tin quan trọng trong cơ chế hoạt động của chúng [33]
Các cơ chế ngăn chặn sự sinh sản của virus cúm
Từ quá trình sản sinh ra virus mới thông qua tế bào lây nhiễm, khoa học đã nghiên cứu và phát hiện ra một số khả năng để ngăn chặn sự phát triển trong vòng đời của virus Sau đây là một số khả năng ngăn chặn sự sinh sản của virus hiệu quả nhất: Một là sử dụng các kháng thể ngăn không cho hemagglutinin bám và xâm nhập vào tế bào chủ [34] Hai là sử dụng chất ức chế để khóa kênh M2 không cho proton truyền qua và virus không thể phóng thích được các RNA [35] Ba là dùng các tác nhân ức chế sự chia cắt liên kết giữa gốc axit sialic tận cùng khỏi phân tử carbonhydrate từ đó ngăn cản sự tách virus khỏi tế bào chủ, nhằm ngăn chặn sự lây lan [36] Bốn là can thiệp trực tiếp lên nhân tố di truyền của RNA, làm tê liệt khả năng phân chia, tổng hợp và hình thành cá thể mới của RNA (ở đây là tác động trực tiếp lên thành phần PA, PN1, PN2; được quan tâm đặc biệt là thành phần PA) không cho virus có cơ hội hình thành và nhân rộng cá thể được [37]
3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT VÀ PHƯƠNG PHÁP
Cấu trúc protein
Amino acid
Các amino acid là những viên gạch xây nên protein Cấu trúc chung của amino acid là nhánh chính (backbone) gồm nhóm amino NH2 và carboxyl COOH nối vào nguyên tử carbon trung tâm (carbon α) (ngoại trừ Proline, nhánh phụ tạo vòng liên kết trực tiếp với nguyên tử N của nhóm amino) Các nguyên tử còn lại liên kết với carbon α là hydrogen và nhóm R hay còn gọi là nhánh phụ (side chain) [38]
Các amino acid được nối với nhau bằng liên kết peptide trong đó nhóm amino nối với nhóm carboxyl Việc tổng hợp liên kết peptide được thực hiện tại ribosome [39] Các chuỗi amino acids này được gọi là peptide hoặc polypeptide (protein) khi độ dài lớn hơn khoảng 50 amino acids Tất cả các protein đều được cấu thành bởi sự kết hợp của 20 loại amino acid.
Cấu trúc bậc một của protein
Cấu trúc bậc một là trình tự sắp xếp của các amino acid trong chuỗi polypeptide mà không chú ý đến vị trí tương đối của chúng trong không gian Các amino acid liên kết với nhau bởi liên kết cộng hóa trị Các chuỗi polypeptide được tổng hợp trong ribosome theo một chiều xác định, bắt đầu từ N cho nhóm NH2 và kết thúc ở đuôi C cho nhóm COOH.
Cấu trúc bậc hai của protein
Cấu trúc bậc hai là được tạo ra từ cấu trúc bậc một Nó chính là sự sắp xếp chuỗi polypeptide hoặc các mối quan hệ trong không gian giữa các nhánh chính của amino acid nằm gần nhau trong chuỗi
Cấu trúc bậc hai không quan tâm tới cấu hình của các nhánh phụ hoặc quan hệ giữa các chuỗi Có ba
26 | P a g e dạng cơ bản của cấu trúc bậc hai là xoắn helix α, dải β và turn [40] Các dạng còn lại là các kiểu biến thể khác nhau của một trong ba dạng trên a) Xoắn helix α
Chuỗi polypeptide của cấu trúc xoắn helix α có dạng như một cái que, chuỗi chính cuộn chặt lại hình thành nên phần lõi của que, các side chain tỏa ra ngoài và tạo nên dạng xoắn ốc Xoắn helix α được giữ ổn định bởi các liên kết hydrogen giữa nhóm NH và nhóm CO của chuỗi chính Trong cấu trúc xoắn helix α, hai amino acid liền nhau cách nhau 1.5 A dọc theo trục của xoắn, lệch nhau 100 0 và như vậy mỗi vòng của xoắn sẽ chứa 3.6 amino acid Bởi vậy, các amino acid cách nhau 3 hoặc 4 đơn vị trên chuỗi polypeptide sẽ rất gần nhau khi ở cấu trúc xoắn helix α, ngược lại, các amino acid cách nhau 2 đơn vị thì ở vị trí đối diện nhau nên khó có thể tạo liên kết Thành phần xoắn helix α trong các protein biến đổi trong một khoảng rất rộng, protein có thể hoàn toàn không có xoắn helix α, hoặc 100% là xoắn helix α Các xoắn helix α đơn thường có chiều dài dưới 4.5 nm Tuy nhiên, hai hay nhiều xoắn helix α có thể xoắn lại với nhau để tạo nên một cấu trúc rất bền vững, chiều dài có thể lên đến 100 nm hoặc hơn [41] b) Dải β
Dải β có cấu trúc khác biệt rõ rệt so với cấu trúc xoắn helix α Một đoạn polypeptipe trong cấu trúc tờ β hầu như bị kéo dãn ra thay vì cuộn chặt như trong cấu trúc xoắn helix α => các đoạn polypeptide đó được gọi là các dải β Khoảng cách giữa hai amino acid kề nhau dọc theo một dải β xấp xỉ 0.35 nm, các side chain của các amino acid này hướng ngược chiều nhau Hai hay nhiều dải β được liên kết bằng các liên kết hydrogen sẽ tạo nên một tờ β Các dải β trong một tờ β có thể định hướng song song hoặc phản song song Trong cấu trúc tờ β phản song song, nhóm NH và nhóm CO của mỗi amino acid lần lượt tạo liên kết hydrogen với nhóm CO và nhóm NH của cùng một amino acid đối diện trên dải β kế cận Còn trong dạng song song của tờ β, nhóm NH và nhóm CO của mỗi amino acid lần lượt liên kết với nhóm CO và nhóm NH của hai amino acid cách nhau 2 đơn vị trên dải β kế cận Một tờ β
27 | P a g e trung bình gồm 4 hoặc 5 dải β, nhưng đôi khi có thể chứa đến 10 dải β hoặc hơn; các cấu trúc tờ β này có thể là hoàn toàn song song, hoàn toàn phản song song hoặc là hỗn hợp của cả hai [42] c) Turn
Là nơi chuỗi polypeptide đổi hướng trong không gian [43, 44] Các turn được phân loại theo số amino acid: α turn (3 amino acid), β turn (2 amino acid), γ (1 amino acid), δ turn (0 amino acid) và π (4 amino acid) Turn được ổn định cấu trúc nhờ các liên kết hydrogen giứa các amino acid ở hai đầu turn d) Một số cấu trúc bậc hai khác
- Loop: Là nơi kết nối giữa hai α helix, khác với turn, loop không có liên kết hydrogen để ổn định cấu trúc [45]
- Các amino acid Proline có thể hình thành cấu trúc đặc biệt gọi là ring gồm 5 residue (pyrrolidine)
Chuỗi Glycine có thể hình thành cấu trúc tương tự dải β hoặc cấu trúc tương tự ring của Proline [46]
- Bulge: Là một amino acid bất thường thuộc dải β không tạo liên kết hydrogen với amino acid đối diện với nó ở dải β song song/phản song song làm cong các dải β này [47].
Cấu trúc bậc ba và bậc bốn của protein
Các cấu trúc bậc hai của chuỗi polypeptide, khi kết hợp với nhau theo rất nhiều cách sẽ tạo nên các cấu trúc 3 chiều phức tạp hơn của các protein Các cấu trúc 3 chiều này đã được biết chi tiết thông qua những kết quả thu được từ tinh thể học tia X hay sự cộng hưởng từ hạt nhân Myoglobin là protein đầu tiên có cấu trúc được quan sát và nghiên cứu chi tiết ở cấp độ phân tử Quá trình cuộn của hầu hết các protein là rất phức tạp, trạng thái cuối cùng mà một chuỗi polypeptipe trong một protein có thể đạt được sau quá trình này được gọi là cấu trúc bậc ba Đặc điểm quan trọng nổi bật của các cấu trúc bậc ba là: Phần lõi bên trong của chúng hầu hết chỉ gồm các residue có side chain không phân cực
28 | P a g e (như Leu, Val, Met, Phe), còn phần bên ngoài bao gồm cả residue và side chain không phân cực và phân cực Sự phân bố của các residue phân cực và không phân cực ở cấu trúc bậc ba của một chuỗi polypeptipe đã bộc lộ một đặc điểm then chốt trong cấu trúc của protein Trong môi trường nước, quá trình cuộn của protein diễn ra theo chiều hướng sao cho các residue kỵ nước bị cách ly khỏi nước
Thêm vào đó, một hệ sẽ mạnh hơn về nhiệt động lực học khi các nhóm kỵ nước của nó tập trung lại thay vì phân tán ra môi trường có nước xung quanh Do vậy, một chuỗi polypeptipe sẽ thực hiện quá trình cuộn sao cho các side chain kỵ nước của nó bị che phủ bên trong, còn các side chain tích điện và phân cực thì phân bố ở mặt ngoài Bên cạnh đó, các thành phần trong chuỗi tương tác với nhau qua liên kết hydrogen, cầu disulfide [48], tương tác tĩnh điện, tương tác van der Waals, liên kết kỵ nước, tương tác giữa các vòng thơm sẽ giúp cấu trúc được giữ ổn định [49, 50] b) Cấu trúc bậc bốn:
Các cấu trúc bậc một, bậc hai, bậc ba là những cấu trúc ba chiều của một chuỗi polypeptide Phức tạp hơn, hai hay nhiều chuỗi polypeptide có thể kết hợp, tương tác với nhau để tạo nên những cấu trúc bậc cao được gọi là cấu trúc bậc bốn Cấu trúc bậc bốn đơn giản nhất có lẽ là dimer, đây là một protein bao gồm hai chuỗi polypeptipe giống hệt nhau Các protein thường có cấu trúc bậc bốn rất phức tạp bao gồm nhiều chuỗi polypeptipe khác nhau.
Nhân ARN (protein PA) của cúm A/H1N1 và các biến thể đột biến của PA
Cấu trúc nhân ARN (protein PA) của cúm A/H1N1
Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đơn âm (-)ssRNA, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt mang tên từ 1 - 8 theo thứ tự giảm dần của kích thước phân tử (theo tên protein mà chúng mã hóa tổng hợp), mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus bao gồm: PA, PB1, PB1-F2, PB2, HA, NA, M (M1 và M2), NP, và NS (NS1 và NS2) [51] Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2α đối xứng dài 50 - 100 nm, đường kính 9 - 10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) - bản chất là lipoprotein,
29 | P a g e tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzyme polymerase (PA, PB1 và PB2) chịu trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của virus Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo nên loop tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn, và tạo thành một sợi RNA duy nhất có tổng độ dài từ 10 000 - 15 000 bp (tuỳ theo từng chủng virus cúm A), chứa đựng khoảng 13.5 kilobase thông tin di truyền và có cấu trúc xoắn α (helix α) bên trong vỏ virus Hai đầu 5’- và 3’- của sợi RNA hệ gen virus có gắn thêm chuỗi nucleotide có tính bảo tồn cao giữa các phân loại là: 5’-AGUAGAACAAGG… và 3’- UCG(U/C)UUUCGU CC [52]
Hình 3.1: Tám phân đoạn gen cấu tạo nên virus cúm
Trong đó các phân đoạn 1, 2, 3 (nhân ARN) là những phân đoạn có vai trò mã hóa tổng hợp các enzyme trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao:
- Phân đoạn 1 (protein PB2): có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus Protein PB2 có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 84*10 3 Da (trên thực tế là 87*10 3 Da) [53] Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ được cho là có liên quan đến vị trí amino acid 627 ở protein PB2 (ở virus cúm gia cầm vị trí này là Glu - thích ứng nhiệt độ cơ thể gia cầm khoảng 40 o C, còn ở virus thích nghi trên người là Lys - thích ứng nhiệt độ cơ thể người khoảng 37 o C) [54]
- Phân đoạn 2 (protein PB1): cũng có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzyme PB1 - tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA [55] Gần đây, đã có phát hiện thêm một protein (PB1-F2) được mã hóa bởi một khung đọc mở khác của PB1, có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis (tạm dịch hiện tượng tế bào chết theo chương trình định sẵn) [56]
- Phân đoạn 3 (protein PA) có kích thước 2233 bp, là phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 83*10 3 Da (trên thực tế là 96*10 3 Da) PA là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus [57]
Cấu trúc của các thành phần PA, PB1 và PB2 cung cấp những thông tin quan trọng trong cơ chế hoạt động cũng như khả năng kháng thuốc của một số chủng đột biến mới Cụ thể là phải thực hiện cho được mục tiêu chính trong xác định hợp chất ức chế RdRp tại vùng “endonuclease” hoặc vùng hoạt động hoặc vùng liên kết (vùng bám) - một phần cấu tạo của gen PA, và là một trong những mục tiêu hấp dẫn cho phát triển thuốc điều trị bệnh cúm đang được các nhà khoa học trên thế giới cực kì quan tâm Những sao chép của virus mRNA bởi chủ thể ribosome yêu cầu phải có “cap 5' ”, và điều này đã được thực hiện trong các tế bào bị nhiễm virus cúm bởi cơ chế "cap-snatching", trong đó vùng endonuclease sẽ tách cap 5' từ chủ thể mRNA, và hoạt động như sao chép của một primers Vùng
31 | P a g e endonuclease bao gồm N-terminal, chiếm gần một nửa thành phần của PA, có chứa ion kim loại (Mn 2+ ) trên nó và ưu tiên tách chất nền pre-mRNA ở đầu cuối 3' của một guanine được định vị bởi 12 nucleotide từ cap 5' Vùng hoạt động endonuclease làm việc tốt trong cấu trúc protein PA sẽ tiết lộ quá trình tham gia ràng buộc nucleotide của các chất nền [58] Các nghiên cứu gần đây bước đầu cho thấy cách các hợp chất thuốc ức chế tương tác tại vùng hoạt động endonuclease của protein PA ở mức độ thực nghiệm mà không có bất kì một cơ chế hoạt động nào được đưa ra Trong nghiên cứu của chúng tôi, sử dụng mô phỏng động lực học phân tử để khảo sát cơ chế bám của hợp chất thuốc đặc trị L-742,001 đến vùng endonuclease (được biết đến như một hợp chất ức chế tốt vùng endonuclease trên PA), cơ chế nhiệt động lực học, và cơ chế kháng thuốc của một số chủng đột biến sẽ phần nào làm rõ được cốt lõi bên trong vấn đề, góp phần xây dựng ra một hệ thống các hợp chất có khả năng trị bệnh cúm A tốt hơn Do đó, trong đề tài này, chúng tôi sẽ nghiên cứu tập trung cho chỉ cấu trúc của protein PA từ hai cấu trúc virus của dịch cúm A/H1N1 1934 (PR8 PA) và dịch cúm A/H1N1 2009 (pH1N1 PA).
Các biến thể đột biến của protein PA
Một số chủng đột biến mới xuất hiện gần đây trên cấu trúc protein PA của virus A/H1N1 là các cá thể đột biến tại các vị trí residues số I79L, F105S và E119D Các cá thể đột biến này tác động đến vùng endonuclease của protein PA làm thay đổi hầu hết các tương tác cũng như liên kết giữa thuốc và vùng bám của protein PA gây nên hiện tượng kháng thuốc hàng loạt [59] Do đó, nhu cầu thiết yếu đưa ra là phải xác định rõ đâu là nhân tố quan trọng làm thay đổi cơ chế hoạt động để thích nghi của các virus cúm nhằm đưa ra một số nhóm gốc cấu trúc thuốc phù hợp để ức chế sự hoạt động sinh sản của các chủng virus cúm đột biến mới này.
Cơ sở mô phỏng động lực học phân tử
Trường lực trong mô phỏng sinh học
Hiện nay trong mô phỏng sinh học, một số trường lực là được phát triển nhằm phục vụ cho các mục đích nghiên cứu đặc trưng khác nhau như tăng độ chính xác, giảm thời gian tính toán đáng kể (tiết kiệm nguồn tài nguyên máy tính), hoặc tăng độ chính xác của phép tính vừa phải đồng thời giảm thời gian thực hiện phép tính:
- Mô phỏng lượng tử kết hợp với cổ điển (QM-MM hybrid) nhằm khảo sát ở mức độ vi mô chỉ cho một số vùng cụ thể (QM) và thực hiện MM trên cả vùng không gian còn lại
- Mô phỏng cổ điển sử dụng trường lực cổ điển để khảo sát
- Mô phỏng hạt thô (mô hình MARTINI, OFEP) sử dụng trường lực gần đúng hạt thô
- Kết hợp giữa mô phỏng cổ điển với hạt thô (MM-CG hybrid)
33 | P a g e Nhìn chung các trường lực này đều cùng có hai đặc điểm quan trọng: Một là tập các hàm thế năng dùng để tính thế năng và lực tương tác Hai là tham số hóa các thông số mô phỏng sao cho phù hợp với các phương trình sử dụng trong tính toán Các thông số này là được lựa chọn sao cho hệ mô phỏng là phù hợp với mô hình thực nghiệm hay thu được từ các mô phỏng ở mức độ lượng tử
Dạng cụ thể của hàm thế và thông số mô phỏng là tùy thuộc vào trường lực Tuy nhiên hàm thế của các trường lực phải có dạng chung là:
(3.1) Ba số hạng đầu là năng lượng của các liên kết cộng hóa trị, góc và góc nhị diện (góc giữa hai mặt phẳng tạo bởi bốn nguyên tử) Số hạng cuối là tương tác tĩnh điện và van der Waals
Hình 3.2: Liên kết giữa hai nguyên tử (a), liên kết góc phẳng tạo bởi ba nguyên tử (b), góc nhị diện proper ở cấu hình trans (c), góc nhị diện improper tạo bởi hai mặt phẳng (d)
34 | P a g e Một số trường lực thông dụng trong mô phỏng cấu trúc protein:
- GROMOCS: Trường lực GROMOS87 (năm 1987) là phiên bản đầu tiên, được sử dụng cho nghiên cứu các hệ phân tử sinh học, lúc đầu các nguyên tử hydrogen dị hợp và thơm là tồn tại ngầm bởi sự đại diện của nguyên tử carbon và các nguyên tử hydrogen gắn kết như một nhóm tập trung trên nguyên tử carbon, một trường lực nguyên tử thống nhất Các thông số tương tác van der Waals được tính toán từ các cấu trúc tinh thể của hydrocarbon và trên các amino acid sử dụng bán kính không liên kết khá ngắn (0.8 nm) Các phiên bản sau đó là tiếp tục có những bổ sung hiệu chỉnh đáng kể, như thông số tương tác van der Waals là được mở rộng đến bán kính không liên kết dài hơn (1.4 nm) cùng một số chức năng quan trọng khác là cũng được thêm vào [60, 61]
- AMBER: Ra đời vào giữa những năm 1980 [62], ban đầu trường lực này bỏ qua các hydrogen không phân cực Các phiên bản sau của trường lực AMBER tiếp tục hiệu chỉnh để kết quả là chính xác hơn khi khảo sát cấu trúc bậc hai protein, ngoài ra nó là cũng đang trên đường tiếp cận tới các phân tử sinh học không phải là protein [63, 64]
- CHARMM: Phát triển vào những năm 1980 [65], ban đầu trường lực này cũng không xét đến các hydrogen không phân cực [66] Phiên bản CHARMM19 và các phiên bản sau đó là đã tính tới tất cả hydrogen Ban đầu nó là tiến hành mô phỏng ở trạng thái khí, các phiên bản sau này phát triển tốt hơn cho mô phỏng trong môi trường dung môi [67, 68]
- OPLS: Là trường lực sử dụng để mô phỏng các hệ ở trạng thái lỏng, ban đầu cho nước và hơn 40 dung môi hữu cơ [69] Sử dụng trong mô phỏng protein, trường lực này ban đầu cũng chỉ xét cho các hydrogen phân cực, và các tham số mô phỏng là được lấy từ trường lực AMBER [70] Phiên bản OPLS cho tất cả nguyên tử (OPLS-AA) là cũng được phát triển sau đó nhưng xây dựng dựa trên các thông số điện tích và hệ số van der Waals từ mô phỏng chất lỏng [71]
Các phương trình chuyển động và thuật giải
Cơ sở chính của mô phỏng MD là giải phương trình Newton cho chuyển động của hệ:
(3.2) Với lực F i = -∂V i /∂r i (i = 1,…,N) Các phương trình Newton được giải đồng thời trong những bước thời gian nhỏ, và với các điều kiện biên thích hợp Một số thuật toán sử dụng để giải các phương trình chuyển động là: a) Thuật toán Verlet Áp dụng khai triển Taylor, tọa độ của hạt ở thời điểm t+Δt được biểu diễn theo tọa độ, vận tốc và gia tốc tại thời điểm t:
(3.3) Ở đây các số hạng có bậc cao hơn hai của Δt được bỏ đi và i là chỉ số của hạt trong hệ, bởi 𝑟 : 𝑡 𝑣 : (𝑡) và 𝑟 : 𝑡 = 𝐹 i (t)/m i , phương trình (3.3) trở thành:
(3.4) Khai triển tương tự cho r i (t-Δt), ta được:
(3.5) Cộng hai phương trình (3.4) và (3.5), ta thu được:
36 | P a g e (3.6) Phương trình (3.6) gọi là thuật toán Verlet [72] Cho tọa độ ban đầu của hệ r i (0),…,r N (0) và vận tốc ban đầu v i (0),…,v N (0) Phương trình (3.4) có thể tạo ra quỹ đạo chuyển động với khoảng thời gian bất kì Vận tốc các hạt của hệ có thể được tính qua:
(3.7) b) Thuật toán Verlet vận tốc
Thuật toán Verlet trình bày ở trên không phụ thuộc vào vận tốc, mà trong một số bài toán cụ thể vấn đề vận tốc là không thể thiếu trong không gian pha (không gian tổ hợp của vận tốc và xung lượng)
Do đó, Swope đã phát triển thuật toán dựa vào tọa độ và vận tốc [73] Thuật toán là tiến hành khai triển đến bậc hai của Δt:
(3.8) Từ phương trình (3.5), áp dụng cho r i (t):
(3.9) Thay phương trình (3.8) vào phương trình (3.9) ta được:
(3.10) Như vậy thuật toán Verlet vận tốc dùng cả hai phương trình (3.8) và (3.10) để tính vị trí và vận tốc đồng thời
Thuật toán leap-frog [74] được sử dụng mặc định trong gói chương trình GROMACS để tính tích phân chuyển động Thuật toán này là một bản chỉnh sửa của thuật toán Verlet, dùng tọa độ tại thời điểm t và vận tốc tại thời điểm (t – Δt/2) để tính tọa độ và vận tốc ở các thời điểm sau đó, thông qua lực F i (t) được xác định bởi tọa độ tại thời điểm t
Vận tốc được tớnh ở ẵ bước thời gian:
(3.11) Vị trí của nguyên tử lúc này được tính bởi công thức:
(3.12) Gia tốc được suy ra từ thế tương tác V i qua công thức:
(3.13) Thuật toán leap-frog đòi hỏi hàm thế tương tác và gia tốc chỉ phụ thuộc tọa độ chứ không phụ thuộc gia tốc Trong trường hợp vế phải của phương trình Newton có chứa các số hạng mô tả ma sát và nhiễu, các thuật toán trên vẫn được áp dụng tốt nhưng giải thuật sẽ phức tạp hơn nhiều.
Điều kiện biên
Các phương trình chuyển động được giải với các điều kiện biên tuần hoàn (hình) Các nguyên tử của hệ được đặt vào trong một hộp, xung quanh là các ảnh tịnh tiến của chính hộp đó Khi một nguyên tử chuyển động ra khỏi hộp ở biên, đồng thời một trong các ảnh của nó sẽ đi vào hộp ở biên đối diện, và do vậy tổng số nguyên tử của hệ luôn được bảo toàn
Hình 3.3: Điều kiện biên tuần hoàn
Các hộp sử dụng mô phỏng thường là các hộp triclicnic với nhiều hình dạng khác nhau Chúng là được xác định bởi ba vector hộp 𝑎, 𝑏, 𝑐 thỏa các điều kiện sau: ay = az = bz = 0 ax > 0, by > 0, cz > 0
|by| ≤ E + ax, |cx| ≤ E + ax, |cy| ≤ E + by
(3.14) Bên cạnh các điều kiện biên tuần hoàn, một điều kiện quan trọng khác cũng phải được xét đến, đó là quy ước ảnh nhỏ nhất Để loại bỏ các tương tác giữa các ảnh của nguyên tử, tầm của tương tác phải nhỏ hơn một nửa chiều dài của vector hộp ngắn nhất, tức là:
(3.15) Với R c là bán kính chặt cụt (cutoff) đối với các tương tác không liên kết Tuy nhiên, quy ước ảnh nhỏ nhất vẫn chưa đầy đủ Khi một hệ gồm một đại phân tử và dung môi được mô phỏng, một phân tử dung môi không thể cùng một lúc tương tác với cả hai mặt của đại phân tử Do đó, chiều dài
39 | P a g e của mỗi vector hộp phải lớn hơn chiều dài của đại phân tử bên cạnh đó cộng với 2 lần bán kính chặt cụt Bán kính chặt cụt là của các tương tác không liên kết, do vậy nó thường được xác định với điều kiện:
Rc < min(ax, by, cz)
Rc < E + min(ax, by, cz)
(3.17) Khái niệm bán kính chặt cụt chỉ áp dụng cho các tương tác tầm ngắn; với các tương tác tầm xa thì các phương pháp như tổng Ewald (Ewald Sum) [75], PME (Particle-Mesh Ewald) [76], và PPPM (Particle-Particle Particle -Mesh) [77] là thường được sử dụng.
Chuẩn bị hệ ban đầu – Cực tiểu hóa năng lượng
Quá trình chuẩn bị hệ ban đầu trước khi mô phỏng là rất quan trọng và cần thiết Đối với các hệ sinh học phức tạp, cần phải có quá trình chuẩn bị cẩn thận và tỉ mỉ Tọa độ ban đầu được lấy từ cấu trúc tinh thể trong thí nghiệm với tia X hoặc qua cộng hưởng từ hạt nhân Các cấu trúc sinh học là được lấy từ các ngân hàng dữ liệu sinh học, chẳng hạn Protein Data Bank Tuy nhiên, các cấu trúc này thường thiếu thông tin cần thiết, chẳng hạn tọa độ các nguyên tử hydrogen, thực nghiệm là khó để xác định chính xác
Các hệ mô phỏng sinh học thường được thực hiện trong môi trường nước, do đó các cấu trúc là đối tượng sinh học cần được nghiên cứu sẽ được ngâm mình trong một hộp là môi trường chứa đầy nước Hộp nước chứa phân tử mô phỏng được tạo ra sao cho phù hợp với kích thước của cấu trúc hệ mô phỏng, các mô hình nước là được lấy từ các mẫu có sẵn trong chương trình mô phỏng Sau đó, ion là được cho vào hộp nước để trung hòa điện tích hoặc để đạt được nồng độ phù hợp với điều kiện thực nghiệm
40 | P a g eHệ ban đầu này sau đó cần phải trải qua quá trình cực tiểu hóa năng lượng trước khi tiến đến các bước cân bằng hệ Tất cả các thông số nhiệt độ và áp suất là thay đổi sao cho năng lượng và thể tích là phù hợp với thực nghiệm, nhằm tránh được hiện tượng chồng lấn nguyên tử, đứt gãy liên kết, và quan trọng nhất là sắp xếp và ổn định lại các phân tử dung môi.
Cân bằng nhiệt độ, áp suất
Các thí nghiệm thực hiện trên hệ sinh học là được tiến hành với điều kiện nhiệt độ không đổi Do đó, tập hợp các đại lượng thống kê mô tả như số nguyên tử N không đổi, thể tích V của hệ không đổi và nhiệt độ T không đổi là cần thiết (NVT) Một số thuật toán được sử dụng trong mô phỏng sinh học cho cân bằng nhiệt độ phổ biến hiện nay như:
Thiết lập hệ tại nhiệt độ T 0 sau đó thay đổi nhiệt độ của hệ theo hàm mũ để ổn định nhiệt độ tại T 0 Thuật toán này có ưu điểm là ngăn cản sự biến động của động năng và nó chỉ dùng để cân bằng hệ trước khi mô phỏng [78]:
(3.18) Với τ là một hằng số
- Thuật toán v-rescale: Được phát triển dựa trên thuật toán Berendsen bằng cách thêm vào một thông số ngẫu nhiên đảm bảo phân bố của động năng chính xác bằng cách thay đổi chính nó:
41 | P a g e Ở đây K là động năng, 𝜏 c là thời gian hồi phục, 𝑁 e là bậc tự do của hệ và dW là quá trình Wiener
Thuật toán v-rescale [79] tạo ra đúng tập hợp thống kê chính tắc nên được dùng nhiều trong mô phỏng
Mô phỏng hệ ở tập hợp thống kê vi chính tắc (NVE) và định kì thay đổi vận tốc của các nhân tố trong hệ từ phân bố Maxwell-Boltzmann [80]
- Thuật toán Nosé-Hoover: Ý tưởng cơ bản của thuật toán này là là gộp chung hệ mô phỏng và tham số nhiệt thành một hệ chính tắc bằng cách đưa thêm vào hàm Hamiltonian của hệ cần mô phỏng một số số hạng Thuật toán này khác với thuật toán Berendsen và v-rescale ở chỗ là nhiệt độ dao động chứ không thay đổi theo hàm mũ [81] b) Cân bằng áp suất
Các hệ mô phỏng sinh học sẽ được thiết lập tại một nhiệt độ để cân bằng áp suất nhằm đạt được các điều kiện tương đồng với thực nghiệm, và tại đó các tham số số hạt-áp suất- nhiệt độ là hằng số (NPT)
Một số thuật toán sử dụng phổ biến cho cân bằng áp suất như:
Thay đổi tọa độ và các vector hộp mô phỏng để tái tạo lại áp suất thực Thuật toán này tạo ra áp suất trong tập hợp NPT không được chính xác cho lắm [78]
Thay đổi phương trình chuyển động của các hạt bằng cách thêm một thông số đặc trưng làm thay đổi kích thước hộp mô phỏng, bản thân các vector hộp cũng thay đổi theo một phương trình chuyển động [82] Thuật toán này đưa hệ đạt tới tập hợp thống kê chính tắc tốt hơn Berendsen
Hàm Hamiltonian của hệ được thêm vào các số hạng động năng của hộp và công năng tác động lên hộp Các phương trình của hệ lúc này ngoài r và v còn có thêm các phương trình đặc trưng cho sự thay đổi kích thước hộp [83].
Các ràng buộc holonomic
Trong mô phỏng cổ điển các dao động tần số cao của liên kết hóa trị tính toán từ dao động cổ điển có sai lệch so với dao động lượng tử Chẳng hạn như nguyên tử hydrogen vốn có khối lượng nhỏ, độ bất định vận tốc lớn dẫn đến độ dài liên kết và góc liên kết giữa hydrogen và nguyên tử liên kết với nó dao động không ổn định Đồng thời các chuyển động có chu kì ngắn kéo theo bước thời gian mô phỏng cũng phải nhỏ Vì vậy, một số ràng buộc là đưa vào mô phỏng để loại bỏ các dao động lượng tử, được gọi là ràng buộc holonomic [84] Ràng buộc này chỉ phụ thuộc vào tọa độ của các nguyên tử của hệ, đôi khi cũng phụ thuộc vào thời gian:
(3.20) Các thuật toán ràng buộc không phụ thuộc thời gian thường được dùng trong mô phỏng các phân tử sinh học Phương trình chuyển động có thể biểu diễn dưới dạng:
(3.21) Ở đây 𝜆 h là các hệ số Langrange a) Thuật toán SHAKE:
Với thuật toán không bị ràng buộc bởi thời gian, phương trình Lagrange là có dạng:
Từ thuật toán Verlet vận tốc, tọa độ của nhân tố tại thười điểm Δt:
(3.23) Ở đây 𝜎 h 0 ≡ 𝜎 h (𝑟 : 0 , … , 𝑟 j (0)) Để đảm bảo các ràng buộc được thỏa mãn trong quá trình mô phỏng, người ta đưa trực tiếp các điều kiện này vào vị trí 𝑟 : (Δ𝑡)và xác định trong quá trình mô phỏng các hệ số cần để đảm bảo ràng buộc:
(3.25) Ở đây 𝜆 h = (Δ𝑡 + /2)𝜆 h Với mỗi điều kiện ràng buộc 𝜎 > 𝑟 E , … , 𝑟 j = 0 ta có:
(3.26) Thay 𝑟 : (Δ𝑡)vào (3.26) thu được hệ N c phương trình phi tuyến cho N c hệ số 𝜆 E , …, 𝜆 j m :
44 | P a g e Trừ khi các ràng buộc có dạng đặc biệt đơn giản, các phương trình (3.27) phải giải bằng phương pháp lặp Một trong số các thuật toán giải các phương trình (3.27) là SHAKE [85] Đầu tiên, giả sử đã có nghiệm thử tốt, 𝜆 h (E) , từ đó tọa độ có thể được tính theo:
Nghiệm chính xác lúc này của các hệ ràng buộc có thể được viết 𝜆 h = 𝜆 h (E) + 𝛿𝜆 h (E) và 𝑟 : ∆𝑡 𝑟 : (E) + (1/𝑚 : ) h 𝛿𝜆 h E ∇ : 𝜎 h (0) Phương trình (3.27) trở thành:
(3.29) Tiếp theo phương trình (3.29) được khai triển Taylor bậc nhất tại 𝛿𝜆 h E = 0:
(3.30) Phương trình (3.30) là hệ phương trình cho 𝜆 (E) h Nếu số phương trình không lớn, phương trình ma trận này có thể được tính trực tiếp để có toàn bộ các 𝜆 (E) h đồng thời, thuật toán này được gọi là matrix SHAKE [86] Đặt 𝑟 : (+) = 𝑟 : (E) + y E
𝑚 : ) h 𝛿𝜆 h + ∇ : 𝜎 h (0); sau đó thay (1) bằng (2) trong phương trình (3.30) cho bước lặp tiếp theo Quá trình này được lặp đi lặp lại cho đến khi các điều kiện ràng buộc thỏa mãn giá trị cho trước
Thuật toán này có nhược điểm là có thể không có nghiệm khi sự dịch chuyển của các nguyên tử lớn Ngoài ra, do bản chất là phương pháp lặp, SHAKE khó có khả năng song song
Thuật toán LINCS có các phương trình ràng buộc bằng 0 (pt 3.22), do đó đạo hàm bậc một và hai theo thời gian của các σ { = 0:
(3.31) Thay @ @6 K 8 K từ phương trình (3.21) vào phương trình (3.31):
(3.32) Từ phương trình (3.32) ta có:
(3.33) Chuyển (3.33) thành hệ phương trình bằng ∇𝜎 → 𝐵, 𝑚 : → 𝑀, 𝜆 : → 𝜆, 𝐹 : → 𝐹, ở đây B, M, λ và F là các ma trận 3N×K Phương trình (3.33) lúc này trở thành:
46 | P a g e Nhân hai vế phương trình (3.34) cho (𝐵𝑀 €E 𝐵 c ) €E :
(3.35) Ở dạng ma trận phương trình (3.21) trở thành:
(3.36) Thay (3.35) vào phương trình (3.33) và nhân trái hai vế cho 𝑀 €E , ta có:
(3.37) Đặt 𝑇 = 𝑀 €E 𝐵 c (𝐵𝑀 €E 𝐵 c ) €E , phương trình (3.37) rút gọn thành:
(3.38) Ở đây I là ma trận đơn vị Sử dụng thuật toán Verlet cho phương trình (3.38), tọa độ ở bước thứ n+1:
(3.39) Giống như SHAKE, việc kết hợp các thuật toán Verlet/leap-frog với LINCS [87] cũng tạo ra mô phỏng thỏa mãn tính chất nghịch đảo thời gian của hệ
Mô hình nước trong mô phỏng sinh học
Là các mô hình nước mà các nguyên tử cố định có cùng dạng hàm thế năng (phương trình 3.40) là tổng của tương tác Coulomb giữa các cặp nguyên tử của hai phân tử nước và thế năng Lenard-Jones giữa các nguyên tử O được xác định thông qua năng lượng đôi của 2 phân tử nước m và n [88]:
(3.40) Ở đây điện tích của hydrogen, A và C được chọn sao cho kết quả thu được là phù hợp với thực nghiệm về cấu trúc và năng lượng ở pha khí của phức hợp nước-alcohol cũng như nước lỏng Một số mô hình nước tường minh như SPC, SPC/E, TIP3P, TIP4P, TIP5P… [89-91] là được sử dụng phổ biến trong mô phỏng cấu trúc protein với những ưu điểm đáng kể so với các phép toán gần đúng của môi trường liên tục b) Mô hình nước không tường minh
Là sự tái tạo lại các hiệu ứng tĩnh điện của phân tử nước bằng các hàm số mô phỏng một môi trường liên tục Mô hình là xây dựng dựa trên năng lượng hòa tan tự do G solv là tổng của hai số hạng G pol và
(3.41) Trong đó G np năng lượng hòa tan tự do tính từ tổng diện tích bề mặt tiếp xúc dung môi nhân với lực căng bề mặt không xét đến điện tích của phân tử G pol là số hạng tương tác tĩnh điện giữa dung môi và chất hòa tan G solv đượcxác định từ phương trình Born tổng quát:
(3.42) Ở đây tổng tính trên mọi cặp nguyên tử, q i và q j điện tích của nguyên tử thứ i và j, r ij là khoảng cách giữa hai nguyên tử, 𝜖 là hằng số điện môi và b i , b j là bán kính Born của các nguyên tử i, j Các mẫu nước khác nhau có cách tính bán kính Born khác nhau
Số hạng G np trong phương trình (3.41) được tính trực tiếp từ bán kính Born của từng nguyên tử sử dụng xấp xỉ ACE đề xuất bởi Schaefer Xấp xỉ này thêm vào một thông số độc lập với loại nguyên tử và phụ thuộc vào mô hình nước Ngoài ra, số hạng này còn thu được từ gần đúng diện tích bề mặt (SA), G np = γSA + b; trong đó SA là diện tích tiếp xúc dung môi, còn γ và b là các hằng số hiệu chỉnh với các giá trị năng lượng hòa tan tự do của alkane [92-94]
Mô hình nước không tường minh có ưu điểm so với môi trường nước tường minh là không cần phải cân bằng dung môi trong quá trình mô phỏng, mô hình này tái tạo lại độ nhớt của nước, do đó cho phép các phân tử hòa tan trong nước thay đổi cấu trúc nhanh hơn Đặc biệt, mô hình này được giảm số bậc tự do của hệ giúp tăng tốc độ tính toán.
Phương pháp Steered Molecular Dynamics (SMD)
Xác định hướng kéo
Gói phần mềm Caver 3.0 [95] là sử dụng để xác định hướng đi ra của thuốc L-742,001 từ vùng endonuclease của viruses A/H1N1/PA Như thấy từ hình 3.4, thuốc L-742,001 là được kéo trực tiếp theo trục z sau khi đã xác định được hướng kéo ra và xoay phức hợp của thuốc và protein dọc theo trục z
Hình 3.4: Hướng kéo của phương pháp SMD cho trường hợp kéo thuốc L-742,001 từ vùng endonuclease của cấu trúc WT cho virus pH1N1 PA
3.4.2 Mô ph ỏ ng steered molecular dynamics (SMD)
Phương pháp steered molecular dynamics (SMD) [96, 97] là phương pháp sử dụng lực kéo để gây ra sự thay đổi bên trong cấu trúc cho mô phỏng động lực học phân tử Phương pháp này tiến hành chạy và điều chỉnh tất cả nguyên tử để thay đổi lực trong hệ cấu trúc nhằm hình thành các mẫu dọc theo một con đường ra vào của thuốc một cách cụ thể Trên cơ sở lý thuyết của một mô phỏng bình thường, sự thay đổi có thể xảy ra tự phát trong quá trình mô phỏng nhưng cần phải có một thời gian đủ dài thì mới quan sát được Phương pháp SMD thì khác, phương pháp này giúp tăng tốc, đẩy nhanh quá trình quan sát và hiểu được sự thay đổi năng lượng của hệ mô phỏng xảy ra theo một cách nào đó nhanh chóng SMD là một trong những phương pháp tiềm năng được sử dụng để tính toán sự thay đổi của năng lượng tự do cho các hệ phân tử sinh học
Quá trình sử dụng lực kéo của phương pháp SMD là xác định dựa trên công thức:
Phương pháp Molecular Mechanics Poisson-Boltzmann Surface Area (MM- PBSA)
Năng lượng liên kết tự do giữa hai phân tử bao gồm một lớn (receptor) và một nhỏ (ligand) là một đại lượng đánh giá khả năng liên kết giữa hai phân tử đó và được tính bằng hiệu năng lượng tự do giữa hai trạng thái liên kết với nhau (complex) và nằm riêng như trong hình 3.5, được xác định bởi công thức: ΔGbind = ΔGbind,solv = ΔGcomplex – ΔGfree-protein – ΔGfree-ligand
Hình 3.5: Sơ đồ tính năng lượng liên kết tự do trực tiếp giữa hai phân tử khi có dung môi
Nhưng nếu tính trực tiếp như phương trình trên thì phải thực hiện tính toán cho một lượng rất lớn các nguyên tử dung môi, vì vậy rất hao tài nguyên máy tính Để giải quyết khó khăn đó, phương pháp MM-PBSA được xây dựng và phát triển, nó là một trong những phương pháp dùng để tính toán năng lượng liên kết tự do Để phép tính được đơn giản hơn, người ta chia nhỏ ra thành các số hạng đơn giản hơn như trong hình 3.6
Hình 3.6: Sơ đồ mô tả quá trình xác định năng lượng liên kết tự do của phương pháp MM-PBSA
Lúc này, ΔGbind,solv là định nghĩa bởi: ΔGbind,solv = ΔGbind,vac + (ΔGsolv,com – ΔGsolv,lig – ΔGsolv,rec)
(3.45) Hay: ΔGbind,solv = ΔGbind,vac + ΔΔGsolv
(3.46) Với ΔΔGsolv là: ΔΔGsolv = GPB + Gsur
(3.47) Và ΔGbind,vac là được ước lượng bởi: ΔGbind,vac = ΔEmm – TΔS
52 | P a g e (3.48) Trong đó đại lượng Emm là tính toán với mỗi chu trình mà không cut-offs: ΔEmm = ΔEbond + ΔEangle + ΔEtorsion + ΔEelec + ΔEvdW
(3.49) Ở đây, Ebond, Eangle và Etorsion là các giới hạn địa phương đến từ các giá trị của tương tác liên kết cộng hóa trị, uốn và xoắn ΔEelec và ΔEvdW là đóng góp từ tương tác tĩnh điện và van der Waals Giá trị GPB là năng lượng phân cực nội tại xác định bởi gần đúng dung môi liên tục [98], nó là sự thay đổi của tương tác tĩnh điện bởi quá trình trung chuyển của hệ với hệ số điện môi và là dao động từ giá trị thấp (ε = 1) đến cao hơn (ε = 78.45) Gsur là năng lượng không phân cực, nó là được làm gần đúng từ sự phụ thuộc tuyến tính của phương pháp tiếp cận dung môi xác định bởi gói phần mềm APBS [99] Cụ thể Gsur = γSASA + β, với γ = 0.0072 (kcal/mol).Å 2 và β = 0
Cuối cùng giá trị của đại lượng entropy [100, 101] là được xác định bởi phương trình:
(3.50) Với S vib là rung động entropy, ћ là hằng số Plank, υ 0 là tần số ban đầu của chế độ dao động, k B là hệ số Boltzmann, T là nhiệt độ tại 300 K, và N A là số Avogadro.
Phương pháp Free Energy Pertuabation (FEP)
Phương pháp FEP được sử dụng để xác định năng lượng liên kết tự do tại các trạng thái khác nhau đạt được từ mô phỏng MD khi hàm Hamiltonian của hệ là thay đổi từ trạng thái A đến trạng thái B thông qua một chuỗi thống kê λ dao động từ 0 đến 1 [102, 103] Quá trình chuyển đổi trạng thái là chỉ xảy ra khi hệ được cân bằng, và cặp tham số λ là sử dụng để thay đổi hàm Hamiltonian từ trạng thái A (λ
Hình 3.7: Sơ đồ mô tả quá trình tính toán năng lượng liên kết tự do bởi phương pháp FEP
Chi tiết hơn, sự thay đổi năng lượng liên kết tự do giữa trạng thái λi và λi+1, ΔGλi -> λi+1 là được xác định bởi Bennett’s Acceptance Ratio (BAR) [104], nó là được mô tả lần lượt như: ΔG = ¢ £ 𝛥𝐺 ¢:→ ¢:‚E ¢ ¤
(3.52) H là hàm Hamiltonian của hệ
Tương tác Coulomb giữa hai nguyên tử phụ thuộc trên giá trị của λ:
54 | P a g e Và tương tác vdW của phương pháp này là xác định bởi:
(3.54) Điểm đặc trưng trong thế năng cần phải được loại bỏ bằng cách thay đổi tương tác vdW và Coulomb với hạn chế năng lượng và giá trị liên quan ở các giá trị từ 0 đến 1, nhưng không ở λ = 0 hoặc 1 Vì vậy, điểm dị thường trong tiềm năng và các dẫn xuất của nó tại r = 0 là không bao giờ đạt được:
VSC = (1 - λ)V A (rA) + λV B (rB) rA = (𝛼𝜎 ơ G λ ˆ + 𝑟 G ) 1/6 rB = (𝛼𝜎 - G λ ˆ + 𝑟 G ) 1/6
(3.55) Trong đó V A và V B là tương tác van der Walls hoặc Coulomb ở trạng thái A (λ = 0) và trạng thái B (λ = 1), α là tham số lõi mềm, p là giá trị tiềm năng λ của lõi mềm, và σ bán kính của tương tác
(thông thường chúng tôi chọn p = 2 và α = 1.5) [105] Sau đó, ta có:
(3.56) Năng lượng tự do liên kết ΔGFEP của phối tử (ligand) và protein là xác định khác nhau giữa ΔGA vàΔGB (ΔGB – ΔGA) Ở đây, ΔGA là năng lượng liên kết tự do thay đổi liên quan đến việc loại bỏ phối tử trong giai đoạn khí của các phức hợp, và ΔGB là sự thay đổi năng lượng liên kết tự do từ quá trình loại bỏ phối tử từ dung môi và rời đến pha khí
Thiết lập mô phỏng và các công cụ phân tích dữ liệu
Thiết lập mô phỏng động lực học phân tử
Để khảo sát sự thay đổi của các chủng virus theo thời gian và khả năng kháng thuốc của chúng cùng các biến thể đột biến mới, chúng tôi tiến hành mô phỏng MD với các hệ phân tử A/H1N1/PA bao gồm pH1N1 PA (virus 2009) và PR8 PA (virus 1934) Ở đây, tổng cộng là có 8 hệ mô phỏng cần thực hiện, bao gồm cấu trúc WT và ba biến thể đột biến tại residue của E119D, I79L và F105S cho cả hai chủng virus, được viết tắt bởi: pH1N1 PAWT, pH1N1 PAE119D, pH1N1 PAI79L, pH1N1 PAF105S, PR8 PAWT, PR8 PAE119D, PR8 PAI79L, PR8 PAF105S [59]
Chúng tôi sử dụng phần mềm GROMACS phiên bản 5.1.2 [106] để tiến hành mô phỏng với trường lực GROMOCS 53a6 [107] Mô hình nước SPC [90] là sử dụng cho tất cả các hệ mô phỏng
Thuật toán leap-frog [74] được sử dụng để tính tích phân phương trình chuyển động với bước thời gian là 2 fs Mặc dù thuật toán Verlet là chính xác hơn thuật toán leap-frog, nhưng thuật toán leap- frog có hiệu năng cao hơn và độ chính xác vẫn đủ sử dụng cho các mô phỏng thông thường Các liên kết trong hệ được ràng buộc bởi thuật toán LINCS [87] Nhiệt độ của hệ được duy trì bởi thuật toán v- rescale [79] với thời gian hồi phục là 1 fs, đảm bảo các hệ mô phỏng được thực hiện trong một tập hợp thống kê chính tắc Đầu tiên, chúng tôi sẽ thực hiện 8 mô phỏng MD bình thường sau đó sẽ sử dụng dữ liệu của 8 hệ này để tiếp tục tiến hành tính toán SMD, MM-PBSA, FEP, cụ thể là: a) Phương pháp SMD:
Các tọa độ cuối cùng tại 800 ns là được sử dụng cho mô phỏng SMD cho các phức hợp của virus PR8 PA và pH1N1 PAI79L Ba phức hợp còn lại bao gồm pH1N1 PAWT, pH1N1 PAE119D và pH1N1 PAF105S là lấy từ cấu trúc thực nghiệm ban đầu để thực hiện mô phỏng SMD Trong mô phỏng SMD, các phức hợp là được đặt trong một hộp trilinic với chiều dài tương ứng của 3 cạnh là 6.6 nm Í 6 nm Í 12 nm để có đủ không gian chứa phức hợp và kéo thuốc ra khỏi vùng hoạt động của protein theo chiều z
56 | P a g e Tọa độ trong tâm của protein trong hộp là định vị tại 3.3 nm Í 3nm Í 2.5 nm Các phức hợp là sau đó được thêm vào một hàm lượng 0.1 mol/ml phân tử NaCl, sau đó ion Na hoặc Cl là được thêm tiếp vào để hệ các phức hợp là được trung hòa về điện tích Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn hệ số k
= 600 (mol.nm 2 ) (gần bằng 1020 pN/nm)
Quá trình thuốc L-742,001 rời khỏi vùng hoạt động của A/H1N1/PA là thực hiện đến 1200 ps và 2000 ps cho cấu trúc cúm pH1N1 PA và PR8 PA với vận tốc kéo là v = 0.001 nm/ps và 0.005 nm/ps Tuy nhiên, kết quả đạt được của hai vận tốc kéo là gần giống nhau, do đó chúng tôi chỉ trình bày cho các kết quả đạt được tại v = 0.001 nm/ps b) Phương pháp MM-PBSA
Tất cả quỹ đạo của 100 ns cuối cùng trong 800 ns của các mô phỏng MD là được dùng để tính toán năng lượng liên kết tự do bằng phương pháp MM-PBSA Nói chính xác hơn, tất cả quỹ đạo của hệ tại trạng thái cân bằng sẽ sử dụng để tính toán năng lượng liên kết tự do giữa L-742,001 và vùng endonuclease của các hệ A/H1N1/PA bởi sử dụng phương pháp MM-PBSA c) Phương pháp FEP
Trong nghiên cứu này, phương pháp FEP là sử sụng để xác điịnh năng lương liên kết tự do giữa thuốc L-742,001 và vùng endonuclease của các hệ A/H1N1/PA, nó là được tính toán dựa trên một dãy thông số λ Cụ thể là 21 cặp thông số λ là sử dụng để giảm tương tác vdW từ λ = 1 đến λ = 0 Đồng thời 12 giá trị của λ (cũng tương ứng từ 1 đến 0) là chọn để giảm tương tác tĩnh điện sử dụng thông qua tương tác thế năng lõi mềm Trong chi tiết, một bộ giá trị λ là giống nhau cho cả hai hệ phức hợp (thuốc + protein trong nước) và chỉ phối tử (chỉ thuốc trong nước) cho tương tác vdW bao gồm 21 giá trị của λ = 0.0; 0.1; 0.2; 0.275; 0.375; 0.45; 0.55; 0.65; 0.675; 0.725; 0.75; 0.775; 0.8; 0.825; 0.85; 0.875;
0.9; 0.925; 0.95; 0.975; và 1.0 Và tương tác Coulomb bao gồm 12 giá trị của λ = 0.0; 0.1; 0.25; 0.45;
Các công cụ phân tích dữ liệu
Liên kết hydrogen được hình thành giữa nguyên tử hydrogen liên kết hóa trị với một nguyên tử có độ âm điện lớn (donor) như 0, N, F và một nguyên tử có độ âm điện lớn gần đó (acceptor) Khi khoảng cách giữa nguyên tử donor và acceptor nhỏ hơn hoặc bằng 0.35 nm và góc tạo bởi donor-hydrogen- acceptor ≤ 30 0 Thỏa mãn các điều kiện đó, một liên kết hydrogen là hình thành b) Độ lệch quân phương Độ lệch quân phương (RMSD) là đại lượng được dùng để đánh giá sự khác nhau giữa cấu trúc của protein tại thời điểm và một cấu trúc được chọn làm tham chiếu, RMSD càng lớn có nghĩa là sự khác biệt càng nhiều RMSD là được định nghĩa bởi:
(3.57) Trong đó, N là số nguyên tử có trong protein, cấu trúc được chọn làm tham chiếu là cấu trúc của protein ứng với cực tiểu chung trên bề mặt năng lượng tự do
Liên kết hydrogen và sự ổn định của các hệ mô phỏng
Liên kết hydrogen
Sự ảnh hưởng của ái lực liên kết của thuốc L-742,001 lên vùng endonuclease của virus cúm A/H1N1/PA có vai trò quan trọng trong khảo sát sự thay đổi của năng lương liên kết tự do và cơ chế nhiệt động lực học phân tử của các phức hợp Sự đóng góp của mạng lưới liên kết hydrogen bắt đầu một vai trò quan trọng trong ước lượng ái lực liên kết giữa thuốc L-742,001 và vùng hoạt động của các hệ A/H1N1/PA Như thấy từ hình 4.1, chỉ có một liên kết hydrogen là hình thành giữa thuốc L- 742,001 và vùng endonuclease của virus pH1N1 PAWT, ở đây L-742,001 là liên kết với residue Lys134 Giống như pH1N1 PAWT, thuốc L-742,001 là cũng chỉ hình thành một liên kết hydrogen với vùng endonuclease của PR8 PAWT, ở đây L-742,001 là liên kết với residue Thr32 Hầu như không có sự khác biệt về số lượng liên kết hydrogen giữa L-742,001 và vùng liên kết của pH1N1 PAWT và PR8 PAWT, tuy nhiên liên kết hydrogen của thuốc L-742,001 với Lys134 là có đặc tính ion hóa và mạnh hơn so với Thr32, và các thành phần khác nhau của mạng lưới liên kết hydrogen và tương tác hydrophobic cũng có thể là nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt trong quá trình kiểm soát sự tương tác của L-742,001 lên vùng endonuclease của hai chủng loại virus cúm Ở đây, liên kết hydrogen là không chỉ đóng góp nhiều nhất đến giá trị năng lượng tương tác mà còn kiểm soát hầu hết sự ảnh hưởng của các residue đột biến tại vùng endonuclease của virus A/H1N1/PA Ngoài ra, sự đóng góp của ion Mn 2+ tại vùng liên kết là ảnh hưởng trực tiếp đến sự thay đổi của ái lực liên kết của L-742,001 lên vùng endonuclease, nó là liên kết với L-742,001 và thúc đẩy quá trình động lực học của L-742,001 trên vùng endonuclease của WT và các biến thể đột biến của A/H1N1/PA
Hình 4.1: Mạng lưới liên kết hydrogen giữa thuốc L-742,001 và vùng endonuclease cho WT của virus cúm pH1N1 PA và PR8 PA, mạng lưới liên kết hydrogen là xác định bởi gói phần mềm LigPlot [108]
4.1.2 S ự ổ n đị nh c ủ a các h ệ mô ph ỏ ng Để xác định sự ổn định của các phức hợp L-742,001-pH1N1 PAs và L-742,001-PR8 PAs, giá trị RMSD liên quan đến cấu trúc ban đầu và mô phỏng đến 800 ns là trình bày như trong hình 4.2 Ở đây, các hệ pH1N1 PAs là tiến đến trạng thái cân bằng sau 300 ns trong khi đó các hệ PR8 PAs là tiến đến trạng thái cân bằng chỉ sau 200 ns Trong chi tiết, các giá trị RMSD là dao động xung quanh 0.3 nm cho các hệ pH1N1 PAWT, pH1N1 PAI79L, pH1N1 PAE119D và 0.4 nm cho pH1N1 PAF105S Trong khi đó, giá trị RMSD là dao động xung quanh 0.25 nm cho PR8 PAWT và PR8 PAI79L, và xung quanh 0.4 nm cho PR8 PAE119D và PR8 PAF105S Tại trạng thái cân bằng, các hệ mô phỏng là ổn định, do đó các quỹ đạo trong khoảng ổn định là được sử dụng để tính toán năng lượng liên kết tự do bằng phương pháp MM-PBSA, ngoài ra quỹ đạo cuối cùng của các hệ phức hợp là chọn để tiến hành mô phỏng SMD và tính toán năng lượng liên kết tự do bởi phương pháp FEP
Sự ổn định của hệ mô phỏng
Hình 4.2: Giá trị RMSD như một hàm của thời gian cho WT và ba biến thể đột biến của virus pH1N1 PA (2009) và PR8 PA (1934).
Kéo thuốc L-742,001 từ vùng endonuclease của các virus cúm A/H1N1/PA
Hồ sơ lực kéo
Trong nghiên cứu này, phương pháp SMD là sử dụng để khám phá ái lực liên kết của thuốc L-742,001 lên vùng endonuclease, ngoài ra sự ảnh hưởng của các biến thể đột biến kháng thuốc (bao gồm I79L, E119D, và F105S) lên vùng endonuclease dựa trên cơ chế động lực học của các virus A/H1N1/PA là cũng nghiên cứu trong chi tiết Quá trình kéo thuốc L-742,001 từ vùng hoạt động của các virus cúm A/H1N1/PA hay còn được gọi là hồ sơ lực kéo là thấy như trong hình 4.3 (a) & (b) Giá trị lực kéo
(b) pH1N1 PA WT pH1N1 PA I79L pH1N1 PA E119D pH1N1 PA F105S
PR8 PA WT PR8 PA I79L PR8 PA E119D PR8 PA F105S
61 | P a g e cực đại (Fmax) là giá trị cần thiết để gây ra sự đứt gãy liên kết hydrogen giữa L-742,001 và vùng hoạt động của nó, và sau đó thuốc L-742,001 là rời khỏi vùng liên kết của các phức hợp A/H1N1/PA Thời gian từ điểm bắt đầu đến khi đạt giá trị cực đại tại đỉnh Fmax trong hồ sơ lực kéo là thời gian cần thiết để kéo thuốc L-742,001 từ vị trí ổn định đến vị trí không ổn định Cũng có thể hiểu theo cách khác là:
Trước đỉnh Fmax, cấu trúc phức hợp là hoạt động như lực kéo tăng dần theo trục z Sau giá trị đỉnh Fmax, sự hoạt động của chúng là phức tạp hơn do sự xuất hiện của các đỉnh yếu hơn tuân thủ theo sự lớn dần của thời gian mô phỏng khi thuốc L-742,001 là thoát ra khỏi vùng hoạt động của các virus A/H1N1/PAs
Do hồ sơ lực kéo của tất cả các phức hợp không là một hàm tuyến tính, nên để đánh giá ái lực liên kết của thuốc L-742,001 trên vùng hoạt động của nó, chúng ta không chỉ dựa trên độ cao của đỉnh Fmax mà còn phụ thuộc vào thời gian mà thuốc L-742,001 rời khỏi vùng hoạt động của A/H1N1/PA
Trong chi tiết hơn, con đường đi ra khỏi vùng liên kết của thuốc L-742,001 cho PR8 PAWT yêu cầu một giá trị lực cực đại Fmax = 916.9 pN, nó là thấp hơn Fmax = 1018.2 pN của pH1N1 PAWT Tuy nhiên thuốc L-742,001 là cần đến 1500 ps để rời khỏi vùng liên kết của PR8 PAWT trong khi nó là chỉ cần khoảng 500 ps để rời khỏi vùng liên kết của pH1N1 PAWT Rõ ràng rằng thời gian cần thiết để thuốc L-742,001 rời khỏi vùng liên kết của PR8 PAWT là lâu hơn gấp ba lần so với pH1N1 PAWT Này cũng có nghĩa rằng ái lực liên kết của phức hợp L-742,001-PR8 PAWT là mạnh hơn L-742,001-pH1N1 PAWT hay phức hợp L-742,001-PR8 PAWT là ổn định hơn phức hợp L-742,001-pH1N1 PAWT
Hình 4.3: Hồ sơ lực kéo và quỹ đạo đi ra từ vùng liên kết của WT và ba biến thể đột biến của virus cúm PH1N1 PA (2009) và PR8 PA (1934) xác định bởi phương pháp SMD
Trong chi tiết hơn, về các cấu trúc phức hợp của virus cúm pH1N1 PA, thời gian cần thiết để kéo thuốc L-742,001 rời vùng liên kết của pH1N1 PAWT (tại Fmax = 1018.2 pN), pH1N1 PAI79L (tại Fmax = 766.1 pN), pH1N1 PAE119D (tại Fmax = 587.7 pN), và pH1N1 PAF105S (tại Fmax = 675.2 pN) là trong khoảng thời gian tương ứng đến 500 ps, 375 ps, 400 ps, và 300 ps Ở đây, mặc dù giá trị lực cực đại Fmax của pH1N1 PAE119D là nhỏ hơn pH1N1 PAI79L và pH1N1 PAF105S, nhưng thuốc L-742,001 là rời vùng liên kết của pH1N1 PAE119D lâu hơn pH1N1 PAI79L và pH1N1 PAF105S dưới sự ảnh hưởng của cùng lực kéo ban đầu như nhau Có lẽ sự ảnh hưởng của residue đột biến E119D đến các residue xung quanh nó thuộc vùng endonuclease đã làm thay đổi cơ chế liên kết của thuốc L-742,001 trên vùng liên kết dẫn đến hiện tượng nó là bị kéo khỏi vùng liên kết lâu hơn pH1N1 PAI79L Tuy nhiên,
PR8 PA WT PR8 PA I79L PR8 PA E119D PR8 PA F105S
(b) pH1N1 P A WT pH1N1 P A I79L pH1N1 P A E119D pH1N1 P A F105S
P os it io n (n m ) pH1N1 P A WT pH1N1 P A I79L pH1N1 P A E119D pH1N1 P A F105S
PR8 PA WT PR8 PA I79L PR8 PA E119D PR8 PA F105S
63 | P a g e kết quả đạt được là khó để xác định chính xác như thế nào về ái lực liên kết là tốt hơn giữa hai biến thể đột biến pH1N1 PAE119D và pH1N1 PAI79L
Về các cấu trúc phức hợp của virus cúm PR8 PA, thời gian kéo thuốc L-742,001 rời khỏi vùng hoạt động của các virus PR8 PA là đến khoảng 1500 ps cho PR8 PAWT (tại Fmax = 916.9 pN), 1250 ps cho PR8 PAI79L (tại Fmax = 638.1 pN), 750 ps cho PR8 PAE119D (tại Fmax = 604.7 pN), và 1000 ps cho PR8 PAF105S (tại Fmax = 563.6 pN) Kết quả dữ liệu đạt được cho thấy sự ổn định của các phức hợp là giảm dần tương ứng đến L-742,001-PR8 PAWT => L-742,001-PR8 PAI79L => L-742,001-PR8 PAF105S
=> L-742,001-PR8 PAE119D Giống như hồ sơ lực kéo, quỹ đạo đi ra theo trục z cho WT và ba biến thể đột biến của hai chủng loại virus pH1N1 PA và PR8 PA là hàm của thời gian mô phỏng (hình 4.3 (c) & (d)), chúng cho thấy rõ hơn về vị trí mà thuốc L-742,001 sẽ là rời khỏi vùng hoạt động của nó
Như một bằng chứng, kết quả đạt được từ hình 4.3 một lần nữa khẳng định rằng thuốc L-742,001 liên kết đến các cấu trúc PR8 PA là tốt hơn pH1N1 PA Kết quả này rõ ràng khẳng định rằng sau một thời gian dài chủng virus cúm PR8 PA (virus cúm năm 1934) đã thay đổi một số thuộc tính ban đầu để thích nghi đến điều kiện môi trường sống hơn (sự thích nghi của virus cúm pH1N1 PA năm 2009), dẫn đến hiện tượng kháng thuốc của một số chủng virus mới, bao gồm cả các biến thể đột biến.
Năng lượng tương tác
Mặc dù số liên kết hydrogen giữa L-742,001 và vùng liên kết là bằng nhau cho cả hai virus pH1N1 PA và PR8 PA, năng lượng tĩnh điện giữa thuốc và các residue thuộc vùng endonuclease của PR8 PA là vẫn mạnh hơn pH1N1 PA
Hình 4.4: Năng lượng tĩnh điện và vdW của WT và ba biến thể đột biến của virus cúm PH1N1 PA
(2009) và PR8 PA (1934) xác định bởi phương pháp SMD
Trong chi tiết, hình 4.4(a) rõ ràng cho thấy năng lượng tĩnh điện là cùng tiến đến giá trị 0 kcal/mol sau 700 ps cho pH1N1 PAWT, pH1N1 PAI79L, và pH1N1 PAF105S, và sau 1000 ps cho pH1N1 PAE119D Trong khi đó, hình 4.4(b) mô tả năng lượng tĩnh điện cùng tiến đến 0 kcal/mol sau 1800 ps cho tất cả các phức hợp của PR8 PAWT, PR8 PAI79L, PR8 PAE119D, và PR8 PAF105S Ở đây, năng lượng tĩnh điện là một đường uốn cong tại điểm mà ở đó đỉnh của lực là đạt giá trị cực đại Giống như năng lượng tĩnh điện, năng lượng vdW cũng thay đổi đột ngột tại điểm cực đại như thấy trong hình 4.4(c)
& (d) Chi tiết hơn, chúng là tiến đến 0 kcal/mol sau 700 ps cho phức hợp pH1N1 PAWT và pH1N1 PAF105S, sau 800 ps cho pH1N1 PAI79L và sau 1100 ps cho pH1N1 PAE119D Trong khi đó năng lượng vdW của các phức hợp PR8 PAs là cùng tiến đến 0 kcal/mol (sau 1950 ps) trễ hơn nhiều trong so sánh
Time (ps) pH1N1 PA WT pH1N1 PA I79L pH1N1 PA E119D pH1N1 PA F105S pH1N1 PA WT pH1N1 PA I79L pH1N1 PA E119D pH1N1 PA F105S
PR8 PA WT PR8 PA I79L PR8 PA E119D PR8 PA F105S PR8 PA WT PR8 PA I79L PR8 PA E119D PR8 PA F105S
E ( kc al /m ol ) el ec
E ( kc al /m ol ) el ec
65 | P a g e với các phức hợp pH1N1 PAs Kết quả này khẳng định rằng năng lượng vdW có vai trò quan trọng hơn năng lượng tĩnh điện.
Ảnh hưởng của các residues đột biến đến cơ chế kháng thuốc L-742,001
Để khảo sát sự ảnh hưởng của các residues đột biến lên sự thay đổi của ái lực liên kết cho pH1N1 PA và PR8 PA, hình 4.5 minh họa số liên kết hydrogen hình thành giữa các residues đột biến và các residues xung quanh nó trong so sánh với cấu trúc hoang dã Cho cấu trúc pH1N1 PA, hình 4.5 (a) &
4.5(b) & 4.5(c) cho thấy sự tăng dần của số liên kết hydrogen của cả hai r79-I79L và r105-F105S và sự giảm dần của r119-E119D có thể dẫn đến sự thay đổi của ái lực liên kết trong so sánh với cấu trúc hoang dã Cho cấu trúc PR8 PA, hình 4.5(d) & 4.5(e) & 4.5(f) phản ánh số liên kết hydrogen của r79- I79L là mất mát trong khi r105-F105S là không thay đổi và r119-E119D là tăng dần trong so sánh với cấu trúc hoang dã, kết quả này dường như là đối lập với cấu trúc pH1N1 PA
Hình 4.5: Liên kết hydrogen giữa các residues đột biến và các residues xung quanh chúng trong so sánh với cấu trúc hoang dã của virus cúm PH1N1 PA (2009) và PR8 PA (1934) xác định bởi phương pháp SMD a) pH1N1 PA- r79 b) pH1N1 PA- r105 c) pH1N1 PA- r119
Time (ps) Time (ps) Time (ps)
N um be r of h yd ro ge n bo nd N um be r of h yd ro ge n bo nd
66 | P a g eNhìn chung, sự khác biệt của cấu trúc đột biến và hoang dã giữa pH1N1 PA và PR8 PA có chỉ ra một sự thay đổi quan trọng trong chức năng cấu trúc và cơ chế hoạt động để dẫn đến hiện tượng kháng thuốc L-742,001 của pH1N1 PA là hơn đến PR8 PA.
Năng lượng liên kết tự do
Năng lượng liên kết tự do xác định bởi phương pháp MM-PBSA
Giống với hồ sơ lực kéo, năng lượng liên kết tự do cũng được dùng để nghiên cứu ái lực liên kết giữa thuốc và các cấu trúc cúm A/H1N1/PA Trong phần này, chúng tôi sẽ trình bày về kết quả năng lượng liên kết tự do đạt được từ phương pháp MM-PBSA, từ đó khảo sát cơ chế bám cũng như cơ chế kháng thuốc của các biến thể đột biến cho cả hai chủng virus cúm A/H1N1/PA
B ả ng 2 Năng lượng liên kết tự do giữa thuốc L-742,001 và vùng endonuclease của WT và ba biến thể đột biến của virus A/H1N1/PA tính toán bởi phương pháp MM-PBSA
Compound ΔEvdW ΔEelec ΔGsur ΔGPB TΔS ΔGbind pH1N1 PAWT -23.1 -12.8 -4.4 30.5 -11.5 -21.3 pH1N1 PAI79L -14.9 -9.0 -5.2 23.3 -12.3 -18.1 pH1N1 PAE119D -13.8 -9.7 -5.1 25.8 -14.7 -17.5 pH1N1 PAF105S -14.4 -10.8 -5.3 27.4 -14.1 -17.2
Như thấy từ bảng 2, sự đóng góp của mỗi năng lượng thành phần tạo nên năng lượng liên kết tự do xác định bởi phương pháp MM-PBSA là cho thấy rằng năng lượng vdW (ΔEvdW) có vai trò quan trọng hơn năng lượng tĩnh điện (ΔEelec), sự thay đổi của năng lượng solvation không phân cực (ΔGsur)
67 | P a g e và năng lượng entropy (TΔS) là không gây ra sự khác biệt của giá trị năng lượng liên kết tự do của các phức hợp, và sự mất mát của năng lượng solvation phân cực (ΔGPB) là được bù trừ bởi các thành phần còn lại trong tính toán năng lượng liên kết tự do Trong chi tiết, giá trị ΔEvdW của các phức hợp L-742,001-PR8 PAs là dao động giữa -36.9 kcal/mol và -27.0 kcal/mol (như trong bảng 2), nó là lớn hơn 2 lần trong so sánh với giá trị ΔEelec của các phức hợp L-742,001-pH1N1 PAs là dao động giữa -23.1 kcal/mol và -13.8 kcal/mol Tương đương với giá trị ΔEelec, giá trị của ΔEvdW và ΔGPB của các phức hợp L-742,001-PR8 PAs (ΔEvdW dao động từ -24.4 đến -18.6 kcal/mol, và ΔGPB dao động từ 47.9 đến 58.9 kcal/mol) là cũng lớn hơn 2 lần trong so sánh với các phức hợp L-742,001-pH1N1 PAs (ΔEvdW là dao động từ -12.8 đến -9.0 kcal/mol, và ΔGPB là dao động từ 23.3 đến 30.5 kcal/mol) Trong khi đó, giá trị ΔGsur và TΔS là không khác biệt nhiều cho tất cả các phức hợp mô phỏng của L-742,001- PR8 PAs (dao động giữa -7.1 kcal/mol và -5.4 kcal/mol cho ΔGsur, và dao động giữa -14.2 kcal/mol và -10.2 kcal/mol cho TΔS) và L-742,001- pH1N1 PAs (dao động giữa -5.3 kcal/mol và -4.4 kcal/mol cho ΔGsur, và giữa -14.7 kcal/mol và -11.5 kcal/mol cho TΔS) Các kết quả đạt được đã chứng minh rằng sự thay đổi của các giá trị ΔEvdW, ΔEelec và ΔGPB là nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt của giá trị năng lượng liên kết tự do cho các cấu trúc phức hợp của hai chủng virus L-742,001-PR8 PAs và L-742,001-pH1N1 PAs Năng lượng liên kết tự do đạt được bởi phương pháp MM-PBSA là dao động trong khoảng từ -21.3 kcal/mol đến -17.2 kcal/mol cho virus cúm pH1N1 PAs, và từ -23.4 kcal/mol đến -18.3 kcal/mol cho virus cúm PR8 PAs Kết quả đạt được từ phương pháp MM-PBSA cho thấy thuốc L-742,001 là bám đến cấu trúc của WT tốt hơn các biến thể đột biến, và năng lượng liên kết tự do của thuốc L-742,001 đến virus cúm PR8 PAs là mang giá trị âm hơn virus cúm pH1N1 PAs, nguyên nhân có lẽ là do sự mất mát của các residue mang tương tác hydrophobic tại vùng hoạt động của virus PR8 PAs
Năng lượng liên kết tự do xác định bởi phương pháp FEP
Giá trị năng lượng vdW (ΔEvdW-FEP) và năng lượng tĩnh điện (ΔEelec-FEP) tính toán từ phương pháp FEP là một lần nữa khẳng định rằng đóng góp của tương tác vdW là quan trọng hơn tương tác tĩnh điệntrong ước lượng năng lượng liên kết tự do bởi phương pháp FEP (ΔGFEP)
B ả ng 3 Thành phần năng lượng liên kết tự do giữa L-742,001 và vùng endonuclease của WT và ba biến thể đột biến của virus A/H1N1/PA tính toán bởi phương pháp FEP
Compound Values pH1N1 PAWT pH1N1 PAI79L pH1N1 PAE119D pH1N1 PAF105S
PR8 PAF105S ΔEvdW-FEP -6.3 -5.2 -8.7 -4.1 -5.3 -6.8 -7.1 -4.3 ΔEelec-FEP -1.9 -2.0 2.1 -2.0 -4.1 -1.1 0.3 -2.9 ΔGFEP -8.2 -7.2 -6.6 -6.1 -9.4 -7.9 -6.8 -7.2
Như thấy từ bảng 3, ΔEvdW-FEP là dao động giữa -8.7 kcal/mol và -4.1 kcal/mol cho virus cúm pH1N1 PAs và từ -7.1 kcal/mol đến -4.3 kcal/mol cho virus cúm PR8 PAs Trong khi đó, ΔEelec-FEP là chỉ dao động trong khoảng từ -2.0 kcal/mol đến 2.1 kcal/mol cho virus cúm pH1N1 PAs và từ -4.1 kcal/mol đến 0.3 kcal/mol cho virus cúm PR8 PAs Rõ ràng sự ảnh hưởng của ions Mn 2+ tại vùng endonuclease là không đáng kể cho sự đóng góp của tương tác Coulomb đến năng lượng liên kết tự do Nó chỉ là nhân tố xúc tác thúc đẩy phản ứng tương tác giữa thuốc L-742,001 và vùng endonuclease mà không là một nhân tố chủ đạo để gây ra sự thay đổi của ái lực liên kết của các phức hợp WT và các biến thể đột biến cho các cấu trúc cúm A/H1N1/PA Ở đây, sự khác biệt nhỏ của năng lượng tĩnh điện của biến thể E119D là dẫn đến sự mất ổn định của năng lượng tương tác theo xu hướng xếp chồng của thuốc L-742,001 và các residues tại vùng liên kết, nó là nguyên nhân bởi sự mất mát một ion Mn 2+ tại vùng endonuclease trong biến thể E119D
So sánh với kết quả thực nghiệm
Mặc dù phương pháp FEP là không xác định được thành phần năng lượng solvation phân cực và không phân cực, nhưng các kết quả năng lượng liên kết tự do ước lượng bởi phương pháp FEP là gần với kết quả thực nghiệm hơn của SMD và MM-PBSA (như thấy trong bảng 4, hình 4.6 & 4.7)
Hình 4.6: Giá trị năng lương liên kết tự do của WT và ba biến thể đột biến của virus cúm pH1N1
PA và PR8 PA được xác định bởi phương pháp MM-PBSA, FEP và thực nghiệm
Trong chi tiết, năng lượng liên kết tự do xác định bởi phương pháp FEP (ΔGFEP) là dao động giữa -8.2 kcal/mol và -6.1 kcal/mol cho virus cúm pH1N1 PAs, và giữa -9.4 kcal/mol và -6.8 kcal/mol cho virus cúm PR8 PAs Rõ ràng rằng nó là gần đúng với kết quả thực nghiệm hơn hai phương pháp còn lại Như kì vọng, hệ số tương quan giữa kết quả của phương pháp SMD và thực nghiệm là khá cao (|R| = 0.84 cho pH1N1 PA, và |R| = 0.79 cho PR8 PA, hình 4.7(a) & (b)) Ngạc nhiên hơn là hệ số tương quan tính toán bởi phương pháp MM-PBSA (|R| = 0.92 cho pH1N1 PA và |R| = 0.80 cho PR8 PA, hình 4.7(c) & (d)) và phương pháp FEP (|R| = 0.98 cho pH1N1 PA và |R| = 0.96 cho PR8
B in di ng F re e E ne rg y (k ca l/ m ol ) pH 1N 1 P A W
70 | P a g e PA, hình 4.7(e) & (f)) là thậm chí còn cao hơn cả phương pháp SMD Những kết quả tính toán được là chứng minh rằng phương pháp FEP ước lượng ái lực liên kết giữa phối tử (thuốc) và thụ thể (protein) là tốt hơn phương pháp SMD và MM-PBSA Mức độ chính xác ở đây là giảm dần như FEP => MM- PBSA => SMD (hình 4.8) Ngoài ra, trong khi giá trị p xác định giữa thực nghiệm và phương pháp SMD hoặc MM-PBSA là p < 0.05 (kết quả có ý nghĩa thống kê), thì giá trị p giữa thực nghiệm và phương pháp FEP là p < 0.01 (kết quả rất có ý nghĩa thống kê) Do đó, phương pháp FEP là rất được khuyến khích trong nghiên cứu ái lực liên kết giữa thuốc và các thụ thể virus cúm A/H1N1/PAs
B ả ng 4 Giá trị lực cực đại xác định bởi phương pháp SMD và năng lượng liên kết tự do tính toán bởi phương pháp MM-PBSA và FEP giữa L-742,001 và vùng endonuclease của WT và ba biến thể đột biến của virus A/H1N/PA Giá trị năng lượng liên kết tự do của thực nghiệm ΔGexp là chuyển đổi từ công thức ΔGexp = RÍTÍln(Ki) với R = 1.987Í10 -3 kcal/mol, T= 300 K, và Ki là giá trị IC50 (thấy tại ref 42)
(SMD) ΔGbind (kcal/mol) (MM-PBSA) ΔGFEP (kcal/mol) (FEP) ΔGexp (kcal/mol) (Experiment) pH1N1 PAWT 1018.2 -21.3 -8.2 -6.4 pH1N1 PAI79L 766.1 -18.1 -7.2 -5.8 pH1N1 PAE119D 587.7 -17.5 -6.6 -5.5 pH1N1 PAF105S 675.2 -17.2 -6.1 -5.0
Hình 4.7: Hệ số tương quan được xác định giữa phương pháp SMD, MM-PBSA, FEP với kết quả thực nghiệm của virus cúm pH1N1 PA và PR8 PA
(c) MMPBSA-pH1N1 PA (d) MMPBSA-PR8 PA
(e) FEP-pH1N1 PA (f) FEP-PR8 PA
