đặng thị bích đào nghiên cứu định lượng chất chống nắng octyl methoxycinnamat và octyl salicylat trong mỹ phẩm bằng phương pháp hptlc

PHƯƠNG PHÁP HPTLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ BÍCH ĐÀO Mã sinh viên: 1901095

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CHẤT

CHỐNG NẮNG OCTYL METHOXYCINNAMAT VÀ OCTYL SALICYLAT TRONG MỸ PHẨM BẰNG

PHƯƠNG PHÁP HPTLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 PGS TS Lê Đình Chi 2 ThS Ngô Minh Thúy

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến

PGS.TS Lê Đình Chi – Phó Viện trưởng, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia,

Giảng viên cao cấp – Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã hướng dẫn và tận tình chỉ bảo em trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

tích và kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội, đã hướng dẫn em từ những ngày đầu tiên thực hiện đề tài và đồng hành cùng em trong suốt quá trình nghiên cứu

Em xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Mai Hương – Giảng viên khoa

Hóa phân tích và kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội đã góp ý cho em những nhận xét quý báu trong quá trình thực hiện đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến thầy cô khoa Hóa phân tích và kiểm nghiệm thuốc, anh chị kỹ thuật viên đã hỗ trợ, tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài tại khoa

Em cũng xin cảm ơn các anh chị học viên, các bạn và các em sinh viên khác đã hỗ trợ, sát cánh bên em trong quá trình thực hiện đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu và các thầy cô trong trường Đại học Dược Hà Nội luôn chỉ dạy, giúp đỡ em trong quá trình học tập và tích lũy kiến thức

Cuối cùng, cho phép em bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới gia đình, anh chị em và bạn bè đã hết lòng yêu thương, giúp đỡ và là điểm tựa vững chắc về tinh thần cho em trong học tập và cuộc sống

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Đặng Thị Bích Đào

MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

1.3.5.Giới hạn cho phép chất chống nắng trong mỹ phẩm 9

1.4 Tổng quan phương pháp nghiên cứu – phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 10

1.4.1.Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 10

1.4.2.Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) 10

1.4.3.Ứng dụng và các yếu tố ảnh hưởng quá trình sắc ký 12

1.5.Một số phương pháp phân tích chất chống nắng trong mỹ phẩm 14Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1.Nguyên vật liêu, thiết bị 17

2.1.1.Hóa chất, chất chuẩn 17

2.1.2.Thiết bị, dụng cụ 17

2.1.3.Đối tượng nghiên cứu 17

2.2.Nội dung nghiên cứu 18

2.3.Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1.Xây dựng phương pháp phân tích 19

2.3.1.1.Khảo sát các điều kiện phân tích 19

2.3.3.6.Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng (LOD, LOQ) 22

2.3.4 Ứng dụng phân tích các mẫu thu thập được 22

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 23

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1.Xây dựng phương pháp phân tích 24

3.1.1.Khảo sát hệ dung môi pha động 24

3.1.2.Khảo sát bước sóng định lượng 25

3.3.Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích chế phẩm kem

chống nắng thu thập được trên thị trường 36

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC International

Hiệp hội về hợp tác phân tích chính thống quốc tế (Association of Official Analytical Collaboration International)

(High Performance Liquid Chromatography)

(High Performance Thin Layer Chromatography)

IMC Isoamyl p-methoxycinnamat

(Relative Standard Deviation)

(Thin Layer Chromatography)

(Ultraviolet)

Bảng 3.3 Kết quả thẩm định độ tuyến tính OMC, OS 29

Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ lặp lại ngày 1 31

Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ lặp lại ngày 2 32

Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ lặp lại và độ chính xác sau 2 ngày 33

Bảng 3.7 Kết quả thẩm định độ đúng của OMC 34

Bảng 3.8 Kết quả thẩm định độ đúng của OS 34

Bảng 3.9 Kết quả thẩm định LOD, LOQ 35

Bảng 3.10 Kết quả định lượng OMC, OS trong một số mẫu kem chống nắng 37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu tạo cơ bản của da 3

Hình 1.2 Bước sóng UV 5

Hình 1.3 Khả năng xâm nhập qua da của tia UV 6

Hình 1.4 Cơ chế chống nắng chất chống nắng vô cơ và hữu cơ 7

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của octyl methoxycinnamat 8

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của octyl salicylat 9

Hình 1.7 Các bộ phận chính của HPTLC 11

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của OMC (quét phổ tại vị trí tương ứng với vết OMC Rf = 0,43), Phổ hấp thụ của OS (quét phổ tại vị trí tương ứng với vết OS Rf = 0,63) 26

Hình 3.2 Sắc ký đồ 6 mẫu phân tích 28

Hình 3.3 Chồng phổ nền lỏng thêm chuẩn với mẫu chuẩn tại vị trí OMC 28

Hình 3.4 Chồng phổ nền lỏng thêm chuẩn với mẫu chuẩn tại vị trí OS 28

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa Spic với khối lượng (ng) của OMC 30

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa Spic với khối lượng (ng) của OS 31

Hình 3.7 Sắc ký đồ xác định LOD của OMC 35

Hình 3.8 Sắc ký đồ xác định LOD của OS 35

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Người xưa có câu “Nhất dáng, nhì da”, chúng ta không thể phủ nhận rằng một làn da trắng sáng, mịn màng sẽ giúp bản thân cảm thấy tự tin hơn mỗi khi xuất hiện Làn da cũng là biểu hiện của một sức khỏe tốt Tuy nhiên, thời gian gần đây biến đổi khí hậu diễn ra ngày càng nghiêm trọng làm gia tăng nắng nóng vào ngày hè ở khắp mọi nơi Việt Nam là nước nhiệt đới gió mùa, theo thống kê tổng số giờ nắng năm 2023 là từ 1500 đến 2600 giờ Nắng nóng kèm theo chỉ số UV cao gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của con người như sạm da, nhăn da, lão hóa da sớm,… nghiêm trọng hơn có thể gây bỏng nhiệt, lâu dần sẽ gây ung thư da và tử vong Do đó, bảo vệ da khỏi ánh nắng mặt trời là vấn đề quan trọng và thu hút sự quan tâm của mọi người cũng như những nhà khoa học Một trong những thành quả nghiên cứu phải kể tới các sản phẩm mỹ phẩm chống nắng, gần đây lại càng được tiêu thụ mạnh mẽ trên thị trường Các chế phẩm chống nắng rất đa dạng: kem, phấn, gel, xịt chống nắng và dạng kem được sử dụng phổ biến hơn cả

Các chất chống nắng được chia làm 2 loại, chất chống nắng vô cơ và chất chống nắng hữu cơ Nhờ khả năng ngăn cản bức xạ tử ngoại tác động lên tổ chức da, các chất này mang lại những kết quả thường được gọi đơn giản là “chống nắng” khi được đưa vào thành phần các loại sản phẩm dùng bôi trên da, phổ biến nhất là các dạng kem Với những lợi thế như: ít gây khó chịu trên da và dễ lưu lại trên da tạo tác dụng bảo vệ mà không để lại vệt trắng, sử dụng tiện lợi nên hiện nay, các chất chống nắng hữu cơ được sử dụng phổ biến hơn so với chất chống nắng vô cơ [12]

Tuy nhiên, ngoài những lợi ích mà chất chống nắng hữu cơ đem lại, nghiên cứu của các chuyên gia cũng cho thấy một số chất chống nắng hữu cơ có thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường sống như gây: kích ứng da, ô nhiễm nguồn nước, diệt vong san hô (hiện tượng tẩy trắng san hô) [32]

Vì vậy, để đảm bảo an toàn cho người sử dụng, cơ quan quản lý ASEAN [9], Ủy ban Châu Âu [15] đã ban hành danh mục các chất chống nắng được phép sử dụng trong mỹ phẩm kèm theo điều kiện áp dụng và giới hạn về hàm lượng Năm 2003, Việt Nam đã tham gia hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm, trong bản bổ sung mới nhất vào tháng 7 năm 2022 của Bộ Y tế [4] Các chất chống nắng hữu cơ được sử dụng phổ biến tại Việt Nam đều nằm trong quy định của hiệp định như: Octocrylen (≤ 10%), Dimethicodiethylbenzalmalonat (≤ 10%), Octyl methoxycinnamat (≤ 10%), Octyl salicylat (≤ 5%), Butyl methoxydibenzoylmethan (≤ 5%), [4] [9]

Từ đây có thể thấy, việc kiểm soát, xác định hàm lượng các chất chống nắng trong chế phẩm chống nắng là tiêu chí quan trọng Hiện nay, trên thế giới một số kỹ thuật

2

nhằm xác định hàm lượng chất chống nắng đã được thực hiện như HPLC [22], [27], GC-MS [38], HPTLC [7],[33]… tuy nhiên ở Việt Nam chưa có nhiều phương pháp xác định hàm lượng chất chống nắng (chỉ mới có 1 nghiên cứu định lượng chất chống nắng bằng HPLC [5]) trong khi các chế phẩm kem chống nắng được lưu hành phổ biến và rộng rãi trên thị trường

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu định lượng chất chống nắng octyl

methoxycinnamat và octyl salicylat trong mỹ phẩm bằng phương pháp HPTLC”

được thực hiện với hai mục tiêu sau: 1 Xây dựng được phương pháp xác định đồng thời một số chất chống nắng trong

chế phẩm kem chống nắng bằng phương pháp HPTLC bao gồm: octyl methoxycinnamat (OMC), octyl salicylat (OS)

2 Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng các chất chống nắng

hữu cơ trong một số mẫu chế phẩm kem chống nắng đang lưu hành trên thị

trường

3

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Cấu tạo cơ bản của da

Da là một trong những cơ quan lớn, chiếm tới khoảng 16% trọng lượng cơ thể Da bao bọc toàn bộ diện tích mặt ngoài cơ thể, gồm 2 lớp chính: Lớp biểu bì, lớp hạ bì

Da cũng có thể tiếp nối với niêm mạc môi, mũi, mi mắt, âm hộ, bao quy đầu, hậu môn Ở da còn có các thành phần phụ thuộc da: lông, các tuyến, móng [3]

1.1.1 Lớp biểu bì

Lớp biểu bì là lớp ngoài cùng của da có chức năng như một lớp bảo vệ chống lại các ảnh hưởng bên ngoài Gồm hai tế bào khác nhau tạo thành: dòng tế bào sừng hóa và dòng tế bào không sừng hóa Phần lớn tế bào biểu mô sừng hóa, hình thành những lớp trên mặt của da Biểu bì có độ dày thay đổi tùy từng vùng cơ thể từ (0,07 đến 2,5 mm) Sự khác nhau về độ dày của biểu bì được giải thích bởi tính chất và sức mạnh của môi trường xung quanh tác động vào da lớp ngoài vùng đó không giống nhau Lòng bàn tay và lòng bàn chân là những vùng có biểu bì dày nhất chiều dài của nó đạt tới 1,5 - 2 mm Biểu bì có thể gồm hàng chục lớp tế bào tạo thành từ trong ra ngoài biểu bì được phân thành 5 lớp: lớp đáy, lớp sợi, lớp hạt, lớp bóng, lớp sừng

Trong đó:

Lớp đáy: là lớp trong cùng của biểu bì, nơi mà các tế bào keratinocyte được sản

sinh và di chuyển đến bề mặt da Ngoài ra, trong lớp đáy còn có loại tế bào thứ hai là hắc tố bào Những hắc tố bào là những tế bào có khả năng tổng hợp chất hắc tố melanin – giúp bảo vệ da chống lại tia UV Lớp đáy còn có hai loại tế bào khác không thuộc tế

Hình 1.1 Cấu tạo cơ bản của da

4

bào sừng hóa: tế bào Langerhans – có vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cơ thể và tế bào Merkel – thường tập trung ở vùng có nhiều mạch máu và dây thần kinh

Lớp sợi: có 5 - 20 tế bào lớn, hình đa diện, nhân hình cầu nằm giữa tế bào giữa

các tế bào Giữa các tế bào thuộc lớp này, có thể nhìn thấy rõ những cầu nối tương bào Trong bào tương của những tế bào thuộc lớp sợi và lớp đáy có thể thấy các hạt sắc tố đen mà chúng thu nhận từ hắc tố bào tiết ra Các tế bào thuộc lớp đáy và lớp sợi có khả năng phân chia cao nên biểu bì được đổi mới rất nhanh (20 - 30 ngày)

Lớp hạt: Gồm 3-5 hàng tế bào đa diện dẹt, bào tương chứa nhiều hạt keratohyalin,

các hạt này liên quan tới hiện tượng thoái hóa sừng của tế bào biểu bì

Lớp bóng: Các tế bào dẹt và dài hơn, trở nên bằng phẳng và không thể phân biệt

được

Lớp sừng: Tế bào đã biến thành những lá sừng mỏng, không nhân, trong bào tương

có nhiều chất keratin Bề dày của lớp sừng phụ thuộc vào từng vùng của cơ thể Lớp sừng ngăn cản sự thấm nước và bốc hơi nước qua da [3]

1.1.2 Lớp hạ bì

Lớp hạ bì được tạo thành bởi mô liên kết thưa nối chân bì với các cơ quan bên dưới giúp cho da trượt được trên cấu trúc nằm dưới tùy từng vùng cơ thể tùy tình trạng nuôi dưỡng ở lớp hạ bì có thể có những thủy mỡ tạo thành một lớp mỡ dày hay mỏng Lớp hạ bì chủ yếu được tạo thành từ các sợi collagen và elastin Nó cũng chứa các mạch máu, dây thần kinh, cơ quan cảm giác, tuyến bã nhờn, tuyến mồ hôi và nang lông [3]

1.2 Tổng quan tia tử ngoại (UV) 1.2.1 Tia UV

Tia UV (tia cực tím) là sóng điện từ nằm trong phổ điện từ giữa ánh sáng nhìn thấy và tia X Tia UV có bước sóng nằm trong dải từ (10 nm÷400 nm) tương ứng với dãy tần số 8E14 Hz÷3E16 Hz Mặt trời là một nguồn tỏa ra tia cực tím lớn nhất Một số nguồn khác có thể tạo ra tia UV là đèn tiệt trùng, đèn hơi thủy ngân, đèn halogen, đèn huỳnh quang, công cụ làm da rám nắng… Tác động sinh học của các tia UV rất khác nhau tùy thuộc vào bước sóng và vì vậy nó được chia thành 3 loại là UVA, UVB và UVC

Theo tiêu chuẩn ISO (ISO 21348) bức xạ UV được chia thành ba loại như sau: • Tia UVA (315nm – 400nm) hay còn gọi là tia UV gần

• Tia UVB (280nm – 315nm) hay còn gọi là tia UV trung bình • Tia UVC (100nm – 280nm) hay còn gọi là tia UV xa

5

Khi ánh sáng mặt trời xuyên qua bầu khí quyển, tất cả tia UVC và khoảng 90% bức xạ UVB được hấp thụ bởi tầng ozon, hơi nước, oxy và carbon dioxid Bức xạ UVA ít bị ảnh hưởng bởi khí quyển Do đó, bức xạ UV tới bề mặt Trái đất phần lớn bao gồm UVA với phần UVB nhỏ, thành phần tia UV nằm trong quang phổ mặt trời chiếu xuống trái đất nằm trong khoảng 290- 400nm [11],[13],[16],[35]

1.2.2 Ảnh hưởng của tia UV

Tia UV được biết đến với một số lợi ích cho sức khỏe như: trung gian tổng hợp tự nhiên vitamin D và endorphin trong da, chống còi xương, tác động đến sức khỏe tim mạch và trao đổi chất, kích thích mọi quá trình hoạt động chính trong cơ thể, chữa một số bệnh ngoài da như vảy nến, hữu ích trong lĩnh vực khử trùng…[20],[24],[30],[31]

Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích kể trên, tia UV cũng gây ra các tác hại khác nhau:

- UVB: Với bước sóng ngắn và năng lượng cao, tia UVB có thể chạm đến các tế bào sâu nhất của lớp biểu bì, kích thích sự sản sinh sắc tố mới gây ra tình trạng rám nắng kéo dài và là nguyên nhân chính làm tổn thương da cấp tính như bỏng nắng, đỏ da, rát da UVB làm tổn thương trực tiếp DNA, gây ung thư da (ung thư da lành tính)

- UVA: Với bước sóng dài và năng lượng thấp, tia UVA xâm nhập vào sâu các lớp da phía dưới (hạ bì) đồng thời kích hoạt sắc tố đã có sẵn ở các tế bào da phía trên, làm tổn hại cho da UVA gây ra chứng lão hóa da sớm do ảnh hưởng gián tiếp đến DNA thông qua sự hình thành các gốc tự do, ức chế miễn dịch và gây ung thư

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng UVA oxy hóa melanin có sẵn, gây sạm màu ngay UVB gây viêm, giải phóng melanin mới dẫn đến sạm da kéo dài hơn nhiều so với sạm da do tác động UVA [36] Khả năng bức xạ tia cực tím gây tổn thương da tăng theo cấp số nhân với bước sóng giảm Ánh sáng tia cực tím ở bước sóng 280 nm có hại gấp 1000

Hình 1.2 Bước sóng UV

6

lần so với ánh sáng ở bước sóng 340 nm, do đó, ngăn chặn tia UVB là yếu tố quan trọng hơn cần xem xét khi áp dụng các biện pháp để ngăn chặn các tác động làm tổn hại da của ánh nắng mặt trời [16],[17]

Không chỉ gây ảnh hưởng đến da, tia UV còn gây nhiều ảnh hưởng đến mắt, là nguyên nhân gây đục thủy tinh thể, tổn thương mắt hay trầm trọng hơn là suy hoại võng mạc và cườm mắt – làm lòa hay mù mắt…

1.3 Các chất chống tia UV (chất chống nắng) 1.3.1 Định nghĩa

Các chất chống tia UV là các chất có thể bảo vệ da khỏi tác hại của tia UV thông qua cơ chế hấp thụ, phản xạ hay tán xạ một phần hoặc toàn bộ chúng Mục tiêu sử dụng các chất này là hạn chế tối đa các ảnh hưởng xấu gây ra bởi ánh nắng mặt trời đồng thời tạo được cảm giác dễ chịu và an toàn cho da [21]

1.3.2 Phân loại chất chống nắng

Dựa trên cơ chế tác dụng có thể chia các chất chống nắng thành các nhóm: • Chất chống UV vô cơ (hay còn gọi là chất chống nắng vật lý): Chất chống nắng vô cơ thường là các oxyd kim loại, trong đó titan dioxyd và kẽm oxyd là các oxyd kim loại được sử dụng rộng rãi nhất để chống tia UV Ngoài ra, các silicat và talc cũng được sử dụng [12] Các chất này bảo vệ da theo cả cơ chế phản xạ, tán xạ và hấp thụ tia UV Ở bước sóng trên 400 nm, hiệu ứng phản xạ và tán xạ chiếm ưu thế, ở bước sóng dưới 400nm, các chất chống UV vô cơ cũng có đặc tính hấp thụ tia cực tím [26]

Nhóm này khá ổn định về mặt hóa học, ít bị phá hủy khi tiếp xúc với ánh nắng vì thế duy trì được khả năng bảo vệ trong thời gian dài Nhược điểm chính là chúng phản

Hình 1.3 Khả năng xâm nhập qua da của tia UV

7

xạ và tán xạ bức xạ vùng khả kiến (trên 400 nm), tạo vệt màu trắng trên da sau khi sử dụng Điều này có thể làm cho sản phẩm chống UV kém hấp dẫn và làm giảm sự thích thú của người dùng [10] Mặt khác, việc bào chế sản phẩm chứa các chất chống nắng này thường khó hơn do chúng có thể làm vỡ nhũ tương [12]

• Chất chống UV hữu cơ (hay còn gọi là chất chống nắng hóa học): Cấu trúc của chất chống UV hữu cơ có sự liên hợp với các nối đôi hoặc nhóm carbonyl, có khả năng hấp thụ tốt bức xạ ánh sáng có bước sóng ở vùng UV [12] Các chất chống nắng hóa học này hoạt động theo cơ chế hấp thụ tia UV và biến nó thành năng lượng nhiệt sau đó giải phóng khỏi da [12]

Các thành phần hữu cơ được sử dụng trong các công thức chống UV có ưu điểm là khá phong phú, đa dạng và tính thẩm mỹ cao so với các thành phần vô cơ Điều này mang lại cho nhà sản xuất sự linh hoạt với các đặc tính của công thức như hệ số chống nắng (SPF), khả năng chống nước và tạo cảm giác dễ chịu trên da Chúng có thể được phân loại thành các nhóm khác nhau theo cấu trúc hóa học như dẫn xuất benzophenon, acid p-aminobenzoic và dẫn chất, salicylat, cinnamat, dẫn chất camphor, dẫn chất triazin, dẫn chất benzotriazon, dẫn chất benzimidazol, [12][16]

Hình 1.4 Cơ chế chống nắng chất chống nắng vô cơ và hữu cơ • Các dược liệu

Một số nguyên liệu có nguồn gốc thực vật đã được chứng minh có khả năng bảo vệ da khỏi tia UV như chè đen, lô hội, dịch chiết nho, trà xanh hay lignin- một polyme sinh học phổ biến trong cây… [37] Ưu điểm của nhóm này là ít gây kích ứng da nhưng do đa thành phần nên khó kiểm soát sự ổn định

8

1.3.3 Ảnh hưởng chất chống nắng tới môi trường và sức khỏe con người

Bên cạnh những lợi ích mà các chất chống nắng hóa học đem lại, còn có tác động bất lợi tới sức khỏe con người và môi trường sống Các chất chống nắng trong quá trình tiếp xúc với da, một số chất chống nắng được hấp thụ qua da và được chuyển hóa hoặc tích lũy sinh học Các quá trình này có thể gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, bao gồm cả những tác động gây đột biến và ung thư [16] Kết quả nghiên cứu In vitro cho thấy, Oxybenzon (Benzophenon-3) có tác dụng progestrogen, kháng androgen và kháng estrogen Oxybenzon, Butyl methoxydibenzoylmethan, Homosalat, Octyl dimethyl PABA và Octinoxat (Octyl methoxycinnamat) làm tăng sự phát triển tế bào MCF-7 trong ung thư vú [32]

Ảnh hưởng của các chất chống nắng hóa học đến môi trường cũng là vấn đề đang được quan tâm Các chất này đã được xác định có trong các nguồn nước trên toàn thế giới, đặc biệt Oxybenzon là chất được phát hiện nhiều nhất với nồng độ cao nhất Các chất chống nắng xâm nhập vào môi trường theo nhiều đường khác nhau Chúng có thể được hấp thu qua da và bài tiết qua nước tiểu, sau đó đi vào đường ống dẫn nước Chất chống nắng cũng có thể được lưu lại trên da và được rửa sạch, từ đó đi vào các nguồn nước tự nhiên Nước thải từ các nhà máy sản xuất cũng là nguồn đưa các chất chống nắng vào nước Như vậy, chất chống nắng hóa học có thể xâm nhập và gây ô nhiễm nguồn nước trên toàn thế giới Nhiều nhà máy xử lý nước thải trên thế giới bao gồm Brazil, Thụy Sĩ, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan và Mỹ đã chứng minh rằng rất khó để loại bỏ các chất này khỏi nguồn nước do đặc tính thân dầu của chúng [23] Các nghiên cứu cũng cho thấy một số chất chống nắng hữu cơ có thể tẩy trắng rạn san hô Theo ước tính có tới 14.000 tấn kem chống nắng, một số có chứa 10% oxybenzon thải vào các vùng có san hô hàng năm Trong phòng thí nghiệm, nồng độ oxybenzon từ 33 đến 50 ppm có thể gây ra hiện tượng tẩy trắng và chết các rạn san hô [32] Điều này có thể ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người khi sử dụng nguồn thức ăn hải sản [23][32]

1.3.4 Chất chống nắng OMC, OS

➢ Octyl methoxycinnamat (OMC)

- Tên IUPAC: 2-ethylhexyl (E)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enoat [25] - CTCT:

9

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của cctyl methoxycinnamat

- KLPT: 290,4 - LogP: 5,3 - Tính chất lý hóa: + OMC ở dạng lỏng, hơi sánh, không mùi, màu vàng nhạt + OMC không tan trong nước, tan trong methanol, có thể trộn lẫn alcol, propylen glycol monomyristat và nhiều loại dầu khác [18]

➢ Octyl salicylat (OS) - Tên IUPAC: Octyl 2-hydroxybenzoat [14] [25]

- CTCT:

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của cctyl salicylat

- KLPT: 250,3 - LogP: 6,8 - Tính chất lý hóa: + OS ở dạng lỏng

+ Thân dầu, tan được trong alcol

1.3.5 Giới hạn cho phép chất chống nắng trong mỹ phẩm

Theo hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm [9], Ủy ban Châu Âu [15] ban hành quy định về giới hạn các chất chống nắng được phép sử dụng Giới

hạn cho phép của 2 chất chống nắng nghiên cứu trong đề tài được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Giới hạn cho phép của 2 chất chống nắng trong mỹ phẩm

Tên chất Hàm lượng cho phép tối đa

ASEAN CHÂU ÂU

- Pha động là hệ dung môi đơn hoặc nhiều thành phần, thay đổi tùy thuộc vào cơ chế sắc ký

- Cơ chế tách có thể là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế, tùy thuộc vào tính chất của hai pha Để tăng cường sức rửa giải, thường kết hợp từ 2-3 dung môi

Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao dẫn Các chất phân tích sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng, kết quả là chúng được tách riêng, có vị trí khác nhau trên bản mỏng

- Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf

Rf = dR/dM

Trong đó:

đi của vết, đơn vị cm)

1.4.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC là một hình thức hiện đại của TLC (sắc ký lớp mỏng)

Pha tĩnh trong HPTLC là những hạt hấp phụ có kích thước nhỏ, đồng đều nên tăng cường khả năng tách chất phân tích

Hơn nữa, HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảp tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất các số liệu đưa ra Trong đó, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có đọ lặp lại cao Các bước của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hanh bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp phải trong quá trình phân tích [2] Các bộ phận chính của hệ thống HPTLC được thể hiện trên hình 1.7

11

Hình 1.7 Các bộ phận chính của HPTLC:

(A) Bộ phận chấm mẫu CAMAG Linomat 5, (B) Bộ phận triển khai sắc ký CAMAG ADC 2, (C) Bộ phận scan bản mỏng CAMAG Scanner 4,

(D) Phần mềm xử lý kết quả winCATS

Một số đặc điểm của 2 phương pháp TLC và HPTLC được so sánh và trình bày trong bảng 1.2 [34]

• Bản mỏng có sẵn nên dễ dàng triển khai phép phân tích • Chuẩn bị mẫu đơn giản, ít gặp vấn đề về nền mẫu • Không cần xử lý trước đối với dung môi như lọc và khử khí • Tiêu thụ pha động ít cho mỗi mẫu

• Phân tích đồng thời mẫu thử và mẫu chuẩn – độ chính xác và độ đúng tốt hơn, hiếm khi cần chuẩn nội

• Thời gian phân tích ngắn hơn và chi phí cho mỗi lần phân tích ít hơn • Không chịu ảnh hưởng từ lần phân tích trước - pha tĩnh và pha động luôn

mới cho mỗi lần phân tích, không có nhiễm chéo • Có thể phát hiện với nhiều chế độ khác nhau đặc hiệu cho mỗi nhóm chất

[2] Bên cạnh rất nhiều ưu điểm trên, HPTLC cũng có một số nhược điểm trong quá trình phân tích như sau:

• Độ tái lặp có thể không đạt được nếu điều kiện độ ẩm không được kiểm soát • Yêu cầu có chất chuẩn

• Độ nhạy bị ảnh hưởng do lượng mẫu thực hiện phân tích nhỏ

❖ Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký trên hệ thống HPTLC ➢ Pha tĩnh:

Đối với HPTLC, hầu hết các bản mỏng silica gel HPTLC 60 được sản xuất từ silica gel có hình dạng hạt không đều Mặc dù đã thu được hiệu quả tách tốt hơn rất nhiều so với TLC thông thường, nhưng để nâng cao hơn nữa chất lượng phép thử như tách tốt hơn, giảm nhiễu nền dẫn tới tăng độ nhạy thì bên cạnh giảm kích thước hạt thì chế tạo các hạt gel silica hình cầu với độ tinh khiết cao của chất hấp phụ là giải pháp mà nhiều nhà sản xuất bản mỏng đã đạt được

➢ Pha động:

Thành phần chính của dung môi rửa giải TLC là các dung môi hữu cơ có bản chất khác nhau tùy thuộc vào chất phân tích và yêu cầu tách Ngoài ra, một số chất còn

13

được thêm vào để điều chỉnh khả năng di chuyển cũng như cải thiện khả năng tách trong quá trình sắc ký

Acid hoặc base: Thêm acid hoặc base chính là thay đổi pH pha động Trong nhiều

trường hợp khả năng tách có thể được cải thiện bằng cách bổ sung acid, thường là acid acetic, acid formic hoặc acid propionic; hoặc bổ sung base như dung dịch amoniac, triethylamin hoặc pyridin Việc này có thể có tác dụng giảm kéo đuôi, dẫn đến vết sắc ký sắc nét hơn, ít khuếch tán hơn, đồng thời làm thay đổi đáng kể tỷ lệ lưu giữ và đôi khi thay đổi thứ tự di chuyển qua các thành phần của mẫu

Thuốc thử tạo cặp ion: Sử dụng thuốc thử tạo cặp ion có thể thành công trong cả

việc cải thiện chất lượng của quá trình tách và thu được sự phân giải các hợp chất mà trước đây tách rất khó Cơ sở của phương pháp là dựa trên sự hình thành phức giữa các ion mang điện tích trái dấu của chất tan và ion thuốc thử trái dấu

Chất chọn lọc đối quang: một số chất chọn lọc đối quang cho vào pha động đã thành công trong việc tách một số lượng đáng kể các chất racemic, điển hình là cyclodextrin

- Dung môi pha mẫu và thể tích mẫu:

Dung môi pha mẫu, thể tích mẫu và dạng chấm mẫu có thể ảnh hưởng tới khả năng tách sắc ký Để thu được kết quả tách sắc ký tốt cần chú ý:

• Pha mẫu trong dung môi không phân cực vì dung môi phân cực vết chấm có xu hướng lan rộng

• Dung môi dùng để hòa tan mẫu phải dễ bay hơi • Khi chấm mẫu tránh xê dịch bản mỏng ảnh hưởng tới vùng mẫu chấm • Thể tích mẫu thích hợp, đường kính vết càng nhỏ càng tốt

- Độ ẩm bình khai triển sắc ký:

Độ ẩm tương đối của phòng thí nghiệm tiêu chuẩn được kiểm soát không được vượt quá 60% Nếu độ ẩm tương đối không quá 60% sẽ chỉ gây ra sự thay đổi nhỏ trong hoạt động của lớp chất hấp phụ, nhưng khi vượt quá 60% sẽ gây ra sự thay đổi rõ rệt Do đó, để duy trì khả năng tái lặp tốt, các bản mỏng phải bảo quản kín và duy trì độ ẩm môi trường phòng thí nghiệm trong khoảng làm việc tối ưu Hơi acid và base sẽ gây ra sự thay đổi trong hoạt động của lớp chất hấp phụ Có thể kiểm soát độ ẩm bình triển khai sắc ký bằng thiết bị có dòng không khí có độ ẩm xác định được tạo bởi dung dịch muối bão hòa

- Phát hiện:

Nhiều hợp chất có hấp thụ ánh sáng UV hoặc có đặc tính huỳnh quang khi bị kích thích bởi tia cực tím hoặc ánh sáng nhìn thấy có thể phát hiện được trực tiếp Nhưng hầu hết các hợp chất không có màu rõ ràng nên phải sử dụng thuốc thử thích hợp để hiện màu Tuy nhiên, việc phun thuốc thử đòi hỏi phải sử dụng thiết bị hút hơi dung môi thích

14

hợp vì các giọt nhỏ của thuốc thử có thể gây hại cho người phân tích hoặc độc hại cho bầu khí quyển xung quanh Ngoài ra, khi phun thuốc thử không đồng đều trên bản mỏng sẽ ảnh hưởng tới kết quả Trong những năm gần đây, kỹ thuật nhúng được sử dụng để thay thế cho phương pháp phun truyền thống Khi sử dụng thuốc thử hiện màu cần xem xét các vấn đề sau:

• Độ nhạy thu được • Độ chọn lọc của thuốc thử đối với chất cần phân tích • Hiệu ứng nền, đặc biệt là nơi sẽ quét quang phổ • Độ ổn định của sắc ký đồ sau khi phun thuốc thử • Sự dễ dàng khi chuẩn bị thuốc thử

• Các nguy cơ liên quan đến việc chuẩn bị và sử dụng thuốc thử

1.5 Một số phương pháp phân tích chất chống nắng trong mỹ phẩm

Bảng 1.3 Một số phương pháp phân tích chất chống nắng trong mỹ phẩm

Chất chống nắng được phân tích

Đối tượng mẫu

Kỹ thuật phân tích Điều kiện – Kết quả TLTK

Oxybenzon, Avobenzon, Octinoxat

Kem chống nắng

HPTLC

+ Bản mỏng: RP-18 F254s, NP (Silic Gel 60 F254)

+ Pha động: Acetonitril: Nước (18:2, tt:tt) cho tấm RP-18 F254s

Cyclohexan: Diethyl ete: Hexan: Aceton(14:2:1:2) cho tấm thường NP (Silic Gel 60F254) + Tiến hành quét bản mỏng, hiện vết:

n-*Oxybenzon: Quét tấm RP ở bước

tuyến tính trong khoảng 200– 900 ng Hàm lượng xác định bằng HPTLC 2,12%, thu hổi 92,17% (so với hàm lượng trên nhãn 2,3%)

* Octinoxat: Quét tấm NP ở bước

[33]

15

tuyến tính trong khoảng 600-2700 ng Hàm lượng xác định bằng HPTLC 3,78% thu hổi 99,47% (so với hàm lượng trên nhãn 3,8%) * Avobenzon: Quét tấm NP ở

0,54-0,56, tuyến tính trong khoảng 900 ng Hàm lượng xác định bằng HPTLC 2,65% thu hồi 102,4% (so với hàm lượng trên nhãn 2,5%)

200-PMDSA, BZP-3, IMC, DHHB, OTC, EMC, EHS, BDM,

MBP, EMT

Kem chống nắng

HPLC

+ Chương trình rửa rải: Ethanol và nước chứa 1 % acid phosphoric 0,1M – Gradient

+ Cột: C18 + Bước sóng: 312 nm + Một số kết quả: LOD: 0,04- 1,66 (μg/mL), LOQ: 0,13- 5,52 (μg/mL)

Độ thu hồi: 97,0- 101,4% Độ lặp lại RSD: 0,38- 2,42%

[22]

ES, HMS, 3-BC, BP-3, IMC,

4-MBC, ED-PABA, EHMC,

BMDBM, DT, DHHB

Kem chống nắng

GC- MS

+ Cột: Cột mao quản HP-5ms

(30m × 250μm × 0,25μm); + Khí: khí nitơ có độ tinh khiết cao;

+ Tốc độ dòng cột: 10 mL/phút; + Thể tích tiêm: 1 μL; phương pháp tiêm: tiêm chia nhỏ, tỷ lệ chia là 10:1;

+ Nhiệt độ đầu vào: 260 oC Nhiệt độ cột thông qua hệ thống sưởi được lập trình: nhiệt

16

điện tử: 70 eV; quét chế độ SIM + Một số kết quả:

LOD: 0,04- 0,63 (μg/mL), LOQ: 0,1- 2,10 (μg/mL)

Độ lặp lại RSD: 1,2- 3,9%

+ Octyl salicylat (Hàm lượng: 93,88% nguyên trạng, số lô: OS#1070220, Thái Lan) - Hóa chất, dung môi tinh khiết phân tích: methanol (Trung Quốc), aceton (Trung Quốc), cyclohexan (Trung Quốc), n-hexan (Trung Quốc), diethyl ether (Trung Quốc), cloroform (Trung Quốc)

- Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck, Đức)

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) của hãng CAMAG, CAT No 027.6200 (Thụy Sỹ) gồm:

+ Bộ phận chấm bán tự động Linomat 5 + Bộ phận khai triển tự động ADC2 + Máy scan bản mỏng TLC Scanner 4 + Buồng soi UV 254 nm và 366 nm + Phần mềm điều khiển WinCATs và quét bản mỏng, thu nhận hình ảnh vết sắc ký, xử lí dữ liệu trên máy tính

- Bản mỏng silica gel 60 F254 của Merck (Đức) - Cân phân tích XPE105 Mettler Toledo (d=0,01mg) (Thụy Sĩ) - Máy ly tâm HERMLE Z306 (Đức)

- Máy siêu âm Helma (Đức) - Máy lắc xoáy Labinco BV L46 (Hà Lan) - Tủ sấy DAIHAN WOF – 105 (Hàn Quốc) - Màng lọc 0,45µm

- Các dụng cụ khác: bình định mức, pipet, bình nón, ống ly tâm, vial,…

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: chất phân tích là octyl methoxycinnamat, octyl salicylat - Mẫu thử: 4 mẫu mỹ phẩm kem chống nắng đang lưu hành trên thị trường Việt Nam

được thu thập theo: + Thành phần công bố trên bao bì sản phẩm: có chứa chất phân tích octyl methoxycinnamat, octyl salicylat

+ Cách thức thu thập: tại các cửa hàng, các trang thương mại điện tử

Mã hóa

SJMmedical ANTI-UV SUNCREAM

- Mẫu nền: nền mẫu dạng kem dùng để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích

không chứa 2 thành phần: octyl methoxycinnamat, octyl salicylat

- Mẫu tự tạo: Mẫu nền thêm chuẩn octyl methoxycinnamat, octyl salicylat với tỷ lệ nhất

định

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các điều kiện phân tích: Khảo sát pha động, bước sóng định lượng, quá trình xử lý mẫu

- Thẩm định phương pháp [6], [8]: + Độ phù hợp hệ thống

+ Độ chọn lọc + Khoảng tuyến tính + Độ lặp lại và độ chính xác + Độ đúng

+ Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ) - Ứng dụng phương pháp để định lượng chất chống nắng trên các mẫu thử đã thu thập được

19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

2.3.1.1 Khảo sát các điều kiện phân tích

- Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254, kích thước 10 x 10cm, 20 x 10cm được hoạt hóa 115ºC trong 15 phút

- Pha động: Dựa vào các nghiên cứu đã công bố [7], [19], [33], khảo sát các hệ pha động sau:

+ Hệ 1: Cyclohexan: diethyl ether (5:1, tt:tt) + Hệ 2: Cyclohexan: diethyl ether: aceton (15:1:2, tt:tt:tt) + Hệ 3: Cyclohexan: diethyl ether: n-hexan: aceton (14:2:1:2, tt:tt:tt:tt) + Hệ 4: Cyclohexan: aceton (7:1, tt:tt)

+ Hệ 5: Cyclohexan: aceton (10:1, tt:tt) + Hệ 6: Cyclohexan: aceton (15:1, tt:tt) + Hệ 7: Cloroform: metanol (9:1, tt:tt)

methoxycinnamat, octyl salicylat nằm trong khoảng 0,20 - 0,80 là tối ưu nhất - Bước sóng phát hiện vết trong quá trình khảo sát pha động: 254 nm

- Bước sóng quét sắc ký đồ định lượng, quét phổ UV-Vis tại vết từng chất phân tích, lựa chọn bước sóng hấp thụ cực đại, quét sắc ký đồ tại bước sóng này để tính toán diện tích pic khi dùng định lượng

2.3.1.2 Xử lý mẫu

Xử lý mẫu dựa trên phương pháp đã được công bố trong tài liệu [7], [33] Tiến hành khảo sát:

- Làm trong mẫu: ngâm trong nước đá, ly tâm, lọc qua màng lọc 0,45µm - Dung môi chiết: MeOH

Chú ý: Nếu nồng độ của các chất chống nắng trong dung dịch thử cao hơn nồng độ

của dung dịch chuẩn, cần tiến hành pha loãng để nồng độ của các chất chống nắng nằm trong khoảng tuyến tính

2.3.2 Chuẩn bị mẫu

2.3.2.1 Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc OMC: Cân một lượng chính xác khoảng 13 mg chất chuẩn OMC vào bình định mức 10 mL, hòa tan và định mức vừa đủ bằng MeOH Dung dịch này có nồng độ OMC khoảng 1300 µg/mL