Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Xác định đồng thời một số glucocorticoids trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò mảng diod (HPLC-DAD)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

ĐỖ THỊ NGỌC THANH

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ GLUCOCORTICOIDS TRONG MỸ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO ĐẦU DÒ MẢNG DIOD (HPLC - DAD)

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HOÁ HỌC Mã số: 8520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2023

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – HCM

ĐHQG-Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Trần Thị Kiều Anh………

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Đinh Văn Phúc……… Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Trần Phước Nhật Uyên………

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 14 tháng 07 năm 2023

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch: TS Đặng Bảo Trung 2 Thư ký: TS Phan Hồng Phương 3 Phản biện 1: PGS.TS Đinh Văn Phúc 4 Phản biện 2: TS Trần Phước Nhật Uyên 5 Uỷ viên: TS Trần Thị Kiều Anh

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

TS ĐẶNG BẢO TRUNG PGS.TS NGUYỄN QUANG LONG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Đỗ Thị Ngọc Thanh……… MSHV: 1970267………… Ngày, tháng, năm sinh: 24/10/1995……… Nơi sinh: Vĩnh Long……… Chuyên ngành: Kỹ thuật Hoá Học………Mã số: 8520301………

I TÊN ĐỀ TÀI:

Tên Tiếng Việt: Xác định đồng thời một số Glucocorticoids trong mỹ phẩm bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò mảng diod (HPLC-DAD)

Tên Tiếng Anh: Simultaneous determination of glucocorticoids in cosmetics by high

performance liquid chromatography with diode-array detection (HPLC-DAD)

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

- Tối ưu các điều kiện phân tích GC bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp đầu dò mảng diod (HPLC-DAD)

- Tối ưu quy trình xử lý mẫu

- Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

- Áp dụng quy trình phân tích trên một số mẫu mỹ phẩm thực đang lưu hành trên thị trường

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2023

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/06/2023 IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS TRẦN THỊ KIỀU ANH

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TP HCM, ngày… tháng… năm 2023

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến các Thầy-Cô bộ môn Kỹ thuật Hoá lý và các thầy cô khoa Kỹ thuật hoá học - Trường Đại học Bách Khoa TPHCM nói chung Những kiến thức, hiểu biết tôi nhận được chính là cơ sở lý thuyết, là nền tảng cho các lý luận khoa học trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô, TS Trần Thị Kiều Anh, Cô đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và cùng tôi giải quyết các khó khăn trong suốt quá trình thực hiện luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3, Trưởng phòng và các đồng nghiệp Phòng thí nghiệm Hoá đã tạo điều kiện để tôi học tập và làm việc Đặc biệt gửi lời cảm ơn đến anh Đào Trí Nguyên - Trưởng nhóm đã hỗ trợ, chỉ dẫn và góp ý cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người thân đã tạo mọi điều kiện tốt nhất, đã cho tôi những lời động viên, khích lệ trong suốt quá trình học và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Trân trọng cảm ơn!

Học viên cao học

Đỗ Thị Ngọc Thanh

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Mục tiêu của đề tài nghiên cứu hướng đến phát triển phương pháp thử để xác định đồng thời các hợp chất thuộc nhóm glucocorticoid, bao gồm prednisolone, prednisone, cortisone, betamethasone, dexamethasone, hydrocortisone acetate, triamcinolone acetonide, betamethasone 17-valerate và momethasone furoate trong nền mẫu mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò mảng diod (HPLC-DAD) Các bước chuẩn bị mẫu là chiết với methanol trong bể cách thuỷ ở 60oC, 10 phút sau đó thêm methanol đến 25 mL rồi để vào tủ lạnh trong 30 phút, ly tâm và lọc Các hợp chất được phân tách bằng sắc ký pha đảo với hệ dung môi nước và acetonitril, chương trình rửa giải gradient và được phát hiện bằng đầu dò DAD với bước sóng 240 nm

Phương pháp được thẩm định về khoảng tuyến tính, độ đặc hiệu, độ chụm, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng và độ đúng Phương pháp phân tích tuyến tính trong khảng 0,2-50 mg/L và hệ số tuyến tính R2 đều trên 0,997 Độ lặp lại, độ tái lập và độ thu hồi của phương pháp đạt yêu cầu theo AOAC Appendix F, 2016 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp là 5 mg/kg và 15 mg/kg, kết quả này tương đương với TCVN 13647:2023- Xác định các steroid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vừa mới ban hành Dựa trên quy trình đã tối ưu, đề tài đã tiến hành phân tích trên 10 mẫu có mặt trên thị trường, kết quả cho thấy có 2/10 mẫu có chứa glucocorticoid (cụ thể là prednisone, cortisone, hydrocortisone acetate và momethasone furoate) với hàm lượng từ 19-62 mg/kg

ABSTRACT

The aim of this research is to develop an analytical method for simultaneous determination nine glucocorticoid compounds (prednisolone, prednisone, cortisone, betamethasone, dexamethasone, hydrocortisone acetate, triamcinolone acetonide, betamethasone 17-valerate and momethasone furoate) in cosmetic matrices by high performance liquid chromatography with diode-array detection (HPLC-DAD) Samples were extracted with methanol in a water bath for 10 min at 60oC, followed by adding methanol to 25 mL and shaking Samples were kept in a freezer for 30 min and centrifuged The extracted solutions were filtrated before being injected to HPLC-DAD The studied compounds were separated by reversed-phase chromatography with a water and acetonitrile gradient elution and detected with DAD detector at 240 nm

The method was validated in terms of linearity of working standard curve, specification, precision, limit of detection, limit of quantification and trueness The analytical method proved to be linear in a range of 0.2-50 mg/L with determination coefficients (R2) over 0.99 The repeatability, reproduccibility and recovery of the method were satisfactory by AOAC Appendix F, 2016 The limits of detection and quantification of the method were 5 mg/kg and 15 mg/kg, respectively This result is similar with that by TCVN 13647:2023- Identification of steroids by high performance liquid chromatography (HPLC) The method was applied to the determination of glucocorticoids in ten real samples, showing that 2/10 samples contained glucocorticoids (namely prednisone, cortisone, hydrocortisone acetate and momethasone furoate) with concentrations from 19 to 62 mg/kg

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS Trần Thị Kiều Anh

Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tác giả

Đỗ Thị Ngọc Thanh

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

2.3.1 Khái niệm và nguyên tắc 12

2.3.2 Pha tĩnh trong sắc ký lỏng 14

2.3.3 Pha động trong sắc ký lỏng 15

2.3.4 Một số thông số đặc trưng của quá trình sắc ký 16

2.4 Tình hình nghiên cứu các phương pháp định tính và định lượng GC trong và ngoài nước 18

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Hoá chất- dụng cụ và thiết bị 22

3.1.1 Chất chuẩn 22

3.1.2 Hoá chất dùng cho xử lý mẫu và phân tích HPLC-DAD 22

3.1.3 Dụng cụ ,thiết bị 23

3.2 Phương pháp nghiên cứu mẫu 23

3.2.1 Phương pháp khảo sát điều kiện phân tích 23

3.3.6 Giới hạn phát hiện và Giới hạn định lượng 32

3.4 Áp dụng phân tích mẫu thực tế 32

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

4.1 Tối ưu hoá các điều kiện phân tích sắc ký 33

4.1.1 Tối ưu cột phân tích 33

4.1.2 Xác định cực đại hấp thu chất phân tích với dectector DAD 35

4.1.3 Tối ưu dung môi pha động 35

4.1.4 Tối ưu tỉ lệ thành phần pha động 37

4.1.5 Tối ưu thể tích tiêm mẫu 40

4.2 Tối ưu quy trình xử lý mẫu 43

4.2.1 Tối ưu dung môi chiết mẫu 43

4.2.2 Tối ưu nhiệt độ chiết mẫu 45

4.2.3 Tối ưu thời gian chiết mẫu 46

4.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 47

4.3.1 Tính đặc hiệu của phương pháp 47

4.3.2 Xây dựng đường chuẩn 48

4.3.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 49

4.3.4 Độ lặp lại, độ tái lập và hiệu suất thu hồi của phương pháp 53

4.4 Xác định các Glucocorticoid trên các mẫu mỹ phẩm thu thập được 55

5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

5.1 Kết luận 57

5.2 Hướng nghiên cứu tiếp theo của đề tài 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC A: SẮC KÝ ĐỒ CỦA DUNG DỊCH CHUẨN 62

PHỤ LỤC B: CÁC KẾT QUẢ TÍNH TOÁN 70

PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP 72 PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ TÍNH TOÁN TRÊN NỀN MẪU THỰC 99

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Một số nội dung quản lý mỹ phẩm của Mỹ, Châu Âu, Nhật và ASEAN 7

Bảng 2.2 Công thức phân tử, cấu trúc hoá học và tính chất lý hóa của các GC 9

Bảng 2.3 Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng 16

Bảng 2.4 Một số phương pháp định tính và định lượng GC 18

Bảng 3.1 Thông tin chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 3.2 Các đại lượng đo và ý nghĩa 27

Bảng 3.3 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau 30

Bảng 3.4 Độ thu hồi yêu cầu với từng khoảng hàm lượng 32

Bảng 4.1 Thời gian lưu của các chuẩn khảo sát trên cột C18 và cột Phenyl Hexyl 34

Bảng 4.2 Các chương trình gradient pha động tối ưu 38

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của thể tích tiêm đến chiều cao pic và diện tích pic 40

Bảng 4.4 Chương trình gradient pha động 42

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của dung môi chiết mẫu đến hiệu suất thu hồi 44

Bảng 4.6 Hiệu suất thu hồi của các GC với các nhiệt độ chiết khác nhau 45

Bảng 4.7 Hiệu suất thu hồi của các GC với các thời gian chiết khác nhau 46

Bảng 4.8 Thời gian lưu của các chuẩn và trên mẫu trắng thêm chuẩn 47

Bảng 4.9 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 49

Bảng 4.10 Xác định IDL, IQL của thiết bị 50

Bảng 4.11 Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của 5 nền mẫu thêm chuẩn tại LOD 51

Bảng 4.12 Độ lặp lại, độ tái lập, hiệu suất thu hồi thêm chuẩn tại LOQ 52

Bảng 4.13 Độ lặp lại, độ tái lập và hiệu suất thu hồi của nền Serum dưỡng da 53

Bảng 4.14 Độ lặp lại, độ tái lập và hiệu suất thu hồi của nền Dung dịch vệ sinh 54

Bảng 4.15 Độ lặp lại, độ tái lập và hiệu suất thu hồi của nền Kem trắng da 54

Bảng 4.16: Độ lặp lại, độ tái lập và hiệu suất thu hồi của nền Sữa tắm 55

Bảng 4.17 Độ lặp lại, độ tái lập và hiệu suất thu hồi của nền Sữa rửa mặt 55

Bảng 4.18 Kết quả phân tích GC trong 10 mẫu mỹ phẩm 56

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Các tác dụng phụ của Glucocorticoid trên da (A: rạn da, B: teo da, C: mụn

trên da, D: viêm da quanh miệng) 11

Hình 2.2 Sơ đồ khối một hệ sắc ký lỏng cơ bản 12

Hình 2.3 Sắc ký đồ phân tách 2 chất và các thông số đặc trưng 16

Hình 3.1 Hệ thống sắc ký lỏng HPLC-DAD 23

Hình 3.2 Quy trình dự kiến phân tích Glucocorticoid 25

Hình 4.1 Sắc ký đồ của chuẩn hh GC khảo sát trên cột C18 34

Hình 4.2 Sắc ký đồ của chuẩn hỗn hợp GC trên cột Phenyl-Hexyl 34

Hình 4.3 Phổ hấp thụ UV của 9 GC 35

Hình 4.4 Phân tích chuẩn hỗn hợp bằng hệ MeOH: nước ( Hệ pha động 1) 36

Hình 4.5 Phân tích chuẩn hỗn hợp bằng hệ ACN: nước (Hệ pha động 1) 36

Hình 4.6 Sắc ký đồ đánh giá độ phân giải hệ pha động 1 39

Hình 4.7 Sắc ký đồ đánh giá độ phân giải hệ pha động 2 39

Hình 4.8 Sắc ký đồ đánh giá độ phân giải hệ pha động 3 39

Hình 4.9 Tối ưu thể tích tiêm 5 μL 41

Hình 4.10 Tối ưu thể tích tiêm 10 μL 41

Hình 4.11 Tối ưu thể tích tiêm 25 μL 41

Hình 4.12 Biểu đồ ảnh hưởng của hiệu suất thu hồi đến dung môi chiết mẫu 44

Hình 4.13 Biểu đồ ảnh hưởng của hiệu suất thu hồi đến nhiệt độ chiết mẫu 45

Hình 4.14 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất thu hồi 46

Hình 4.15 Sắc ký đồ của mẫu trắng 47

Hình 4.16 Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn 48

Hình 4.17 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 48

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ASEAN Association of South East

Asia’s Nations

Liên hiệp các quốc gia Đông Nam Á

BMV Betamethasone 17-valerate Betamethason 17-valerat

BoA Bureau of Accreditation Văn phòng Công nhận chất lượng

HCA Hydrocortisone acetate Hydrocortison acetat

HPLC High performance liquid

spectrophometry

Sắc ký lỏng khối phổ hai lần

LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng

PAL Pharmaceutical Affairs Law Luật quản lý Dược (Nhật Bản)

NĐ-CP - Nghị định - Chính phủ

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

TAA Triamcinolone acetonide Triamcinolon acetonid

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

USFDA United state – Food and Drug

1 MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Bước sang thiên niên kỷ mới, sự phát triển vượt bậc của xã hội khiến nhu cầu làm đẹp của phụ nữ hiện nay ngày càng tăng cao, kéo theo đó là hàng loạt các loại mỹ phẩm ra đời nhằm đáp ứng nhu cầu chung của khách hàng Với mong muốn làm đẹp hiệu quả và nhanh chóng các chị em đã không ngần ngại lựa chọn các loại mỹ phẩm không rõ nguồn gốc đem lại nhiều tác dụng phụ khó lường Một trong số đó là các loại mỹ phẩm chứa glucocorticoid

Glucocorticoid (GC) là một loại thuốc có hiệu quả cao và được sử dụng rộng rãi cho điều trị các bệnh viêm nhiễm Trong da liễu, chúng được sử dụng để điều trị các rối loạn về da như bệnh vẩy nến, bệnh chàm, các bệnh da liễu khác Chúng làm giảm viêm tạm thời một cách nhanh chóng Tuy nhiên điều trị kéo dài với các chế phẩm chứa GC có thể dẫn đến tác dụng phụ như teo da, phản ứng da và một số tác dụng phụ khác có hệ thống như tăng huyết áp, đái tháo đường, loãng xương, viêm da dị ứng tiếp xúc, hội chứng Cushing,v.v [1] Chính vì những lý do này mà các sản phẩm mỹ phẩm không được chứa GC do sản phẩm mỹ phẩm không có mục đích chữa bệnh, không quy định liều dùng và thời gian sử dụng Theo Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN về quản lý mỹ phẩm và Thông tư số 06/2011/TT-BYT ngày 25 tháng 01 năm 2011 của Bộ Y tế quy định về quản lý mỹ phẩm, GC thuộc nhóm chất không được phép dùng cho các sản phẩm mỹ phẩm [2] Tuy nhiên, do tác dụng ‘thần dược’ là chống viêm, làm trắng da nhanh chóng nên một số cơ sở sản xuất không chân chính vẫn đã ngụy tạo GC vào mỹ phẩm

Việc thẩm định chuyển giao phương pháp xác định GC trong mỹ phẩm theo Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN tại Việt Nam là hết sức cần thiết hiện nay Hơn nữa, theo nghị định số 78/NĐ-CP ban hành ngày 16/05/2016 của Chính Phủ; Văn bản hợp nhất số 08/VBHN-BKHCN hợp nhất thông tư hướng dẫn về xây dựng và áp dụng tiêu chuẩn, Viện kiểm nghiệm thuốc TPHCM đã đưa ra dự thảo 16 Tiêu chuẩn Việt Nam về xác định các chất cấm họ steroid trong nền mẫu mỹ phẩm Chính vì vậy, việc xây dựng một phương pháp phân tích để phát hiện các chất cấm trong mỹ phẩm như GC là yêu cầu

thực tiễn đặt ra trong công tác kiểm nghiệm mỹ phẩm Trong phạm vi luận văn thạc sĩ “ Xác định đồng thời một số glucocorticoids trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò mảng diod (HPLC-DAD)” nghiên cứu tiến hành tối ưu các điều kiện sắc ký và chiết mẫu thích hợp để định lượng đồng thời 9 hợp chất thuộc nhóm GC, bao gồm: prednisolone, prednisone, cortisone, betamethasone, dexamethasone, hydrocortisone acetate, triamcinolone acetonide, betamethasone 17-valerate và momethasone furoate có trong mỹ phẩm trên thị trường Đặc biệt trong nghiên cứu này, sẽ thực hiện trên 5 nền mẫu đại diện nhất cho mỹ phẩm theo quy định của Bureau of Accreditation (BoA, AGL 03) về xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp trong mẫu mỹ phẩm

1.2 Mục đích nghiên cứu

Xây dựng quy trình xác định GC trong mỹ phẩm ổn định, đạt độ tin cậy cao, độ nhạy thích hợp, đáp ứng yêu cầu quốc tế; có thể áp dụng cho các phòng thí nghiệm trên cả nước có thiết bị HPLC-DAD Phương pháp triển khai được đánh giá giá trị sử dụng qua các thông số: khoảng tuyến tính, độ đặc hiệu, độ lặp lại, độ tái lặp, độ thu hồi, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Ứng dụng quy trình để khảo sát hàm lượng GC trong mỹ phẩm đang lưu hành trên thị trường

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: các chất thuộc nhóm GC, bao gồm: prednisolone, prednisone, cortisone, betamethasone, dexamethasone, hydrocortisone acetate, triamcinolone acetonide, betamethasone 17-valerate và momethasone furoate

Phạm vi nghiên cứu:

- Địa điểm: nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 – Khu Công nghiệp Biên Hoà 1, Đồng Nai

- Thời gian: 01/01/2023-01/06/2023

1.4 Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu này thành công sẽ góp phần xây dựng Tiêu chuẩn Việt Nam, đưa ra một phương pháp cụ thể, phổ quát áp dụng cho mọi phòng thí nghiệm trên khắp Việt Nam Ngoài ra, kết quả của luận văn sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu sau tiếp nối và phát triển

1.5 Ý nghĩa thực tiễn

Xác định các GC có mặt trái phép trong các mẫu mỹ phẩm theo nhu cầu khách hàng và các cơ quan chức năng Nhằm cung cấp thêm thông tin cho các cơ quan chức năng trong việc kiểm tra chất lượng sản phẩm, giúp người sử dụng ý thức hơn trong việc lựa chọn sản phẩm có nguồn gốc, xuất xứ rõ ràng.

2 TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về mỹ phẩm 2.1.1 Giới thiệu về mỹ phẩm

Vẻ đẹp hình hài luôn là mối quan tâm của mọi người ở mọi thời đại, đặc biệt là đối với Phụ nữ Mỹ phẩm là một trong những phương tiện làm đẹp xuất hiện từ lâu đời và ngày càng phát triển vượt bậc Theo Thông tư số 06/2011/TT – BYT “Sản phẩm mỹ phẩm là một chất hay chế phẩm được sử dụng để tiếp xúc với những bộ phận bên ngoài cơ thể con người (da, hệ thống lông tóc, móng tay, móng chân, môi và cơ quan sinh dục ngoài) hoặc răng và niêm mạc miệng với mục đích chính là để làm sạch, làm thơm, thay đổi diện mạo, hình thức, điều chỉnh mùi cơ thể, bảo vệ cơ thể hoặc giữ cơ thể trong điều kiện tốt” [3] Có nhiều tiêu chí phân loại mỹ phẩm, dựa theo công dụng, có thể phân loại mỹ phẩm như sau:

- Dành cho mặt: kem, serum, lotion, sữa rửa mặt, phấn trang điểm, son… - Dành cho cơ thể: sữa tắm, dung dịch vệ sinh, sữa dưỡng thể, nước hoa…

- Dành cho hệ thống lông, tóc, móng: dầu gội, dầu xả, thuốc nhuộm, sơn móng… - Dành cho răng miệng: kem đánh răng, nước súc miệng…

Thành phần của các loại mỹ phẩm khác nhau tuỳ theo công dụng của nó:

- Kem dạng cream: là một dạng nhũ tương bán rắn, thành phần chính là nước và dầu không hoà tan trong nước Ngoài ra còn nhiều chất hỗ trợ khác như chất nhũ hoá, chất làm trắng, chất dưỡng ẩm

- Serum: là một dạng tinh chất dạng lỏng hoặc gel chuyên đặc trị các vấn đề về da Thành phần chủ yếu là dưỡng chất và các vitamin

- Dung dịch vệ sinh: là một tính chất dạng lỏng, gel hoặc sữa có độ nhớt cao hơn nước Thành phần chủ yếu là chiết xuất từ các thảo dược thiên nhiên

- Sữa tắm: có dạng lỏng, trong hoặc đục Thành phần chủ yếu là chất tạo bọt, chất hoạt hoá, chất ổn định, chất dưỡng ẩm, tạo hương

- Sữa rửa mặt: dạng kem, dạng bọt, dạng gel Thành phần chủ yếu là nước, chất làm sạch, chất dưỡng ẩm Ngoài ra, tuỳ thuộc vào đặc tính của từng loại sữa rửa mặt còn bổ sung những chất khác như chất làm sáng da, trị mụn, mờ thâm…

Ngoài những thành phần chủ yếu trên, đôi khi các nhà sản xuất còn bổ sung thêm một số chất hỗ trợ để nâng cao tác dụng của sản phẩm như chất làm trắng hydroquinone, glucocorticoid…, chất bảo quản paraben, phthalate, formaldehyde…Đây là những chất cấm sử dụng hoặc sử dụng với liều lượng quy định

Theo BoA thực hiện xác nhận giá trị sử dụng phương pháp đối với mẫu mỹ phẩm thì thực hiện trên ít nhất 5 nền mẫu theo các dạng sản phẩm qui định trong thông tư 06/2011/TT-BYT nên các nền mẫu đại diện chúng tôi chọn là (1) Kem trắng da, (2) Serum dưỡng da, (3) Dung dịch vệ sinh phụ nữ, (4) Sữa tắm, (5) Sữa rửa mặt

- Phải ghi nhãn mác đúng quy định

- Thông tin về sản phẩm rõ ràng, có hướng dẫn sử dụng

- Sản phẩm có chứa các thành phần có thể gây kích ứng da cần phải được kiểm tra sơ bộ theo hướng dẫn kèm theo

- Sản phẩm không được chứa chất độc hại, chất gây ô nhiễm hoặc phân hủy gây dị ứng cho người sử dụng

❖ Châu Âu:

Các nước Châu Âu tuân thủ theo Chỉ thị quản lý mỹ phẩm của Liên minh Châu Âu (The European Union Cosmetic Directive) được phê duyệt từ năm 1976, trong đó có đưa ra các phụ lục sau [4]:

- Phụ lục VII: Danh mục các chất lọc tia UV

Châu Âu yêu cầu tất cả các sản phẩm được bán trên thị trường phải đăng ký thông tin trên cổng thông tin sản phẩm mỹ phẩm Nhà sản xuất chịu trách nhiệm về sự an toàn của các sản phẩm của mình

❖ Nhật Bản:

Nhật Bản quản lý mỹ phẩm theo luật Quản lý Dược – PAL (Pharmaceutical Affairs Law) được phê duyệt lần đầu tiên vào năm 1943, có sửa đổi vào những năm 1948, 1960 và 1979 Tuy nhiên, đến năm 2001, luật này đã được thay đổi nhiều và có những quy định mới PAL bãi bỏ quy định các sản phẩm mỹ phẩm phải được phê duyệt hoặc cấp phép trước khi đưa ra thị trường Các nhà sản xuất, nhà phân phối phải có trách nhiệm đảm bảo tính an toàn của sản phẩm Đồng thời, phải thông báo tên của sản phẩm trước khi sản xuất hoặc nhập khẩu để các cơ quan có thẩm quyền xác định được đặc điểm của từng sản phẩm [5]

❖ ASEAN:

Năm 2003, “Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm” đã được các nước trong khối ASEAN thông qua, ký kết và cam kết thực hiện Hướng dẫn mỹ phẩm ASEAN (Asean Cosmetics Directive, gọi tắt là ACD) dựa trên quy định của Liên minh Châu Âu, cũng có quy định về danh mục các chất bị cấm trong mỹ phẩm (Phụ lục

II), danh mục các chất được sử dụng có giới hạn về hàm lượng, nồng độ và điều kiện sử dụng (Phụ lục III), danh mục các chất màu sử dụng trong mỹ phẩm (phụ lục IV), danh mục các chất bảo quản (phụ lục VI), danh mục các chất lọc tia UV (phụ lục VII) [2]

* Tóm tắt những quy định chính về mỹ phẩm của Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản và ASEAN [4] [5] được thể hiện ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Một số nội dung quản lý mỹ phẩm của Mỹ, Châu Âu, Nhật và ASEAN

Thông tin sản phẩm

Không bắt buộc (tự nguyện)

An toàn sản phẩm (nhà sản xuất chịu trách nhiệm)

“-“: không có thông tin Nguồn: Tổng hợp từ tài liệu [4], [5]

2.1.2.2 Quản lý mỹ phẩm ở Việt Nam

Ngày 02/9/2003, chính phủ Việt Nam đã ký “Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm Theo Hiệp định này, 10 nước ASEAN đã cam kết thực hiện tiến trình hòa hợp và từ ngày 01/01/2008, Hiệp định bắt đầu có hiệu lực [4] Gần đây nhất, ngày 20/1/2011, Bộ Y tế có thông tư số 06/2011/TT-BYT của của Bộ trưởng Bộ Y tế về

việc ban hành “Quy định về quản lý mỹ phẩm” gồm 11 chương, 53 điều Thông tư này qui định việc quản lý các sản phẩm mỹ phẩm sản xuất trong nước, mỹ phẩm nhập khẩu để lưu thông trong lãnh thổ Việt Nam, bao gồm: Công bố sản phẩm mỹ phẩm, hồ sơ thông tin sản phẩm, yêu cầu về an toàn sản phẩm, ghi nhãn mỹ phẩm, quảng cáo mỹ phẩm, xuất khẩu, nhập khẩu mỹ phẩm, lấy mẫu mỹ phẩm để kiểm tra chất lượng, kiểm tra, thanh tra và xử lý vi phạm, trách nhiệm của tổ chức, cá nhân sản xuất, buôn bán sản phẩm mỹ phẩm tại Việt Nam phải tuân thủ các quy định về quản lý mỹ phẩm trong thông tư này [3]

2.2 Tổng quan về nhóm chất glucocorticoid (GC) 2.2.1 Tổng quan

Glucocorticoid là một loại hormone steroid liên kết với thụ thể glucocorticoid Chúng được tổng hợp tại tuyến vỏ thượng thận nên có mặt trong hầu hết các loài động vật có xương sống [1] Tên Glucocorticoid xuất phát từ vai trò của nó trong việc điều chỉnh quá trình trao đổi chất của glucose và có cấu trúc của steroid [6] Glucocorticoid có hai dạng: tự nhiên (cortisone, hydrocortisone) và tổng hợp Sự khác biệt đa dạng của glucocorticoid tổng hợp là do thay đổi các nhánh để hình thành các dẫn xuất khác nhau Bản chất của sự khác biệt về mức độ mạnh của các dẫn xuất là do florua hóa hoặc chlorin hóa (halogen hóa) của hợp chất

2.2.2 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các glucocorticoid (GC)

Công thức phân tử, cấu trúc hoá học và tính chất lý hóa của các GC nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Công thức phân tử, công thức cấu tạo và tính chất lý hóa của các GC

Cortisone (CS) C21H28O5 360,4 Bột kết tinh trắng hay gần như trắng

Không tan trong nước, tan trong ethanol

Triamcinolone acetonide

(TAA) C24H31FO6 434,5 Bột kết tinh trắng hay gần như

trắng, đa hình Không tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96 %

(BMS) C22H29FO5 392,5 Bột kết tinh trắng hay gần như

trắng Không tan trong nước, tan trong ethanol

Betamethasone 17-Valerate

2.2.3 Tác dụng dược lý

Glucocorticoid có nhiều tác dụng dược lý quan trọng như chống viêm, chống dị ứng và ức chế miễn dịch, nên được sử dụng trong nhiều chỉ định y khoa khác nhau [7], trong đó có chỉ định dùng tại chỗ để kiểm soát viêm da cơ địa, eczema và các viêm da khác [8]

2.2.4 Tác dụng phụ không mong muốn

GC làm trắng da bằng cách đầu tiên là làm co mạch, làm chậm quá trình luân chuyển tế bào da, giảm số lượng và hoạt động của tế bào hắc tố, giảm sản sinh hormone kích

thích tế bào hắc tố [9] Tuy nhiên khi sử dụng trong thời gian dài có thể gây ra nhiều tác

dụng không mong muốn như teo da, phản ứng da và một số tác dụng phụ khác có hệ thống như tăng huyết áp, đái tháo đường, loãng xương, viêm da dị ứng tiếp xúc, hội chứng Cushing [1] Tác dụng phụ toàn thân là ức chế trục tuyến yên-thượng thận [10]

Theo nghiên cứu của Rohini Sharma và cộng sự, khảo sát trên 200 bệnh nhân sử dụng

các chế phẩm GC tại chỗ trên mặt thì họ gặp những tác dụng phụ như phổ biến nhất là mụn trứng cá [11]

Hình 2.1 Các tác dụng phụ của Glucocorticoid trên da (A: rạn da, B: teo da, C: mụn trên da, D: viêm da quanh miệng) [12]

Chính vì những tác dụng phụ không mong muốn nêu trên nên các chất thuộc nhóm GC là những chất bị cấm sử dụng cho mỹ phẩm hầu hết tại các nước phát triển trên thế giới [13], [14] Tại Việt Nam, các chất thuộc nhóm GC là những chất bị cấm sử dụng cho mỹ phẩm do Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm quy định (nhóm chất số 300, Annex II – Các chất, nhóm chất không được phép dùng trong mỹ phẩm) [2]

2.3 Sơ lược về hệ thống sắc ký lỏng 2.3.1 Khái niệm và nguyên tắc

Sắc ký lỏng (HPLC) là một kỹ thuật để tách hỗn hợp các chất thành các thành phần riêng biệt dựa trên sự tương tác giữa chất phân tích với pha động (thường là chất lỏng) và pha tĩnh (thông thường là các hạt nhồi đều và nhỏ, có thể từ 3 đến dưới 2 µm) Pha động mang theo chất phân phân tích di chuyển qua pha tĩnh đứng yên Sự khác biệt về tương tác giữa pha động và pha tĩnh chính là nguyên nhân tạo nên quá trình phân tách Một hệ sắc ký lỏng cơ bản được cấu thành từ hai bộ phận cơ bản gồm hệ phân tách và bộ phận phát hiện và định lượng các chất phân tích

2.3.1.1 Thành phần cơ bản của hệ phân tách

Một hệ phân tách sắc ký gồm các thành phần cơ bản như: bộ phận tiêm mẫu, bơm, cột sắc ký, pha động (dung môi rửa giải), đầu dò (Hình 2.2) [15]

Hình 2.2Sơ đồ khối một hệ sắc ký lỏng cơ bản [16]

- Bơm cao áp (pump): để đưa pha động vào cột, thực hiện quá trình tách trên hệ thống sắc ký và rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột Bơm có thể hoạt động ở

vùng áp suất lên đến 500-1000 bar với tốc độ dòng có thể điều chỉnh từ 0-5 mL/phút

- Valve tiêm mẫu (injector): Là bộ phận đưa chất phân tích vào cột với một lượng nhất định tùy thuộc vào độ nhạy và mức yêu cầu phát hiện của chất phân tích - Cột tách (column): Cột tách là bộ phận chứa pha tĩnh, được xem như thành phần

quan trọng nhất trong quá trình sắc ký, là yếu tố quyết định hiệu quả của quá trình tách Cột sắc ký có rất nhiều loại, kích thước tùy thuộc vào mục đích và đối tượng phân tích, thông thường cột có kích thước từ 5-25 cm với cỡ hạt từ 1,8-5,0 µm 2.3.1.2 Bộ phận phát hiện và ghi nhận tín hiệu

Đầu dò (detector) là nơi phát hiện tín hiệu chất phân tích dựa trên các tính chất lý hóa của chúng Nơi chuyển tín hiệu chất phân tích từ tín hiệu điện sang hình dạng sắc ký Tín hiệu này được chuyển đến và xử lý bởi một máy tính điều khiển Hiện tại, thị trường phân tích thiết bị có rất nhiều loại đầu dò với các tính chất mục đích khác nhau [17] Có thể kể đến các loại đầu dò như:

- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS)

- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS)

- Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang

- Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: Các cation, anion, các hợp chất có tính dẫn điện…

- Detector khối phổ (MS): thường được dùng để nhận biết và xác định các hợp chất khi chúng rất khó tách bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ, chẳng hạn như các chất có khối lượng phân tử lớn, các hợp chất không bền nhiệt và các hợp chất phân cực

Mỗi dectector đều có những ưu nhược điểm khác nhau Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn detector mảng diod (Diod Array Detector – DAD) bởi detector DAD rất

phổ biến hiện nay, có khả năng phân tách đồng thời nhiều hợp chất, phù hợp để phân tích GC Ngoài ra detector DAD tương đối rẻ hơn các loại dectector khác, mang tính kinh tế cao hơn Tuy detector UV cũng mang nhiều đặc tính nổi trội như detector DAD nhưng detector DAD có ưu điểm hơn là có khả năng quét được một dải bước sóng và xem được hình dạng phổ của chất phân tích Hơn nữa, trong nền mẫu mỹ phẩm có chứa rất nhiều các chất hấp thụ tại bước sóng 240 nm, nếu chỉ dựa vào thời gian lưu để khẳng định chất đó là các GC có thể dễ bị nhầm lẫn Vì vậy, khi kết hợp giữa thời gian lưu và hình dạng phổ hấp thụ có thể khẳng định chính xác chất cần phân tích

❖ Nguyên lý xác định chất phân tích bằng detector DAD:

Khi chiếu một chùm tia bức xạ điện tử với một tần số xác định đi qua môi trường vật chất thì sau khi đi qua năng lượng của bức xạ không thay đổi nhưng cường độ bức xạ thay đổi Sự thay đổi cường độ bức xạ do sự hấp thụ bức xạ của hợp chất có trong hỗn hợp mà chùm tia bức xạ chiếu qua Dựa vào sự thay đổi cường độ bức xạ, xác định được chất phân tích Chất phân tích sau khi được tách khỏi cột sắc ký, được dẫn vào flowcell của đầu đo và được chiếu bởi một chùm tia tử ngoại Sự hấp thụ tia bức xạ bởi các chất tan tuân theo định luật Lambert-Beer

2.3.2 Pha tĩnh trong sắc ký lỏng

Trong sắc ký lỏng, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3-7 µm Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC)

- Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN v.v.)

- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37

Ưu điểm của sắc ký pha đảo là tách và phân tích các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực Hơn nữa, thành phần pha động chủ yếu

là methanol (MeOH), acetonitril (ACN), tetrahydrofuran (THF)… đây là những dung môi rẻ tiền, mang tính kinh tế cao Các GC đều có cấu trúc hóa học chứa nhân steroid với giá trị pKa > 10 [18], chủ yếu ở dạng tự do nên kỹ thuật sắc ký pha đảo được lựa chọn trong nghiên cứu này

2.3.3 Pha động trong sắc ký lỏng

Trong sắc ký lỏng pha động là thành phần được cho đi qua cột liên tục để phân tách các hợp chất trong một hỗn hợp, có những yêu cầu sau:

- Pha động phải trơ với pha tĩnh

- Bền vững, ổn định và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký - Hoà tan được mẫu

- Phải có độ tinh khiết cao, có độ nhớt thấp và phù hợp với detector

Có thể chia pha động làm hai loại: pha động có độ phân cực cao và pha động có độ phân cực thấp Để phân tích một nhóm chất, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi là gradient pha động

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải

Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ rửa giải (eluent strength)…Trong đó, độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các mũi sắc ký

Bảng 2.3 Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng [19]

cực, Ɛ

Độ rửa giải, Ƹ

Độ nhớt (25oC), cP

Chỉ số khúc xạ (25oC)

Nhiệt độ sôi, oC

2.3.4 Một số thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

Hình 2.3 Sắc ký đồ phân tách 2 chất và các thông số đặc trưng

Thời gian lưu

- tR: thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra khỏi cột

- to: thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết

- tR’: thời gian lưu thực của một cấu tử, với tR’= tR-to- W: là chiều rộng đáy pic

- W1/2: là chiều rộng pic đo ở chiều cao ½ pic

Hệ số dung lượng k’

Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức:

𝑘′ = 𝑡′𝑅𝑡0 =

𝑡𝑅− 𝑡0𝑡0 =

𝑡0 − 1 (2.1) Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời điểm cân bằng Nếu k’nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm mẫu do đó làm giảm khả năng tách.Nếu k’ quá lớn thì chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể chấp nhận trong khoảng rộng 1-20

Hệ số chọn lọc α

𝛼 = 𝑘′𝐵𝑘′𝐴 =

𝑡𝑅,𝐵− 𝑡0𝑡𝑅,𝐴− 𝑡0 (𝑘

𝐵 > 𝑘′𝐴) (2.2) α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng Để tách riêng hai chất thường chọn α nằm trong khoảng 1,5 đến 2

(2.3)

𝑁 = 5,54 [ 𝑡𝑅𝑊1/2 ]

Độ phân giải

Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức:

𝑅𝑠 = 2(𝑡𝑅,𝐵 − 𝑡𝑅,𝐴)𝑊𝐵 − 𝑊𝐴 =

1,18(𝑡𝑅,𝐵 − 𝑡𝑅,𝐴)𝑊1/2𝐵 − 𝑊1/2𝐴 =

√𝑁4 (

𝛼 − 1𝛼 ) (

1 + 𝑘′𝐵) (2.6) Độ phân giải cơ bản đạt được khi RS = 1,5 khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng, chỉ xen phủ nhau 0,3 %

RS = 1,0: hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4 % RS = 0,75: hai pic chưa tách nhau

2.4 Tình hình nghiên cứu các phương pháp định tính và định lượng GC trong và ngoài nước

Hiện nay, đã có nhiều phương pháp như phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) [20] [21] phương pháp HPLC với detector PDA [20] [22] phương pháp HPLC – MS/MS [23] [14] [24] [13] [25] đã được sử dụng để định tính và định lượng GC trong mỹ phẩm Tóm tắt một số phương pháp định tính, định lượng GC được trình bày trong bảng 2.4.

Bảng 2.4 Một số phương pháp định tính và định lượng GC

STT Phương pháp

Điều kiện phân tích Khoảng tuyến tính(µg/mL)

Thời gian phân tích (phút)

LOD LOQ (µg/g)

Tác giả

1 TLC - Mẫu kem: chiết mẫu với MeOH bằng cách để trên bếp cách thủy ấm, ly tâm, để lạnh → lấy lớp dịch trong bay hơi và hòa tan cặn trong MeOH

- Mẫu lỏng: chiết mẫu với ethyl acetat → bay hơi trên bếp cách thủy

Association of South East Asian nation - ASEAN (2005) [20]

→ hòa tan cặn trong MeOH

2 DAD

HPLC-giống phương pháp xử lý của TLC

35 phút

LOD: 50 LOQ:70-160 3 TLC 5 g chế phẩm được

20-chiết với MeOH → Đặt trên bếp cách thủy → làm lạnh trong nước đá 1 giờ → Lọc, bốc hơi trên bếp cách thủy tới khô → Hòa lại cặn trong 5 mL MeOH

LOD: 200 Hoàng Thanh Tâm (2008) [21]

3

HPLC-PDA Mẫu được chiết với hỗn hợp (hh)

dicloromethan-MeOH (9:1, v/v) → đặt trên bếp cách thủy ấm → làm lạnh trong nước đá →

Bốc hơi đến khô → Hòa tan cặn trong hỗn hợp ACN-MeOH-H2O (20:30:30, v/v)

0,2-1,2 60 LOD: 2,0 µg/mL LOQ: 0,3-6,0 µg/mL

0,1-Lê Thị Hường Hoa (2013) [22]

4 LC-MS Mẫu được phân tán trong THF→ lắc siêu âm→ pha loãng với hh acid formic 0,1%/ACN và acid

0,3-100 30 phút

LOD:12-35 ng/mL LOQ:35-95 ng/mL

Andrisano V Fiori J (2014) [24]

formic 0,1%/nước (20:80, v/v)

LOD:1,4-Yun Sik Nam, và cộng sự (2012) [13]

LOD: 0,085-0,109 LOQ: 0,102-0,212

Giaccone V, và cộng sự(2016) [14]

LC-MS/MS

1 g mẫu được chiết với 20 mL MeOH có chứa 1 mL acid formic 0,1 %, lắc siêu âm 30 phút → ly tâm ở 2000 vòng trong 10 phút → lọc

0,1-2,0 25 phút

LOD: 30,0 (ng/mL) LOQ:2,5-90,0 (ng/mL)

0,8-Nam Sook Kim và cộng sự (2017) [25]

LC-MS/MS

Mẫu được chiết với ethyl acetate: nước (20:5, v/v) → ly tâm →lọc → làm bay hơi dịch lọc đến khô rồi hòa tan cặn trong ACN:H2O (1:10, v/v) Làm sạch bằng cột chiết pha rắn SPE

0,12-6,0 - LOD: 0,3 ug/g LOQ: 0,6-0,12 ug/g

0,03-Bùi Quang Đông và cộng sự (2020) [23]

Phương pháp TLC [21] [22] tiến hành đơn giản, chi phí thấp, dễ dàng so sánh kết quả trên cùng một bản mỏng Tuy nhiên, độ đặc hiệu còn hạn chế và giới hạn phát hiện thường cao Để khẳng định kết quả cần phải tiến hành thử trên một số hệ dung môi khác nhau với các phương pháp phát hiện khác nhau Do đó, thường chỉ sử dụng để sàng lọc sơ bộ và kiểm tra nhanh [21]

Phương pháp LC – MS/MS có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp [23] [14] [24] [13] [25] khoảng tuyến tính rộng và có thể cung cấp được thông tin cấu trúc các chất, phù hợp để phân tích các chất cấm trong mỹ phẩm Tuy nhiên, phương pháp của Fiori [24], Nam Sook Kim [25], Yun Sik Nam [13] và cộng sự thời gian phân tích còn dài Hơn nữa, thiết bị HPLC – MS đắt tiền, không phải phòng thí nghiệm nào cũng có

Đối với phương pháp HPLC – UV hay HPLC – DAD, tuy giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng còn cao so với LC-MS/MS nhưng phương pháp này có tính đặc hiệu, độ chính xác cao, khả thi trên thực tế với hầu hết phòng thí nghiệm được trang bị hệ thống HPLC Do đó, phương pháp HPLC - DAD được chúng tôi nghiên cứu và phát triển để xác định đồng thời một số glucocorticoids trong mỹ phẩm tại Việt Nam.

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Hoá chất- dụng cụ và thiết bị 3.1.1 Chất chuẩn

Các chất chuẩn Glucocorticoid được cung cấp bởi Dr Ehrenstorfer, Germany Độ tinh khiết của chuẩn sử dụng trong quá trình khảo sát được trình bày trong Bảng 3.1, khối lượng cân, thể tích định mức và nồng độ chuẩn gốc xem chi tiết tại Phụ lục B

Bảng 3.1 Thông tin chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu

Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 100 (mg/L): Hút chính xác 1,00 mL dung dịch chuẩn gốc 1000 mg/L vào bình định mức 10 mL Định mức tới vạch bằng methanol Bảo quản ở (4±4)oC, các dung dịch này bền trong 06 tháng

3.1.2 Hoá chất dùng cho xử lý mẫu và phân tích HPLC-DAD

Các loại dung môi sử dụng trong quá trình khảo sát thuộc loại tinh khiết phân tích của Mecrk (USA), bao gồm: acetonitrile (ACN), methanol (MeOH) Nước cất khử ion (UPW) của Merck Millipore dùng để chuẩn bị pha động

3.1.3 Dụng cụ ,thiết bị

- Thiết bị HPLC-DAD gồm hệ thống sắc ký lỏng Agilent 1290 và đầu dò mảng diod (Hình 3.1)

Hình 3.1 Hệ thống sắc ký lỏng HPLC-DAD

- Bể cách thuỷ (JSR, Hàn Quốc) - Máy ly tâm (Biotage, Thụy Điển)

- Cân phân tích, chính xác đến 0,1 mg và 0,01 mg

- Các dụng cụ thông dụng trong phòng thí nghiệm khác như: micropipet các loại, ống ly tâm, cốc thuỷ tinh, đũa thuỷ tinh, pipet, bình định mức, vial thuỷ tinh, màng lọc polytetrafluoroethylene…

3.2 Phương pháp nghiên cứu mẫu

3.2.1 Phương pháp khảo sát điều kiện phân tích

Đối với sắc ký lỏng, thành phần pha động ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách chất Pha động phải đảm bảo yêu cầu sao cho các pic chất cần phân tích trong sắc ký đồ không chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, ít bị dãn pic, thời gian lưu không được quá dài Để tối ưu các điều kiện sắc ký, nghiên cứu này tiến hành khảo sát lần lượt các yếu tố sau:

- Khảo sát cột phân tích: cột C18, cột Phenyl Hexyl

- Khảo sát bước sóng cho detector

- Khảo sát dung môi pha động: Methanol: nước và acetonitril: nước - Khảo sát chương trình rửa giải gradient

- Khảo sát thể tích tiêm mẫu: 5 μL, 10 μL, 25 μL

3.2.2 Phương pháp xử lý mẫu

Đối với các phương pháp sắc ký, nền mẫu và quy trình xử lý mẫu có ảnh hưởng lớn đến kết quả của phương pháp, đặc biệt là với các đối tượng mẫu phức tạp như mỹ phẩm Do vậy, để tiến hành xác định GC trong nền mẫu mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng có kết quả tốt cần xây dựng quy trình xử lý mẫuphù hợp

Dựa theo quy trình hình 3.2, khảo sát điều kiện chiết mẫu như sau:

- Khảo sát loại dung môi chiết: Methanol, methanol:nước (8:2 v/v), acetonitril - Khảo sát thời gian chiết: 5 phút, 10 phút, 30 phút, 60 phút

- Khảo sát nhiệt độ chiết: 25 oC, 40 oC, 60 oC, 90 oC

Để đánh giá hiệu quả quá trình chiết mẫu, đối với các nền mẫu thực không chứa GC, chúng ta tiến hành khảo sát trên nền mẫu trắng thêm chuẩn, hiệu quả của quá trình chiết được đánh giá dựa vào hiệu suất thu hồi, tính theo công thức:

Tham khảo quy trình ACM 007 [20] và điều kiện thực tế phòng thí nghiệm, quy trình chiết mẫu dự kiến được trình bày trong Hình 3.2

Hình 3.2 Quy trình dự kiến phân tích Glucocorticoid

3.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích

Việc xác nhận giá trị sử dụng được thực hiện ngay khi kết thúc quá trình khảo sát phương pháp và phải thực hiện trước khi công bố và áp dụng vào phân tích mẫu khách hàng Quá trình xác nhận có thể chia thành các giai đoạn khác nhau như kiểm tra xác nhận (áp dụng đối với các phương pháp thử tuân thủ hoàn toàn các yêu cầu kỹ thuật và

Cân khoảng 1,0 g mẫu vào ống ly tâm

Lắc votex 10 phút

Làm ấm trên bể cách thủy 60oC, 10 phút

Ly tâm với tốc độ 3000-4000 rpm sau đó làm lạnh 10 phút

Lọc qua giấy lọc băng xanh thu được dịch trong

Đo trên HPLC-DAD + 5 mL dung môi chiết

Hòa tan cặn trong 5 mL MeOH Cô khô dịch trong trong bể cách thủy

phạm vi áp dụng của phương pháp thử tiêu chuẩn) hoặc xác nhận đầy đủ các thông số (áp dụng cho các phương pháp thử không tiêu chuẩn, được phát triển tại phòng thí nghiệm) Việc thẩm định phương pháp phụ thuộc vào nhu cầu và phạm vi áp dụng của phòng thí nghiệm [26] Trong nghiên cứu này, phương pháp thử xác định đồng thời các GC được xác nhận giá trị sử dụng qua các thông số: độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lập lại, độ tái lập, độ đúng

3.3.1 Độ đặc hiệu

Tính đặc hiệu là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt tạp chất khác như tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất…Cụ thể trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống với chất phân tích Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác [26]

Để đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp, các dung dịch chuẩn hỗn hợp GC, mẫu mỹ phẩm không chứa GC, mẫu mỹ phẩm không chứa GC được thêm chuẩn Sau đó so sánh độ phù hợp của pic với pic của dung dịch chuẩn hỗn hợp

3.3.2 Khảo sát khoảng tuyến tính

Xác định đường chuẩn của các chất GC bằng cách đo các dung dịch chuẩn ở các nồng độ khác nhau trên hệ thống HPLC-DAD, gồm 0,20; 0,50; 1,00; 5,00; 10,0 ; 20,0 mg/L, trong đó mỗi nồng độ tiến hành phân tích lặp lại 3 lần

Đánh giá đường chuẩn:

- Đánh giá thông qua R2 ≥ 0,995, hoặc tTN (thực nghiệm) và so sánh với tLT (lý thuyết) với tLT là t0,99, f=n-2, tra bảng student (yêu cầu tTN ˂ tLT)

- Đánh giá độ chệch nồng độ dựa vào giá trị Δi (yêu cầu Δi ˂ ±15%)

∆𝑖% = 𝐶𝑡−𝐶𝑐

𝐶𝑐 ×100 (3.2) Trong đó: