nghiên cứu chế tạo kit thử nhanh nitrit nitrat trong thực phẩm

Áp dụng kit chế tạo được để kiểm tra nhanh nitrit và nitrat trong các loại thực phẩm đang lưu hành ở thành phố Thủ Dầu Một..... Trong số các hóa chất dùng để bảo quản thực phẩm, muối nit

Thực phẩm

Thực phẩm hay còn được gọi là thức ăn là bất kỳ vật phẩm nào, bao gồm chủ yếu các chất: chất bột (cacbohydrat), chất béo (lipit), chất đạm (protein), hoặc nước, mà con người hay động vật có thể ăn hay uống được, với mục đích cơ bản là thu nạp các chất dinh dưỡng nhằm nuôi dưỡng cơ thể hay vì sở thích.

Phụ gia thực phẩm

Phân loại phụ gia thực phẩm

 Chất phụ gia có nguồn gốc tự nhiên: Được ly trích và tinh chế từ thiên nhiên

 Chất phụ gia tổng hợp: Được sản xuất bằng phương pháp hóa học

 Chất phụ gia có nguồn gốc vô cơ

 Chất phụ gia có nguồn gốc hữu cơ b Theo mục đích sử dụng:

 Phụ gia bổ sung chất dinh dưỡng cho thực phẩm

 Phụ gia bảo quản thực phẩm

Phụ gia làm tăng giá trị cảm quan của thực phẩm (chất tạo màu, chất tạo mùi, chất tạo vị, ) c Theo chức năng:

Bảng 1.1 Phân loại nhóm chất phụ gia theo chức năng

STT Tên nhóm chất phụ gia Chức năng

1 Chất điều chỉnh độ chua hay độ axit

Dùng để duy trình hay làm trung hòa độ chua của thực phẩm

2 Các chất điều vị Dùng để làm tang hay cải thiện vị của thực phẩm

3 Các chất ổn định Dùng để làm ổn định hệ phân tán, đồng nhất của sản phẩm

4 Các chất bảo quản Dùng để cản trở sự phát triển của vi khuẩn, làm chậm hay ngừng quá trình lên men, acid hóa hay hư hại của thực phẩm

5 Các chất chống đông vón Dùng để phòng sự chống vón và tạo sự đồng nhất cho sản phẩm thực phẩm

6 Các chất chống oxy hóa Dùng để đề phòng hay cản trở sự oxy hóa trong sản phẩm thực phẩm

7 Các chất chống tạo bọt Dùng để làm mất khả năng tạo bọt trong thực phẩm

8 Các chất độn Dùng để làm tăng khối lượng cho sản phẩm

9 Các chất tạo ngọt Dùng để tạo vị ngọt cho thực phẩm

10 Các chể phẩm tinh bột Dùng để làm tăng độ dày, độ đông đặc, độ ổn định và tăng khối lượng của thực phẩm

11 Các enzym Dùng để xúc tác quá trình chuyển hóa trong chế biến thực phẩm

12 Các chất đẩy khí Dùng để đẩy không khí trong túi đựng các sản phẩm

13 Các chất làm bóng Dùng để làm bóng bề mặt sản phẩm

14 Các chất làm dày Dùng để làm chất độn, làm cho sản phẩm trở nên đặc hơn

15 Các chất làm ẩm Dùng để tạo cho sản phẩm có độ ẩm theo ý muốn

16 Các chất làm rắn chắc Dùng để làm tăng tính rắn chắc, tránh sự vỡ nát của thực phẩm

17 Các chất nhũ hóa Dùng để tạo ra hệ phân tán đồng nhất của sản phẩm

18 Các loại phẩm màu Dùng để tạo ra hoặc cải thiện màu sắc cho sản phẩm

19 Các chất tạo phức kim loại hòa tan

Dùng để tạo phức hòa tan với các kim loại đa hóa trị, cải thiện chất lượng và tính vững chắc của thực phẩm

20 Các chất tạo xốp Dùng để tạo xốp cho sản phẩm

21 Chất xử lý bột Dùng cải thiện chất lượng nướng hoặc màu cho thực phẩm

22 Các chất tạo hương thơm cho thực phẩm

Dùng để tạo mùi thơm cho các sản phẩm thực phẩm

Vai trò của phụ gia thực phẩm

Việc thêm các chất phụ gia vào thực phẩm nhằm làm tăng giá trị dinh dưỡng:

Bổ sung vitamin, khoáng chất không có hoặc đã bị mất đi trong khi chế biến như: thêm iod vào muối; thêm vitamin A, vitamin D vào sữa; thêm vitamin B vào bánh mì, bột, gạo vì khi xay phần lớn vỏ cám có nhiều loại vitamin này đã mất đi

Giữ cho thực phẩm an toàn, tươi lâu hơn: Thực phẩm thường bị một số vi khuẩn, nấm độc, mốc, men làm hư hỏng Chất phụ gia có thể giúp bảo quản, làm chậm quá trình lên men, ngăn chặn sự phân hủy của thực phẩm như: Sulfit được cho vào các loại trái cây khô, nitrat được cho thêm vào các loại thịt chế biến như xúc xích, thịt muối, thịt hộp Làm thay đổi bề ngoài, tăng mùi vị và sức hấp dẫn của thực phẩm Ví dụ: Chất nhũ hóa lecithin ở sữa, lòng đỏ trứng, đậu nành làm món ăn có độ ẩm, không khô cứng Chất làm bột nở như muối bicarbonat, natri phosphat được dùng khi làm bánh nướng, bánh mì để làm cho bánh mềm, xốp hơn Một số chất màu có công dụng làm cho thực phẩm có vẻ ngoài hấp dẫn hơn hoặc phục hồi màu sắc nguyên thủy của thực phẩm; duy trì hương vị vitamin dễ bị phân hủy vì ánh sáng; tạo cho thực phẩm có dáng vẻ đặc trưng, dễ phân biệt.

Ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khoẻ con người

Hiện nay, việc tìm hiểu sự ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khỏe con người vẫn là một vấn đề phức tạp Các triệu chứng chúng ta thường thấy thuộc vào loại phản ứng dị ứng của cơ thể với một số chất phụ gia như: ngứa ngáy, da nổi đỏ, nhức đầu, đau bụng, chóng mặt, khó thở, [3] Một vài ví dụ như:

 Nhóm sulfite: Có thể gây khó thở, nhất là đối với những người bị hen suyễn Sulfite được trộn trong rau quả, quả khô (như nho khô) hoặc đông lạnh, các loại nước giải khát, trong thủy sản đóng hộp và trong các loại xốt cà chua

 Nhóm nitrit và nitrat (muối diêm): Có khả năng gây ung thư khi chuyển thành nitrosamin trong lúc chiên nướng Các chất này rất hữu hiệu trong việc ngăn cản sự phát triển và diệt vi khuẩn, đặc biệt là khuẩn clostridium botulinum trong đồ hộp Ngoài tác dụng giúp bảo quản tốt, nitrit và nitrat còn tạo cho thịt có màu hồng tươi rất hấp dẫn Thịt nguội, jăm - bông, thịt xông khói, xúc xích đều có chứa nitrit và nitrat

 Bột ngọt (MSG – monosodium glutamate): Có người không hợp với bột ngọt nên cảm thấy khó chịu trong người, chóng mặt, nhức đầu, khô miệng, nóng ran ở mặt, Tuy nhiên, các triệu chứng trên chỉ tồn tại trong một khoảng thời gian ngắn

 Đường hóa học E951 – Aspartame: Chất aspartame nên có thể bị đau bụng, chóng mặt, nhức đầu

Giới thiệu về nitrit, nitrat

Nitrat

1.3.1.1 Tính chất vật lí, hóa học của nitrat

Nitrat là muối của axit nitric Trong muối nitrat, ion NO3 - có cấu tạo hình tam giác đều với góc ONO bằng 120 o và độ dài liên kết N-O bằng 1,218 Å Khối lượng mol ion

NO3 - là 62,0049 g/mol Ion NO3 - không có màu nên các muối nitrat của những cation không màu đều không có màu Hầu hết các muối nitrat đều dễ tan trong nước Một vài muối hút ẩm trong không khí như NaNO3 và NH4NO3 Muối nitrat của những kim loại hoá trị II và hoá trị III thường ở dạng hydrat.[4]

Muối nitrat khan của kim loại kiềm khá bền với nhiệt (chúng có thể thăng hoa trong chân không ở 380 – 500 o C) Còn các nitrat của kim loại khác dễ phân hủy khi đun nóng

Nitrat là muối của axit kém bền HNO3 HNO3 bị thủy phân dưới tác dụng của ánh sáng, dung dịch có màu vàng Trong nước, HNO3 là axit mạnh nên phân li hoàn toàn

Tất cả các muối nitrat đều tan trong nước và là chất điện li mạnh Trong dung dịch, chúng phân li hoàn toàn thành các ion Ion NO3 - không có màu, nên màu của một số muối nitrat là do màu của cation kim loại trong muối tạo nên

7 Một số muối nitrat như NaNO3, NH4NO3, hấp thụ hơi nước trong không khí nên dễ bị chảy rữa Các muối nitrat dễ bị phân hủy Độ bền nhiệt của muối nitrat phụ thuộc vào bản chất của cation tạo muối

Muối nitrat của các kim loại hoạt động mạnh (kali, natri, ) bị phân hủy thành muối nitrit và oxi Muối nitrat của magie, kẽm, sắt, chì, đồng, bị phân hủy thành oxit kim loại tương ứng, NO2 và O2 Muối nitrat của bạc, vàng, thủy ngân, bị phân hủy thành kim loại tương ứng, khí NO2 và O2

Hg(NO3)2 → Hg +2NO2 + O2 Ở nhiệt độ cao, muối nitrat phân hủy ra oxi nên chúng là các chất oxi hóa mạnh Khi cho than nóng đỏ vào muối kali nitrat nóng chảy, than bùng cháy

Ion NO3 - trong môi trường axit có khả năng oxi hoá như axit nitric

Trong môi trường trung tính muối nitrat hầu như không có khả năng ôxi hóa, nhưng trong môi trường kiềm có thể bị Al, Zn khử đến NH3

4Zn + NO3 - + 7OH - → 4ZnO2 - + NH3 + 2H2O

Do tính chất oxi hóa trong môi trường axit, nitrat còn có khả năng tham gia nitro hóa với một số chất hữu cơ như: axit sulfosalicilic, diphenylamin, antipyrin Khi chuyển về môi trường kiềm sản phẩm của quá trình nitro hóa sẽ có màu Đây là cơ sở cho phản ứng định lượng nitrat bằng phương pháp trắc quang.

Nitrit

1.3.2.1 Tính chất vật lí, hóa học của nitrit

Trong muối nitrit nguyên tử N ở trạng thái lai hóa sp 2 , hai obitan lai hóa tham gia tạo thành liên kết σ với hai nguyên tử O và một obitan lai hoá có cặp electron tự do Một obitan 2p còn lại không lai hoá của nitơ có một electron độc thân tạo nên liên kết π không định chỗ với hai nguyên tử oxy

Nhờ có cặp electron tự do ở nitơ, ion NO2 - có khả năng tạo liên kết cho nhận với ion kim loại Một phức chất thường gặp là natricobantinitrit Na3[Co(NO2)6] Đây là thuốc thử dùng để phát hiện ion K + nhờ tạo thành kết tủa K3[Co(NO2)6] màu vàng

8 Nitrit kim loại kiềm bền với nhiệt, chúng không phân hủy khi nóng chảy mà chỉ phân hủy ở trên 500 0 C Nitrit của kim loại khác kém bền hơn, bị phân hủy khi đun nóng, chẳng hạn như AgNO2 phân hủy ở 140 0 C, Hg(NO2)2 ở 75 0 C [4]

Axit nitrơ không bền, nhanh chóng bị phân hủy, nhất là khi đun nóng:

3HNO2 → HNO3 + 2NO + H2O Bởi vậy khi khí NO2 tan trong nước thì thực tế tạo nên HNO3 và NO theo phản ứng:

3NO2 + H2O → 2HNO3 + NO Trong dung dịch nước, axit nitrơ là một axit yếu (Kb= 4,5.10 -4 ), hơi mạnh hơn axit cacbonic Do không bền, axit nitrơ rất hoạt động về mặt hóa học Nó vừa có tính oxi hóa vừa có tính khử

Axit nitrơ oxi hóa được dung dịch HI đến I2, dung dịch SO2 đến H2SO4, ion Fe 2+ đến ion Fe 3+ … còn bản thân nó biến thành NO Với những chất oxi hóa mạnh như KMnO4, MnO2, PbO2, axit nitrơ bị oxi hóa đến axit nitric

Các muối nitrit bền nhiệt hơn HNO2 và có thể tồn tại độc lập Phần lớn các nitrit tan tốt trong nước, trừ AgNO2 Nitrit của các kim loại kiềm nóng chảy không phân hủy Cũng như ion NO2 -, đa số muối nitrit không có màu

Trong môi trường axit, muối nitrit có tính oxi hóa và tính khử như axit nitrơ

Muối NaNO2 được dùng rộng rãi trong công nghiệp hóa học, nhất là công nghiệp nhuộm azo.

Độc tính

Nitrat và nitrit là những tác nhân gây ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng và là một trong những nguyên nhân gây ra hai loại bệnh: hội chứng da xanh ở trẻ sơ sinh và ung thư dạ dày ở người lớn

Khi đi vào cơ thể, nitrat tham gia phản ứng khử ở dạ dày và đường ruột do tác dụng của các men tiêu hoá sinh ra nitrit Nitrit sinh ra phản ứng với Hemoglobin tạo thành methaemoglobinemia làm mất khả năng vận chuyển oxi của Hemoglobin

Thông thường Hemoglobin chứa Fe 2+ , ion này có khả năng liên kết với oxi Khi có mặt NO2 - nó sẽ chuyển hoá thành Fe3 + làm cho hồng cầu không làm được nhiệm vụ chuyển tải oxi Nếu duy trì lâu sẽ dẫn tới tử vong [5][6]

9 4HbFe2 + (O2) + 4NO2 - + 2H2O → 2HbFe 3+ + OH - +4NO3 - +O2

Sự tạo thành methaemoglobinemia đặc biệt thấy rõ ở trẻ em Trẻ em mắc chứng bệnh này thường xanh xao và dễ bị đe doạ đến cuộc sống đặc bệt là trẻ dưới 6 tháng tuổi

Nồng độ nitrit cao hơn 100 mg NO3 - /L khi vào dạ dày, tại đây pH thấp, nitrit được chuyển thành axit nitrơ có khả năng phản ứng được với amin hoặc amit sinh ra nitrosamine – đây là hợp chất tiền ung thư, mối quan hệ này đã được thử nghiệm trên động vật Ngoài ra các amin bậc II và III có thể kết hợp với axit nitrơ để tạo thành nitrosamin theo cơ chế sau [5][6]

Do đó để hạn chế mối nguy hại do nitrit, nitrat gây ra, Bộ Y tế Việt Nam qui định hàm lượng nitrit, nitrat cho phép có trong thực phẩm chế biến: Thịt muối, jambon, xúc xích, lạp xưởng (125 mg KNO2/kg và 500 mg KNO3/kg) [7].

Các phương pháp xử lý mẫu thực phẩm

Kỹ thuật vô cơ hóa ướt

a Bằng axit đặc mạnh, có tính oxy hóa mạnh

Dùng axit vô cơ mạnh và đặc (HCl, H2SO4), axit mạnh đặc có tính oxy hóa mạnh (HNO3, H2SO4), hỗn hợp hai axit (HNO3 + H2SO4), hay ba axit (HNO3 + H2SO4 +

10 HClO4) để phân hủy mẫu trong bình Kendan hay ống nghiệm được đun nóng Lượng axit thường gấp 15 - 20 lần lượng mẫu và còn tùy thuộc vào loại mẫu Thời gian hòa tan mẫu trong các hệ hở, bình Kendan thường vài giờ đến vài chục giờ, cũng tùy thuộc vào loại mẫu, cỡ mẫu, bản chất của các chất cần xác định,

Trong quá trình xử lý này các nguyên tố kim loại ở dạng các hợp chất cơ kim của mẫu rau quả sẽ bị oxy hóa, đốt cháy các chất hữu cơ, đưa các kim loại về các muối vô cơ tan trong dung dịch nước, quá trình hóa học chính là:

Mẫu + HNO3 + H2SO4  CO2 + H2O + Men(SO4)m + Mex(NO3)y b Xử lý mẫu trong lò vi sóng

Trong các hệ lò đơn giản:

 Hệ bình mẫu đóng kín (có áp suất cao)

Trong các hệ nhiều bình và tự động hoàn toàn:

 Hệ bình mẫu hở có khống chế nhiệt độ

 Hệ bình mẫu đóng kín (có áp suất cao) có khống chế nhiệt độ và áp suất

 Xử lý trong lò vi sóng hệ kín (có áp suất) thì chỉ cần 50 - 60 phút.

Kỹ thuật vô cơ hóa khô

Nung để xử lý sơ bộ mẫu không có phụ gia và chất bảo vệ là quá trình xử lý mẫu sơ bộ nhờ tác dụng của nhiệt độ thích hợp trong một thời gian nhất định, nhằm phá vỡ cấu trúc dạng tinh thể ban đầu của mẫu phân tích để chuyển nó sang một dạng các hợp chất khác đơn giản, dễ hòa tan tiếp bằng dung dịch axit hay bằng dung dịch kiềm để lấy các chất phân tích vào dung dịch thích hợp, sau đó có thể xác định được nó theo một phương pháp nhất định.

Kỹ thuật vô cơ hóa khô ướt kết hợp

Xử lý khô ướt kết hợp là kế tiếp nhau, trước tiên xử lý ướt sơ bộ, sau đó mới nung, nên tính chất và diễn biến của nó cũng tương tự như trong hai kiểu đã đề cập ở trên, chỉ có khác là sau khi xử lý mẫu không phải đuổi lượng axit dư quá nhiều như trong xử lý ướt Sau khi xử lý ướt ta đem nung sẽ nhanh hơn và quá trình xử lý sẽ triệt để hơn xử lý ướt Phương pháp này hạn chế được mất chất phân tích của một số kim loại khi nung

Một số kỹ thuật chưng cất trong xử lý mẫu

Nguyên tắc chung của chưng cất

Chưng cất là một kỹ thuật tách và tinh chế các chất dựa theo điểm sôi (nhiệt độ sôi) của chất để tách chúng theo từng phân đoạn của nhiệt độ sôi khi chưng cất trong những điều kiện áp suất nhất định Việc chưng cất có thể lấy được riêng từng chất (tại một điểm sôi của chất), khi mỗi chất trong hỗn hợp có điểm sôi khác nhau rõ rệt, hay một nhóm chất (khi chúng có cùng điểm sôi).

Chọn kỹ thuật chưng cất

– Việc chọn cách chưng cất nào là tùy thuộc vào các vấn đề chính sau đây:

+ Theo mục đích của việc phân tích để chọn cách chưng cất

+ Hỗn hợp mẫu thuộc loại nào và các chất cần phải chưng cất

+ Bản chất và nhiệt độ sôi của các chất cần phân tích

+ Chất nền và loại chất nền của mẫu phân tích

– Trong xử lý mẫu phân tích, kỹ thuật chưng cất thường được áp dụng cho hai loại chất:

+ Xử lý mẫu xác định các tạp chất trong các dung môi tinh khiết

+ Chưng cất tách các chất phân tích dễ bay hơi trong mẫu để tách chúng ra khỏi mẫu ban đầu, sau đó xác định chúng theo một cách phù hợp.

Các phương pháp phân tích nitrit, nitrat

Bảng 1.2 Phương pháp xác định nitrit

STT Phương pháp Nguyên tắc Lưu ý

Phương pháp phân tích thể tích

Oxi hoá ion NO2 - thành ion NO3 - bằng KMnO4, điểm cuối của quá trình chuẩn độ được nhận biết khi màu tím của KMnO4 chuyển thành màu tím rất nhạt (gần như mất màu) Độ nhạy không cao và tính chọn lọc kém vì trong dung dịch có nhiều ion có khả năng bị ion MnO4 - oxy hoá

Nitrit tác dụng với hỗn hợp thuốc thử axit sunfanilic và α- naphtylamin trong môi trường thích hợp hình thành hợp chất điazo có màu đỏ, đo độ hấp thụ quang (A) của dung dịch ở bước sóng λ 520 nm

+ pH của môi trường phản ứng (1,7 ÷ 3)

+ Nếu trong mẫu có hợp chất chứa nitrogentriclorua (màu đỏ), nó sẽ ảnh hưởng đến mật độ quang

+ Ion Cu 2+ làm giảm kết quả đo vì nó là chất xúc tác cho sự phân hủy muối điazoni

+ Một số ion Sb, Fe, Pb, Ag, có trong mẫu sẽ kết tủa, gây cản trở phép đo quang

Bảng 1.3 Phương pháp xác định nitrat

STT Phương pháp Nguyên tắc và thuốc thử Lưu ý

1 Phương pháp khử bằng Cd – Cu

Nitrat bị khử về nitrit khi cho mẫu chạy qua cột chứa

Cd – Cu kim loại Sau đó nitrit được xác định khi cho tác dụng với hỗn hợp thuốc thử axit sunfanilic và α – naphtylamin để tạo thành hợp chất azo màu đỏ, đo độ hấp thụ quang A ở bước sóng λ = 520 nm

+ Phải tiến hành phục hồi cột một cách định kỳ

+ Khi nồng độ vượt vài mg/L, các ion kim loại Sb 3+ , Au 3+ ,

Bi 3+ , Fe 3+ , Pb 2+ , Hg 2+ , Ag + , PtCl6 2- và VO3 2- làm giảm hiệu suất khử nitrate trên cột

+ Ion Cu 2+ có thể gây sai số âm do xúc tác phân hủy muối diazonium

2 Phương pháp khử bằng ion Cd 2+ - huyền phù Zn

Ion NO3 - được khử về ion

NO2 - khi cho tác dụng với hỗn hợp ion Cd 2+ và huyền phù Zn kim loại, sau đó ion

NO2 - được xác định khi cho

+ Phản ứng khử phụ thuộc vào nhiệt độ, vì vậy tất cả các mẫu phải được khử ở cùng một nhiệt độ

+ Các ion ảnh hưởng: Au, Bi,

13 tác dụng với axit sunfanilic và α-naphthylamin

Fe, Pb, Ag,…có thể làm giảm kết quả đo và màu của một số ion xen lẫn màu của chất hấp thụ

Phản ứng kết hợp giữa hai phân tử NO3 - với một phân tử của axit cromotropic (C10H8O8S2) hình thành nên hợp chất màu vàng Sau đó đem đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 410 nm

Nếu lượng clo dư (là chất oxy hóa) và có mặt nitrit cũng tạo nên hợp chất màu vàng với axit cromotrophic

Natri salixilat nitrat tác dụng với natri salixilat trong môi trường axit tạo dung dịch có màu vàng dạng p – nitrosalixylat, đo mật độ quang của chất này ở bước sóng 420nm

Phương pháp không bị ảnh hưởng bởi nitrit (≤ 2 mg/L), clorua (≤ 200 mg/L), sắt (≤ 5 mg/L)

Bảng 1.4 Phương pháp xác định đồng thời nitrat, nitrit

STT Phương pháp Nguyên tắc và thuốc thử

1 Sắc ký trao đổi ion Nitrat và nitrit được chiết ra khỏi mẫu thử bằng nước nóng Dung dịch nước được xử lý bằng axetonitril để loại bỏ các chất gây nhiễu Hàm lượng nitrat và nitrit của dung dịch sau đó được xác định bằng sắc ký trao đổi ion (IC) và detector tử ngoại (UV) ở bước sóng

2 Phương pháp đo phổ sau khi khử nitrat thành nitrit bằng

+ Nitrit trong dịch chiết của mẫu thử được xử lý bằng sulfanilamide và N-(1-naphthyl)-ethylenediamine

14 enzym dihydrochloride Đo độ hấp thụ của hợp chất màu đỏ tạo thành tại bước sóng 540 nm

+ Nitrat trong dịch chiết của mẫu phân tích được chuyển thành nitrit bằng enzym khử nitrat (nitrat reductaza) Nitrit được chuyển thành cùng với nitrit có sẵn trong mẫu phân tích sẽ phản ứng với sulfanilamide và N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride Cường độ màu của hợp chất màu đỏ tạo thành này được đo bằng máy đo phổ ở bước sóng

540 nm Hàm lượng nitrat được tính từ chênh lệch kết quả giữa các phép đo phổ

3 Phương pháp dùng axit sunfanilic và α-naphtylamin

+ Nitrit ở trong mẫu được xác định bằng cách cho tác dụng với hỗn hợp axit sunfanilic và α-naphtylamin, phản ứng tạo ra hợp chất điazo màu đỏ Sau đó đo độ hấp thụ quang A ở bước sóng λ = 520 nm

+ Tổng nitrat, nitrit trong mẫu được xác định bằng cách cho thêm dung dịch EDTA và đệm amoni, sau đó cho chảy qua cột khử Cd-Cu Ở đây nitrat bị khử về nitrit, sau đó nitrit được xác định bằng phương pháp quang phổ như trên

4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp này dựa trên việc tách nitrat, nitrit trên cột tách và được xác định bằng detectơ UV Hỗn hợp pha động là octyl amonium orthophotphat0,01 M + metanol theo tỷ lệ 30% (thể tích/thể tích) ở pH = 7, tốc độ bơm pha động là 0,8 mL/phút, thời gian phân tích cho một mẫu là 10 phút

1.7 Phương pháp phân tích định tính, bán định lượng nirit, nitrat bằng hỗn hợp thuốc thử axit sulfanilic và α-naphthylamin

Phương pháp này dựa trên TCVN 8742:2011 do cục vệ sinh an toàn thực phẩm tổ chức biên soạn để định tính và bán định lượng nitrit và nitrat trong thực phẩm theo nguyên tắc sau:

Hòa tan (chiết xuất) nhanh NO3 - và NO2 - trong mẫu thực phẩm trong môi trường nước, tiến hành khử nitrat thành nitrit Đo màu hồng của dung dịch có độ hấp thụ quang cực đại, được hình thành bởi dung dịch NO2 - tác dụng với thuốc thử axit sulfanilic và α- naphtylamin trong môi trường axit [9].

Tình hình nghiên cứu Kit thử nhanh nitrit, nitrat trong và ngoài nước

Bảng 1.5 Một số bộ Kit thử nhanh nitrit, nitrat trong và ngoài nước hiện nay

Mã Kit Xuất xứ Giá thành Giới hạn phát hiện Test Kit nitrat

Việt Nam (Bộ Công An)

Nội dung nghiên cứu

Khảo sát điều kiện tối ưu chế tạo kit thử nhanh nitrit, nitrat trong thực phẩm 16 2.2.2 Chế tạo kit

 Khảo sát bước sóng hấp thụ

 Khảo sát thời gian hiện màu

 pH của môi trường phản ứng

 Khảo sát điều kiện khử nitrat về nitrit

 Xác định ngưỡng phát hiện của kit thử

 Xây dựng thang màu bán định lượng nitrit, nitrat trong thực phẩm

 Bộ kit thử nitrit gồm: V mL hỗn hợp thuốc thử: axit sulfanilic và α-naphthylamin

 Bộ kit thử nitrat gồm: V mL hỗn hợp thuốc thử: axit sulfanilic và α-naphthylamin, m (g) bột kẽm.

Áp dụng kit chế tạo để kiểm tra nhanh nitrit, nitrat trong một số loại thực phẩm lưu hành ở thành phố Thủ Dầu Một

phẩm lưu hành ở thành phố Thủ Dầu Một

 Đối tượng: các loại thực phẩm đang lưu hành ở thành phố Thủ Dầu Một: lạp xưởng, xúc xích, …

 Địa điểm: chợ Thủ Dầu Một, chợ Phú Hòa.

Phương pháp nghiên cứu

Cơ sở của phương pháp nghiên cứu

17 Phương pháp xác định nitrit dựa trên cơ sở phản ứng của nitrit với hỗn hợp thuốc thử axit sulfanilic và α-naphthylamin để tạo thành hợp chất azo màu hồng [6], phản ứng như sau:

Nitrat trong mẫu được xác định bằng cách khử chúng về nitrit bằng chất khử là bột Zn.

Đo độ hấp thụ của dung dịch hợp chất màu

Khi chiếu một dòng sáng qua dung dịch chất màu thì chất đó sẽ hấp thụ chọn lọc một số tia sáng tùy theo màu sắc của chất Định luật Lambert – Beer mô tả mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích (chất màu) và độ hấp thụ của nó bằng phương trình toán học sau:

A: Độ hấp thụ quang của chất tại bước sóng 

: Hệ số hấp thụ của chất tại bước sóng  l: Chiều dày cuvet đựng mẫu

C: Nồng độ của chất phân tích Điều kiện sử dụng định luật:

 Chùm sáng phải đơn sắc

 Dung dịch phải loãng, trong suốt

 Chất phân tích phải bền và bền dưới tác dụng của tia UV – Vis

Kỹ thuật chế tạo kit

Hình 2.1 Sơ đồ chế tạo kit thử nitrit, nitrat

Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện

Ngưỡng phát hiện đối với chất phụ gia được tiến hành như sau: nghiên cứu nitrit trên mẫu chuẩn với nồng độ lần lượt là: 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 8 mg/L, 10 mg/L Mỗi nồng độ nitrit trên cho phản ứng với thuốc thử đã lựa chọn tối ưu và mẫu trắng cũng thực hiện song song để so màu Dựa vào sự thay đổi màu của dung dịch so với mẫu trắng để lựa chọn mức nồng độ nitrit thấp nhất mà dung dịch chuyển màu làm giới hạn phát hiện cho bộ kit đã chế tạo

Thực hiện các bước tương tự trên để xác định ngưỡng phát hiện cho kit thử nitrat.

Lấy mẫu

Mẫu được lấy từ 02/03/2020 đến giữa tháng 25/03/2020, mẫu được lấy và bảo quản theo hướng dẫn chung về lấy mẫu thực phẩm phục vụ thanh tra, kiểm tra chất lượng, vệ sinh an toàn thực phẩm (TCVN 5140:2008)

Bột kẽm Thuốc thử NA NaOH 1 M

Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực phẩm

Nơi lấy mẫu Loại thực phẩm Ngày lấy mẫu Số lượng mẫu

Chợ Phú Hòa Lạp xưởng, dưa leo, cải ngọt, xúc xích 02/03/2020 03

Chợ Thủ Dầu Một Lạp xưởng, dưa leo, cải ngọt, xúc xích 10/03/2020 02

Hình 2.2 Một số mẫu thực phẩm xúc xích, lạp xưởng, cải, dưa leo

Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

Thiết bị, dụng cụ

 Máy đo pH F-51 (Horiba, Nhật)

 Máy cất nước hai lần Aquartron A4000D (Bibby, Anh)

 Bếp cách thủy WNB 14 (Memmert, Đức)

 Máy trắc quang UV-Vis

 Cân phân tích PA214 độ chính xác  0,1mg (OHAUS, Mỹ)

 Một số dụng cụ khác: bình định mức, cốc, pipet, đũa thủy tinh, phễu lọc, bình tam giác, bình tia, bóp cao su, …

Hóa chất

Các hóa chất cần sử dụng cho nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.1

Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu

Tên hóa chất Xuất xứ

Axit sulfanilic Đức α-naphthylamin Đức

‒ Dung dịch gốc KNO 3 1,0 g/L: Hòa tan 0,50 g KNO3 trong nước, bảo quản với 1 mL chloroform, định mức thành 500 mL

‒ Dung dịch trung gian KNO 3 0,1 g/L: Pha loãng 10,0 mL dung dịch gốc thành 100 mL bằng nước cất

‒ Dung dịch làm việc KNO 3 10 mg/L: Pha loãng 10,0 mL dung dịch trung gian thành

‒ Dung dịch gốc KNO 2 1,0 g/L: Hòa tan 0,50 g KNO2 trong nước, bảo quản với 1mL chloroform, định mức thành 500 mL

‒ Dung dịch trung gian KNO 2 0,1 g/L: Pha loãng 10,0 mL dung dịch gốc thành 100 mL bằng nước cất

‒ Dung dịch làm việc KNO 2 10 mg/L: Pha loãng 10,0 mL dung dịch trung gian thành

‒ Axit sunfanilic 2,5.10 -3 M: Hòa tan 0,108 g axit sunfanilic trong 100 mL nước nóng, thêm vào 10 mL HCl đậm đặc, định mức thành 250 mL

‒ α-naphtylamin 2,5.10 -3 M: Hòa tan 0,089 g α-naphtylamin trong 100 mL nước, thêm vào 2,5 mL HCl đậm đặc, định mức thành 250 mL

‒ NaOH 1M: Hòa tan 4 g NaOH trong nước và định mức thành 100 mL

Nghiên cứu chế tạo kit thử xác định nitrit, nitrat trong thực phẩm

Bước sóng hấp thụ

Chuẩn bị 1 bình định mức 25 mL, cho vào bình 5 mL dung dịch KNO2 10,00 mg/L, thêm 1,2 mL NaOH 1M rồi 2,5 mL axit sulfanilic 2,5.10 -3 M và 2,5 mL α- naphthylamin 2,5.10 -3 M Định mức đến vạch rồi lắc đều Sau 15 phút, đo độ hấp thụ quang của dung dịch hợp chất màu ở các bước sóng khác nhau từ 400 – 700 nm Kết quả thu được ở hình 3.1

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của hợp chất màu azo Nhận xét: Hợp chất màu azo hấp thụ ánh sáng cực đại tại bước sóng λmax = 520 nm Trong các thí nghiệm sau, giá trị bước sóng λ = 520 nm được chọn để đo độ hấp thụ quang.

Thời gian bền màu

Chuẩn bị 1 bình định mức 25 mL Cho vào bình 5 mL dung dịch chuẩn KNO2

10,00 mg/L, thêm 1,2 mL NaOH 1 M rồi 2,5 mL axit sulfanilic 2,5.10 -3 Mvà 2,5 mL α- naphthylamin 2,5.10 -3 M Định mức đến vạch rồi lắc đều Mẫu trắng gồm các dung dịch trên nhưng không chứa KNO2, định mức 25 mL Tiến hành đo phổ hấp thụ tại λ= 520 nm

Cứ 1 phút đo độ hấp thụ một lần

Hình 3.2 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch màu azo theo thời gian

Từ hình 3.2 cho thấy: Thời gian ổn định màu của hợp chất azo từ 30 phút trở lên.

Môi trường pH tạo muối điazoni thích hợp

Chuẩn bị 8 bình định mức 25 mL Cho vào mỗi bình 5 mL dung dịch KNO2 10 mg/L, sau đó thêm vào mỗi bình các thể tích khác nhau của dung dịch NaOH 1 M, rồi thêm 2,5 mL SA 2,5.10 -3 M và 2,5 mL NA 2,5.10 -3 M Định mức đến vạch, lắc đều và đo pH của dung dịch Sau 30 phút đo độ hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng λ = 520 nm Mẫu trắng gồm các dung dịch trên nhưng không chứa KNO2, định mức 25 mL Kết quả chỉ ra ở bảng 3.1; hình 3.3 và hình 3.4

Hình 3.3 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch hợp chất màu azo theo pH tạo muối điazoni

Bảng 3.1 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch hợp chất màu azo theo pH tạo muối điazoni pH 1,5 1,8 2,0 2,2 2,5 2,8 3,3 3,6

Hình 3.4 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch màu azo theo pH

Từ kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.4 cho thấy: Khi thay đổi pH trong khoảng từ 1,5 ÷ 3,6 thì độ hấp thụ quang tăng dần và đạt giá trị lớn nhất trong khoảng pH = 1,8 ÷ 2,5, lớn hơn khoảng giá trị pH đó thì độ hấp thụ quang (A) giảm dần Vậy chúng tôi chọn giá trị pH nằm trong khoảng từ 1,8 ÷ 2,5 để tạo hợp chất màu azo, ứng với VNaOH = 1,2 mL.

Khảo sát tỉ lệ thuốc thử

Chuẩn bị 7 bình định mức 25 mL: lấy 5 dung dịch chuẩn KNO210,00 mg/L, thêm 1,2 mL NaOH 1 M, V1 (mL) axit sulfanilic 2,5.10 -3 M và V2 (mL) α-naphthylamin 2,5.10 -3 M theo tỉ lệ khảo sát Định mức đến vạch và lắc đều Để yên 30 phút, tiến hành đo phổ hấp thụ λ= 520 nm Mẫu trắng gồm các dung dịch trên nhưng không chứa KNO2, định mức 25 mL Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch các hợp chất màu azo vào tỉ lệ thuốc thử SA:NA

Hình 3.5 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch các hợp chất màu azo vào tỉ lệ thuốc thử SA:NA

Hình 3.6 Kết quả khảo sát tỉ lệ thuốc thử SA:NA

Từ kết quả trên cho thấy tỉ lệ SA : NA = 1 : 1 cho phức có màu tốt nhất nên chọn tỉ lệ này để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo

Xác định ngưỡng phát hiện

Chuẩn bị 6 bình định mức 25 mL: pha dung dịch nitrit ở các nồng độ 0 mg/L; 0,02 mg/L; 0,04 mg/L; 0,06 mg/L; 0,08 mg/L; 0,1 mg/L, sau đó cho hỗn hợp 2,5mL axit sulfanilic 2,5.10 -3 M và 2,5mL α-naphthylamin 2,5.10 -3 M, thêm 1,2 mL NaOH 1M Định mức đến vạch 25 mL và lắc đều Để yên 30 phút, tiến hành đo mật đo quang ở bước sóng

520 nm Mẫu trắng gồm các dung dịch trên nhưng không chứa KNO2, định mức 25 mL Kết quả thu được ở hình 3.7

Hình 3.7 Ngưỡng phát hiện của nitrit Nhận xét: Kết quả hình 3.7 cho thấy: ở nồng độ > 0,08 mg/L kit cho màu rõ ràng nhất Vì vậy giới hạn phát hiện của nitrit là 0,08 mg/L.

Nghiên cứu chế tạo kit thử nitrat

Khảo sát tính khử của kẽm

Chuẩn bị 8 bình định mức 25 mL: cho vào bình định mức 10 mL NO3 - 10 mg/L, thêm m (g) Zn Sau 2 phút, lọc và cho hỗn hợp 2,5 mL axit sulfanilic 2,5.10 -3 M và 2,5 mL α-naphthylamin 2,5.10 -3 M, thêm 1,2 mL NaOH 1 M Định mức đến vạch và lắc đều, để yên khoảng 30 phút rồi tiến hành đo phổ hấp thụ tại  = 520 nm

Mẫu trắng gồm các dung dịch trên nhưng không chứa KNO3 và không thêm Zn định mức 25 mL Kết quả thu được ở bảng 3.3

MT 0,02mg/L 0,04mg/L 0,06mg/L 0,08mg/L 0,1mg/L

Bảng 3.3 Sự phụ thuộc độ hấp thụ của hợp chất màu ở các khối lượng kẽm khác nhau

Hình 3.8 Sự phụ thuộc độ hấp thụ của hợp chất màu ở các khối lượng kẽm khác nhau

Từ bảng 3.3 và hình 3.8 cho thấy khối lượng Zn thêm vào 0,06 g thì độ hấp thụ quang của hợp chất màu đạt giá trị cao nhất, nên chúng tôi chọn giá trị mZn = 0,06 g cho các nghiên cứu tiếp theo

3.2.1.2 Thời gian khử của kẽm

Thí nghiệm: Chuẩn bị 5 bình định mức 25 mL, cho vào 5 mL NO3 - 10 mg/L, thêm 0,06 (g) kẽm vào lắc trong t (giây), lọc và cho hỗn hợp 2,5 mL axit sulfanilic 2,5.10 -3 M và 2,5 mL α-naphthylamin 2,5.10 -3 M, thêm 1,2 mL NaOH 1 M Định mức đến vạch và lắc đều, để yên khoảng 30 phút rồi tiến hành đo phổ hấp thụ tại  = 520 nm

Mẫu trắng gồm các dung dịch trên nhưng không chứa KNO3 và không thêm Zn, định mức 25 mL

Hình 3.9 Kết quả khảo sát thời gian khử của Zn Bảng 3.4 Kết quả đo độ hấp thụ của hợp chất màu ở các thời gian khử khác nhau

Hình 3.10 Sự phụ thuộc của hợp chất màu với các thời gian khử khác nhau của Zn Nhận xét: Kết quả trên cho thấy thời gian khử t = 2 phút thì quá trình khử nitrat về nitrit của kẽm đạt hiệu suất cao nhất Vì vậy chúng tôi chọn thời gian khử nitrat về nitrit của Zn là 2 phút

Xác định ngưỡng phát hiện của kit chế tạo

Thí nghiệm: Chuẩn bị 7 bình định mức 25 mL: pha dung dịch nitrat ở các nồng độ

0 mg/L; 1 mg/L; 2 mg/L; 4 mg/L; 6 mg/L; 8 mg/L; 10 mg/L, sau đó cho 0,06 g kẽm khử trong 2 phút, lọc và cho hỗn hợp 2,5 mL axit sulfanilic 2,5.10 -3 M và 2,5 mL α- naphthylamin 2,5.10 -3 M, thêm 1,2 mL NaOH 1 M Định mức đến vạch và lắc đều, để yên khoảng 30 phút rồi tiến hành quan sát sự hiện màu

Hình 3.11 Ngưỡng phát hiện của nitrat Nhận xét: Kết quả hình 3.10 cho thấy ở nồng độ > 4 mg/L dung dịch hiện màu rõ ràng nhất Vì vậy chọn giới hạn phát hiện của kit là 4 mg/L.

Xây dựng thang màu bán định lượng

Xây dựng thang màu bán định lượng nitrat: Ghi lại màu của dung dich ở các nồng độ tăng dần rồi lập thành bảng màu

Pha dung dịch nitrat ở các nồng độ tăng dần: 0 mg/L; 4 mg/L; 10 mg/L; 20 mg/L;

30 mg/L; 40 mg/L; 50 mg/L; 100 mg/L; 150 mg/L; 200 mg/L; 250mg/L; 300 mg/L; 350 mg/L; 400 mg/L; 450 mg/L; 500 mg/L; 550 mg/L

Thêm 0,06 g bột kẽm, lọc sau 2 phút rồi thêm hỗn hợp 2,5 mL axit sulfanilic và 2,5 mL α-naphthylamin, 1,2 mL NaOH 1 M để yên 30 phút Kết quả thu được ở hình 3.11

Hình 3.12 Thang màu bán định lượng nitrit, nitrat

Sản phẩm: từ kết quả nghiên cứu trên chúng tôi chế tạo bộ kit thử nhanh nitrit, nitrat bao gồm:

Hướng dẫn sử dụng bộ kit thử nhanh nitrit, nitrat trong thực phẩm được trình bày ở phần phụ lục.

So sánh kit thử với phương pháp xác định hàm lượng nitrat khử bằng Cd – Cu

 Xác định hàm lượng nitrat bằng kit thử

Thí nghiệm: Chuẩn bị 1 bình định mức 25 mL: cho vào 18,5 mL NO3 -, thêm 0,06 (g) kẽm vào lắc trong 2 phút, lọc và cho hỗn hợp 2,5 mL axit sulfanilic 2,5.10 -3 M và 2,5 mL α-naphthylamin 2,5.10 -3 M, thêm 1,2 mL NaOH 1 M Định mức đến vạch và lắc đều, để yên khoảng 30 phút rồi tiến hành so màu

 Xác định hàm lượng nitrat bằng phương pháp khử Cd – Cu

- Chuẩn bị cột Cd - Cu

- Tiến hành khử nitrat về nitrit bằng cột Cd – Cu

- Cho dung dịch sau khi khử tác dụng với hỗn hợp thuốc thử: axit sulfanilic và α- naphthylamin

- Tiến hành đo quang sau 15 phút

Kết quả xác định theo hai phương pháp được thể hiện ở bảng sau

Bảng 3.5 So sánh hai phương pháp xác định hàm lượng nitrat

Chỉ tiêu Phương pháp khử bằng

Phương pháp xác định nồng độ Đo quang So màu

Nồng độ NO3 - 16,625 mg/L Khoảng 15 mg/L

Quy trình thực hiện Phức tạp Đơn giản

Thời gian tiến hành 2 giờ 35 phút

Hình 3.13 Dung dịch phức màu sau khi thử bằng hai phương pháp

Áp dụng kit chế tạo được để kiểm tra nhanh nitrit và nitrat trong các loại thực phẩm đang lưu hành ở thành phố Thủ Dầu Một

Tiến hành lấy mẫu phân tích định tính và bán định lượng các mẫu thực phẩm (xúc xích, lạp xưởng, cải ngọt, dưa chuột) ngẫu nhiên tại các chợ bán lẻ trên phạm vi thành phố Thủ Dầu Một Dưới đây là một số hình ảnh phát hiện nitrat trong thực phẩm

Hình 3.14 Kết quả kiểm tra nitrat trong một số thực phẩm

Bảng 3.6 Kết quả phân tích định tính nitrat trong một số mẫu thực phẩm

Loại mẫu Số lượng mẫu Kết quả phân tích định tính

Có nitrat Không có nitrat

Bảng 3.7 Kết quả bán định lượng nitrat trong một số mẫu thực phẩm

Hàm lượng nitrat trong mẫu

Kit Giới hạn cho phép của Bộ Y Tế

Kiến nghị

Sử dụng những điều kiện đã khảo sát ở đề tài này để làm Test kit thử nhanh nitrit, nitrat trong thực phẩm có giới hạn phát hiện thấp hơn góp phần giúp người tiêu dùng có thể lựa chọn được các sản phẩm vệ sinh an toàn hơn

[1] TCVN 5660:2010, Tiêu chuẩn chung đối với phụ gia thực phẩm

[2] Bộ Y tế (2001), Danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm,

Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT

[3] Nguyễn Thượng Chánh (2005), Chất phụ gia trong thực phẩm, http://www.advite.com/chatphugia.htm, 5/10/2019

[4] Nguyễn Đình Luyện, Ngô Văn Tứ (2011), Phương pháp phân tích lý hóa, NXB Đại học Huế

[5] Nguyễn Thị Hoàn (2009), Nghiên cứu phương pháp động học trắc quang xác định hàm lượng nitrit trong mẫu nước ngầm và thực phẩm, Luận văn Thạc sĩ khoa học,

Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên

[6] Lê Thị Huỳnh Như, Thủy Châu Tờ, Nguyễn Thị Lợi (2016), Xác định hàm lượng nitrat, nitrit trong một số loại rau quả ở thành phố Thủ Dầu Một, Tạp chí Đại học

[7] Bộ Y tế (1998), Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm, Quyết định số 867/1998/QĐ-BYT

[8] Phạm Luận (1999), Giáo trình hướng dẫn về những kỹ thuật xử lý mẫu phân tích, Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, tr 25 - 34

[9] TCVN 8742:2011, Plant – Determination of nitrate and nitrite by colorimetric method

PHỤ LỤC Hướng dẫn sử dụng kit nitrit, nitrat

Tính năng: Bộ kit giúp phát hiện nhanh nitrit, nitrat trong một số loại thực phẩm (xúc xích, lạp xưởng, rau, …)

Bước 1: Lấy khoảng 5 g mẫu làm nhuyễn cho vào cốc, thêm khoảng 20 mL nước ngâm từ 10 – 15 phút, gạn lấy phần dung dịch

Bước 2: Cho gói bột vào sau 2 phút, gạn lấy dung dịch Bước 3: Cho thuốc thử theo thứ tự 1, 2, 3 Để yên 30 phút Bước 4: So dung dịch với thang màu xác định hàm lượng nitrit, nitrat

Hình 4.1 Sản phẩm kit thử nhanh nitrit, nitrat trong thực phẩm mg/L 0 4 10 20 30 40 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 mg/kg 0 20 50 100 150 200 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750