Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Chiết tách hợp chất Ecdysteroid từ thông đỏ và nghiên cứu khả năng gây lột xác trên cua (Scylla paramamosain)

Các nghiên cứu cho thấy ecdysone được thêm vào thức ăn với tỷ lệ thích hợp có tác dụng kích thích sự lột xác, đẩy nhanh quá trình trưởng thành của tằm, làm tăng trọng lượng kén tằm, rút

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN VĂN TRÍ

CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT ECDYSTEROID TỪ THÔNG ĐỎ VÀ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY LỘT XÁC TRÊN CUA

(SCYLLA PARAMAMOSAIN)

(Extraction Ecdysteroid compounds from Taxus wallichiana and research

potential moult of crab (Scylla Paramamosain))

Chuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa Học

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP.HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2020

Công trình được hoàn thành tại: Trung Tâm Sâm và Dược Liệu Tp HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Phạm Thành Quân

Cán bộ hướng dẫn khoa học 2:

Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS TS Bạch Long Giang

Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS Phan Thị Hoàng Anh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 11 tháng 01 năm 2020

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 Chủ tịch Hội đồng: PGS TS Nguyễn Thị Phương Phong

2 Cán bộ phản biện 1: PGS TS Bạch Long Giang

3 Cán bộ phản biện 2: TS Phan Thị Hoàng Anh

4 Ủy viên: TS Nguyễn Thanh Tùng

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KTHH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

TÊN ĐỀ TÀI: Chiết tách hợp chất ecdysteroid từ thông đỏ và nghiên cứu khả năng

gây lột xác trên cua (Scylla paramamosain)

I NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Chiết tách, tinh sạch β-ecdysone từ cao lá thông đỏ

- Nghiên cứu quy trình chiết xuất cao giàu ecdysteroid và chiết 500 gam cao ecdysteroid bán

thành phẩm ở quy mô pilot Từ đó làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn viên cho cua

- Nghiên cứu phối trộn chế phẩm thức ăn viên chứa ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm cao trung gian và chế phẩm thức ăn cua

- Khảo sát hoạt tính kích thích lột xác trên cua

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 02/06/2019

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 20/12/2020

IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1: PGS TS Phạm Thành Quân

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 2:

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

Cảm ơn TS Bùi Thế Vinh, ThS Lâm Bích Thảo, KS Nguyễn Nhật Minh và các Thầy Cô, các Anh Chị em, bạn bè tại Trung tâm sâm và dược liệu Tp HCM, bộ môn Hóa Hữu Cơ, khoa Kỹ Thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa Tp HCM đã giúp đỡ tôi thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn!

Nguyễn Văn Trí

độ β-ecdysone trong cao không thấp hơn 0,138%

Kết quả nuôi thí nghiệm ban đầu cho thấy khi nuôi với thức ăn viên nhân tạo 45% đạm bổ sung 10 ppm ecdysone có khả năng kích thích cua lột xác, thời gian lột xác của cua diễn ra sớm hơn, tập trung và đồng loạt vào khoảng 20 ngày

ABSTRACT

β-ecdysone compound was successfully isolated from Taxus wallichiana

Liquid-liquid extraction with ethyl acetate was selected as the extraction process of ecdysteroid, which had higher efficiency (0.138%) than through the Diaion HP-20 column (0.073%) Food for nuggets of crabs has been mixed and has the presence of ecdysteroid

The standard for Taxus wallichiana extract and crabs’ food containing

ecdysteroid has been formulated The moisture of the extract and crabs’ food do not exceed 20% and 12%, respectively, and the concentration of β-ecdysone in the extract

is not lower than 0.138%

Preliminary experimental results showed that when crabs were fed with artificial pellets 45% protein supplemented with 10 ppm ecdysone has the ability to stimulate crab molting, crab molting time takes place earlier, focused and simultaneously at 20th day

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác

Học viên

Nguyễn Văn Trí

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

ABSTRACT ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix

Chương 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Giới thiệu chung về cây thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana) 1

Tên gọi 1

1.1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Phân bố 2

1.1.3 Sinh thái 3

1.1.4 Công dụng 3

1.1.5 Độc tính 4

1.1.6 1.2 Giới thiệu về ecdysteroid 4

Giới thiệu chung về β-ecdysone 6

1.2.1 Công thức cấu tạo và danh pháp 7

1.2.2 Tính chất vật lý 7

1.2.3 Ứng dụng của β-ecdysone 7

1.2.4 1.3 Giới thiệu sinh lý lột xác của cua 9

Sinh lý lột xác của cua 9

1.3.1 Đặc điểm quá trình lột xác của cua 11

1.3.2 1.4 Phương pháp cô lập các hợp chất hữu cơ 12

Sắc ký phân bố - sắc ký cột 12

1.4.1 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 13 1.4.2

Chương 2: Thực Nghiệm 14

2.1 Nội dung nghiên cứu 14

2.2 Vật liệu, hóa chất sử dụng 14

Vật liệu 14

2.2.1 Hóa chất 14

2.2.2 Thiết bị 15

2.2.3 2.3 Quy trình thực hiện 15

Chiết tách, tinh sạch β-ecdysone từ cao methanol 15

2.3.1 Nghiên cứu quy trình chiết xuất ecdysteroid và chiết 500g cao ecdysteroid bán 2.3.2 thành phẩm ở quy mô pilot 18

Nghiên cứu phối trộn chế phẩm chứa ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua 21 2.3.3 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm cao trung gian và chế phẩm đã phối 2.3.4 trộn 23

Khảo sát hoạt tính kích thích lột xác cua ở mô hình thí nghiệm 23

2.3.5 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Chiết tách, tinh sạch β-ecdysone từ cao tổng 26

Chạy cột sắc ký phân bố 26

3.1.1 Sắc ký hấp phụ cột silica gel 27

3.1.2 3.2 Nghiên cứu quy trình chiết xuất ecdysteroid và chiết 500 g cao ecdysteroid bán thành phẩm ở quy mô pilot 30

Kết quả chạy cột Diaion HP-20 30

3.2.1 Lắc phân bố với ethyl acetate 31

3.2.2 Định lượng β-ecdysone bằng phương pháp HPLC 32

3.2.3 3.3 Nghiên cứu phối trộn chế phẩm chứa Ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua 40

Phối trộn cao chứa ecdysteroid vào thành phần thức ăn cho cua 40

3.3.1 Đánh giá tính chất hóa lý của viên thức ăn thành phẩm 40

3.3.2 3.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm cao bán thành phẩm và viên thức ăn thành phẩm có bổ sung ecdysteroid 41

Độ ẩm của cao bán thành phẩm và chế phẩm đã phối trộn 41

3.4.1 Định tính ecdysteroid bằng SKLM trong cao bán thành phẩm và viên thức ăn 3.4.2 thành phẩm có bổ sung ecdysteroid 43

3.5 Khảo sát hoạt tính kích thích lột xác trên cua ở mô hình thí nghiệm 47

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

4.1 Kết luận 53

4.2 Kiến nghị 53

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 60

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cây thông đỏ 1

Hình 1.2 Một số công thức của ecdysteroids [30] 6

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của β-ecdysone [30] 7

Hình 2.1 Quy trình tiến hành sắc ký phân bố cột A 16

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình sắc ký hấp phụ cột B 17

Hình 2.3 Quy trình tiến hành sắc ký phân bố 18

Hình 2.4 Quy trình lắc phân đoạn với ethyl acetate 19

Hình 3.1 SKLM các phân đoạn cột A Hệ dung môi DCM - MeOH (80 : 20) 26

Hình 3.2 SKLM phân đoạn của cột B1 Hệ dung môi DCM - MeOH (85:15) 28

Hình 3.3 SKLC phân đoạn của cột B2 Hệ dung môi DCM – MeOH (85:15) 29

Hình 3.4 Kết tinh phân đoạn V 29

Hình 3.5 SKLM đối chứng kết tinh và chuẩn β-ecdysone 30

Hình 3.6 Kết quả SKLM khi lắc phân bố với ethyl acetate 31

Hình 3.7 Kết quả thẩm định độ đặc hiệu của quy trình phân tích 32

Hình 3.8 Đường chuẩn và sắc ký đồ β-ecdysone chuẩn 33

Hình 3.9 Sắc ký đồ của mẫu cao ethyl acetate 35

Hình 3.10 Sắc ký của phân đoạn 40% ethanol 37

Hình 3.11 (1)Thiết bị chiết và (2) thiết bị lắc phân đoạn 39

Hình 3.12 Mẫu cao sau khi phối trộn thức ăn và xát hạt (trước khi sấy) 41

Hình 3.13 Kết quả định tính ecdysteroid trong thức ăn cua và cao thông đỏ 43

Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu cao bán thành phẩm 44

Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu thức ăn cua 45

Hình 3.16 Thức ăn chế biến dùng cho nuôi thí nghiệm 48

Hình 3.17 Bố trí cua trong bể nuôi thí nghiệm 48

Hình 3.18 Sự tăng trưởng, tỷ lệ sống, tỷ lệ lột vỏ của cua nuôi 50

Hình 3.19 Tỷ lệ lột vỏ của cua ở các nghiệm thức theo thời gian nuôi 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Tỉ lệ phối trộn phụ gia 22

Bảng 2 2: Kích thước cua và thức ăn bổ sung cho cua 24

Bảng 3.1 Bảng số liệu kết quả chạy sắc ký cột Diaion HP-20 31

Bảng 3.2 Kết quả xác định khoảng tuyến tính 33

Bảng 3.3 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại 34

Bảng 3.4 Hàm lượng β-ecdysone trong cao EtOAc 36

Bảng 3.5 Hàm lượng β-ecdysone trong PĐ 40% 38

Bảng 3.6 So sánh hai phương pháp chiết xuất 38

Bảng 3.7 Bảng chiết cao quy mô Pilot 40

Bảng 3.8 Kết quả độ ẩm của thức ăn sau khi trộn, sấy khô 41

Bảng 3.9 Kết quả độ ẩm của cao bán thành phẩm và chế phẩm đã phối trộn 42

Bảng 3.10 Kết quả phân tích độ tro toàn phần của cao bán thành phẩm và sản phẩm 42

Bảng 3.11 Kết quả phân tích β-ecdysone trong cao MeOH thông đỏ 45

Bảng 3.12 Kết quả phân tích β-ecdysone trong thức ăn 46

Bảng 3.13 Kết quả phân tích β-ecdysone trong thức ăn ban đầu 46

Bảng 3.14 Kết quả phân tích β-ecdysone trong thức ăn cua sau 3 tháng 46

Bảng 3.15 Kết quả phân tích β-ecdysone trong thức ăn cua sau 6 tháng 47

Bảng 3.16 Thành phần hóa học của các thức ăn cua (VCK) 49

Bảng 3.17 Các chỉ tiêu môi trường ở các nghiệm thức trong suốt thời gian thí nghiệm 49

Bảng 3.18 Tăng trưởng, tỷ lệ cua lột vỏ, tỷ lệ sống của cua nuôi ở các nghiệm thức 51

HMBC Heteronuclear Multiple Bond

HSQC Heteronuclear Single Quantum

NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

UV365 Ultra violet, λ=365 nm Đèn UV bước sóng 365 nm

hệ II

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về cây thông đỏ lá dài

Tên gọi

1.1.1

Tên khoa học: Taxus wallichiana

Tên thông thường: thông đỏ lá dài

Zucc (Thông đỏ Himalaya)

Hình 1.1 Cây thông đỏ

ặc ểm t ực vật

1.1.2

Thông đỏ lá dài là một loại cây thân gỗ, thường xanh, kích thước trung bình hoặc nhỏ, chậm lớn (cây sinh trưởng cả trăm năm chỉ có đường kính không quá 35 cm) Chiều cao: 20-30 m, đường kính ngang ngực: 1-1,5 m Cây mọc đứng [9, 2]

Cành: Xòe rộng, cành non màu lục, chuyển sang nâu sau 3 hoặc 4 năm, mọc phân tán tùy theo điều kiện môi trường

Vỏ cây: Phía ngoài màu nâu đỏ nhạt, hơi dày, bóc tách thành từng mảng hay từng tấm nhỏ, thịt màu nâu đỏ

Lá: Mềm, xếp hình xoắn ốc thành 2 dãy, mọc cách, thuôn thành đỉnh nhọn, gốc

lá mọc xuống, mép lá phẳng, mặt trên xanh vàng, mặt dưới xanh nhạt với các dải lỗ khí xanh nhạt hơn ở hai bên gân giữa Lá của các chồi chính có thể mọc dựng lên hơn là xếp dãy

Hoa: Phân tính khác gốc Hoa cái đơn độc, có một hạt và được bao quanh nhưng không bao kín bằng lớp áo hạt màu đỏ, chín trong 1 năm Hoa đực tạo thành hàng ở nách lá, nhỏ, hình trứng, dài 6 mm và rộng 3 mm, nhưng không có cuống hoặc cuống rất nhỏ

Hạt: Hình trứng, dài 7 mm và rộng 5 mm, màu đen khi chín

Phân bố

1.1.3

Tháng 7/2006, tổ chức IUCN đã tìm thấy loài thông đỏ lá dài tại Afghanistan, Bhutan, tây nam Trung Quốc (Sichuan, Xizang, Yunnan), Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Himachal Pradesh, Jammu-Kashmir, Manipur, Sikkim, Uttar Pradesh), phía bắc Myanmar, Nepal (vùng núi Hymalaya), Pakistan, Indonesia, Philippin, Việt Nam

Ở Việt Nam, loài này được tìm thấy ở một số vùng núi cao thuộc các tỉnh Lào Cai (Hoàng Liên Sơn), Khánh Hòa, Lâm Đồng (Đà Lạt, Đơn Dương, Đức Trọng, Lạc Dương,…), Hà Giang (Thái An-Quản Ba), độ cao phân bố 1400-1600 m hoặc hơn

Sự phân bố của thông đỏ khá đa dạng trong khu vực Lâm Đồng, nhưng số lượng

cá thể ở mỗi nơi lại ít Số lượng cá thể nhiều nhất tại khu vực Núi Voi (100 cây), tại

đây cây không bị che phủ và phát triển tương đối tốt Ở những nơi bị che phủ như Lán Tranh thì số lượng cá thể ít (1 cây) Có nơi cây lại già cỗi, chẳng hạn như khu vực Cổng Trời số lượng cá thể là 20 cây nhưng lại già cỗi, gần như không phát triển nữa

Sinh thái

1.1.4

Phạm vi độ cao: 2000-3500 m so với mặt biển

Dạng rừng: Rừng nhiệt đới thường xanh

Cây càng lớn đòi hỏi ánh sáng càng cao Trong tầng ưu thế sinh thái, nơi nào có khoảng trống, lượng ánh sáng nhiều thì cây phát triển mạnh và ngược lại [2]

Khí hậu: Nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ trung bình năm 20-25oC, độ ẩm đất 40%, độ ẩm không khí 85-90%

30-Thổ nhưỡng: Thích hợp với đất có thành phần cơ giới nhẹ, thoát nước, phát triển trên đất nâu vàng phiến thạch hay đất nâu đỏ trên đất bazan, độ pH đất 5,1-5,6

Thảm thực vật: Ở Lâm Đồng, thông đỏ thường phân bố rải rác hỗn giao với các loài cây lá rộng thường xanh và cây lá kim với kiểu rừng chính là hỗn giao cây lá rộng-cây lá kim Trong kiểu thảm này chúng phân bố ở tầng ưu thế sinh thái hợp với các loài đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), kim giao nam (Nageia wallichiana), thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius), thông nàng (Dacrycarpus imbricatus), du sam (Keteleeria evelyniana) và một số loài thuộc Fagaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae,

Hạt phát tán không xa (với bán kính 6-8 m so với từ tâm cây), nảy mầm và phát triển nơi có độ ẩm cao, cường độ ánh sáng trung bình Tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên rất thấp so với số lượng hạt cây mang hàng năm

Tái sinh tự nhiên: Ít gặp, cây mầm và cây non chịu bóng tốt

Công dụng

1.1.5

Gỗ thông đỏ chắc chắn, có tính co dãn, ít nứt nẻ, không cong vênh, không thấm nước, là loại gỗ quý, thường dùng trong điêu khắc thủ công mỹ nghệ và đóng các đồ gỗ gia dụng cao cấp [2]

Trong dân gian, lá thông đỏ được dùng để trị hen suyễn, viêm phế quản, các bệnh về đường tiêu hoá; cành và vỏ dùng trị bệnh giun đũa; nước sắc của thân cây thông non dùng trị bệnh đau đầu

Thông đỏ chứa một hàm lượng lớn Taxol, là nguyên liệu quý giá cho điều trị một số bệnh ung thư như ung thư buồng trứng, ung thư vú, cổ tử cung

ộc tính

1.1.6

Mặc dù là loại thảo dược quý hiếm nhưng thông đỏ lại chứa những độc tố mạnh

và có cường độ cao Bằng những kiểm nghiệm khoa học, người ta đã chỉ ra rằng hầu như trong mọi bộ phận của cây đều có chất độc ngoại trừ vỏ của hạt

Độc tố trong thông đỏ được định danh gồm hơn 350 loại taxan khác nhau, có sức bền tồn tại đến mức kể cả khi phơi hay sấy khô vẫn có khả năng gây chết người Tất cả chúng đều có bản chất là các alkaloid Taxan xuất hiện ở hầu hết mọi bộ phận của cây, nhưng nhiều nhất là trong lá và vỏ cây

Độc tính của taxan rất mạnh, có thể gây chết người Cơ chế của chúng là gây độc cho hệ tim mạch và thần kinh, dẫn đến hệ quả là huyết áp thấp, nhịp tim chậm, giảm sức co bóp cơ tim Sự giảm huyết áp xuống mức thấp và sự giảm nhịp tim đến quá chậm làm thiếu máu ở tim, não và nhiều cơ quan trọng yếu Trên hệ thần kinh, taxan gây ra hiện tượng run, co giật, bất tĩnh khiến nạn nhân ngừng thở và tử vong [2]

1.2 Giới thiệu về ecdysteroid

Ecdysteroid là hormone lột xác ở côn trùng trong đó bao gồm ecdysone và đồng đẳng của nó như 20-hydroxyecdysone

Các ecdysteroid đầu tiên, được phân lập từ tằm nhộng bởi các nhà khoa học Đức, Butenandt và Karlson, vào năm 1954 [11] Ecdysteroid đóng vai trò thiết yếu trong tất cả các loài côn trùng, bằng việc điều chỉnh sự lột xác, biến thái, sinh sản và gián đoạn sự phát triển Bên cạnh đó ecdysteroid cũng được tìm thấy có trong động vật giáp xác như tôm [12], cua và từ thực vật Cho đến nay, ít nhất 2% các loài thực vật trên thế giới đã được nghiên cứu cho sự hiện diện của ecdysteroid, nhưng chỉ hơn 300

hợp chất đã được xác định Mức ecdysteroid trong đó thường từ 0,1 đến 3% trọng lượng khô, cao hơn gấp 1000 lần so với côn trùng [10]

Ecdysteroid không tham gia nội sinh trong quá trình chuyển hóa động vật có vú,

và không độc hại đối với động vật có vú LD50 = 20E (tương đương 6 g/kg thể trọng)

Ecdysteroid ở nồng độ rất thấp có khả năng gây rối loạn sự phát triển và sinh sản của côn trùng, tiêu diệt côn trùng gây hại mà ít hoặc không làm ảnh hưởng đến các sinh vật khác Loại thuốc trừ sâu này bền, thân thiện với môi trường và có tiềm năng phòng chống các loại dịch bệnh gây hại cho nông nghiệp, thay thế các loại thuốc trừ sâu gây độc cho con người và hệ sinh thái như DDT

Quan trọng hơn ecdysteroid còn cho thấy tác động tích cực lên động vật có vú là kích thích sự tổng hợp protein và đang được ứng dụng làm thuốc giúp tăng cơ bắp trên thị trường hiện nay Ngoài ra, nhiều nghiên cứu còn cho thấy ecdysteroid cũng giúp làm giảm lượng cholesterol trong gan, trị đái tháo đường, giúp mau lành vết thương nhỏ, bỏng…[10], [14]

Các Ecdysteroid phổ biến như: α-ecdysone, β-ecdysone, 3-dehydroecdysone; 25-deoxyecdysone nhưng chỉ có 1 dạng có hoạt tính (dạng hoạt động) là β-ecdysone

Một số công thức của ecdysteroid đã được xác định

Hình 1.2 Một số công thức của ecdysteroids [30]

Giới thiệu chung về β-ecdysone

1.2.1

β-ecdysone, được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1966, là một steroid hormone

do động vật chân đốt (côn trùng, nhện, tôm, cua,…) tiết ra, có tác dụng thúc đẩy sự lột xác Nó là một trong những nội tiết tố phổ biến nhất trong các loài động vật chân đốt

Công thức cấu tạo và danh pháp

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của β-ecdysone [30]

Công thức phân tử: C27H44O7.

Khối lượng phân tử: 480 (g/mol)

Danh pháp: 2-beta, 3-beta, 14, 20, 22, 25-Hexahydroxy-5-beta-cholet-7-en-6-one Tên thông thường: β-ecdysone, ecdysterone, 20-hydroxyecdysone, crustecdysone

Tính chất vật lý

1.2.3

β-ecdysone là hợp chất có dạng tinh thể màu trắng

Tan trong MeOH, EtOH, C5H5N

Nhiệt độ nóng chảy: 241-242,50C

Ứng dụng của β-ecdysone

1.2.4

 Trong c ăn nu tằm lấy tơ

Ảnh hưởng của β-ecdysone đã được kiểm tra trên loài tằm Bombyx mori (tằm

tơ) và một số loài tằm nuôi với mục đích thương mại khác Các nghiên cứu cho thấy ecdysone được thêm vào thức ăn với tỷ lệ thích hợp có tác dụng kích thích sự lột xác, đẩy nhanh quá trình trưởng thành của tằm, làm tăng trọng lượng kén tằm, rút ngắn thời gian chăn nuôi tằm tạo kén mà không gây hại hay ảnh hưởng nhiều đến sự phát triển của tằm [18], [13]

β-Trong nuôi trồng thủy hải sản

β-ecdysone được trộn vào thức ăn tươi cho tôm, cua, ghẹ nhằm kích thích tôm, cua, ghẹ lột xác nhanh, mau cứng vỏ Nhiều sản phẩm thức ăn cho tôm, cua, ghẹ được sản xuất trên thị trường có bổ sung thêm β-ecdysone Đặc biệt, ghẹ lột là loại hàng thương phẩm được thị trường trong nước và thế giới ưa chuộng, có giá trị cao về kinh

tế và dinh dưỡng,với hàm lượng canxi và photpho dễ hấp thụ, có tác dụng phục hồi nhanh chóng tình trạng thiếu và mất canxi ở trẻ em và người cao tuổi

Kỹ thuật nuôi ghẹ lột tương đối phức tạp và có nhiều phương pháp, như thay đổi các yếu tố sinh thái (nhiệt độ, độ mặn, chất saponin) hay sử dụng các loại chất kích thích (chitoxan, hormone 20E (20-hydroxyecdyson), chất kích thích lột vỏ molt & grow) Hormone lột vỏ 20E được trộn vào thức ăn tươi cho ghẹ với nồng độ 1 ppm và

so sánh hiệu quả với các phương pháp khác Sau 20 ngày nuôi, tỷ lệ ghẹ lột vỏ đạt 75% Kết quả đạt được cho thấy tỷ lệ sống, tỷ lệ lột vỏ của ghẹ cao và trong thời gian ngắn hơn so với sử dụng các phương pháp thay đổi yếu tố sinh thái, và có hiệu quả tương đương với các chất kích thích khác Do đó, việc sử dụng chất kích thích hormone 20E trong nuôi trồng thủy hải sản giúp tăng năng suất và tiết kiệm thời gian sản xuất, nâng cao hiệu quả và giá trị kinh tế của thủy hải sản trên thị trường trong và ngoài nước [7]

71-Tác dụng ối vớ cơ t ể người

Đối với cơ thể con người, β-ecdysone được cho là không gây độc hại, có khả năng thúc đẩy sự tổng hợp protein, loại bỏ cholesterol, điều chỉnh đường huyết và lipid, ngăn ngừa bệnh tiểu đường, chống rối loạn nhịp tim, chống mệt mỏi, hỗ trợ điều trị viêm khớp dạng thấp

β-ecdysone và các ecdysteroid khác được bán trên thị trường làm thực phẩm chức năng trong thể thao, đặc biệt trong môn thể hình, giúp tăng cường phát triển cơ bắp Tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu khoa học cụ thể nào chỉ ra hiệu quả thực sự đối với cơ thể con người của β-ecdysone và các loại thực phẩm chức năng này [30]

1.3 Giới thiệu sinh lý lột xác của cua

Sinh lý lột xác của cua

1.3.1

Quá trình lột xác của giáp xác nói chung và cua nói riêng do hormone ecdysone

và hormone juvenile kiểm soát Hormone ecdysone do tuyến X ở cuống mắt tiết ra còn juvenile do tuyến Y nằm ở mặt bụng tiết ra Chính tỉ lệ hai loại hormone này trong hệ bạch huyết sẽ quyết định con vật có lột xác hay không

Hormone ecdysone, quan trọng hơn cả là -ecdysone, được sản xuất bởi tuyến

Y có thể đáp ứng cho sự khởi đầu các giai đoạn dẫn tới sự lột xác Nếu cơ quan Y bị loại khỏi cơ thể cua, các con vật sẽ không trải qua bất kỳ sự lột xác nào nữa Bằng chứng về việc hormone ecdysone kiểm soát lột xác được chứng minh bằng việc cấy cơ quan Y vào trong các cua thiếu những cấu trúc này, khi đó chúng có thể hồi phục khả năng lột xác Hoạt động tiết của cơ quan Y không chịu sự kiểm soát của hệ thần kinh

mà được xác định bởi sự hiện diện hay vắng mặt của hormone juvenile do máu mang tới từ tuyến nội tiết cuống mắt (hormone ức chế lột xác, molt-inhibiting hormone, MIH, juvenile hormone, JH) Khi tác động ức chế của JH bị loại, chẳng hạn như cắt bỏ các cuống mắt, sự lột xác của giáp xác xảy ra nhanh chóng

Tuy nhiên, sự lột xác có thể hoàn thiện, nếu các cơ quan Y bị loại sau các giai đoạn D sớm (D0 và D1), như vậy chúng có vai trò quan trọng cho việc khởi đầu của giai đoạn tiền lột xác nhưng lại không quan trọng với các giai đoạn sau

Sự tái sinh các chi đã chứng tỏ tác động của hormone lột xác ở mức độ mô Khi một chân của cua tự gãy, một mầm chân phát triển sau đó Tuy nhiên, “giai đoạn tăng trưởng cơ bản” này bị giới hạn với mức độ tái tổ chức và phát triển ban đầu của các mô mới, và khi giai đoạn này hoàn tất, sự tăng trưởng ngừng Mầm chi không gia tăng kích thước hơn nữa sau giai đoạn này hoặc là các cuống mắt của con vật bị loại để kích thích cơ quan Y giải phóng hormone, biến đổi cơ thể cua một cách tự nhiên dẫn đến giai đoạn tiền lột xác Sau đó mầm chi bắt đầu gia tăng về kích thước khi con vật lột xác

Hormone cơ quan Y là cần thiết cho các giai đoạn khởi đầu của sự thành thục tuyến sinh dục cũng như sự phát triển của mầm chi, ít nhất nó cũng được đòi hỏi cho sự phân chia tế bào

Rất ít hormone được dự trữ trong cơ quan Y ở giai đoạn intermoult nhưng lại hiện diện nhiều trong máu Trong phần lớn giáp xác có cuống mắt, tuyến nội tiết cuống mắt (tuyến xoang) nằm ở khoảng 2/3 của đường dọc theo cuống mắt và nằm trên mặt lưng của hạch thị giác Đó là nơi dự trữ và giải phóng hormone được tạo thành dọc theo các trục thần kinh tới tuyến xoang với tốc độ vài mm mỗi ngày

Các hormone được giải phóng bởi tuyến cuống mắt có thể có các vai trò sau: ức chế lột xác; kiểm soát trao đổi glucid; kiểm soát cường độ trao đổi chất; ức chế sự phát triển tuyến sinh dục; kiểm soát sự phân bố sắc tố; kiểm soát sự trao đổi protein; kiểm soát trao đổi chất nước và kiểm soát nhịp tim

Rõ ràng sự khởi đầu đáp ứng của hormone đến từ cơ quan X, khi loại bỏ cơ quan một X sẽ thúc đẩy sự hoạt động của cơ quan Y và đẩy nhanh sự lột xác một cách không bình thường, và không quá nhanh khi loại bỏ cả hai cơ quan X và tuyến xoang Việc cấy lại phức hợp tuyến xoang và cơ quan X vào những con cua thiếu cuống mắt làm chậm sự lột sớm trên con vật Các tế bào ở cơ quan X ngừng tiết 4 - 5 ngày trước

sự lột xác bình thường ở cua và bắt đầu hoạt động lại vài ngày sau khi lột xác

Ở ấu trùng Decapod, tuyến xoang được thành lập khá trễ trong sự phát triển (giai đoạn ấu trùng thứ 5 ở Palaemonetes) Do chưa có tuyến xoang nên ấu trùng trải qua các lần lột xác liên tiếp một cách nhanh chóng mà không trải qua giai đoạn intermoult Việc cắt cuống mắt không ảnh hưởng đến cường độ lột xác Kết quả này cho thấy rằng các loài thuộc hình thức lột xác thường xuyên (diecdycis) có thể cũng có các cơ quan X không hoạt động, cho phép chúng trải qua nhanh chóng từ lần lột xác này đến lần lột xác kế tiếp, còn các hình thức lột xác theo mùa, năm (anecdycis) thì ngược lại, cơ quan X hoạt động theo mùa, năm [8]

ặc ểm quá trình lột xác của cua

1.3.2

Quá trình lột xác của cua trải qua 4 giai đoạn chính:

Giai đoạn A: xảy ra ngay sau lột xác và cua không ăn, chia thành hai giai đoạn phụ A1 và A2

A1: vỏ quá mềm nên con vật không thể tự đứng trên những chân, khối lượng cơ thể đang gia tăng vì nước được hấp thu vào cơ thể

A2: sự khoáng vỏ bắt đầu và con vật có thể đứng nhưng vỏ vẫn còn mềm Khối lượng đã ổn định Hàm lượng nước trong cơ thể là 86%

Giai đoạn B: là giai đoạn chính của sự khoáng hóa vỏ mới cua vẫn chưa ăn, chia thành hai giai đoạn phụ là B1 và B2

B1: sự tiết lớp vỏ trong đã bắt đầu, các đốt đùi và đốt bàn có thể uốn cong mà không bị gãy Hàm lượng nước 85%

B2: sự tiết lớp vỏ trong tiếp tục, các đốt đùi trước, đốt bàn sẽ bị nứt khi bị uốn cong Hàm lượng nước 83%

Giai đoạn C: vỏ cua đã cứng nhưng sự canxi hóa vỏ vẫn tiếp tục ở những giai đoạn đầu của giai đoạn C, cua bắt đầu ăn tiếp tục trở lại và được chia thành bốn giai đoạn phụ là C1, C2, C3, C4

- C1: thời kì chính của sự sinh trưởng các mô, các mặt phía trong của chân còn đàn hồi khi bị n n Hàm lượng nước chiếm 80%

- C2: sự phát triển các mô đang được tiếp tục, vỏ chân vẫn còn đàn hồi khi nén nhẹ nhưng sẽ bị nứt khi bị nén quá mạnh Hàm lượng nước chiếm 76%

- C3: vỏ đã cứng nhưng sự canxi hóa vẫn chưa hoàn tất phần bên và phần trước mai Hàm lượng nước chiếm 68%

- C4: (intermoult): sự canxi hóa đã hoàn tất và lớp màng đã được tiết ngay dưới vùng đã được canxi hóa Các vật chất dự trữ trong quá trình trao đổi chất đang được tích lũy Sự tăng trưởng mô đã hoàn tất Hàm lượng nước 60% Có thể là giai đoạn ngừng lột xác vĩnh viễn (là giai đoạn kết thúc sinh trưởng của một loài nào đó)

Giai đoạn D: là quá trình chuẩn bị cho sự lột xác tiếp theo, sự tái hấp thu canxi xảy ra và các lớp ngoài của vỏ mới đang được tiết ra, và được chia thành bốn giai đoạn phụ là D1, D2, D3, D4

D1: dấu hiệu đầu tiên của việc báo hiệu lột xác đó là sự xuất hiện của gai mới trong gốc của những gai cũ Lớp vỏ ngoài được tiết bởi những tế bào biểu bì dưới vỏ

D2: là lớp vỏ giữa (lớp sắc tố được tiết)

D3: sự tái hấp thu canxi xảy ra đều khắp từ vỏ cũ và điều này gây ra sự nứt ở một số nơi, sự nứt này tạo khe cửa vỡ cho giáp xác lột xác

D4: sự tái hấp thu canxi dọc theo các đường nứt đã hoàn tất, kết quả là tạo khe cửa vỏ nhờ đó con vật có thể thoát ra ngoài, sự hấp thu nước bắt đầu [8]

Giai đoạn E: giai đoạn cua đã thoát ra khỏi vỏ cũ và hấp thu nước nhanh chóng, gồm bốn giai đoạn phụ là:

- Giai đoạn tiền lột xác từ D1 – D4

- Giai đoạn hậu lột xác từ A1 – C3

- Giai đoạn gian lột xác là C4

và divinyl benzen do hãng Misubishi (Nhật) sản xuất Diaion có 4 loại chính gồm Diaion HP-10, HP-20, HP-30, HP-40, trong đó thông dụng nhất là HP-20

Diaion HP-20 ở dạng hạt nhẹ xốp, diện tích bề mặt khoảng 600 m2/g, đường

kính xoang trung bình khoảng 400Ao Diaion HP-20 không tan trong nước và cũng không tan trong các dung môi hữu cơ [1, 4, 29]

Chất mang sử dụng trong pha tĩnh là chất trơ đối với các chất cần tách Chất mang có phủ pha tĩnh (lỏng) được nhồi vào cột như trong sắc ký hấp phụ Cột cũng tương tự Chất mang phải hấp phụ và lưu giữ pha tĩnh lỏng và phải có diện tích bề mặt rộng Nó phải bền cơ và dễ dàng nhồi vào cột khi được phủ pha tĩnh lỏng và không cản trở dòng chảy pha động

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Nội dung nghiên cứu

- Chiết tách, tinh sạch β-ecdysone từ cao lá thông đỏ Nghiên cứu quy trình chiết xuất

cao giàu ecdysteroid và chiết 500 g cao ecdysteroid bán thành phẩm ở quy mô pilot

- Nghiên cứu phối trộn chế phẩm chứa ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm cao trung gian và chế phẩm thức ăn cho

giảm áp, làm mẫu cao nghiên cứu, được cung cấp bởi Trung Tâm Sâm và Dược Liệu

Tp Hồ Chí Minh Nguồn gốc thông đỏ trồng ở Lâm Đồng do trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt cung cấp

Hóa chất

2.2.2

- Methanol (Merck)

- β-ecdysone chuẩn (Sigma aldrich)

- Dichloromethane (Trung Quốc)

- Sulfuric acid (Trung Quốc)

Thiết bị

2.2.3

 Tủ sấy KC-65, tủ sấy chân không VWRS/P

 Cân phân tích Meltler Toledo AB- 204

 Đèn soi UV-VIS DESAGA SARTEDT GRUPPE

 Máy cô quay BUCHI R-114

 Máy siêu âm Elma LC 60H (Đức)

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu Detector UV-Vis PDA, cột HiQ sil C18HS (Size: 4,6 mm x 250 mm)

2.3 Quy trình thực hiện

Chiết tách, tinh sạc β-ecdysone từ cao methanol

2.3.1

Từ 200 gam cao MeOH thông đỏ ban đầu, được chạy qua sắc ký cột diaion

HP-20 để tập trung phân đoạn chứa ecdysteroid Tập trung phân đoạn giàu ecdysteroid, cô quay giảm áp đến cao đặc Tiếp tục cho cao phân đoạn chứa ecdysteroid chạy qua cột silicagel pha thuận với hệ dung môi giải ly DCM - MeOH Thu các phân đoạn, chấm đối chiếu với chất chuẩn β-ecdysone để tìm ra phân đoạn giàu β-ecdysone Tập trung

và tinh chế phân đoạn giàu β-ecdysone để thu được β-ecdysone tinh sạch

2.3.1.1 Sắc ký phân bố - cột diaion HP-20

Quá trình sắc ký được tiến hành trong bình chiết ngấm kiệt loại 5 lít (Cột A)

Cân 1 kg hạt diaion HP-20 được sử dụng để nạp vào bình, sử dụng nước cất rửa

qua hai lần, xả hết nước Cân 200 gam cao (MeOH) thông đỏ được hòa tan hoàn toàn trong methanol, cho vào bình chứa diaion HP-20 ngâm trong 48 h cho hạt hấp phụ mẫu Tiến hành sắc ký lần lượt bằng H2O - ethanol với các nồng độ ethanol tăng dần (0, 20%, 40%, 60%) Ở mỗi phân đoạn thu đến khi nhạt màu Các phân đoạn thu được chấm trên SKLM với chất chuẩn β-ecdysone tìm ra phân đoạn chứa ecdysone Thuốc thử hiện hình vết là H2SO4 10% trong cồn sấy ở 105oC 5 phút và soi dưới UV 366 nm

Hình 2.1 Quy trình tiến hành sắc ký phân bố cột A

Phân đoạn chứa ecdysone được tập trung, cô giảm áp thu cao để tiếp tục chạy cột silica gel

2.3.1.2 Sắc ký hấp phụ cột silica gel

Chuẩn bị mẫu: Phần cắn thu được sau khi chạy qua cột Diaion HP-20 được hòa

tan với một lượng tối thiểu methanol Sau đó bổ xung thêm một lượng silica gel có

khối lượng bằng với khối lượng cắn, trộn đều đến khô hoàn toàn mới nạp mẫu

Chuẩn bị cột: Cân một lượng silica gel gấp 45 lần khối lượng mẫu Thêm một

lượng dung môi DCM bằng lượng silica gel, hòa thành hỗn dịch, trộn đều và tiến hành nạp cột Sau khi nạp để ổn định cột 48 giờ rồi nạp mẫu và tiến hành sắc ký với hệ pha động là DCM - MeOH, tỉ lệ lần lượt là 100 : 0, 95 : 5, 90 : 10, 85 : 15 Thu phân đoạn các dịch lần lượt ra khỏi cột Chấm SKLM các phân đoạn với ecdysone chuẩn để theo dõi quá trình chạy sắc ký Thuốc thử hiện hình vết là H2SO4 10% trong cồn và soi dưới

Ngâm 48 h Sắc ký bằng H 2 O - EtOH (0%, 20%, 40%, 60% ethanol)

200 gam cao thông đỏ

Cột A

1 kg diaion HP-20

SKLM Phân đoạn chứa ecdysone

đèn UV 366 nm Gộp các lọ có kết quả sắc ký đồ giống nhau Quá trình sắc ký dừng lại khi đã thu được tất cả ecdysone trong cột

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình sắc ký hấp phụ cột B

Cắn chứa ecdysone Silica gel pha thuận

Thêm 1 lượng DCM (1: 1)

Nhồi cột

Cột B

Để ổn định 48 h

Hòa tan bằng MeOH

Thêm silica gel tỉ lệ (1:1)

Nghiên cứu quy trình chiết xuất ecdysteroid và chiết 500g cao ecdysteroid bán

2.3.2

thành phẩm ở quy mô pilot

Hai phương pháp được đề xuất để thu nhận cao giàu ecdysteroid là chạy cột diaion HP-20 và lắc phân bố với ethyl acetate Từ đó sẽ chiết xuất 500 g cao thông đỏ chứa ecdysteroid để nghiên cứu phối trộn thức ăn kích thích lột xác cho cua

2.3.2.1 Sắc ký phân bố - cột diaion HP-20

Quá trình sắc ký được tiến hành trong bình chiết ngấm kiệt loại 5 lít Cân 100 gam hạt nhựa diaion HP-20 sạch, thêm 500 ml Acetone, tạo thành hỗn dịch và nạp cột Cân khoảng 15 gam cao (MeOH) thông đỏ được bổ sung thêm 15 ml methanol hòa tan hoàn toàn, cho vào bình chứa diaion HP-20 ngâm trong 48 giờ cho hạt hấp phụ mẫu Tiến hành sắc ký lần lượt bằng H2O - ethanol với các nồng độ ethanol tăng dần (0, 20%, 40%, 60%) Ở mỗi phân đoạn thu dịch đến khi nhạt màu Các phân đoạn thu được chấm trên SKLM với chất chuẩn tìm ra phân đoạn chứa ecdysone Thuốc thử hiện hình vết là H2SO4 10% trong cồn sấy ở 105oC 5 phút và soi dưới UV 366 nm

Hình 2.3 Quy trình tiến hành sắc ký phân bố

Rửa hai lần bằng nước Hòa tan với15 ml MeOH

Ngâm 48 h Sắc ký bằng H 2 O - EtOH (0%, 20%, 40%, 60% ethanol)

15 g Cao thông đỏ

Cột Diaion HP-20

100 g diaion HP- 20

SKLM

Phân đoạn chứa ecdysone

2.3.2.2 Lắc phân bố t u p ân oạn

Cân khoảng 15 gam cao (MeOH) thông đỏ, hòa tan trong 60 ml nước cất Lắc phân bố với n_hexane đến hết màu Loại bỏ dịch n_hexane, tập trung dịch nước tiếp tục lắc phân bố với ethyl acetate, mỗi lần lắc 50 ml, thu phần ethyl acetate Thêm vào phần dịch ethyl acetate một lượng Na2SO4 (tỉ lệ 2 g Na2SO4/500 ml dung dịch) ngâm trong 30 phút Lọc lấy phần dịch mang cô quay chân không tới cao và ghi nhận khối lượng

Hình 2.4 Quy trình lắc phân đoạn với ethyl acetate

2.3.2.3 Xác ịnh sự hiện diện của ecdysone bằng sắc ký lớp mỏng

- Các cao phân đoạn được tiến hành so sánh với β-ecdysone chuẩn bằng SKLM

Lắc phân bố với n_hexane

Lắc phân bố với ethyl acetate

Hấp phụ nước lẫn bằng Na 2 SO 4

Cô quay chân không ở 50 o C

Cao chứa ecdysone ,hòa nước

Dịch nước chứa ecdysone

Dịch EtOAc lẫn nước + ecdysone

Cao EtOAc

Dịch nước

Dịch ethyl acetate chứa ecdysone

- Hiện phát quang ở UV bước sóng 366 nm

- Hiển thị màu với H2SO4 10% trong cồn và sấy ở 105oC trong 5 phút

2.3.2.4 Xây dựng quy trìn ịnh lượng β-ecdysone

Chuẩn bị mẫu, dung m p a ộng

Mẫu thử: được tách chiết bằng phương pháp thích hợp, thu nhận cao và pha loãng với MeOH với hàm lượng thích hợp, lọc qua màng 0,22 µm

Dung môi pha động: MeOH, nước cất 2 lần được lọc qua màng 0,22 µm

Mẫu chuẩn: Pha loãng dung dịch gốc thành các nồng độ khác nhau, dán nhãn và bảo quản lạnh Khi tiến hành sắc ký, để chuẩn về nhiệt độ phòng, lắc đều, lọc qua màng 0,22 µm và bơm vào máy HPLC với điều kiện sắc ký đã được tối ưu

Quy trình định lượng β-ecdysone trong cao Thông đỏ bằng phương pháp HPLC được thực hiện trong điều kiện:

 Pha động: MeOH - nước tỷ lệ 40 : 60 (v : v)

 Pha tĩnh: Cột HiQ sil C18HS (Size: 4,6 mm x 250 mm)

 Detector UV-Vis PDA, bước sóng: 244 nm

a) ộ ặc hiệu và chọn lọc của p ương p áp

Phân tích các mẫu thử cao EtOAc (chiết từ cây thông đỏ), mẫu cao EtOAc thêm chuẩn và mẫu chuẩn β-ecdysone theo quy trình đã được xây dựng Ghi nhận và so sánh

sự xuất hiện peak trên sắc ký đồ của các mẫu thu được dựa trên các thông số như thời gian lưu, hệ số bất đối xứng As và độ hấp thu bước sóng UV cực đại

a) ường chuẩn và khoảng tuyến tính

Pha các mẫu chứa chuẩn β-ecdysone có nồng độ từ 5 μg/ml – 150 μg/ml Phân tích theo quy trình đã xây dựng Xác định sự tương quan giữa nồng độ và diện tích

đỉnh β-ecdysone thu được bằng phương pháp hồi quy tuyến tính

b) ộ úng và ộ lặp lại của p ương p áp

Tiến hành thẩm định độ đúng, độ lặp lại với 3 mẫu thử khác nhau Lần lượt cho thêm vào mỗi mẫu thử một lượng chất chuẩn β-ecdysone có tỷ lệ 80%, 100%, 120% so với hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu thử Thực hiện phân tích các mẫu thử trên, mỗi nồng độ ứng với 3 lần lặp lại trên cùng điều kiện Độ đúng của phương pháp được xác định bằng tỷ lệ % độ phục hồi của lượng chất chuẩn đã thêm vào mẫu thử Độ lặp lại được xác định dựa vào độ lệch chuẩn (RSD) của độ phục hồi giữa các lần lặp lại trên các mẫu thử, độ lệch chuẩn RSD thường ≤ 2%

2.3.2.6 ịn lượng β-ecdysone trong cây t ng ỏ

Từ cao thông đỏ, sau quá trình chiết (chạy diaion HP-20 và lắc phân đoạn) thu được phân đoạn 40 và dịch chiết EtOAc mang cô thành cao, hòa tan bằng MeOH định mức 10 ml Lọc qua màng 0,22 µm tiến hành phân tích theo phương pháp đã được xây dựng với ba lần lặp lại, xác định nồng độ β-ecdysone dựa vào phương trình đường chuẩn đã được xây dựng Hàm lượng β-ecdysone có trong cây thông đỏ được xác định theo tỷ lệ % giữa khối lượng β-ecdysone xác định từ mẫu thử với khối lượng khô của nguyên liệu từ cây thông đỏ

Nghiên cứu phối trộn chế phẩm chứa ecdysteroid bổ sung vào thức ăn c o cua

2.3.3

2.3.3.1 Khảo sát các phụ gia phối trộn

Thức ăn cho cua ngoài hoạt chất, còn có thể có các phụ gia khác hỗ trợ dẫn cho hoạt chất và nhiều mục đích khác như: điều hương, độn, chống oxi hóa, hút nước, màu…

Việc chọn lựa các phụ gia phụ thuộc nhiều vào đặc điểm hóa lý của hoạt chất, cách thức sử dụng… đối với bột bổ sung vào thức ăn trong thủy sản, bột thành phẩm chứa ecdysteroid được tiến hành như sau:

Cao ecdysteroid được hòa tan lại trong cồn EtOH và phối trộn với các loại phụ gia trên, bổ sung vào thức ăn chứa 45% đạm, xát hạt, sấy khô Khảo sát các lượng phụ gia phối trộn khác nhau và đánh giá tính chất hóa, lý của bột thành phẩm dựa trên các tiêu chí [theo Dược điển Việt Nam V (DĐVN)]:

1

2.3.3.2 án g á tín c ất hóa lý của bột thành phẩm

 Bột tơi, không bị ẩm, vón, màu sắc đồng nhất

 Độ ẩm bột: thường không quá 12%

Cách tiến hành:

Ch n cân được sấy ở 105oC đến khối lượng không đổi và cân bì, cân 1 g nguyên liệu vào một ch n cân, đem sấy ở 105oC trong tủ sấy dưới áp suất thường đến khối lượng không đổi (chênh lệch giữa 2 lần cân không quá 0,5 mg)

Độ ẩm nguyên liệu được tính theo công thức:

100

a

b a H

Trong đó:

 a: Khối lượng nguyên liệu trước khi sấy (g)

 b: Khối lượng nguyên liệu sau khi sấy (g)

 H%: Độ ẩm (kl/kl)

 Độ mịn: bột được thử độ mịn theo quy định của Dược điển Việt Nam V

 Độ đồng đều hàm lượng: kiểm tra hàm lượng β-ecdysone trong thành phẩm bằng HPLC

- Dựa trên các chỉ tiêu yêu cầu cho cao chiết và bột thuốc trong DĐVN V quy

định Tiến hành kiểm tra và đưa ra bảng tiêu chuẩn cho kiểm nghiệm cao

ecdysteroid và bột thành phẩm ecdysteroid:

- Độ ẩm: xác định bằng phương pháp mất khối lượng do sấy khô

- Độ mịn: rây bột thuốc qua các rây có kích thước lỗ khác nhau, đánh giá kích

thước các tiểu phân qua rây theo quy định của DĐVN

- Định tính: thăm dò và đưa ra pha động thích hợp để định tính ecdysteroid bằng

mỗi lỗ 8 – 10 mm cho nước luân chuyển Ngoài ra, cần làm thêm hệ thống mái che, hệ thống cung cấp oxy, máy quạt nước để đảm bảo nuôi trường tốt cho cua phát triển

Thí nghiệm được thực hiện tại ao nuôi cua của hộ dân tại huyện Cần Giờ Thí nghiệm bao gồm các nghiệm thức:

Nghiệm thức 1: Thức ăn viên nhân tạo 45% đạm, không bổ sung chế phẩm chứa ecdysteroid

Nghiệm thức 2: Thức ăn viên nhân tạo 45% đạm, nồng độ ecdysteroid là 1 ppm Nghiệm thức 3: Thức ăn viên nhân tạo 45% đạm, nồng độ ecdysteroid là 5 ppm Nghiệm thức 4: Thức ăn viên nhân tạo 45% đạm, nồng độ ecdysteroid là 10 ppm

Bảng 2.2 Kích thước cua và thức ăn bổ sung cho cua

Thức ăn viên nhân tạo 45% đạm

0

Hệ thống nuôi thử nghiệm bao gồm bể composite thể tích 500 lít, hình tròn và

hệ thống các bể dự trữ nước nuôi cùng độ mặn, đảm bảo lượng nước ổn định xuyên suốt quá trình nuôi, thay và cấp nước Tất cả các bể nuôi đều được lắp hệ thống sục khí nhằm duy trì hàm lượng oxy hòa tan (DO) luôn đạt mức ≥ 4,0 mg/lít Nước nuôi cua có

độ mặn từ 15-18‰, pha từ nước biển vùng Vũng Tàu và nước ngọt thủy cục Cua dùng cho thí nghiệm gồm 200 con cua khỏe mạnh, chân càng còn nguyên, trọng lượng ban đầu 40 - 50 g/con được đặt mua từ trại giống Chị Xoàn - Cà Mau Cua được thuần dưỡng trong thời gian một tuần để làm quen với môi trường trước khi đưa vào nuôi thử nghiệm chính thức Tiến hành thí nghiệm, cua (42 ± 2,0 g/con) được lựa chọn ngẫu

nhiên, chuyển vào các giỏ có gắn nắp (1 con/giỏ) sau đó chuyển vào các bể nuôi với mật độ 10 con/bể 250 lít nước

Cho cua ăn mỗi ngày 02 lần vào lúc 8:00 giờ sáng và 5:00 giờ chiều với lượng thức ăn ≤ 5% trọng lượng thân, theo dõi kiểm tra thường xuyên thức ăn trong các giỏ

để điều chỉnh lượng thức ăn phù hợp cho lần ăn tiếp theo Cá tạp được lấy mẫu đem phơi khô nhằm xác định hệ số quy đổi trọng lượng tươi – khô Nghiệm thức sử dụng cá tạp, cua được cho ăn theo trọng lượng quy khô tương ứng với các nghiệm thức sử dụng thức ăn viên Trong suốt thời gian nuôi thí nghiệm, các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, oxy hoà tan được theo dõi hàng ngày (sáng 7 giờ, chiều 4 giờ) bằng nhiệt kế, máy đo pH và oxy hòa tan; độ mặn được theo dõi 1 tuần/lần bằng máy đo độ mặn; nitơ ammonia (N-NH4) được đo 01 lần/tuần bằng test kit để theo dõi và cấp bổ sung hoặc thay nước mới đảm bảo môi trường thích hợp cho cua nuôi

Ghi nhận lượng thức ăn thừa hàng ngày và số cua chết trong thời gian 7 tuần thí nghiệm Trong giai đoạn cua lột, quan sát cua 4 giờ/lần, sau khi cua lột vỏ thì thu cua lột và đem cân đo Các số liệu ghi nhận bao gồm tỷ lệ tăng trưởng, tỷ lệ sống,

tỷ lệ lột vỏ cả chu kỳ nuôi, tỷ lệ lột vỏ trong ngày và thời gian lột được tính trên chương trình Excel Phân tích thống kê bằng phương pháp ANOVA theo sau là ph p thử DUNCAN ở mức ý nghĩa 0,05 bằng phần mềm thống kê SPSS 18.0

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Chiết tách, tinh sạch β-ecdysone từ cao tổng

Chạy cột sắc ký phân bố

3.1.1

a Các số liệu thu được: Với 200 gam cao MeOH thông đỏ chạy cột diaion HP –

20 ta thu được

Phân đoạn 20% ethanol sau khi chạy thu được 4 lít dung dịch

Phân đoạn 40% ethanol sau khi chạy thu được 5,2 lít dung dịch

Phân đoạn 60% ethanol sau khi chạy thu được 2 lít dung dịch

b Kết quả hình ảnh

Hình 3.1 SKLM các phân đoạn cột A Hệ dung môi DCM - MeOH (80 : 20)

Từ kết quả trên ta thấy chỉ có phân đoạn 40% ethanol có vết trùng với ecdysone chuẩn Vì vậy phân đoạn này sẽ được tiếp tục sử dụng để tách chiết ecdysone Tập trung phân đoạn 40% ethanol, cô quay chân không, cân xác định khối lượng ta được 10,4836 g cao Tiếp tục chạy qua cột silica gel để thu β-ecdysone

Phun H 2 SO 4 10%

sấy 105OC 5 phút

Soi dưới đèn UV

366 nm

Sắc ký hấp phụ cột silica gel

3.1.2

3.1.2.1 Chạy cột silica gel 1(cột B1)

Chạy bằng hệ pha động là DCM - MeOH, tỉ lệ lần lượt là 100: 0, 95: 5, 90: 10, 85: 15 Chấm SKLM theo dõi quá trình giải ly và tập hợp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau

a.Các thông số kết quả

 Kích thước cột B1: đường kính 4 cm x cao 80 cm

 Lượng Silical gel nạp vào cột 450 g gấp 45 lần mẫu

 Tốc độ dòng chảy 60 giọt/ phút

 Thể tích thu một phân đoạn 100 ml

Tổng số 80 phân đoạn Tập trung các lọ phân đoạn giống nhau thành 7 phân đoạn chính