TỔNG QUAN
Dẫn truyền thuốc
1.1.1 Khái niệm về dẫn truyền thuốc
Dẫn truyền thuốc là một phương pháp hay còn được gọi là một quá trình đưa hoạt chất vào cơ thể nhằm đạt được hiệu quả điều trị tại một điểm cụ thể [1] Đây là một lĩnh vực nghiên cứu về một số vật liệu mới hoặc hệ thống chất mang để tăng tính hiệu quả và giảm tác dụng phụ của thuốc nhờ vào việc đưa hoạt chất đúng vị trí, đúng thời điểm và đúng liều lượng [1] Điều này đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị một số bệnh, ví dụ như tiểu đường, ung thư [2]
Lĩnh vực này được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1952 khi Smith Klein Beecham giới thiệu hệ dẫn truyền đầu tiên có khả năng kiểm soát quá trình giải phóng thuốc Dexedrine® Sản phẩm này bao gồm các hạt dạng macro được phủ một lớp hỗn hợp glyceryl monostearate và sáp ong có độ dày khác nhau để kiểm soát sự hòa tan và đạt được hiệu quả giải phóng hoạt chất trong 12 giờ [3] Công nghệ này, được gọi là công nghệ Spansule, cho phép kiểm soát quá trình giải phóng thuốc Thập niên 70 – 80, các nhà khoa học tập trung vào các công trình nghiên cứu về polymer phân hủy sinh học ứng dụng trong dẫn truyền thuốc Vào những năm
1970, Don Cowser và Danny Lewis hợp tác với các nhà nghiên cứu tại Đại học Alabama ở Birmingham đã phát triển và thử nghiệm lâm sàng steroid - nạp vi hạt PLGA để tải thuốc tránh thai [4] Vào cuối những năm 1970, Lynda Saunders và John Kent tại Syntex đã được cấp bằng sáng chế về nghiên cứu ứng dụng các vi hạt PLGA cho việc giải phóng leutinizing hormone-releasing hormone (LHRH) [5]
Năm 1971, Alza đã đưa ra định nghĩa về các thành phần chính của hệ thống dẫn truyền thuốc Các sản phẩm dẫn truyền thuốc có kiểm soát đầu tiên được thiết kế ở dạng macro với lượng thuốc ban đầu có nồng độ không đổi được bao bọc trong các màng kiểm soát tốc độ giải phóng làm bằng polymer, chẳng hạn như Silastic hoặc poly(ethylene-co-vinyl acetate) [6] Các hệ dẫn truyền thuốc thế hệ đầu tiên này đã ứng dụng các cơ chế giải phóng thuốc khác nhau, bao gồm các cơ chế hòa
3 tan, khuếch tán, thẩm thấu và trao đổi ion [3] Vào cuối những năm 1980 và đầu những năm 1990, các hệ dẫn truyền nanoparticle, bao gồm các hạt micelle polyme PEGylated và liposome được nghiên cứu rộng rãi Năm 1989, Alexander Kabanov ở Nebraska đã phát triển hệ micelle PEGylated chứa thuốc dựa trên các copolymer ba khối PEO-PPO-PEO được gọi là Pluronics [7] Năm 1995, Martin Woodle và Frank Martin đã phát triển liposome-doxorubicin PEGylated có tên Doxil® đã được FDA chấp thuận cho sử dụng lâm sàng [8]
Hiện nay, trên thế giới vẫn đang nghiên cứu về các hệ dẫn truyền thuốc điển hình như copolymer nhạy nhiệt poly(ethylene glycol)-poly(lactic-co-glycolic acid) biến tính acid folic (FA-PEG-PLGA) để tải đồng thời cisplatin và paclitaxel mà có thể tương tác đặc hiệu với thụ thể trên tế bào ung thư (2015) [9] Jin và cộng sự công bố hệ nanocapsule mang paclitacel kết hợp liagand là peptide iRGD tăng cường xuyên thấm màng tế bào ung thư (2016) [10] Onpattro (patisiran) được phát triển bởi Công ty dược phẩm Alnylam dưới dạng hạt nano lipid dẫn truyền thuốc, trở thành loại thuốc RNAi (RNA interference) đầu tiên được FDA chấp thuận vào năm 2018 [11] Faisal Raza và cộng sự đã tổng hợp thành công hệ peptide hydrogel FER-8 nhạy pH load paclitaxel để nhắm trực tiếp lên tế bào ung thư (2019) [12]
1.1.2 Những ưu điểm và những mặt hạn chế của hệ dẫn truyền
Với các phương pháp dẫn truyền thuốc truyền thống như uống và tiêm, việc đưa thuốc vào cơ thể thường đối mặt với việc thuốc đi vào tuần hoàn máu và được phân phối toàn thân Điều đó dẫn đến những tác dụng phụ không mong muốn do thuốc được phân phối khắp cơ thể hoặc không đạt được liều lượng chữa bệnh vì chỉ một phần nhỏ thuốc đến cơ quan cần điều trị, bên cạnh đó thuốc có để bị lichuyển hóa ở gan dẫn đến giảm khả năng điều trị [13] Để giải quyết được những vấn đề nêu trên, năm 1952 các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu hệ dẫn truyền thuốc nhằm mục đích duy trì liên tục nồng độ thuốc ở phạm vi điều trị (mô hoặc tế bào) giúp tăng hiệu quả điều trị Việc đưa hoạt chất tới
“đúng chỗ” góp phần giảm tác dụng phụ của thuốc với cơ thể Hệ dẫn truyền thuốc
4 cũng giúp bảo vệ những hoạt chất có thời gian bán hủy ngắn như peptide và protein [14]
Cho đến nay mặc dù đã phần nào thực hiện được mục tiêu ban đầu đặt ra, tuy nhiên vẫn có một số lưu ý khi nghiên cứu vật liệu dẫn truyền thuốc như: độc tính của nguyên liệu và sản phẩm chuyển hóa của nó sau khi đưa vào cơ thể; những phản ứng của hệ thống miễn dịch đối với hệ gây nên sự phân hủy và khả năng nhắm đích của hệ thống Tốc độ giải phóng thuốc, độ bền hệ thống chất mang, tránh trường hợp giải phóng thuốc quá nhanh trong thời gian ngắn Sự khó chịu và bất tiện gây ra bởi hệ dẫn truyền thuốc Chi phí, độ khó khăn khi thực hiện và lưu trữ, khả năng sản xuất ở quy mô lớn [15]
1.1.3 Một số hệ dẫn truyền thuốc tiêu biểu
Hiện nay, các nghiên cứu trong việc dẫn truyền thuốc đã có sự phát triển rõ rệt và tập trung vào một số hệ dẫn truyền tiêu biểu sau: a) Liposome Được nghiên cứu từ những năm 1963 (Bangham) và trở nên phổ biến vào những năm 2000 (Manosroi) Liposome là một túi hình cầu có ít nhất một lớp lipid kép (gồm 2 phân tử phospholipid với đuôi kị nước hướng vào nhau) bao bọc hoạt chất hoặc hoạt chất được phân tán vào lớp lipid kép Liposome được tập trung nghiên cứu nhằm để kiểm soát được quá trình giải phóng thuốc vào đúng vị trí bệnh [16, 17]
Hình 1.1 Cấu trúc của liposome [18]
Do có thành phần chính là phospholipid và cholesterol nên liposome có khả năng tương thích sinh học, chuyển hóa trong cơ thể và có tiềm năng trong việc ứng dụng làm chất mang thuốc [19] Tùy thuộc vào tính ưa dầu hay ưa nước của dược chất cũng như tương tác hóa lý mà dược chất có thể phân bố trong lõi của liposome hoặc phân bố giữa lớp phospholipid, gắn với đầu không phân cực hoặc hấp phụ trên bề mặt của liposome [20] Ưu điểm của liposome là khả năng tương thích sinh học cao, chuyển hóa dễ trong cơ thể con người Liposome đã được thử nghiệm lâm sàng trong chữa ung thư (Rahman 1990, Janoff 1992), kháng khuẩn và dùng làm chất bổ trợ trong các vaccine [21] Liposome có khả năng bảo vệ thuốc khỏi quá trình đào thải của cơ thể, đưa thuốc đến vị trí cần tác động và giảm độc tính của thuốc đối với cơ thể Tuy nhiên, liposome có những hạn chế nhất định, đó là lượng thuốc mang được thấp, sự giải phóng mất kiểm soát của các loại thuốc thân nước khi có mặt các thành phần máu và độ ổn định lưu trữ kém [22] b) Nanogel
Nanogel được định nghĩa là các hạt hydrogel có kích thước nano được hình thành bởi các mạng polymer (liên kết bằng tương tác vật lý hay hóa học) và không
6 gian bên trong nó, do đó có được tính chất của cả hydrogel và nano [23] Kích thước hạt nanogel khoảng từ 20 - 200 nm có thể thay đổi để tránh quá trình thực bào, cho phép dẫn truyền theo hướng chủ động và thụ động
Hình 1.2 Cấu trúc của Nanogel [23]
Lượng thuốc tải được tương đối cao mà không cần phản ứng hóa học do đó không làm thay đổi hoạt tính của thuốc [24] Tuy nhiên, việc đạt được kích thước nano và giữ cho hệ nano ổn định cùng với việc các chất hoạt động bề mặt hay các monomer ban đầu còn dư lại sau quá trình tổng hợp có nguy cơ gây độc cho cơ thể là mặt hạn chế của hệ dẫn truyền này [25] c) Polymer
Hiện nay, các vật liệu polymer đã được nghiên cứu và phát triển các ứng dụng y sinh Các polymer, dù là tổng hợp (ví dụ như polylactide-co-glycolide hoặc PLG) hoặc có nguồn gốc tự nhiên (ví dụ alginate, chitosan, v.v.), đều có khả năng bao bọc các phân tử sinh học và dược chất, mang lại lợi thế trong việc điều trị như giải phóng thuốc có kiểm soát, giảm độc tính và bảo vệ thuốc khỏi sự chuyển hóa và mất hoạt tính [26]
Hoạt chất được tải vào bên trong của một polymer sau đó được cấy hoặc tiêm vào cơ thể Các nghiên cứu ban đầu của các hệ dẫn truyền này là các polymer không phân hủy, có thể giải phóng thuốc ưa dầu có phân tử lượng nhỏ trong một thời gian dài Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là không thể giải phóng các thuốc
Tổng quan về hydrogel
Theo định nghĩa, hydrogel là mạng lưới polymer có cấu hình ba chiều có khả năng trương nở trong nước nhưng vẫn giữ được cấu trúc ổn định, được hình thành từ các chuỗi polymer ưa nước Nhờ vào cấu trúc ưa nước này cho phép hydrogel có thể hấp thu một lượng lớn nước hoặc hoạt chất [39, 40] Hydrogel có thể được chế tạo ở nhiều dạng khác nhau như dạng tấm, hạt nano, dạng phim,… nên thường được sử dụng trong các lĩnh vực y sinh, cảm biến sinh học, loại bỏ các thành phần độc hại từ nước thải, [41]
Hydrogel là vật liệu có khả năng chuyển pha giữa hai trạng thái “sol-gel” nhờ vào các lực liên kết như ion, liên kết hydro hoặc kỵ nước đóng vai trò chính Mức độ hydrat hóa và điện tích của mỗi hydrogel là khác nhau tùy thuộc vào các nhóm chức có trong nó (-OH, -CONH- , -CONH2- , …) [42] Các liên kết chéo giữa các mạch polymer là yếu tố giúp cho hydrogel không bị tan trong nước [43] Lượng nước được hấp thụ bên trong hydrogel cho phép sự khuếch tán tự do của một số phân tử chất tan, trong khi mạng polymer đóng vai trò như một chất nền để giữ nước và ổn định cấu trúc của hydrogel [44]
Các tính chất vật lý đặc trưng của hydrogel giúp chúng được sử dụng rộng rãi trong dẫn truyền thuốc Cấu trúc có độ xốp cao của chúng có thể dễ dàng được điều chỉnh bằng cách kiểm soát mật độ của các liên kết chéo trong ma trận gel và ái lực của hydrogel đối với môi trường nước khi chúng trương nở Độ xốp của chúng cũng cho phép nạp thuốc và giải phóng thuốc với tốc độ phụ thuộc vào hệ số khuếch tán của phần tử thuốc qua mạng gel [43]
Bên cạnh những ưu điểm trên thì hydrogel cũng có một số hạn chế như số loại thuốc có thể được nạp vào, thời gian phân hủy và tính độc hại của nó Do đó cần phải phát triển và nghiên cứu thêm để đưa vào ứng dụng trong y học Nhiều dược phẩm có chứa hoạt chất tự nhiên đã được nghiên cứu kết hợp với các polymer sinh học mang lại hiệu quả cao trong việc điều trị [45]
Việc phân loại hydrogel (Hình 1.4) phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau như tính chất vật lý của chúng, bản chất của liên kết trong phân tử, phương pháp điều chế, điện tích ion, khả năng đáp ứng kích thích và khả năng phân hủy sinh học [43, 46]
Cross-linking là những liên kết chéo có bản chất vật lý hay hóa học, làm cho hydrogel có cấu trúc mạng 3D và ổn định ma trận gel (trương nở trong nước nhưng vẫn giữ được cấu trúc không gian ba chiều) Tính chất của polymer như khối lượng phân tử, độ bền cơ học, khả năng chịu nhiệt và chịu dung môi phụ thuộc vào các cross-linking có trong nó [43]
Số lượng cross-linking có vai trò quyết định tới khả năng co dãn của polymer, càng nhiều liên kết thì polymer càng trở nên kém linh động Ngoài ra độ hòa tan cũng bị ảnh hưởng bởi các liên kết này, việc hình thành các liên kết cộng hóa trị
-Liên kết bằng trùng hợp
-Liên kết bằng phản ứng hóa học
-Liên kết bằng tương tác ion
-Polymer mạng xen kẽ và bán xen kẽ Điện tích có trong hệ
-Điện tích âm hay dương -Amphoteric -Zwitterionic Đáp ứng kích thích
Khả năng phân hủy sinh học
-Có thể phân hủy -Không thể phân hủy
12 mạnh làm cho polymer không bị hòa tan trong dung môi nhưng có thể hấp thụ dung môi để tạo thành gel [48]
Hình 1.6 Các loại cross-linking trong hydrogel [49]
Hydrogel có thể được phân loại dựa trên bản chất cross-linking, bao gồm hydrogel liên kết vật lý và hydrogel liên kết hóa học Các hydrogel liên kết vật lý thường có tính chất cơ học kém không đáp ứng được các yêu cầu đòi hỏi độ bền nhưng có khả năng gel hóa nhanh tại chỗ khi được tác nhân kích thích Trái lại, hydrogel hóa học có độ bền cơ học cao hơn nhưng tốc độ gel hóa chậm và có khả năng gây độc Do đó việc kết hợp khả năng gel hóa nhanh của hydrogel vật lý và độ bền của hydrogel hóa học đã và đang được nghiên cứu giúp cung cấp hoạt chất tốt hơn [50] a) Các hydrogel cross-linking vật lý
Ngày nay, các nhà khoa học chủ yếu tập trung vào hydrogel cross-linking vật lý Vật liệu này có thể đạt được trạng thái gel bằng cách thay đổi các lực liên phân tử như liên kết hydro, tương tác kỵ nước, lực ion tĩnh điện,… Những thay đổi này có thể xảy ra do sự sắp xếp bên trong của các polymer hoặc có thể được gây ra bởi các kích thích bên ngoài như nhiệt độ, pH, điện trường, áp suất, ánh sáng,… Các liên kết này là liên kết vật lý nên quá trình tạo gel của hydrogel có thể đảo ngược [46, 51]
Do quá trình tổng hợp khác nhau, cho nên mỗi loại hydrogel vật lý có các đặc tính riêng về độ bền cơ học, thời gian tạo gel và khả năng phân hủy… Ưu điểm của hydrogel loại này là tránh được những chất liên kết ngang hay xúc tác (có thể gây độc) để tạo cross-linking còn sót lại so với hydrogel liên kết hóa học, từ đó cung cấp phương pháp đơn giản và an toàn để hình thành nên hydrogel tiêm tại vị trí mong muốn khi có tác động của tác nhân bên ngoài thích hợp [46, 50]
Hình 1.7 Cơ chế gel hóa thông qua quá trình proton hóa và khử proton thông qua sự thay đổi pH [50]
Hydrogel nhạy pH đang được nghiên cứu và phát triển, pH là một thông số môi trường quan trọng có thể được sử dụng cho hệ dẫn truyền vì mỗi vị trí trong cơ thể có một giá trị pH khác nhau Từ đó giúp đưa các hoạt chất sinh học đến các vị trí khác nhau trong cơ thể, chẳng hạn như dạ dày, ruột, khối u gan, mạch máu và âm đạo Quá trình chuyển pha chủ yếu xảy ra thông qua quá trình proton hóa và khử proton của các nhóm ion xung quanh giá trị pKa Ưu điểm của hydrogel loại này là có thêm các nhóm ion để tương tác với các phân tử sinh học phức tạp [52]
Hình 1.8 Cơ chế gel hóa do tương tác kỵ nước khi chịu kích thích của nhiệt độ [53]
Hydrogel nhạy nhiệt có thể thay đổi độ hòa tan của toàn bộ mạng polymer bằng các thay đổi nhiệt độ của môi trường ngoài, từ đó gây ra sự c/huyển pha “sol- gel-sol” Thông thường, cấu trúc của hydrogel nhạy cảm với nhiệt độ thường chứa các thành phần kỵ nước và ưa nước Sự thay đổi cân bằng ưa nước-kỵ nước và các nhóm nhạy cảm với nhiệt độ cụ thể có trong hydrogel quyết định tính chất của hệ dẫn truyền [54]
Bằng cách thay đổi tỉ lệ giữa các đoạn ưa nước và kỵ nước, có thể thay đổi nhiệt độ chuyển pha của hydrogel nhạy nhiệt Ưu điểm của hydrogel nhạy nhiệt là tốc độ gel hóa nhanh và đơn giản do đó được sử dụng rộng rãi trong việc dẫn truyền thuốc [55] b) Các hydrogel cross-linking hóa học
Hydrogel cross-linking hóa học có thể thay đổi từ trạng thái “sol” sang trạng thái “gel” bằng cách hình thành liên kết cộng hóa trị trong mạng lưới polymer thông qua các phản ứng hóa học Những hydrogel này thường được ứng dụng trong việc cấy, kết hợp để tạo xương, và hiện nay đang được nghiên cứu chủ yếu với những hydrogel hình thành tại chỗ ứng dụng che vết thương hở [51]
Sự hình thành cross-linking được thực hiện bằng cách bổ sung các chất liên kết chéo dưới dạng phân tử nhỏ, liên hợp polymer-polymer, tác nhân cảm quang hoặc bằng phản ứng xúc tác của enzyme, phản ứng Michael, phản ứng Schiff’s base… Chất liên kết chéo là các phân tử có ít nhất hai nhóm chức phản ứng cho phép hình thành cầu nối giữa các chuỗi polymer Nhược điểm của phương pháp sử
15 dụng phân tử liên kết ngang nhỏ là độc tính tiềm tàng của các tác nhân liên kết chéo chưa phản ứng còn sót lại [50, 51]
Nạp và giải phóng thuốc
1.3.1 Nạp thuốc vào hệ hydrogel
Có nhiều phương pháp nạp thuốc vào trong hydrogel Việc lựa chọn phương pháp chủ yếu phụ thuộc vào loại thuốc, bản chất của hydrogel, tương tác giữa thuốc và hydrogel và nơi mà thuốc sẽ được phân phối Nhìn chung, thuốc có thể được cố định vào hydrogel theo hai cách: post loading và in situ loading [65]
Phương pháp post-loading gồm hai bước: đầu tiên là hình thành hydrogel và sau đó đưa thuốc vào trong mạng lưới polymers Quá trình này được thực hiện bằng cách cho hydrogel trương nở trong dung dịch thuốc cho đến khi đạt trạng thái cân bằng, thuốc có thể được giữ ổn định trong hệ nhờ vào tác nhân vật lý hoặc hóa học Mặt khác, hệ thuốc-hydrogel này có thể được nạp vào hệ thống dẫn truyền thứ cấp khác để tạo môi trường thích hợp cho việc giải phóng thuốc có nhắm mục tiêu [66]
Hình 1.11 Phương pháp loading hoạt chất vào hydrogel [65]
Phương pháp in situ loading thích hợp với hydrogel ở dạng tiêm đáp ứng với các kích thích của cơ thể để thực hiện quá trình gel hóa, điển hình là hydrogel tiêm nhạy nhiệt Quá trình này thông qua các giai đoạn: tiền gel hóa (polymers và hoạt chất được phân tán đều trong dung dịch), gel hóa tại chỗ (hình thành cross-linking dưới kích thích của nhiệt độ, pH, ánh sáng…), giải phóng hoạt chất và sự phân hủy hydrogel trong cơ thể [67]
1.3.2 Tương tác giữa hoạt chất và hydrogel
Tương tác giữa hoạt chất và hydrogel được tạo thành có thể là liên kết vật lý hoặc hóa học tùy thuộc vào bản chất và loại của chúng Những tương tác này có vai trò trong việc ổn định hệ dẫn truyền và ảnh hưởng đến tốc độ giải phóng thuốc [55] Tương tác tĩnh điện thường được dùng nhằm tăng độ bền liên kết giữa thuốc và hydrogel, giúp kiểm soát tốc độ giải phóng thuốc khỏi mạng hydrogel Thuốc sẽ được giải phóng khi hydrogel bị phân hủy hoặc có sự xuất hiện của các ion trong môi trường [59]
Hình 1.12 Tương tác tĩnh điện giữa thuốc và hydrogel [55]
Tính ưa nước của hydrogel gây khó khăn cho việc mang và giải phóng các loại thuốc kỵ nước Tuy nhiên, việc thêm các thành phần kỵ nước có thể làm giảm đáng kể lượng nước có trong hydrogel, từ đó làm thay đổi các tính chất của vật liệu sinh học này Cyclodextrin có vị trí để liên kết với thuốc kỵ nước, đồng thời không làm thay đổi tính ưa nước tổng thể của hydrogel Do đó, một số nghiên cứu đã thêm cyclodextrin và đã đạt được hiệu quả nhất định [68]
Hình 1.13 Tương tác kỵ nước giữa thuốc và hydrogel [55]
Ngoài ra, thuốc và hydrogel cũng có thể được liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị Tốc độ giải phóng thuốc trong trường hợp này được kiểm soát thông qua tốc độ phân cắt hóa học hoặc enzyme phân hủy [69]
Hình 1.14 Tương tác cộng hóa trị giữa thuốc và hydrogel [59]
1.3.3 Cơ chế giải phóng hoạt chất ra khỏi hệ hydrogel
Hydrogel là một mạng lưới polymer gồm các mắt lưới được tạo thành từ các liên kết chéo; các mắt lưới này cho phép khuếch tán chất lỏng và chất tan có kích thước nhỏ từ đó giúp kiểm soát quá trình giải phóng thuốc ra khỏi hệ dẫn truyền Kích thước mắt lưới được khảo sát thường nằm trong khoảng từ 5 đến 100 nm [70]
Một trong những cơ chế phổ biến nhất để mô tả quá trình giải phóng hoạt chất ra khỏi hệ hydrogel là cơ chế khuếch tán Trong quá trình này các phân tử thuốc sẽ di chuyển từ trong hydrogel qua các mắt lưới và đến môi trường giải phóng Tốc độ giải phóng thuốc phụ thuộc vào nồng độ thuốc, kích thước mắt lưới và các hiện tượng bên trong hydrogel (khuếch tán bên trong) [70]
Kích thước phân tử của hoạt chất và kích thước lưới quyết định tốc độ giải phóng thuốc và được dự đoán bằng thống số r lưới / r thuốc Một số loại thuốc có kích thước nhỏ hơn kích thước mắt lưới (rlưới / rthuốc >1) sẽ khuếch tán nhanh chóng
20 qua hydrogel, dẫn đến thời gian giải phóng ngắn Khi kích thước của thuốc gần với kích thước mắt lưới (rlưới / rthuốc ≈ 1), quá trình giải phóng thuốc bị chậm lại đáng kể Khi thuốc lớn hơn kích thước mắt lưới (rlưới / rthuốc 60%) Đây là thành phần cấu trúc nên vỏ của động vật giáp xác và côn trùng và là chất liệu cấu tạo màng sinh học tự nhiên phổ biến thứ hai sau cellulose, có cấu trúc tinh thể cứng chắc do tương tác hydro giữa các nhóm acetamide và hydroxyl [75] Chính vì cấu trúc cứng này cùng với nhược điểm hòa tan kém trong nước, cũng như do có nhiều nhóm acetyl mà chitin khó được áp dụng Sau khi deacetyl hóa một phần chitin để chuyển thành chitosan thì số lượng nhóm amine và khả năng hòa tan trong nước tăng lên [76]
Một trong những đặc tính của chitosan là khả năng thay đổi điện tích ở môi trường pH khác nhau, tích điện dương ở pH thấp và không tích điện ở pH trung tính hoặc cao, do đó chitosan có khả năng thay đổi độ tan và tạo thành gel [77]
Hình 1.16 Phản ứng Deacetyl hóa Chitin để hình thành nên Chitosan [76]
Với pKa 6.2-7 của nhóm D-glucosamine có mặt trong phân tử thì chitosan là một base yếu, trở nên kém hòa tan trong môi trường trung tính hoặc kiềm Các amine béo của chitosan có thể bị proton hóa trong điều kiện acid, với bản chất là cation, chitosan tan được trong nước sau khi hình thành các muối carboxylate (formate, acetate, lactate, citrate,…) [78] Do có sự hiện diện của nitơ trong cấu trúc phân tử, và khả năng proton hóa, chitosan có thể tạo được phức chất polyelectrolyte, điều mà các polysaccharide thông thường khác chưa làm được, đồng thời các cation chitosan có thể tạo thành gel khi tương tác với các anions mang điện tích âm [79]
Khi ở dạng dung dịch, chitosan có khả năng tạo liên kết hydro nhờ vào gốc amine và hydroxyl trong phân tử, những liên kết này góp phần tạo nên độ nhớt cho dung dịch chitosan Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào nồng độ và nhiệt độ, khi nồng độ chitosan tăng và nhiệt độ giảm thì độ nhớt sẽ tăng, độ nhớt của chitosan quyết định độ ổn định của hydrogel và tiềm năng ứng dụng của nó [78]
Bên cạnh đó, với khả năng phân hủy sinh học (thông qua enzyme, các quá trình thực bào,…) cùng với đặc tính tương thích sinh học, ít độc với cơ thể và khả
23 năng kháng khuẩn giúp chitosan là một trong những lựa chọn hàng đầu trong các lĩnh vực y sinh (băng dính vết thương, xương,…) hay dẫn truyền thuốc (hydrogel, hạt nano,…) [76] Trong cơ thể người, chitosan có thể được phân hủy bởi một số enzyme sinh lý như lysozyme, di-N-acetylchitobiase, N-acetyl-beta-d glucosaminidase, chitiotriosidase,… và quá trình phân hủy sinh học này giải phóng các oligosaccharides không gây độc [80]
1.4.2 Hydrogel có nguồn gốc từ chitosan
Bên cạnh các hydrogel được tổng hợp từ các polymer tổng hợp như: PEG; PVA; PAA; PMA;… có độ bền cơ học, tính chất hóa lý và khả năng tương thích khác nhau [81] Các polymer tự nhiên, như polysaccharide và protein, cũng đã được sử dụng làm vật liệu để tạo thành hydrogel và có tiềm năng lớn trong các ứng dụng y sinh với vai trò là chất mang, giải phóng thuốc Chitosan là một polysaccharide với những ưu điểm như dễ tổng hợp, tương thích sinh học với cơ thể, có khả năng phân hủy sinh học dễ dàng đã thu hút được sự chú ý của các nhà nghiên cứu và ngày càng được mở rộng ứng dụng trong lĩnh vực hydrogel [82]
Lực liên kết giữa các chuỗi polysaccharide trong phân tử chitosan là tương tác hydro, kỵ nước và ion Những tương tác này bị ảnh hưởng bởi trọng lượng phân tử và cường độ ion Do đó, để cải thiện các đặc tính của chitosan như độ ổn định và độ bền nhằm ứng dụng trong dẫn truyền thuốc mà cụ thể là hydrogel chitosan thì việc tạo thêm các liên kết ngang là điều cần thiết và đang được nghiên cứu [76]
Hydrogel chitosan có thể được tổng hợp thông qua phương pháp liên kết ngang cộng hóa trị hoặc ion với việc bổ sung các chất liên kết ngang khác nhau Các hydrogel được tạo thành dựa trên liên kết ngang cộng hóa trị có cấu trúc mạng ổn định và lâu dài, không thuận nghịch khi liên kết đã được hình thành Tuy nhiên, các chất liên kết ngang cộng hóa trị như glutaraldehyde thường độc đối với sinh vật cũng như việc hình thành liên kết ngang cộng hóa trị làm cho hydrogel khó phân hủy Do đó, các chất liên kết ngang vật lý (những phân tử mang điện tích) đã được nghiên cứu để tạo thành các liên kết thuận nghịch trong hydrogel và tăng khả năng tương thích sinh học [83] Chitosan là một cationic polyelectrolyte polymer với các
24 nhóm amine có thể ion hóa, nên các anion thường được sử dụng làm chất liên kết ngang ion, một trong số đó là β-glycerophosphate (GP)
1.4.3 β-glycerophosphate và cơ chế của quá trình sol-gel β-glycerophosphate là một ester của glycerol được cấu thành từ các phân tử glycerophospholipid, đồng thời cũng là một hợp chất hữu cơ tự nhiên được tìm thấy trong cơ thể và đã được sử dụng như một yếu tố tạo xương trong phòng thí nghiệm để nuôi cấy tế bào gốc tủy xương của con người [83] Phân tử này cũng được sử dụng như một nguồn phosphate trong điều trị mất cân bằng chuyển hóa phosphate và ứng dụng trong việc ức chế một số loại enzyme trong cơ thể [84]
Hình 1.17 Công thức cấu tạo của β-glycerophosphate
Chitosan không phải là polymer nhạy nhiệt, do đó GP được thêm vào dung dịch chitosan để tạo thành hệ hydrogel có thể thực hiện quá trình chuyển pha sol-gel dưới sự thay đổi của nhiệt độ Việc duy trì dung dịch CS trong phạm vi pH từ 6.8 đến 7.2 khi có mặt của muối GP khiến hệ hydrogel CS-GP trở thành hệ gel hóa nhạy nhiệt, ở dạng lỏng tại nhiệt độ phòng và chuyển thành gel khi nhiệt độ tăng đến nhiệt độ sinh lý (điểm chuyển pha ≥ 37 o C) Khắc phục được hạn chế tạo kết tủa ở pH sinh lý của dung dịch chitosan là một ưu điểm của hệ hydrogel này [85]
Sự hình thành mạng lưới gel liên quan đến sự thay đổi mức độ phân ly (pKa) của các nhóm amine, do nhóm -NH2 được liên kết với gốc phosphate của GP dẫn đến việc giảm mật độ điện tích dương làm giảm độ dày của vỏ solvat hóa xung quanh nhóm này và tạo điều kiện cho sự kết tụ của các chuỗi polymer, đồng thời thay đổi bản chất của chuỗi từ ưa nước sang kỵ nước [86]
Hình 1.18 Cơ chế tạo gel nhạy nhiệt của Chitosan khi có sự góp mặt của β- glycerophosphate [85]
Khi thêm GP vào dung dịch CS sẽ điều chỉnh các tương tác tĩnh điện, kỵ nước và liên kết hydro trong quá trình tạo gel, lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi CS giảm và số lượng liên kết hydro giữa các chuỗi tăng lên Tương tác tĩnh điện giữa các nhóm phosphate của GP với các nhóm amine của CS cũng được hình thành, đồng thời giúp tăng cường các tương tác kỵ nước CS-CS bởi vai trò cấu trúc của GP đối với nước Các khảo sát đặc tính lưu biến chỉ ra rằng sự phụ thuộc vào nhiệt độ của quá trình tạo gel bắt nguồn từ tương tác kỵ nước của chuỗi CS và các nhóm glycerol Sự kết tụ các chuỗi CS được ngăn cản bởi tương tác CS-nước ở nhiệt độ thấp và khi tăng nhiệt độ, các phân tử nước bị loại bỏ bởi các nhóm chức của glycerol, thúc đẩy các chuỗi CS kết tụ dẫn đến tạo gel [84, 85]
Bên cạnh đó, nhiệt độ tăng làm tăng năng lượng dao động và quay của các phân tử nước dẫn đến giảm lượng phân tử nước bao quanh các chuỗi CS Các phân tử nước này được loại bỏ xung quanh chuỗi CS giúp tăng cường tương tác của các phân đoạn kỵ nước với nhau Mặt khác, tại nhiệt độ thấp, CS có dạng cuộn xoắn do các liên kết hydro nội phân tử và khi nhiệt độ tăng, số lượng liên kết hydro nội phân tử giảm xuống, cho phép các phân tử CS mở ra và tạo thuận lợi cho quá trình gel hóa [85]
1.4.4 Ứng dụng hydrogel chitosan-β-glycerophosphate
Hydrogel chitosan-β-glycerophosphate (CS-β-GP) tiêm dưới da hoặc tiêm bắp có thể làm tăng thời gian giải phóng từ một ngày đến một tháng, tùy thuộc vào thành phần và cấu trúc của hydrogel cũng như đặc tính của hoạt chất Một số loại thuốc đã được nghiên cứu với phương pháp này, chẳng hạn như aspirin, risperidone, insulin, methylprednisolone, docetaxel, venlafaxine, doxorubicin, curcumin và một số kháng sinh [84]
Lá trầu và hoạt chất flavonoid
Trầu có tên khoa học là Piper betle L (hay Piper sriboa L.), thuộc họ hồ tiêu (Piperaceae), trầu còn có tên gọi khác là trầu cay, trầu lương, thược tương, thổ lâu đằng, được trồng để lấy lá ăn trầu và sử dụng trong phong tục thờ cúng của các dân tộc ở Việt Nam [91]
Hình 1.19 Lá trầu (Piper betle L.)
Lá trầu có vị cay nồng, mùi thơm hắc, tính ấm, có tác dụng trừ phong, tiêu viêm, sát trùng, kháng khuẩn Trong y học cổ truyền Ấn Độ, lá trầu là một bài thuốc chữa bệnh được sử dụng rộng rãi có nhiều tác dụng chữa bệnh khác nhau như đau khớp, đau họng, khó tiêu, người dân Ấn Độ cho rằng việc sử dụng thường xuyên lá trầu nghiền lẫn với mật ong giúp bảo vệ họng khỏi bị nhiễm trùng Còn trong các bài thuốc dân gian ở Việt Nam, lá trầu có tác dụng hữu hiệu với bệnh thấp khớp và viêm tinh hoàn [92]
Thành phần hóa học chính của các hoạt chất trong lá trầu là các hợp chất thuộc nhóm terpene và dẫn xuất của phenol Các hoạt chất này có những tác dụng sinh học tốt như tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa Nhiều nghiên cứu gần đây còn cho biết lá trầu còn chứa hàm lượng flavonoid cao giúp trầu có hoạt tính kháng viêm, giảm đau tốt được đánh giá bởi Badrul Alam và cộng sự trong nghiên cứu về các hoạt động chống oxy hóa, giảm đau và chống viêm của chiết xuất lá trầu năm 2013 [93]
Flavonoids thuộc nhóm polyphenol, có cấu trúc đặc trưng bởi 2 vòng phenol (A, B) và 1 dị vòng C, nhóm hydroxyl tại carbon C-5 và C-7 trên vòng A và được phân thành sáu loại khác nhau bao gồm: flavanones, isoflavones, flavonols, flavone, anthocyanidins và flavanol Đây là nhóm hợp chất tự nhiên có nhiều hoạt tính sinh học tác dụng tốt với sức khỏe người [94]
Nhờ vào các nhóm hydroxyl ở vòng B, nên flavonoids có khả năng chống oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do Mặt khác, một số flavonoid có khả năng ức chế cả hai con đường cyclooxygenase và 5-lipoxygenase của quá trình chuyển hóa arachidonate góp phần vào các đặc tính chống viêm Nghiên cứu của Alejandra Ester Rotelli, cho thấy các hợp chất quercetin, morin và hesperetin thể hiện tác dụng chống viêm đối với quá trình viêm cấp tính do carrageenan gây ra trên chuột cao hơn so với sau khi dùng chứng dương phenylbutazone [95]
Dựa trên tổng quan tài liệu cho thấy hydrogel là một trong những lĩnh vực tiềm năng, đặc biệt là hydrogel CS-β-GP với độc tính thấp và khả năng ứng dụng cao trong lĩnh vực dẫn truyền thuốc Cao lá trầu với hàm lượng flavonoid cao cũng cho thấy tiềm năng trong lĩnh vực kháng viêm, nhưng những nghiên cứu về hydrogel nạp cao chiết chưa được phổ biến Do đó, trong nghiên cứu này tiến hành khảo sát, so sánh khả năng nạp và giải phóng thuốc Diclofenac Sodium và cao lá trầu trên hệ hydrogel CS-β-GP
NỘI DUNG THỰC NGHIỆM
Mục tiêu, đối tượng và nội dung nghiên cứu
2.1.1 Mục tiêu và đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu tổng hợp hydrogel chitosan-β-glycerophosphate với các điều kiện tổng hợp khác nhau Sau đó, khảo sát và so sánh khả năng giải phóng thuốc kháng viêm diclofenac sodium (DS) và flavonoid trong cao trầu ra khỏi hệ hydrogel
Nội dung 1: Tổng hợp hydrogel chitosan-β-glycerophosphate dưới các điều kiện tổng hợp khác nhau: khối lượng phân tử chitosan, nồng độ chitosan và nồng độ chất liên kết ngang
Nội dung 2: Khảo sát khả năng chuyển pha sol-gel của hệ hydrogel chitosan- β-glycerophosphate thu được (trước và sau khi nạp hoạt chất)
Nội dung 3: Nạp thuốc DS và cao trầu vào hydrogel CS-β-GP theo phương pháp in situ khi thay đổi các yếu tố nồng độ dung dịch hoạt chất nạp vào, thành phần CS và GP có trong hydrogel
Nội dung 4: Khảo sát tốc độ giải phóng DS và flavonoid trong cao trầu theo thời gian từ hydrogel CS-β-GP khi thay đổi nhiệt độ môi trường giải phóng.
Hóa chất và thiết bị sử dụng
Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng
STT Tên hóa chất Nguồn gốc
Chitosan (CS) Khối lượng phân tử cao (CSH), Mw24 kDa
Khối lượng phân tử trung bình (CSM), Mw'2 kDa
2 β-Glycerol phosphate (GP) Sigma-Aldrich
5 Diclofenac sodium (DS) Trung Quốc
6 Dung dịch đệm phosphate (PBS, pH = 7.4) Trung Quốc
8 Ammonium chloride hexahydrate Việt Nam
- Bếp khuấy từ gia nhiệt
- Máy đo quang phổ UV-VIS Thermo Genesys 10S UV-VIS
- Máy Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier FTIR Alpha II, Bruker, Đức
- Máy sấy thăng hoa: Toption TPV-50F, Trung Quốc
-Kính hiển vi điện tử quét (Field Emission Scanning Electronic Microscopy, FE-SEM) S4800, Hitachi, Nhật
- Một số dụng cụ sử dụng: nhiệt kế, giá đỡ và kẹp, cá từ, bể điều nhiệt, ống nhỏ giọt, beaker các loại 25 mL, 50 mL,…
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Tổng hợp hydrogel chitosan-β-glycerophosphate
Hình 2.1 Quy trình tổng hợp hydrogel chitosan-β-glycerophosphate [96]
32 Đầu tiên là khảo sát khả năng hòa tan của chitosan bằng các acid khác nhau gồm lactic acid, acetic acid và citric acid với các nồng độ khác nhau để khảo sát nồng độ acid phù hợp và lượng chitosan tối đa có thể hòa tan được
Sau khi đã xác định được nồng độ acid và nồng độ chitosan cần hòa tan, chitosan được cân một lượng tùy vào công thức hydrogel cần khảo sát sau đó cho dung dịch acid vào và khuấy ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất, sau đó làm lạnh dung dịch chitosan này xuống 5 o C bằng bể đá Đồng thời hòa tan một lượng β-GP thích hợp vào nước RO, làm lạnh xuống 5 o C rồi nhỏ từ từ từng giọt dung dịch β-GP này vào dung dịch chitosan đã được chuẩn bị trước đó ở 5 o C để tránh sự gel hóa cục bộ trong quá trình phản ứng Khuấy hệ phản ứng ở 5 o C trong vòng 1 giờ ( Hình 2.2 ), sau đó gel hóa ở nhiệt độ 37 o C rồi cấp đông bằng nitơ lỏng đến -50 o C và sấy thăng hoa thu được sản phẩm hydrogel chitosan-β- glycerophosphate đông khô
Hình 2.2 Hệ thống tổng hợp hydrogel chitosan-β-glycerophosphate
Hình 2.3 Tương tác ion giữa CS và β-GP [84]
2.3.2 Kiểm tra cấu trúc của hydrogel chitosan-β-glycerophosphate thu được thông qua phổ FT-IR
Mẫu hydrogel đông khô được phân tích bằng kính hiển vi hồng ngoại Alpha II FT-IR kết hợp với phần mềm để thu phổ hồng ngoại FT-IR ở số sóng từ 4000-400 cm -1 Dữ liệu kết quả thu được được xuất ra đồ thị có trục tung biểu diễn độ truyền suốt (Transmittance, %), trục hoành biểu diễn số sóng (Wavenumber, cm -1 ) Thông qua phổ FT-IR từ các nghiên cứu trước đó để xác nhận sự tạo thành của hydrogel chitosan-β-glycerophosphate
2.3.3 Phân tích hình thái học của chitosan/ β-glycerophosphate hydrogel thông qua phổ SEM
Kính hiển vi điện tử quét (SEM) sử dụng chùm điện tử năng lượng cao hội tụ để tạo ra nhiều loại tín hiệu trên bề mặt của mẫu vật rắn Các tín hiệu thu được cho biết thông tin về hình thái bên ngoài của vật liệu tạo nên mẫu Độ phóng đại M (magnification): tỷ lệ giữa kích thước trên màn hình hiển thị và kích thước thật của mẫu (M=D/d) Thanh đơn vị (scale bar) có thể được dùng để ước lượng kích thước lỗ rỗng trên bề mặt vật liệu hoặc chiều dày mẫu vật trong một số trường hợp
Hình thái của hydrogel chitosan-β-glycerophosphate sau khi được tổng hợp được xác định cấu trúc bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) sau khi
34 gel hóa và đông khô Các mẫu hydrogel sau khi đã được đông khô bằng thiết bị sấy thăng hoa sẽ được phủ một lớp vàng và đưa vào kính hiển vi điện tử quét hoạt động ở điện áp gia tốc 10 kV Từ hình ảnh thu được đánh giá bề mặt và cấu trúc lỗ xốp của hydrogel
2.3.4 Khảo sát quá trình sol-gel của hệ hydrogel chitosan-β-glycerophosphate
Hydrogel nhạy nhiệt chitosan-β-glycerophosphate có thể hòa tan trong nước dưới nhiệt độ sol-gel tạo thành dung dịch ở dạng lỏng, nhưng khi nhiệt độ vượt qua giới hạn này hydrogel ngày càng kỵ nước và không hòa tan, dẫn đến hình thành gel Nhiệt độ sol-gel có thể được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau, chẳng hạn như phương pháp đảo ngược ống nghiệm, phép phân tích nhiệt lượng quét vi sai Trong nghiên cứu này, quá trình chuyển đổi sol-gel của hệ hydrogel chitosan-β- glycerophosphate theo nhiệt độ được thực hiện bằng phương pháp đảo ngược ống nghiệm 10 ml có nắp đậy Phương pháp này cho phép quan sát trực tiếp trạng thái của hydrogel có trong ống với định nghĩa “sol” là trạng thái dòng chất lỏng có thể chảy được và “gel” là trạng thái rắn và không chảy, những trạng thái này phải ổn định trong 1 phút [97] a) Khảo sát thời gian sol-gel của các mẫu hydrogel ở nhiệt độ 37 o C và 39 o C
Quá trình được thực hiện như sau: Trích 2ml mỗi mẫu dung dịch CS-β-GP ở các nồng độ xác định cho vào ống bi Ủ các ống bi này trong bể điều nhiệt ở 37 o C và 39 o C Cách 1 phút, ống bi được đảo ngược một lần để đánh giá trạng thái của mẫu Thời gian tạo gel được tính từ thời điểm sau 1 phút cho ống bi vào bể điều nhiệt đến thời điểm tại đó hydrogel ở trạng thái không chảy khi đảo ngược ống bi
Bảng 2.2 Thành phần chitosan và -glycerophosphate trong mẫu hydrogel được lựa chọn khảo sát
%w/v (%khối lượng/thể tích) %w/v (%khối lượng/thể tích)
1% CSM 5% - 10% b) Lập đồ thị chuyển pha sol-gel của các mẫu hydrogel Đồ thị chuyển pha sol-gel của hệ hydrogel được lập với trục tung là nhiệt độ chuyển pha của hydrogel và trục hoành là nồng độ β-GP Quá trình được thực hiện như sau
2mL mẫu hydrogel được cho vào các hũ bi, sau khi ổn định nhiệt độ ở 25 ºC trong 20 phút, sau đó gia nhiệt từ từ với tốc độ 0,5 ºC/phút, từ 25 ºC đến nhiệt độ khi xuất hiện quá trình chuyển đổi từ sol sang dạng gel và ghi lại nhiệt độ
Các mẫu thí nghiệm được chọn giống như thí nghiệm khảo sát thời gian sol- gel nhưng có thêm các mẫu có chứa hoạt chất là Diclofenac Sodium và cao trầu với nồng độ 2000ppm (các thành phần CS và β-GP giữ nguyên không đổi)
2.3.5 Lập đường chuẩn của Diclofenac Sodium Độ hấp thu cực đại của Diclofenac Sodium (DS) được xác định bằng cách quét phổ UV-VIS trong khoảng bước sóng từ 200-700 nm Dung dịch dùng để quét phổ được chuẩn bị bằng cách hòa tan DS trong dung dịch đệm phosphate (PBS) pH 7.4 có nồng độ 20 μg/mL Phổ UV-VIS cho thấy độ hấp thu cực đại ở bước sóng
277 nm nên ta thực hiện lập đường chuẩn ở bước sóng này
Hình 2.4 Đường chuẩn của diclofenac sodium tại bước sóng 277 nm
Quá trình lập đường chuẩn của DS được thực hiện như sau DS được cân một lượng 250 mg hòa tan trong PBS định mức lên 100 mL với bình định mức 100 mL Lấy 1 mL dung dịch này cho vào bình định mức 100 mL, định mức lên 100 mL với PBS, thu được dung dịch có nồng độ 25 μg/mL, từ đó pha loãng ra thành các dung dịch có nồng độ 20 μg/mL, 15 μg/mL, 10 μg/mL, 8 μg/mL, 6 μg/mL, 4 μg/mL, 2 μg/mL Đồng thời chuẩn bị dung dịch thuốc DS pha trong PBS có nồng độ 30 μg/mL tương tự cách pha dung dịch thuốc 25 μg/mL Sử dụng máy quang phố UV- VIS để đo độ hấp thu của các dung dịch này ở bước sóng 277 nm rồi lập đường chuẩn cho thuốc DS với mẫu trắng là dung dịch đệm phosphate
2.3.6 Lập đường chuẩn cao trầu Độ hấp thu cực đại của cao trầu được xác định bằng cách quét phổ UV-VIS trong khoảng bước sóng từ 350-700 nm Dung dịch dùng để quét phổ được chuẩn bị bằng cách hòa tan cao trầu trong RO có nồng độ 50 μg/mL Phổ UV-VIS cho thấy độ hấp thu cực đại ở bước sóng 416 nm nên ta thực hiện lập đường chuẩn ở bước sóng này y = 0.0292x + 0.0009 R² = 0.9998
Hình 2.5 Đường chuẩn của cao trầu tại bước sóng 416 nm
Quá trình lập đường chuẩn của cao trầu được thực hiện như sau Cao trầu được cân một lượng 300 mg hòa tan trong RO định mức lên 100 mL với bình định mức 100 mL Lấy 1 mL dung dịch này cho vào bình định mức 10 mL, định mức lên
10 mL với RO, thu được dung dịch có nồng độ 300 μg/mL, từ đó pha loãng ra thành các dung dịch có nồng độ 250 μg/mL, 200 μg/mL, 150 μg/mL, 100 μg/mL, 50 μg/mL, 40 μg/mL, 30 μg/mL, 20 μg/mL và 10 μg/mL Sử dụng máy quang phố UV- VIS để đo độ hấp thu của các dung dịch này ở bước sóng 416 nm rồi lập đường chuẩn với mẫu trắng là nước RO
và lập đường chuẩn flavonoid
Nạp hoạt chất vào hệ hydrogel chitosan-β-glycerophosphate
Hoạt chất gồm Diclofenac Sodium (DS) và cao trầu được nạp vào trong hệ hydrogel chitosan-β-glycerophosphate bằng phương pháp in situ loading Quá trình được thực hiện như sau
Hình 2.8 Quy trình nạp DS và Trầu vào hydrogel chitosan-β-glycerophosphate
Dung dịch thuốc DS với các nồng độ 1000; 2000 và 3000 ppm (mg/mL) được chuẩn bị bằng cách hòa tan thuốc DS với khối lượng tương ứng vào nước RO Đối với dung dịch cao trầu ta tính lượng cao cần thiết để pha thông qua độ ẩm của cao đo được và cũng hòa tan vào nước RO thành các nồng độ trên
Sau khi cho một lượng chitosan vào dung dịch lactic acid vào và khuấy ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất, ta cho một lượng dung dịch
DS hoặc cao trầu với nồng độ được pha sẵn vào và tiếp tục khuấy, hỗn hợp sau đó được làm lạnh xuống 5 o C bằng bể đá Đồng thời hòa tan một lượng β-GP thích hợp vào nước RO, làm lạnh xuống 5 o C rồi nhỏ từ từ từng giọt dung dịch β-GP này vào dung dịch chitosan đã được chuẩn bị trước đó ở 5 o C để tránh sự gel hóa cục bộ trong quá trình phản ứng Khuấy hệ phản ứng ở 5 o C trong vòng 1 giờ, sau đó gel hóa ở nhiệt độ 37 o C để thu hệ Chitosan-β-glycerophosphate đã load DS hoặc trầu.
Khảo sát tốc độ, tỷ lệ giải phóng hoạt chất từ hydrogel CS-β-GP
Mỗi mẫu hydrogel CS-β-GP đã được nạp hoạt chất ở dạng sol sẽ được hút 2ml cho vào hũ bi giống nhau, sau đó ủ ở 37 o C để thu được dạng gel Tiếp đến, 6ml dung dịch đệm phosphate (PBS, pH = 7.4) được cho vào hũ bi để làm môi trường giải phóng Các hũ bi sau đó sẽ được ổn định nhiệt độ 37 o C hoặc 39 o C để hoạt chất từ bên trong hệ hydrogel giải phóng ra ngoài
Tại mỗi khoảng thời gian xác định, dung dịch giải phóng cũ được lấy ra và dung dịch giải phóng mới được cho vào Sau khi ly tâm, phần dung dịch nổi phía trên của môi trường giải phóng đã lấy đi được thu thập và phân tích Nồng độ của
DS trong các dung dịch này được xác định bằng máy quang phổ UV-VIS ở bước sóng 277 nm Đối với hoạt chất là cao trầu thì quá trình giải phóng được tính dựa trên lượng flavonoid giải phóng ra khỏi hệ hydrogel bằng cách định lượng flavonoid có trong môi trường theo phương pháp AlCl3 ở bước sóng 425nm như đã trình bày ở trên
Phần trăm lượng thuốc đã giải phóng tích lũy (% Cumulative drug release –
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Tổng hợp hydrogel chitosan-β-glycerophosphate
3.1.1 Cấu trúc hydrogel chitosan-β-glycerophosphate thu được theo phổ hồng ngoại FT-IR
Mẫu hydrogel chitosan-β-glycerophosphate sau khi tổng hợp theo quy trình
2.3.1 được phân tích bằng phổ hồng ngoại FT-IR để xác định các nhóm chức có mặt trong sản phẩm
Hình 3.1 Phổ hồng ngoại FT-IR của hydrogel chitosan-β-glycerophosphate thu được sau khi tổng hợp a) và của bài báo tham khảo b) [99]
Dãy hấp thu rộng ở 3226 cm -1 thể hiện cho nhóm -OH có trong cấu trúc của CS-β-GP, đồng thời cũng thể hiện cho dao động kéo dãn của liên kết N-H trong cấu trúc của CS Các dãy hấp thu ở 2924 cm -1 và 2866 cm -1 biểu hiện cho dao động kéo dãn và dao động uốn của nhóm CH2 trong CS-β-GP
Một đỉnh hấp thu ở 1659 cm -1 đặc trưng cho dao động kéo dãn của nhóm C=O có trong nhóm CH3-C=O- liên kết với amine bậc 2 ở trong cấu trúc của chuỗi CS Liên kết P=O trong phân tử β-GP cũng được thể hiện qua dãy hấp thu này Dãy hấp thu ở 1111 cm -1 ứng với dao động kéo dãn của nhóm C-O-C trong cấu trúc polysaccharide của phân tử CS Một đỉnh hấp thu mạnh ở 1054 cm -1 thể hiện cho liên kết P-O và đỉnh hấp thu ở 961 cm -1 đặc trưng cho liên kết P-OH trong cấu trúc của β-GP
Thông qua phổ FT–IR thu được của sản phẩm đã cho thấy các nhóm chức cùng với các liên kết đặc trưng của phân tử CS và β-GP có trong hydrogel CS-β-
GP Đồng thời, ta có thể thấy sự tương đồng giữa phổ FT-IR thu được so với phổ của bài báo tham khảo [99]
3.1.2 Đặc điểm hình thái của hydrogel chitosan-β-glycerophosphate quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét
Sau khi được tổng hợp và sấy thăng hoa, các mẫu hydrogel được kiểm tra kích thước và độ đồng đều lỗ thông qua kính hiển vi điện tử quét SEM và thu được kết quả như Hình 3.2 Ảnh chụp SEM của các mẫu hydrogel cho thấy hydrogel CSH-β-GP tổng hợp được có cấu trúc lỗ rỗng liên kết với nhau tạo thành một mạng lưới ba chiều Kích thước lỗ trung bình của các mẫu hydrogel tổng hợp với tỉ lệ β-GP khác nhau được trình bày ở Bảng 3.1 , khi tăng nồng độ β-GP từ 3% lên 5% (w/v) thì kích thước mắt lưới giảm dần 55.62 xuống 28.71 m
45 a) 1 %CSH – 3 % β-GP b) 1 %CSH – 4 % β-GP c) 1 %CSH – 5 % β-GP
Hình 3.2 Hình ảnh kính hiển vi điện tử quét (SEM) của các mẫu hydrogel chitosan- β-glycerophosphate 1%CSH – a) 3% β-GP, b) 4% β-GP và c) 5% β-GP
Bảng 3.1 Đường kính lỗ trung bình của các mẫu hydrogel chitosan-β- glycerophosphate
Mẫu hydrogel Đường kính lỗ trung bình (m)
Rõ ràng, một trong các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước mắt lưới đó là mật độ liên kết ngang, được quyết định một phần bởi nồng độ của β-GP có trong hydrogel thu được Như vậy nồng độ β-GP tăng sẽ làm tăng liên kết ngang do tăng tương tác ion giữa β-GP và chitosan nên kích thước mắt lưới giảm.
Khả năng chuyển pha sol-gel của hydrogel nhạy nhiệt chitosan-β-
Quá trình chuyển pha đặc trưng của hydrogel chitosan-β-glycerophosphate là sự chuyển đổi pha từ dạng “sol’ sang dạng “gel” Để nghiên cứu khả năng tạo gel
46 của sản phẩm phù hợp cho các ứng dụng như tiêm (dưới da), băng dính vết thương,… thì nhiều công thức hydrogel với thành phần khác nhau đã được khảo sát trong nghiên cứu này.
3.2.1 Khảo sát thời gian chuyển pha sol-gel của hydrogel chitosan-β- glycerophosphate ở nhiệt độ 37 °C và 39 °C
Thời gian gel hóa của hydrogel là một trong những yếu tố có ý nghĩa quan trọng để lựa chọn hydrogel phù hợp cho ứng dụng tiêm tại chỗ Nếu thời gian gel hóa quá dài sẽ dẫn đến sự suy giảm hay chuyển hóa các hoạt chất có trong hydrogel làm suy giảm tác dụng của thuốc hoặc tạo ra các sản phẩm chuyển hóa độc hại, bên cạnh đó đòi hỏi người bệnh phải giữ vị trí cố định trong thời gian lâu hơn Nhưng nếu thời gian gel hóa quá nhanh sẽ dẫn đến khó khăn trong việc chuẩn bị hoặc gây tắc ống tiêm trong quá trình sử dụng
Khả năng tạo gel được thể hiện thông qua thời gian tạo gel của hydrogel chitosan-β-glycerophosphate ở nhiệt độ 37 °C và 39 °C đã được quan sát và ghi nhận
Bảng 3.2 Thông số thành phần và khả năng chuyển pha sol-gel của hydrogel chitosan-β-glycerophosphate a) CS H và b) CS M ở nhiệt độ 37 °C và 39 °C a)
Bảng 3.2 thể hiện thời gian chuyển pha của hydrogel được tổng hợp theo các công thức, thành phần CS và β-GP khác nhau Kết quả thực nghiệm cho thấy, khi nồng độ β-GP tăng dần với nồng độ CS không đổi là 0.5% hoặc 1% w/v thời gian tạo gel có xu hướng giảm Điều này có thể được giải thích là do khi tăng nồng độ cross-linker (β-GP) giúp trung hòa mật độ điện tích dương có trong chuỗi CS tốt hơn và tạo thành nhiều cầu nối kéo các chuỗi CS gần lại với nhau dẫn đến việc tăng tương tác kị nước và liên kết hydro giữa các chuỗi CS giúp tăng khả năng gel hóa và giảm thời gian gel hóa của hydrogel Đối với các mẫu CSH 0.5% và CSM 1% khi nồng độ β-GP thấp hơn 5% thì không có khả năng tạo gel khi ủ trong khoảng nhiệt độ từ 37-39 °C với thời gian ủ trên 60 phút Khi nồng độ β-GP quá thấp thì sẽ không đủ để trung hòa mật độ điện tích dương có trong chuỗi CS dẫn đến việc lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi CS ngăn cản quá trình hình thành gel Khi sử dụng CSH 1% thì nồng độ β-GP trong hydrogel chỉ cần 3% thì có thể hình thành gel, điều này cho thấy khi tăng nồng độ hoặc khối lượng phân tử CS thì có thể giảm lượng β-GP mà vẫn đảm bảo được khả năng tạo gel
Mặt khác, với nhiệt độ ủ là 39 °C khi tăng nồng độ CSH từ 0.5% lên 1% w/v và giữ nguyên nồng độ β-GP là 5%, thời gian gel hóa giảm 6 lần Đồng thời với cùng nồng độ CS 1% và β-GP 5%, CSH giúp giảm thời gian gel so với CSM 3 lần Điều này là do mạch CS càng dài và nồng độ CS trong công thức hydrogel càng lớn thì có thêm nhiều nhóm –OH và –NH giúp tăng số lượng liên kết hydro giữa các phân tử CS giúp việc gel hóa dễ dàng hơn [100]
48 a) Dạng sol (25 °C) b) Dạng gel 90 o (37°C) c) Dạng gel 180 o (37°C)
Hình 3.3 Hydrogel ở dạng sol ở nhiệt độ phòng 25 °C và ở dạng gel ở nhiệt độ cơ thể 37 °C
Nhiệt độ cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ tạo gel Mọi công thức hydrogel khảo sát đều ổn định ở dạng sol khi nhiệt độ môi trường bên ngoài là 25 °C, giúp cho quá trình bảo quản và ứng dụng hydrogel trở nên dễ dàng hơn Khi nhiệt độ môi trường là 39°C thì tốc độ tạo gel nhanh hơn so với ở 37°C, tăng khả năng ứng dụng trong các tế bào viêm
Bên cạnh đó, một số nghiên cứu khác cũng cho các kết quả tương tự Trong nghiên cứu của Chenite và các cộng sự (2001), khi giữ nguyên nồng độ CS là 2% và nồng độ β-GP trong hydrogel tăng từ 0–8% thì thời gian gel hóa giảm dần từ 13–2 phút, với công thức hydrogel 2% CS – 0.262M β-GP khi tăng nhiệt độ từ 32 đến 47 °C thì thời gian gel giảm 19 lần [101] Năm 2011 Qi Feng Dang và cộng sự cũng đã nghiên cứu về khả năng chuyển pha của hệ hydrogel chitosan-glycerophosphate, kết quả cho thấy khi giữ nguyên nồng độ CS là 0.18% và thay đổi β-GP 2–8% thì thời gian gel giảm dần từ 3-1 phút [102] Sự ảnh hưởng của nồng độ và khối lượng phân tử CS đến hydrogel đã được Hui Yun Zhou (2007) khảo sát, khi tăng khối lượng CS từ 88 – 1360 kDa và nồng độ CS tăng từ 1 – 3% thì độ nhớt của hydrogel tăng, khả năng tạo gel nhanh hơn [103]
Do β-GP có giá thành cao, khả năng tương thích sinh học kém hơn so với chitosan, để giảm chi phí sản xuất và tăng khả năng ứng dụng của hydrogel cần giảm lượng β-GP có trong công thức mà vẫn giữ được thời gian gel hóa phù hợp
Các công thức hydrogel với nồng độ CSH 1% được chọn để khảo sát khả năng nạp và giải phóng hoạt chất
3.2.2 Khảo sát quá trình chuyển pha sol-gel của hydrogel chitosan-β- glycerophosphate theo nhiệt độ
Khảo sát nhiệt độ gel hóa của các mẫu hydrogel chitosan-β-glycerophosphate thu được khi thay đổi nồng độ CSH, nồng độ β-GP Quá trình được thực hiện bằng phương pháp đảo ngược ống nghiệm, tất cả các mẫu được đặt trong bể điều nhiệt và được ổn định nhiệt độ ở 25 °C sau đó tiến hành tăng nhiệt độ với tốc độ khoảng 0.5 °C /phút đến khi quá trình chuyển pha xảy ra thì ghi lại nhiệt độ đó
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn quá trình chuyển pha sol-gel của hydrogel chitosan-β- glycerophosphate khi tổng hợp với Chitosan (high) nồng độ khác nhau
Khả năng sol-gel theo nhiệt độ của hydrogel thu được khi tổng hợp với nồng độ CSH khác nhau là 0.5% và 1% w/v được thể hiện ở Hình 3.4 Nhìn chung, khi nồng độ CSH trong hydrogel được giữ nguyên và nồng độ β-GP tăng dần từ 3% đến 10% thì nhiệt độ chuyển pha của hydrogel giảm dần từ 38 đến 31.5 °C đối với mẫu
CSH 1% Đối với mẫu 0.5% khi nồng độ β-GP tăng từ 3% đến 7% thì nhiệt độ chuyển pha giảm mạnh từ 62 đến 41°C và giảm dần đến 37 °C khi nồng độ β-GP tăng đến 10% Như vậy khi tăng nồng độ β-GP trong công thức hydrogel chitosan-
50 β-glycerophosphate thì nhiệt độ gel hóa của hydrogel giảm và quá trình hình thành gel trở nên dễ dàng hơn
Sự ảnh hưởng này có thể giải thích là do ảnh hưởng của β-GP đến quá trình gel hóa Các tương tác gây ra sự chuyển đổi sol-gel trong dung dịch CS-β-GP là: (1) lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi chitosan tích điện dương; (2) lực hút tĩnh điện giữa các nhóm amin của chitosan và nhóm phosphate của β-GP; và (3) tương tác kỵ nước và liên kết hydro giữa các chuỗi chitosan Các nhóm –OH của β-GP cung cấp thêm sự hydrat hóa do liên kết hidro với các phân tử nước, do đó ngăn ngừa sự hình thành gel dưới nhiệt độ sinh lý Khi nhiệt độ môi trường tăng lên đến nhiệt độ chuyển pha thì các phân tử chitosan loại bỏ nước dần do liên kết hydro bị đứt và dẫn đến sự hình thành [104]
Khi nồng độ β-GP thấp, số lượng các nhóm phosphate không đủ để trung hòa các nhóm amine tích điện có trong phân tử CS, làm cho chuỗi CS đẩy nhau ra và khó có thể tập trung lại Để trung hòa mật độ điện tích dương trên chuỗi chitosan, cần một lượng muối β-GP tối thiểu Sau khi vượt qua ngưỡng này, lực hút tĩnh điện giữa các nhóm phosphate của phân tử β-GP và các nhóm amin của chitosan cho phép tạo ra liên kết hydro qua OH–NH và O–HN của chuỗi chitosan Do đó, việc bổ sung muối β-GP vào dung dịch nước chitosan điều chỉnh các tương tác tĩnh điện và kỵ nước, và liên kết hydro giữa các chuỗi CS, là động lực chính trong việc hình thành gel và giảm nhiệt độ chuyển pha của hydrogel
Bên cạnh đó, khi so sánh hai kết quả của hydrogel ở nồng độ CSH 0.5% và 1% w/v trong khoảng nồng độ β-GP 3-5% thì sự chênh lệch nhiệt độ chuyển pha rất lớn và giảm dần khi β-GP tăng đến 10% Đường chuyển pha sol-gel của hydrogel khi tổng hợp với CSH 1% bị dịch chuyển xuống vùng nhiệt độ thấp hơn so với CSH
0.5% Như vậy, khi tăng nồng độ CS có trong phân tử hydrogel thì nhiệt độ chuyển pha của hydrogel giảm Điều này có thể giải thích là do nồng độ polymer CS cao hơn dẫn đến nhiều nhóm –OH và –NH hơn nên liên kết hydro giữa các phân tử CS nhiều tạo sự kết tụ dễ dàng; tạo thành gel nhanh hơn so với những loại có nồng độ
So sánh với kết quả nghiên cứu của Jaepyoung Cho và cộng sự (2006), các mẫu hydrogel được dùng để khảo sát với nồng độ CS 0.1 – 0.2 M và nồng độ β-GP thay đổi từ 0.33 – 0.83 M, có sự tương đồng giữa sự thay đổi nhiệt độ chuyển pha của hydrogel trong nghiên cứu này ( Hình 3 4) và bài báo tham khảo Cụ thể là khi tăng nồng độ β-GP từ 0.33 đến 0.83 M và giữ nguyên nồng độ CS 0.15M thì nhiệt độ chuyển pha của hydrogel giảm từ 79đến 58 °C ( Hình 3.5 ) Khi tăng nồng độ CS từ 0.1 đến 0.2 M và giữ nguyên nồng độ β-GP là 0.66M thì nhiệt độ chuyển pha giảm từ 70 đến 58°C
Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn quá trình chuyển pha sol-gel của hydrogel chitosan-β- glycerophosphate của Jaepyoung Cho và cộng sự [105]
Nạp hoạt chất vào hệ hydrogel chitosan-β-glycerophosphate
Hệ hydrogel chitosan-β-glycerophosphate được nạp hoạt chất Diclofenac Sodium (DS) và cao trầu với nồng độ khác nhau (1–3 mg/mL) theo phương pháp in situ được phân tích bằng ảnh chụp SEM và khảo sát khả năng sol-gel
3.3.1 Đặc điểm hình thái của hydrogel chitosan-β-glycerophosphate sau khi nạp hoạt chất quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét a) CSH-β-GP (1% CSH – 4% β-GP) b) CSH-β-GP-DS 2 mg/mL c) CSH-β-GP-Cao trầu 2 mg/mL
Hình 3.7 Hình ảnh kính hiển vi điện tử quét (SEM) của các mẫu hydrogel chitosan- β-glycerophosphate (1% CSH – 4% β-GP) trước và sau khi nạp hoạt chất
Các mẫu hydrogel sau khi đã được nạp hoạt chất có số lượng và kích thước mắt lưới giảm rõ rệt so với khi chưa được nạp (Hình 3.7) Điều này là do các hoạt chất đã lấp đầy vào các mắt lưới và bị giữ lại ở trong mạng cấu trúc 3 chiều của hydrogel, do đó có thể chứng minh được rằng hệ hydrogel chitosan-β- glycerophosphate được nạp thuốc thành công bằng phương pháp in situ
3.3.2 Khảo sát quá trình chuyển pha sol-gel của hydrogel chitosan-β- glycerophosphate đã nạp hoạt chất theo nhiệt độ
Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn quá trình chuyển pha sol-gel của hydrogel chitosan-β- glycerophosphate đã nạp hoạt chất a) Diclofenac Sodium; b) Cao trầu
Hình 3.9 Hydrogel chitosan-β-glycerophosphate ở dạng gel sau khi đã load hoạt chất DS (trái) và cao trầu (phải)
DS và trầu với nồng độ 2 mg/mL được nạp vào hydrogel ( Hình 3.9 ) với các hệ hydrogel khác nhau để khảo sát quá trình chuyển đổi pha sol-gel, quá trình này được thực hiện giống như khi khảo sát hệ hydrogel không có hoạt chất được trình bày ở mục 3.2.2
Hydrogel CSH--GP-DS có nhiệt độ chuyển pha cao hơn so với lúc chưa nạp ở cả hai công thức với nồng độ CSH khác nhau là 0.5% và 1% w/v, sự chênh lệch nhiệt độ trước và sau khi nạp ở công thức 0.5% CS cao hơn 1% CS và giảm dần khi tăng nồng độ β-GP có trong hydrogel (Hình 3.8a) Khi nồng độ CS trong hydrogel là 0.5% tại nồng độ β-GP là 9% thì không có sự chênh lệch nhiệt độ chuyển pha giữa hydrogel có và không có DS, đối với hydrogel CS 1% thì giá trị này là 7% Đối với hoạt chất là cao trầu cũng cho kết quả tương tự (Hình 3.8b) , nhưng nhiệt độ chuyển pha khi nạp trầu cao hơn DS 65 o C so với 63.5 o C (0.5% CSH– 3% β-GP) và 39.5°C so với 39°C (1% CSH – 3% β-GP) Do đó có thể kết luận rằng, hệ hydrogel chitosan-β-glycerophosphatesau khi đã được nạp hoạt chất vẫn có khả năng chuyển pha sol-gel theo nhiệt độ và không có khác biệt quá lớn so với hệ hydrogel ban đầu (