Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu tổng hợp nanochitosan và ứng dụng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS.TS Lê Thị Kim Phụng

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 Chủ tịch: PGS TS Nguyễn Thị Phương Phong 2 Phản biện 1: TS Trần Phước Nhật Uyên

3 Phản biện 2: TS Hà Cẩm Anh 4 Ủy viên: TS Trần Tấn Việt 5 Thư ký, ủy viên: TS Lê Vũ Hà

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Trần Thanh Việt MSHV: 2170175

Ngày/tháng/năm sinh: 06/07/1998 Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Kỹ thuật hóa học Mã số: 8520301

1 Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp nanochitosan và ứng dụng

(Synthesis of nanochitosan and applications)

2 Nội dung thực hiện:

- Chiết xuất và định lượng thành phần cao lá trầu

- Nghiên cứu tổng hợp và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất lý hóa của nanochitosan mang chiết xuất lá trầu

- Nghiên cứu tổng hợp và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất lý hóa của nanochitosan mang tinh dầu sả

- Nghiên cứu tổng hợp và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất lý hóa của nanochitosan mang ion kẽm

- Đánh giá hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, kháng nấm và kháng oxi hóa) của vật liệu

- Đánh giá ứng dụng của vật liệu (bảo quản trái cây, màng kháng khuẩn)

3 Ngày giao nhiệm vụ: 09/2022

4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 05/2023

5 Họ và tên người hướng dẫn: PGS TS Lê Thị Kim Phụng

TP Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 05 năm 2023

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Sau hơn một năm thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ tại Trung tâm Nghiên cứu Công nghệ Lọc Hóa Dầu (RPTC) – Đại học Bách Khoa TP.HCM Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến cô PGS.TS Lê Thị Kim Phụng và nhóm nghiên cứu Kỹ Thuật Quá Trình Bền Vững đã tạo điều kiện thực hiện, cũng như định hướng và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu của mình

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Đỗ Nguyễn Hoàng Nga, người đã tận tình chỉ dẫn, góp ý, động viên trong những lúc tôi gặp khó khăn Xin cám ơn em Lý Bội Tuyền và các bạn đồng nghiệp khác tại trung tâm đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian nghiên cứu Ngoài ra, tôi cũng xin cảm ơn các bạn sinh viên K19 tại lab đã cùng nhau làm việc, trao đổi để hoàn thành tốt định hướng nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên và là chỗ dựa vững chắc trong khoảng thời gian này và mai sau

Xin chân thành cảm ơn!

Trần Thanh Việt

TÓM TẮT

Thực trạng lạm dụng hóa chất tổng hợp nhằm kéo dài thời gian bảo quản các loại nông sản và thực phẩm đã gây ra các hệ lụy nghiêm trọng ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường và sức khỏe của người tiêu dùng Trong khi đó, các chế phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên lại ít được quan tâm và khai thác hiệu quả Chitosan có nguồn gốc chủ yếu từ vỏ tôm, cua với các tính chất đặc biệt như khả năng tạo màng sinh học, kháng khuẩn và kháng nấm tốt Bên cạnh đó, lá trầu, sả và ion kẽm là các thành phần phổ biến, dễ tìm, có khả năng kháng lại các mầm bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra Tuy nhiên, các thành phần tự nhiên dễ bị biến tính, kém ổn định với điều kiện môi trường như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm…, các ion kẽm cho thấy hoạt tính khi sử dụng với hàm lượng cao có thể gây độc Trong nghiên cứu này, hệ vi bao mang chiết xuất lá trầu (NCS-PB), tinh dầu sả (NCS-LEO) và ion kẽm (NCS-Zn) từ chitosan sử dụng phương pháp gel hóa ion kết hợp với công nghệ siêu âm được sử dụng để chế tạo chế phẩm có thể khắc phục các nhược điểm nêu trên Phương pháp trích ly cao lá trầu có hỗ trợ siêu âm cho hiệu suất thu hồi đạt 29,37% với hàm lượng flavonoid tổng cao nhất đạt 1584,89 mg rutin/g cao khô, làm nguyên liệu cho quy trình tổng hợp các NCS-PB Các hạt NCS-PB, NCS-LEO và NCS-Zn có kích thước trung bình tương ứng là 372,9; 715,6 và 261,9 nm, độ ổn định cao với thế zeta từ 26,5; 25,0 và 30,0 mV; chỉ số PDI từ 0,333; 0,410 và 0,400 Ngoài ra,

NCS-PB, NCS-LEO và NCS-Zn có khả năng ức chế hiệu quả các vi khuẩn E coli,

S aureus trong thử nghiệm in vitro, khả năng kháng oxi hóa cao thông qua hiệu

suất bắt gốc tự do DPPH đạt 98,23% NCS-PB và NCS-LEO còn được ứng dụng để kéo dài thời gian bảo quản dâu tây đến 15 ngày và chế tạo màng sinh học có khả năng kháng khuẩn hiệu quả Do đó, các hạt nanochitosan mang chiết xuất lá trầu, tinh dầu sả và ion kẽm được đánh giá là vật liệu tiềm năng, an toàn và hiệu quả cho ứng dụng bảo quản trước và sau thu hoạch, giảm thiểu sử dụng hóa chất tổng hợp ảnh hưởng đến sức khoẻ con người và ô nhiễm môi trường

ABSTRACT

The abuse of synthetic chemicals to prolong the shelf life of agricultural products and foodstuffs has caused serious consequences, directly affecting the environment and consumers' health Meanwhile, preparations derived from nature are less interesting and exploited effectively Chitosan is derived mainly from shrimp and crab shells with excellent properties such as good biofilm, antibacterial and antifungal ability Besides, betel leaf, lemongrass, and zinc ions are common ingredients, abundant and resistant to pathogens caused by bacteria and fungi However, natural ingredients are easily denatured and less stable to environmental conditions such as light, temperature, and humidity ., zinc ions show bioactivity when used with high levels that can be toxic In this study, chitosan-based nanoencapsulation of betel leaf extract (NCS-PB), lemongrass essential oil (NCS-LEO), and zinc ion (NCS-Zn) using ionic gelation method combined with ultrasonic technology can overcome the mentioned disadvantages The ultrasound-assisted extraction of betel leaf yielded a recovery efficiency of 29.37% with the highest total flavonoid content of 1584.89 mg rutin/g extract, as the raw material for the synthesis of NCS-PB The NCS-PB, NCS-LEO, and NCS-Zn particles have average sizes of 372.9, 715.6, and 261.9 nm, high stability with zeta potential of 26.5, 25.0, and 30 mV, PDI of 0.333, 0.410, and 0.400, respectively, which are determined by Dynamic Light Scattering In addition, NCS-PB, NCS-LEO, and NCS-Zn show the

effective inhibition of E coli, S aureus bacteria by in vitro test, high oxidation

resistance through DPPH radical scavenging activity of 98.23% PB and LEO are also used in strawberry storage for up to 15 days and in fabricating antimicrobial films Therefore, betel leaf extract, lemongrass essential oil, and zinc ions encapsulated in nanochitosan are potential, safe, and highly effective materials for pre- and post-harvest preservation, minimizing synthetic preservatives that affect human health and environmental pollution

NCS-LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và thông tin trích dẫn trong đề tài được thực hiện đúng với các quy định và ghi rõ trong danh mục tài liệu tham khảo Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố dưới bất kỳ hình thức nào Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng cũng như kết quả luận văn của mình

Học viên cao học

Trần Thanh Việt

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 18

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 18

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.2 Hoá chất, thiết bị và dụng cụ 18

2.3 Chiết xuất và định lượng thành phần cao lá trầu 19

2.4 Quy trình tổng hợp nanochitosan mang chiết xuất lá trầu 21

2.5 Quy trình tổng hợp nanochitosan mang tinh dầu sả 22

2.6 Quy trình tổng hợp nanochitosan mang ion kẽm 24

2.7 Phương pháp phân tích vật liệu 25

2.7.1 Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng flavonoid tổng của cao chiết 25

2.7.2 Phân tích phân bố kích thước hạt 26

2.7.3 Phân tích hình thái và kích thước hạt 28

2.7.4 Xác định hiệu suất bao bọc và khả năng tải của hạt 29

2.7.5 Phân tích cấu trúc hạt 30

2.7.6 Phân tích tính chất hóa học 30

2.7.7 Đánh giá hoạt tính sinh học 31

2.7.8 Đánh giá khả năng ứng dụng của vật liệu 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36

3.1 Chiết xuất và định lượng cao chiết lá trầu 36

3.2 Tổng hợp nanochitosan mang chiết xuất lá trầu (NCS-PB) 37

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến kích thước của NCS-PB 37

3.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng cao lá trầu và chitosan đến kích thước của NCS-PB 39

3.2.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng chitosan và STPP đến kích thước của NCS-PB 40

3.2.4 Hiệu suất bao bọc và khả năng tải của NCS-PB 41

3.3 Tổng hợp nanochitosan mang tinh dầu sả (NCS-LEO) 42

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến kích thước của NCS-LEO 42

3.3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng tinh dầu sả và chitosan đến kích thước của NCS-LEO 43

3.3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng chitosan và STPP đến kích thước của NCS-LEO 45

3.3.4 Hiệu suất bao bọc và khả năng tải của NCS-LEO 46

3.4 Tổng hợp nanochitosan mang ion kẽm (NCS-Zn) 46

3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến kích thước của NCS-Zn 46

3.4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng Zn2+/CS đến kích thước của NCS-Zn 47

3.4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng chitosan và STPP đến kích thước của

NCS-Zn 48

3.4.4 Hiệu suất bao bọc và khả năng tải của NCS-Zn 50

3.5 Hình thái học của vật liệu 50

3.6 Tính chất hóa học của vật liệu 52

3.7 Cấu trúc của vật liệu 53

3.8 Hoạt tính sinh học của vật liệu 54

3.8.1 Khả năng kháng khuẩn và kháng nấm 54

3.8.2 Khả năng kháng oxi hóa 55

3.9 Đánh giá khả năng ứng dụng của vật liệu 56

3.9.1 Ứng dụng dịch nhúng bảo quản trái cây sau thu hoạch 56

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CNC Cellulose Nanocrystals Nanocellulose tinh thể

DLS Dynamic Light Scattering Tán xạ ánh sáng động

FESEM Field Emission Scanning Electron Microscope

Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường

FTIR Fourrier Transform Infrared spectroscopy

Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier

IC50 Half-maximal Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế một nửa LEO Lemongrass essential oil Tinh dầu sả

MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

PDI Poly Dispersity Index Chỉ số phân bố kích thước

STPP Sodium Tripolyphosphate Natri tripolyphotphat UV-VIS Ultravioliet – Visible Quang phổ tử ngoại khả

kiến

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của phân tử chitin (a) và chitosan (b) 2

Hình 1.2 Các nhóm chức trong cấu trúc hoá học của chitosan 3

Hình 1.3 Cơ chế kháng khuẩn gram âm (trái) và gram dương (phải) của chitosan 4

Hình 1.4 Cơ chế tổng hợp nanochitosan bằng phương pháp gel ion 7

Hình 1.5 Một số ứng dụng của nanochitosan trong các lĩnh vực 8

Hình 1.6 Cơ chế tổng hợp nanochitosan kết hợp với tinh dầu sử dụng phương pháp gel hóa ion 16

Hình 2.1 Quy trình xử lý nguyên liệu 19

Hình 2.2 Quy trình chiết cao lá trầu có hỗ trợ siêu âm .20

Hình 2.3 Quy trình chiết cao lá trầu có hỗ trợ enzyme .21

Hình 2.4 Quy trình tổng hợp nanochitosan mang chiết xuất lá trầu .22

Hình 2.5 Quy trình tổng hợp nanochitosan mang tinh dầu sả .23

Hình 2.6 Quy trình tổng hợp nanochitosan mang ion kẽm .24

Hình 2.7 Cơ chế phản ứng của các hợp chất flavonoid và thuốc thử AlCl3 với sự có mặt của NaNO2 26

Hình 2.8 Thiết bị UV-VIS 754 Stech International 26

Hình 2.9 Thiết bị DLS Zetasizer Nano ZS .28

Hình 2.10 Thiết bị FE-SEM S4800 (Hitachi) .29

Hình 2.11 Thiết bị D8 ADVANCE (Bruker) .30

Hình 2.12 Thiết bị ALPHA II (Bruker) .31

Hình 2.13 Thiết bị đo quang Gene Quant 1300 .32

Hình 2.14 Cơ chế bắt gốc tự do DPPH của gallic acid 33

Hình 2.15 Quy trình tổng hợp CNC từ rơm (A) và quy trình chế tạo màng PVA/CNC/NCS-LEO (B) .35

Hình 3.1 Hiệu suất thu hồi và hàm lượng TFC của cao lá trầu sử dụng các phương pháp chiết khác nhau .36

Hình 3.2 Hiệu suất thu hồi và hàm lượng TFC của cao lá trầu sử dụng phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm ở các thời gian xử lý khác nhau .37

Hình 3.3 Kích thước trung bình (A), PDI và thế zeta (B) của NCS-PB theo các

Hình 3.10 EE và LC của NCS-LEO theo các tỷ lệ LEO/CS khác nhau .46

Hình 3.11 Kích thước trung bình (A), PDI và thế zeta (B) của NCS-Zn theo các nồng độ chitosan khác nhau .47

Hình 3.12 Kích thước trung bình (A) , PDI và thế zeta (B) của NCS-Zn ở các tỷ lệ Zn2+/CS khác nhau .48

Hình 3.13 Kích thước trung bình (A), PDI và thế zeta (B) của NCS-Zn ở các tỷ lệ CS/STPP khác nhau .49

Hình 3.14 Hiệu suất bao bọc và khả năng tải của NCS-Zn theo các tỷ lệ Zn2+/CS khác nhau 50

Hình 3.15 Ảnh FE-SEM của NCS (A), NCS-PB (B), NCS-LEO (C), NCS-Zn (D) ở độ phóng đại 120k .51

Hình 3.16 Phổ EDX của NCS-Zn .51

Hình 3.17 Phổ FTIR của CS, NCS, PB, LEO, NCS-PB và NCS-LEO .52

Hình 3.18 Phổ FTIR của NCS, ZnSO4 và NCS-Zn .53

Hình 3.19 Phổ XRD của CS, NCS, NCS-PB, NCS-LEO, NCS-Zn .54

Hình 3.20 Khả năng kháng oxi hóa của NCS-PB và NCS-LEO theo tỷ lệ khối

lượng hoạt chất/chitosan khác nhau .56

Hình 3.21 Độ hụt khối của dâu tây đối chứng và được xử lý với các nghiệm thức

CS 0,5; NCS 0,5; CS-PB; NCS-PB và OG thương mại 57

Hình 3.22 Độ hụt khối của dâu tây đối chứng và được xử lý với các nghiệm thức

CS 0,7; NCS 0,7; CS-LEO và NCS-LEO .57

Hình 3.23 Ảnh màng PVA (A), PVA/CNC (B) và PVA/CNC/NCS-LEO (C) .61

Hình 3.24 Hiệu quả ức chế vi khuẩn E coli và S aureus của màng PVA/CNC và

PVA/CNC/NCS-LEO .61

Bảng 2.2 Các yếu tố khảo sát trong quy trình tổng hợp NCS-LT 22

Bảng 2.3 Các yếu tố khảo sát trong quy trình tổng hợp NCS-LEO 23

Bảng 2.4 Các yếu tố khảo sát trong quy trình tổng hợp NCS-Zn 24

Bảng 2.5 Các nghiệm thức sử dụng bảo quản dâu tây 34

Bảng 3.1 MIC (ppm) kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất tự nhiên 55

Bảng 3.2 Hiệu quả ức chế vi khuẩn E.coli và S.aureus của CS 0,5; NCS 0,5; PB; và NCS-LEO; NCS 0,3 và NCS-Zn 55

NCS-Bảng 3.3 Nồng độ IC50 của các hợp chất tự nhiên 56

Bảng 3.4 Ngoại quan của dâu tây trong 15 ngày bảo quản 59

LỜI MỞ ĐẦU

Với sản lượng nông sản và thực phẩm ngày càng lớn, nhu cầu sử dụng các chất tổng hợp nhằm kéo dài thời gian lưu trữ, vận chuyển và tiêu dùng càng cao dẫn đến các hệ lụy nghiêm trọng như ngộ độc thực phầm, tỷ lệ ung thư gia tăng, hiệu quả bảo quản không cao gây lãng phí lương thực, thực phẩm… Bên cạnh đó, dư lượng thuốc hoá học thải ra gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường sinh thái

Trong khi đó, chitosan là một polymer sinh học có nguồn nguyên liệu phong phú chỉ sau cellulose trong tự nhiên Chitosan được chiết xuất từ vỏ giáp xác (tôm, cua), côn trùng, nấm với các tính chất nổi bật như khả năng tạo màng, tính kháng khuẩn, kháng nấm, tương thích sinh học cao, thân thiện với môi trường đang được các nhà nghiên cứu quan tâm trong rất nhiều lĩnh lực như y học, thực phẩm, dệt may…, đặc biệt là trong nông nghiệp Nhiều công trình nghiên cứu về nanochitosan kết hợp các hợp chất hữu cơ và vô cơ được xem là đối tượng tiềm năng với đặc điểm kích thước nhỏ giúp dễ dàng thẩm thấu qua thành tế bào thực vật và khả năng kháng vi sinh vật cao hơn so với chitosan kích thước phân tử lớn

Các chiết xuất thực vật như lá điều, lá vối, lá huyền tinh… giàu hàm lượng các hợp chất polyphenol, flavonoid, alkaloid, tannin và các loại tinh dầu tự nhiên phổ biến như quế, sả chanh, tràm, bạc hà… có tính kháng khuẩn, kháng nấm và kháng oxi hóa cao Hơn nữa, các ion kim loại như Ag, Cu, Zn… được nghiên cứu có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm hiệu quả khi sử dụng với hàm lượng thích hợp Việc kết hợp giữa nanochitosan và các thành phần có hoạt tính sinh học này giúp tăng cường khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và kháng oxi hóa của vật liệu, tạo ra chế phẩm sinh học an toàn, hiệu quả cho bảo quản thực phẩm

Do đó, đề tài “Nghiên cứu tổng hợp nanochitosan và ứng dụng” có ý

nghĩa khoa học về sự kết hợp giữa nanochitosan và thành phần kể trên giúp tăng cường khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và kháng oxi hóa của vật liệu, góp phần giải quyết thực trạng lạm dụng thuốc hoá học trong bảo quản trước và sau thu hoạch, phát triền ngành nông nghiệp xanh và bền vững

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Chitosan

1.1.1 Nguồn gốc của chitosan

Chitin là một trong những polymer sinh học có nhiều trong tự nhiên chỉ sau cellulose, được tìm thấy trong thành phần từ các nguồn khác nhau như vỏ động vật giáp xác (tôm, cua, sò), thành tế bào của nấm, côn trùng… [1] Các nguồn nguyên liệu thô chiếm khoảng 20 – 30% chitin, 20 – 40% protein, 30 – 60% khoáng chất và gần 14% lipid [2] Chitin có nguồn gốc từ vỏ động vật giáp xác đầu tiên được loại bỏ canxi cacbonat (CaCO3) bằng axit clohydric (HCl) loãng, sau đó khử protein bằng dung dịch natri hydroxit (NaOH), tiếp tục tiến hành quá trình khử acetyl hóa bằng dung dịch NaOH 40 – 50%, mức độ acetyl hóa trên 50% [3]

Chitosan là sản phẩm deacetyl hoá của chitin, một polymer tự nhiên mạch thẳng có trọng lượng phân tử cao, bao gồm các D-glucosamine liên kết với các N-

acetyl-D-glucosamine bằng liên kết β-1,4-glucoside được mô tả như hình 1.1, sự phân

bố các tiểu đơn vị này phụ thuộc vào phương pháp điều chế chitosan [4, 5] Chitosan và các dẫn xuất của nó được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm bởi những tính chất độc đáo được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực như dược phẩm, y học, dệt may, nông nghiệp… [3] Đặc biệt trong nông nghiệp, chitosan và dẫn xuất oligochitosan được tìm hiểu và nghiên cứu ứng dụng trong thuốc bảo vệ thực vật với những tính chất nổi bậc như khả năng tạo màng, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa trong bảo quản nông sản và kích thích phản ứng phòng vệ của cây trồng chống lại vi sinh vật [6]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của phân tử chitin (a) và chitosan (b) [2] 1.1.2 Tính chất của chitosan

1.1.2.1 Tính chất lý hoá của chitosan

Khả năng hòa tan của chitosan trong môi trường acid yếu như acid acetic, acid lactic, acid citric… được giải thích dựa trên sự có mặt của các nhóm -NH2 được proton hóa, khi đó giá trị pKa xấp xỉ 6,5 Khi số nhóm amin được proton hóa lớn hơn 50%, chitosan trở nên dễ hòa tan hơn [7] Ngoài ra, khả năng hòa tan của chitosan phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như khối lượng phân tử, mức độ acetyl hóa, độ pH, nhiệt độ và độ kết tinh của polymer [8]

Hình 1.2 mô tả các nhóm chức trong cấu trúc phân tử chitosan, mỗi đơn vị

monomer bao gồm một nhóm amin (C2), hai nhóm hydroxyl (C6, C3), liên kết glycosidic và nhóm acetamide cũng được xem là một nhóm chức trong cấu trúc hoá học Các nhóm chức này cho phép thực hiện một số phản ứng tạo ra các dẫn xuất khác của chitosan với các đặc tính hoàn toàn mới [8]

Hình 1.2 Các nhóm chức trong cấu trúc hoá học của chitosan [8] 1.1.2.2 Tính kháng khuẩn của chitosan

Chitosan với hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng được ứng dụng rất nhiều trong nông nghiệp để bảo vệ thực vật [6] Cơ chế kháng khuẩn của chitosan được mô tả như

hình 1.3, do sự tương tác giữa các nhóm amine điện tích dương và các nhóm

carboxylate điện tích âm trên bề mặt tế bào vi khuẩn đã phá vỡ cấu trúc màng tế bào và tính toàn vẹn, gây rò rỉ các thành phần nội bào và chất điện giải ra môi trường bên ngoài làm chết vi sinh vật Ngoài ra, tính chất kháng khuẩn của chitosan còn phụ thuộc vào khối lượng phân tử, cho phép chitosan xuyên qua màng tế bào, vào tế bào

và cản trở sự tổng hợp các chức năng của DNA và RNA dẫn đến cái chết của vi sinh vật Trong khi đó, chitosan có khối lượng phân tử cao bao bọc bề mặt tế bào và ngăn cản các chất dinh dưỡng vào tế bào vi sinh vật, làm tế bào đói và gây chết tế bào [9]

Hình 1.3 Cơ chế kháng khuẩn gram âm (trái) và gram dương (phải) của chitosan [6]

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của chitosan như trọng lượng phân tử, nồng độ, nguồn gốc nguyên liệu, độ pH, chủng loài và số lượng vi khuẩn… cũng được khảo sát Cụ thể, chitosan có mức độ deacetyl hóa cao hơn có tác dụng kháng khuẩn tốt hơn Bên cạnh đó, tính kháng khuẩn của chitosan tăng lên khi có giá trị pH thấp do sự proton hóa và khả năng hòa tan cao hơn trong môi trường axit [5] Hơn nữa những nghiên cứu về mức độ kháng khuẩn tương ứng với khối lượng phân tử khác nhau của chitosan cũng được tiến hành để đánh giá Trong thử nghiệm kháng khuẩn trên dâu tây cho kết quả nghiên cứu màng chitosan có khối lượng phân tử cao và hàm lượng chitosan cao có khả năng kháng khuẩn hai loại vi khuẩn là

Staphylococcus aureus (S aureus) và Escherichia coli (E coli) tốt hơn [10]

Từ những công trình nghiên cứu cho thấy chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn Nồng độ ức chế tối thiểu khác nhau giữa các loài từ 10–1000 ppm Các dẫn xuất amoni bậc bốn của chitosan bao gồm N,N,N-trimethylchitosan, N–propyl–N,N-dimethylchitosan và N-furfuryl-N,N-dimethylchitosan đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc ức chế sự sinh trưởng

và phát triển của E coli, đặc biệt là trong môi trường axit Tương tự, một số dẫn xuất

khác của chitin và chitosan đã được chứng minh là có khả năng ức chế các vi khuẩn E

coli, S aureus và một số loài Bacillus [11]

1.1.2.3 Tính kháng nấm của chitosan

Chitosan có khả năng kháng nhiều loại nấm gây bệnh cho thực vật như

Penicillium expansum, Botrytis cinerea, Lasiodiplodia theobromae, Alternaria tenuissima và Fusarium oxysporum Ngoài khả năng kích thích sức đề kháng của thực

vật, chitosan tác động trực tiếp như một chất ngăn ngừa và diệt nấm bằng cách liên kết với bề mặt tế bào của nấm dẫn đến sự thẩm thấu của màng sinh chất và rò rỉ các vật

liệu nội bào Nhiều loài Aspergillus có khả năng gây thối rữa trái cây, gây bệnh cho

cây trồng và dẫn đến thiệt hại về mặt kinh tế trong nông nghiệp [12]

Nồng độ ức chế tăng trưởng tối thiểu của các loài từ 10 đến 5000 ppm, khả năng kháng nấm tối đa của chitosan thường được quan sát thấy xung quanh giá trị pKa của nó (pH=6.0) [11] Với tỷ lệ 1 mg/mL, chitosan có thể làm giảm sự phát triển trong

môi trường in vitro của một số loại nấm và oomycetes ngoại trừ Zygomycetes [13]

Một số nghiên cứu cho thấy khả năng kháng nấm gây hại cho thực vật của chitosan

như nấm Colletotrichum gloeosporides gây thối rữa xoài, nấm Penicillium expansum gây bệnh mốc xanh ở táo, nấm Phytophthora capsici gây bệnh bạc lá và thối trái của ớt, nấm Physalospora piricola và nấm Alternaria kikuchianaTanaka trên lê, nấm

Botrytis cinerea gây thối chùm nho, nấm Cladosporium spp và Rhizopus spp ở dâu

ngoài ra còn có một số vi khuẩn như E coli, L monocytogenes…

1.1.2.4 Khả năng kích thích phản ứng phòng vệ của thực vật

Ngoài khả năng kháng khuẩn và kháng nấm, chitosan còn giúp kích thích phản ứng phòng vệ của thực vật chống lại vi sinh vật Tăng sức đề kháng của thực vật đối với mầm bệnh thông qua việc điều tiết các enzyme liên quan đến hệ thống phòng vệ và thúc đẩy hoạt động của các protein chống lại bệnh (PR – protein) thông qua việc kích hoạt các thụ thể trên bề mặt tế bào hoặc màng từ các tác động bên trong lên DNA của thực vật, từ đó cấu trúc ảnh hưởng đến quá trình phiên mã gen Ngoài ra, các tác nhân bên ngoài cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của cây, kích thích tính kháng sinh của cây bằng cách mô phỏng sự hiện diện của mầm bệnh trên thực vật [14]

Bên cạnh việc điều tiết các enzyme, chitosan còn thúc đẩy hoạt động của các protein chống lại bệnh như chitinase và β-1,3-glucanase (hai loại protein PR) tham gia

vào quá trình chống lại mầm bệnh do khả năng làm phân hủy một phần thành phần tế bào các tác nhân gây bệnh [15] Sự gia tăng hoạt động của chitinase và β-1,3-glucanase bởi chitosan được chứng minh trong các nghiên cứu như bảo quản trái cây, quả cam sau 24 giờ xử lý với chitosan cho thấy hoạt động của enzyme đã góp phần làm giảm đốm đen trên quả [16] Một nghiên cứu cho thấy chitosan có khả năng

kháng nấm F oxysporum ở những cây cà chua khi được bón gốc hoặc phun lá bằng

cách hạn chế sự phát triển của mầm bệnh đối với các mô rễ bên ngoài và tạo ra một số phản ứng phòng vệ Hiệu ứng này được giải thích dựa trên sự tích tụ lớn của các hợp chất nấm gây độc tại vị trí xâm nhập và do tính chất tạo màng của chitosan cũng có thể hoạt động như một hàng rào cản trở chất dinh dưỡng ra bên ngoài Do đó, làm giảm tối đa việc cung cấp các chất dinh dưỡng cần cho sự phát triển của mầm bệnh [17]

1.2 Nanochitosan

1.2.1 Tính chất của nanochitosan

Chitosan thể hiện tính chất chelate hóa đối với các hợp chất vô cơ và hữu cơ khác nhau tạo thành lớp màng sinh học với đặc tính nổi bật về độ ổn định, độ hòa tan và hoạt tính diệt khuẩn phổ rộng đáng kể Tuy nhiên, chitosan kích thước lớn có độ hòa tan thấp hơn trong các dung môi có nước làm hạn chế hoạt động diệt khuẩn trên phạm vi rộng của nó So với chitosan dạng khối, các hạt nano chitosan thể hiện tính linh hoạt cao trong các tính chất sinh học do các đặc tính hóa lý bị thay đổi như: kích thước, diện tích bề mặt, hiệu quả bao bọc, bản chất cation, các nhóm chức hoạt động đơn lẻ hoặc pha trộn với các hợp chất khác… [6] Hiệu quả kháng nấm của

nanochitosan đối với chủng nấm Cercospora sp và Corticium salmonicola Berk được báo cáo rằng trên 97% và thấp hơn đối với chủng Phanerochaete salminicolor là

76,86% [18] Do đó, các hạt nanochitosan có tiềm năng sử dụng làm chất kháng khuẩn và kháng nấm tự nhiên, hiệu quả cao và an toàn [19]

1.2.2 Phương pháp tổng hợp nanochitosan

Nanochitosan được tổng hợp bằng nhiều phương pháp khác nhau bao gồm gel hóa ion, vi nhũ tương, khuếch tán dung môi nhũ hóa, phức hợp polyelectrolyte và phương pháp micell đảo Trong đó, phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là gel

hóa ion với ưu điểm đơn giản và không áp dụng lực cắt cao hoặc sử dụng dung môi hữu cơ [20]

Phương pháp gel ion hóa: dựa trên sự tương tác giữa các nhóm điện tích trái dấu bao gồm nhóm amin tích điện dương của chitosan và nhóm polyanion tích điện

âm của tripolyphosphat được mô tả như hình 1.4 Các hạt nanochitosan được hình

thành dưới sự khuấy trộn cơ học mạnh mẽ ở nhiệt độ phòng Kích thước và điện tích bề mặt của các hạt có thể được điều chỉnh bằng cách thêm chất ổn định [21]

Hình 1.4 Cơ chế tổng hợp nanochitosan bằng phương pháp gel ion [22]

Phương pháp vi nhũ tương: chitosan trong dung dịch acid axetic và chất liên kết ngang glutaraldehyde được thêm vào hỗn hợp bao gồm chất hoạt động bề mặt phân tán trong dung môi hexan trong điều kiện khuấy liên tục ở nhiệt độ phòng Dung môi sau đó được loại bỏ bằng cách làm bay hơi dưới áp suất thấp, và chất hoạt động bề mặt dư được loại bỏ bằng cách kết tủa với CaCl2 và sau đó đem đi ly tâm [23] Nhược điểm của phương pháp này là sử dụng dung môi hữu cơ và chất liên kết glutaraldehyde

Phương pháp phân tán nhũ tương: dung môi hữu cơ được cho vào dung dịch chitosan có chứa chất ổn định như poloxamer dưới tác động khuấy cơ học, sau đó đồng hoá ở áp suất cao Nhũ tương thu được được pha loãng với một lượng lớn nước để kết tủa các hạt nano Nhược điểm chính của phương pháp này bao gồm sử dụng lực cắt cao và dung môi hữu cơ [24]

Phương pháp micell đảo: dung dịch chitosan được thêm vào hỗn hợp dung môi hữu cơ có chứa chất hoạt động bề mặt dưới sự khuấy trộn liên tục để tạo thành các micell đảo Ưu điểm của phương pháp này chính là không sử dụng chất liên kết chéo Ngoài ra, các hạt nano thu được có kích thước siêu mịn [25]

Phương pháp sử dụng phức hợp polyelectrolyte dựa trên sự tự lắp ráp của polymer tích điện dương và dung dịch DNA plasmid làm giảm tính ái nước do sự trung hòa điện tích giữa polymer cation và DNA [26]

1.2.3 Ứng dụng của nanochitosan

Các hạt nanochitosan với các tính chất lý hóa và đặc tính sinh học nổi bật như khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao, khả năng tương thích và phân huỷ sinh học, không độc hại khiến chúng trở thành một loại vật liệu an toàn và thân thiện với môi trường [27] Do những đặc tính độc đáo này, các hạt nanochitosan được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực bao gồm y (dẫn truyền thuốc, mô nhân tạo…), thực phẩm (giảm béo, bảo quản…), dệt may (kháng khuẩn), nông nghiệp (thuốc trừ sâu, phân

bón)… được tóm tắt như hình 1.5 Ngoài ra, nanochitosan còn được kết hợp với các

loại tinh dầu và dịch chiết tự nhiên để tăng cường hoạt tính sinh học

Hình 1.5 Một số ứng dụng của nanochitosan trong các lĩnh vực [20]

1.3 Chiết xuất tự nhiên 1.3.1 Dịch chiết lá trầu

Lá trầu có tên khoa học là Piper betel (L), thực vật thuộc họ hồ tiêu (Piperaceae), phân bố chủ yếu ở các nước châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc,

Indonesia, Malaysia và Việt Nam [28] Với tính chất kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa tốt, lá trầu được sử dụng để điều trị các vấn đề về răng miệng, viêm nướu, đau đầu, viêm khớp và kích thích hệ tiêu hóa [29] Ngoài ra, chiết xuất từ lá trầu còn được sử dụng như chất kháng khuẩn, kháng nấm tự nhiên có hiệu quả cao ứng dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, nông sản và phòng ngừa các mầm bệnh gây hại trên thực vật [30]

1.3.1.1 Các thành phần của chiết xuất lá trầu

Lá trầu có hệ thống thành phần hóa học phức tạp và được chia thành các nhóm chủ yếu như alkaloid, flavonoid, tanin, steroid, phenol, glycosid, saponin và terpenoid,

glycosid [31-34] Bảng 1.1 tóm tắt các phương pháp và thành phần hóa thực vật được

phân lập từ lá trầu Trong đó, phương pháp chiết truyền thống được sử dụng để chiết xuất lá trầu như ngâm dầm, sử dụng các dung môi bao gồm metanol, etanol, hexan và chloroform Thành phần chính thu được của lá trầu là hydroxychavicol chiếm khoảng 66 - 80% Tuy nhiên, phương pháp cổ điển này tốn nhiều thời gian hơn để thu thập các hợp chất Các phương pháp chiết hiện đại gồm soxhlet, chiết siêu âm, chiết vi sóng, chiết siêu tới hạn cũng được áp dụng để rút ngắn thời gian và tăng hiệu suất trích ly Tuy nhiên, chưa có sự so sánh về hàm lượng hoạt chất giữa các dịch chiết trong các công trình này Guha và cộng sự cũng cho biết lá trầu tươi chứa nhiều nước (85 – 90%), protein (33,5%), carbonhydrate (0,5 – 6,1%), chất khoáng (2,33%), chất béo (0,4 – 1%), chất xơ (2,3%), tinh dầu (0,08 - 0,2%), tanin (0,1 - 1,3%), ancaloid (arakene) [35] Hương vị cay nồng đặc trưng của lá trầu là do sự hiện diện của các hợp chất phenolic, cụ thể là chavicol và terpene Tuỳ theo nồng độ của các hợp chất này mà mùi vị sẽ khác nhau ở các loài thực vật [36, 37] Các hợp chất phenolic trong lá trầu có đặc tính kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa tốt, đặc trưng cho tính chất của chavicol, pyrocatechol, carvacrol, safrole và eugenol [32], các terpene trong lá như 1,8-cineole, cadinene, camphene, caryophyllene, limonene, a-pinene và b-pinene[38, 39]

Ngoài ra, các bộ phận khác của cây trầu gồm thân và rễ cũng được nghiên cứu để thu hồi các hợp chất có hoạt tính sinh học cao Nhóm nghiên cứu của Ghost và các cộng sự đã báo cáo sự hiện diện của resorcinol-4-allyl, stigmast-4-en-3,6-dione,β-sitosterol và aristolactam AII có trong rễ của cây trầu [40] Bên cạnh đó, Biswas và cộng sự đã phân lập các hợp chất khác nhau từ thân trầu bao gồm piperlonguminine, piperdardine, dehydropipernon α-pinenene, guineensine, 6-dione, aristololactam A-II, pellitorine, syringaresinol-O-β-D-glucopyranoside, pinoresinol, piperolein-B, N-isobutyl-2-E, 4 -E-dodecadienamide, cepharadione A, axit dotriacontanoic, β-daucosterol, tritriacontane, β-sitosterol etyl glucoside (2E,4E)-N-isobutyl-7-(3',4'-methylenedioxyphenyl)- 2,4-heptadienamide, axit 23-hydroxyursan-12-en-28-oic, (2S)-4'- hydroxy- 2,3-dihydrofl avonone-7-O-β-D-glucoside và β-sitosterol- 3-O-β-D-glucoside-6'-O-palmitat [41]

Chiết xuất lá trầu chứa nhiều chất chuyển hóa thứ cấp như polyphenol, flavonoid, alkaloid, ketone, terpene và sterol do đó có đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa tốt giúp ngăn ngừa hư hỏng thực phẩm hiệu quả [39] Một số hợp chất được biết đến với hoạt tính kháng khuẩn trong chiết xuất trầu gồm α-pinene, cis-sabinene, eugenol, β-farnesene, β-salenene, eugenyl acetate, garmacerene-B, spathulenon, globulol, allylpyrocatechol diacetate [42] Các chất chiết xuất có hoạt

tính kháng khuẩn chống lại mầm bệnh thực phẩm như E coli, Shigella dysenterae-1 và S aureus [43] Ngoài ra, nhóm nghiên cứu của Srinivasan và các cộng sự cũng báo

cáo rằng 13 hợp chất có khả năng kháng khuẩn, các axit phthalic và axit hexanedioic được tìm thấy trong lá trầu có thể ức chế sự phát triển của hầu hết các vi khuẩn [44] nhiều công trình đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn của lá trầu để bảo quản thực phẩm và cho kết quả đầy hứa hẹn

Bảng 1.1 Các thành phần của chiết xuất lá trầu được phân lập sử dụng các phương pháp khác nhau Dung môi/

phương pháp chiết

Methanol/ Ngâm GC-MS Tricyclo [2.2.1.0(2,6)] heptan-3-metanol, axit propanoic, axit benzedicarboxylic, dietyl, Ar-tumerone, axit sunfuric, isohexylpentyl este, phenol, axit benzoic, 2-etylhexyl este, nonyl -phenol hỗn hợp các chất đồng phân, 5-(4-isopropoxy-benzyl)-2-(4-methol), metanol, (xyclohexyl) (2,3-dimetylphenyl), 1,4,4,7,7-pentametyl bicyclo[ 3.3.0], axit 1,2-benzenedicarboxylic, pyridinium, 1-hexadecyl-, clorua, axit phthalic, butyl oct-3-yl este, 1-butanone, 3-metyl-1,3-diphenyl, dibutyl phthalate, 1 ,axit 2-benzenedicarboxylic, butyl 2-etylhexyl este, 1-S-octyl-1-thio-l-arabinitol, axit 4-methoxy-isophthalic, dietyl phthalate, axit 4-hexadecynoic, 2-methoxy-, metyl este, cyclononanone , dodecane, 1,1′-oxybis-, axit hexanedioic, dioctyl este, diisooctyl phthalate

1,2-[45]

Ethanol, nước, hexan, acetone /

Ngâm

Phương pháp quốc tế AOAC

Độ ẩm (84,83-86,48%), tro (4,30-4,20%), carbohydrate (5,03-5,20%), protein (3,20-3,34%), lipid (0,80-0,78%), TSS (23,00-23,03 oBrix), tổng phenolic (13,08-15,03 mg/100gm), vitamin C (5,21-5,20 mg/100gm), Na (11,37-11,35 mg/100gm), P (41,54-40,33 mg/100gm)

aristololactam A II, aristololactam B II, piperolactam A, cepharadione A

[49]

Ethanol/ Soxhlet GC-MS Hydroxychavicol (69,464%), 4-chromanol (24%), eugenol (4,86%), phenylpropene-3,3-diol diacetate (0,923%), 4-allyl-1,2-diacetoxybenzene (0,765%)

1-[50]

Ethanol 79%/ Chiết GC-MS Hydroxychavicol (66,5%), eugenol (12%), isoeugenol (3%) và 4-allyl- [51]

GC-MS 2-hydrazinopyridin, morphinan, 6,7-didehydro-3-methoxy -metyl-, (14.alpha.)-, imidazol, 4-triflometyl-, 1-metyl-2-aminometylimidazol, benzo[h]quinolin, 2, 4-dimetyl-, axetamit, N-xyclopentyl-2-(2-metyl -5-nitroimidazol-1-yl)-, 2-xyanmetyl-8-xyan-6.7-pentametylen-1.2.4-triazolo[1.5-a] pyridin, 1H-imidazol, 1-(4-metylphenyl)-, 1-(di(1-aziridinyl)phosphorothioyl)-2-(triclometyl)-4,5-dihydro-1H-imidazol, 1,2,5-oxadiazol -3-carboxamit, 4-amino-N-cyclopentyl-, 1H-benzimidazol, 5-nitro-, 1-vinylbenz(c)imidazol, 2-[3-dimetylaminophenoxy]-5-nitro-thiazol, 2,8-dimetylquinolin , 7-chloro-4-methoxy-3-metylquinolin, 1H-indol, 2-metyl-3-phenyl-, 1-metyl-2-phenylbenzimidazol, 1H-indol, 1-metyl-2-phenyl-

[52]

Ethanol/ Chiết có hỗ trợ vi sóng

Thuốc thử Folin–ciocalteu, AlCl3 và molybdate

Hàm lượng phenolic tổng số (1180±296 mg GAE/100g), hàm lượng flavonoid tổng số (81±8 mg QE/100g), hàm lượng axit caffeoylquinic (247±67 mg CGAE/100g)

[53]

Chiết siêu tới hạn GC-MS indole,imidazol, 4,5-diclo-1-metyl-, thiazol, 2,4,5-trimetyl-, pyridin, (2-nitrovinyl)-, 2,3,5-trimetyl-6-(1-metyl- 3-oxo-(Z)-1-butenylamino)indol, 1H-Indol, 2-metyl-3-phenyl-, 1-Amino-2-(4-chlorobenzoyl)-6,7,8,9-tetrahydro-5 -metylthieno[2,3-c] isoquinoline, 1'-Acetyl-2'-(1,2-dihydroquinoxalin-2-yl)-1',2'-dihydroquinoline,

4-pyridin, 1,2,3,6-tetrahydro -1-metyl-4-[4-chlorophenyl]-, 2-etylacridin, benzo[h]quinolin, 2,4-dimetyl-

[52]

1.3.1.2 Hoạt tính sinh học của chiết xuất lá trầu

Dịch chiết lá trầu có khả năng kháng khuẩn phổ rộng với các chủng gram âm và gram dương [47] Nhóm nghiên cứu của Ali và các cộng sự đã sử dụng chiết xuất lá trầu sử dụng dung môi ethanol 95% có tổng hàm lượng polyphenol là 840

mg GAE/g cao khô cho thấy hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả chống lại Escherichia

coli (E coli), Staphylococcus aureus (S aureus), Streptococcus mutans, Streptococcus và các chủng nấm như Candida albicans [55] Hartini và các cộng sự

đã khảo sát hoạt tính sinh học trên các chủng vi khuẩn E coli, S aureus, S

epidermidis cho thấy tác dụng đối kháng xảy ra khi trộn lẫn dịch chiết của lá trầu đỏ

và lá trầu không, dẫn đến hoạt tính của hỗn hợp thấp hơn so với việc sử dụng riêng biệt từng chiết xuất [56] Ngoài ra, dịch chiết ethanol của lá trầu được báo cáo có

thể kháng lại vi khuẩn Vibrio alginolyticus (V alginolyticus) từ cá vược châu Á (Lates calcarifer), là tác nhân hữu hiệu thay thế cho kháng sinh thương mại trong

nuôi trồng thủy sản [57]

Các dung môi khác nhau của chiết xuất lá trầu như nước, ether dầu hỏa, ethyl acetate, methanol và chloroform cũng được đánh giá hoạt tính trên các chủng

vi khuẩn Klebsiella Pneumoniae (K pneumoniae), Bacillus subtilis (B subtilis),

Bacillus cereus (B cereus), Salmonella typhi và Enterobacter aerogenes Chiết xuất

thu được còn cho thấy khả năng kháng oxy hóa tốt với hiệu suất bắt gốc tự do cao khi so sánh với chất chuẩn ascorbic acid [58] Ảnh hưởng của các dung môi etyl axetate, hexane, ethanol, metanol đối với hoạt tính kháng nấm của lá trầu được báo cáo bởi nhóm nghiên cứu của Pawar và các cộng sự Trong đó, chiết xuất sử dụng

dung môi ethyl acetate cho thấy khả năng ức chế vi nấm Aspergillus sp và Rhizopus

sp cao hơn hẳn so với các dung môi còn lại, cho thấy tiềm năng quản lý dịch hại

trong nông nghiệp và bảo quản thực phẩm tránh hư hỏng [59] Thành phần chính trong lá trầu ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của chiết xuất là hydroxychavicol, Thamaraikani và các cộng sự đã tinh chế hydroxychavicol với metanol và phân lập bằng sắc ký cột silica gel Các hoạt tính kháng lại vi sinh vật gây ngộ độc trong

ngành công nghiệp thực phẩm như E coli và Salmonella của hydroxychavicol cũng

đã được đánh giá với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) trong khoảng 20-50 µg/ml [46]

1.3.2 Tinh dầu sả

Tinh dầu sả (tên khoa học Cymbopogon spp.) là một hỗn hợp của nhiều terpen

và terpenoid khác nhau, trong đó các thành phần chính như monoterpene tuần hoàn và mạch vòng Các monoterpene có nguồn gốc từ geranyl diphosphate là thành phần tổng hợp của isopentenyl diphosphate và đồng phân của dimethylallyl diphosphate Ngày nay, có rất nhiều công nghệ đã được áp dụng để chiết xuất tinh dầu nhưng chưng cất hơi nước là phương pháp phổ biến nhất để chiết tinh dầu mà không làm mất tính chất của chúng Thành phần trong tinh dầu vô cùng đa dạng, tùy theo các nguồn chiết xuất mà tinh dầu có hàm lượng các phân tử khác nhau Các thành phần phân tử trong tinh dầu có thể được chia làm 4 nhóm chính là terpenes (limonene, α – pinene, p – cymene, sabinene, γ – terpinene và β – caryophyllene); terpenoids (thymol và carvacrol); phenylpropanoids (cinnamaldehyde và eugenol) và nhóm gồm các chất khác [60] Các hợp chất này được tìm thấy trong thành phần hóa học của tinh dầu chịu trách nhiệm cho hoạt động kháng khuẩn của các loại tinh dầu khác nhau Nhìn chung, cơ chế kháng khuẩn của tinh dầu được chia thành 4 nhóm chức năng chính bao gồm:

- Ức chế hoạt động của protein cùng các enzyme tổng hợp protein,

- Tính kỵ nước cho khả năng hòa tan vào bên trong màng tế bào và ti thể của vi khuẩn, làm xáo trộn cấu trúc của vi khuẩn và làm cho thành phần bên trong vi khuẩn dễ thấm hơn và các ion, các chất khác ở bên ngoài có thể dễ dàng khuếch tán vào bên trong vi khuẩn gây nên ức chế các quá trình tổng hợp trong tế bào,

- Tương tác với thành tế bào để các phân tử kháng khuẩn khác dễ hấp thu hơn, - Ức chế bộ phận dòng chảy bài tiết kháng khuẩn Từ đó dẫn đến chết các tế bào vi khuẩn nhờ vào sự ngăn chặn trao đổi chất của chúng [61]

Ngoài tính kháng khuẩn, tinh dầu còn biết đến như là một tác nhân kháng nấm hiệu quả Các nghiên cứu đã chỉ ra được hoạt động kháng nấm của tinh dầu giảm theo thứ tự các nhóm hợp chất như sau: phenols > aldehydes > ketones > alcohols > ethers > hydrocarbons [62] Ngoài ra, hoạt tính kháng nấm của tinh dầu sẽ tăng lên

nhờ vào các nhóm chất như: p-n-propylphenol < thymol < isoeugenol < eugenol [63]

Tinh dầu sả có khả năng ức chế hiệu quả sự phát triển của E coli với các giá

trị MIC và MBC là 20 μg/mL mỗi loại Tương tự, nhiều nghiên cứu cho thấy hiệu

quả trên các chủng Bacillus subtilis, Salmonella enterica typhimurium, S aureus,

Klebsiella pneumoniae với MIC là 25–50 μg/mL Các thành phần như limonene,

linalool và myrcene cũng có tác dụng hiệp đồng và có thể đóng vai trò quyết định trong việc tăng hiệu quả kháng khuẩn, kháng nấm của tinh dầu [64] Do đó, tinh dầu sả là đối tượng tiềm năng cho ứng dụng trong các lĩnh vực như nông nghiệp, bảo quản thực phẩm, làm tá dược trị liệu

1.4 Ion kẽm

Kẽm là một nguyên tố thiết yếu cho sự phát triển của vi sinh vật và sinh vật bậc cao vì nó tham gia vào nhiều phản ứng tế bào quan trọng ở nồng độ nội sinh thấp Nồng độ kẽm trong máu là 10−4 M, tỷ lệ tối ưu của nguyên tố này là cần thiết cho các hoạt động xúc tác và cấu trúc trong cơ thể người [65] Nồng độ kẽm được điều chỉnh trong điều kiện sinh lý bởi một số chất vận chuyển sao cho các ion Zn2+ về cơ bản không độc hại đối với các sinh vật bậc cao [66] Tăng nồng độ Zn2+ trên mức tối ưu (từ 10−7 đến 10−5 M) tùy thuộc vào chủng vi sinh vật gây nhiễu loạn cân bằng nội môi và cho phép Zn2+ thâm nhập vào bên trong gây độc tế bào sinh vật nhân sơ Do đó, các ion Zn2+ với nồng độ thích hợp cho hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm hiệu quả [67]

Một số báo cáo về hoạt tính kháng khuẩn của Zn2+ phụ thuộc vào nồng độ và

thời gian tiếp xúc Kẽm clorua hoạt động theo cách phụ thuộc vào liều chống lại E

coli trong khi kẽm axetat thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên P aeruginosa và S aureus đối với nồng độ trên 11 mmol L−1 Hơn nữa, sự tiếp xúc kéo dài của kẽm (ở mức 100 μg−1) đến bào tử Aspergillus brasiliensis ức chế sự nảy mầm của chúng

đến 25% Các hoạt động kháng khuẩn này được giải thích bởi hai cơ chế, cả hai đều dẫn đến chết tế bào: (i) tương tác trực tiếp với màng vi sinh vật dẫn đến mất ổn định màng và tăng cường tính thấm; (ii) tương tác với axit nucleic và vô hiệu hóa các enzyme của hệ hô hấp [68]

Ngoài ra, thực vật hấp thụ kẽm dưới dạng ion (Zn2+) qua các màng tế bào [69] Nhưng khi nồng độ quá cao sẽ gây nên một số tác dụng ngược cho thực vật như héo, hoại tử lá, ức chế và suy giảm sinh khối, phân chia tế bào và làm giảm sự tăng trưởng của thực vật [70] Chính vì vậy, ion Zn2+ không chỉ là tác nhân kháng khuẩn, kháng nấm hiệu quả, mà còn là nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho sự phát triển của thực vật khi sử dụng ở liều lượng thích hợp

1.5 Tình hình nghiên cứu

Với các tính chất nổi bật và tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, nanochitosan được xem là vật liệu có khả năng kết hợp với nhiều thành phần có

hoạt tính sinh học như dịch chiết, tinh dầu thiên nhiên và ion kim loại Bảng 1.2

tóm tắt một số nghiên cứu sử dụng nanochitosan như hệ chất mang giúp bảo vệ các thành phần hoạt chất nhạy cảm, giúp tăng cường các tính chất của hệ như khả năng hòa tan, kháng khuẩn, kháng nấm và kháng oxi hóa Nhóm nghiên cứu của Shetta và cộng sự đã tổng hợp thành công tinh dầu bạc hà (PO) và tinh dầu trà xanh (GTO)

được bao bọc trong các hạt nanochitosan bằng phương pháp gel hóa ion (hình 1.6)

Kết quả cho thấy kích thước hạt nano trung bình trong khoảng từ 252,6 đến 256,3 nm, thế zeta khoảng từ 20 đến 29 mV Các hạt nano bọc tinh dầu PO cho thấy khả năng kháng khuẩn đáng kể với nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) lần lượt là 1,11

và 2,72 mg/mL trên vi khuẩn S aureus và E coli Trong khi đó, giá trị MBC của hệ

NCS-GTO đối với hai loại vi khuẩn trên là 0,57 và 1,15 mg/mL [71]

Hình 1.6 Cơ chế tổng hợp nanochitosan kết hợp với tinh dầu sử dụng phương pháp

gel hóa ion [72]

Một nghiên cứu khác của Arabpoor và các cộng sự về chế tạo tinh dầu

Eryngium campestre (ECEO) được bao bọc bởi hạt chitosan để kéo dài thời gian

bảo quản của quả anh đào Kích thước hạt trung bình của hạt tổng hợp được là 157,85 ± 26,32 nm và thế zeta là 16,6 ± 0,1 mV Nghiên cứu này đã chứng minh rằng việc phủ lên quả anh đào bằng các hạt CS/ECEO đã làm giảm tổng số vi khuẩn, axit chuẩn độ và giảm trọng lượng khi được bảo quản ở 4ºC trong 21 ngày [73] Ngoài ra, hạt nanochitosan mang chiết xuất vỏ quả lựu (PPE) có kích thước từ 275-400 nm, thế zeta -30 đến -23 mV cũng được sử dụng để kéo dài thời hạn sử dụng của quả mơ Kết quả cho thấy tổng số lượng vi khuẩn ưa lạnh, số lượng nấm men và nấm mốc, sự hao hụt trọng lượng của quả mơ được xử lý với NCS-PPE là thấp nhất, cho thấy tiềm năng của lớp phủ nhũ tương nanochitosan bổ sung chiết xuất PPE trong bảo quản sau thu hoạch

Bảng 1.2 Tóm tắt các nghiên cứu sử dụng hệ vi bao nanochitosan mang hoạt chất Hoạt

Lá trầu - Kích thước hạt: 131 - 431,1 nm

- Thế zeta: (-30) - (-23) mV

- Kích thước hạt : 684,37 - 186,83 nm

- Kích thước hạt: 204,4 nm

- Thế zeta: 47,8 mV - PDI: 0,5

- EE= 66,6%, LC=2,5%

- Kháng khuẩn S.typhi, S.aureus, L innocua

- Bảo quản quả việt quất

[77]

Chitosan/ZnO

- Kích thước hạt: 70 - 230 nm

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Tổng hợp thành công nanochitosan mang chiết xuất lá trầu, tinh dầu sả và ion kẽm định hướng ứng dụng bảo quản trước và sau thu hoạch

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

- Chiết xuất và định lượng thành phần của cao lá trầu

- Nghiên cứu tổng hợp và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất lý hóa của nanochitosan mang chiết xuất lá trầu

- Nghiên cứu tổng hợp và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất lý hóa của nanochitosan mang tinh dầu sả

- Nghiên cứu tổng hợp và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất lý hóa của nanochitosan mang ion kẽm

- Đánh giá hoạt tính sinh học (khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxi hóa) của vật liệu

- Đánh giá ứng dụng của vật liệu (bảo quản trái cây, màng kháng khuẩn)

2.2 Hoá chất, thiết bị và dụng cụ

Bảng 2.1 Danh mục hoá chất

(158kDa; mức deacetyl ≥ 75%) (C6H11NO4)n Việt Nam 3 Sodium tripolyphosphate; 60% Na₅P₃O₁₀ Trung Quốc

15 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl; 97% C18H12N5O6 Trung Quốc

16 Zinc sulfate; 99,5% ZnSO4 Trung Quốc

Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong đề tài nghiên cứu bao gồm: máy khuấy từ, cân phân tích, bể ổn định nhiệt, bơm chân không, máy nghiền, bể siêu âm, máy siêu âm dạng thanh, máy ly tâm, máy cô quay chân không, buret, beaker, ống đong và các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm

2.3 Chiết xuất và định lượng thành phần cao lá trầu

Lá trầu trước khi chiết xuất thành cao khô được xử lý như quy trình hình 2.1

Lá trầu tươi sau khi chọn lọc được rửa với nước sạch để loại bỏ các tạp chất và bụi bẩn, sau đó phơi khô trong bóng râm đến khi độ ẩm thấp hơn 12% Để tăng hiệu quả trích ly các hợp chất, lá trầu được nghiền thành bột mịn và phân loại bằng rây 500 mesh, phần bột mịn sau khi rây được bảo quản trong túi zip và sử dụng làm nguyên liệu cho quy trình chiết xuất lá trầu

Hình 2.1 Quy trình xử lý nguyên liệu

Bột lá trầu được chiết bằng phương pháp trích ly rắn - lỏng có hỗ trợ của

sóng siêu âm như hình 2.2 30g bột được phân tán trong 300ml dung dịch ethanol

80% dưới tác dụng của sóng siêu âm (máy Hielscher UP400St) ở công suất 120 W trong các khoảng thời gian khảo sát gồm 10, 20, 30, 40, 50 phút, hỗn hợp được giải nhiệt trong thau đá Sau đó, hỗn hợp được lọc sạch bã và dịch chiết được cô quay chân không ở 50 ºC trong 1h Cao khô thu được được bảo quản trong tủ mát ở 4ºC để sử dụng cho quy trình tổng hợp nanochitosan kết hợp cao lá trầu

Hình 2.2 Quy trình chiết cao lá trầu có hỗ trợ siêu âm.

Quy trình chiết xuất lá trầu được thực hiện theo một phương pháp khác với

sự có mặt của enzyme cellulase như hình 2.3 Điều kiện chiết được tham khảo từ

nghiên cứu của Sara và các cộng sự, enzyme cellulase được kích hoạt trong môi trường pH 5 cho hiệu quả chiết xuất các hợp chất phenolic cao [80] 30g bột lá trầu

được phân tán vào 300ml dung dịch đệm phosphate, sau đó enzyme được cho vào hỗn hợp theo tỷ lệ khối lượng enzyme/bột là 1/100 Hỗn hợp được khuấy liên tục ở nhiệt độ 50 ºC trong các khoảng thời gian 45, 120, 240, 360, 480 phút Tiếp theo, hỗn hợp được lọc sạch bã và cô quay chân không để thu hồi cao khô

Hình 2.3 Quy trình chiết cao lá trầu có hỗ trợ enzyme 2.4 Quy trình tổng hợp nanochitosan mang chiết xuất lá trầu

Quy trình tổng hợp nanochitosan mang chiết xuất lá trầu được tóm tắt như

hình 2.4 Dung dịch chitosan được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong acetic acid 1%

ở nhiệt độ phòng trong 1h Sau đó, pH của dung dịch được điều chỉnh đến 4 bằng NaOH 2N, 100 µL tween 80 được thêm vào hỗn hợp và khuấy liên tục ở cùng nhiệt độ Dịch chiết lá trầu được chuẩn bị cùng lúc bằng cách hòa tan cao khô trong

ethanol ở các nồng độ như bảng 2.2 Tiếp theo, dịch chiết được phân tán vào hỗn

hợp và khuấy liên tục trong 15 phút Dung dịch STPP được nhỏ giọt vào hỗn hợp trên với tốc độ khuấy 700 rpm Sau cùng, hỗn hợp được đồng nhất bằng sóng siêu âm với công suất 220W trong 10 phút

Hình 2.4 Quy trình tổng hợp nanochitosan mang chiết xuất lá trầu Bảng 2.2 Các yếu tố khảo sát trong quy trình tổng hợp NCS-LT

Nồng độ chitosan (%)

Tỉ lệ LT/CS (g/g)

Tỉ lệ CS/STPP (g/g)

2.5 Quy trình tổng hợp nanochitosan mang tinh dầu sả

Quy trình tổng hợp nanochitosan mang tinh dầu sả được tóm tắt như hình

2.5 Dung dịch chitosan được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong acetic acid 1% ở

nhiệt độ phòng trong 1h Sau đó, pH của dung dịch được điều chỉnh đến 4 bằng NaOH 2N, 100 µL tween 80 được thêm vào hỗn hợp và khuấy liên tục ở cùng nhiệt độ Pha dầu được chuẩn bị cùng lúc bằng cách hòa tan tinh dầu sả trong ethanol ở

các nồng độ như bảng 2.3 Tiếp theo, pha dầu được phân tán vào hỗn hợp và khuấy

liên tục trong 15 phút Dung dịch STPP được nhỏ giọt vào hỗn hợp trên với tốc độ khuấy 700 rpm Sau cùng, hỗn hợp được đồng nhất bằng sóng siêu âm với công suất 220W trong 10 phút

Hình 2.5 Quy trình tổng hợp nanochitosan mang tinh dầu sả Bảng 2.3 Các yếu tố khảo sát trong quy trình tổng hợp NCS-LEO

Nồng độ chitosan (%)

Tỉ lệ LEO/CS (g/g)

Tỉ lệ CS/STPP (g/g)

2.6 Quy trình tổng hợp nanochitosan mang ion kẽm

Quy trình tổng hợp nanochitosan mang ion kẽm được tóm tắt như hình 2.6

Dung dịch chitosan được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong acetic acid 1% ở nhiệt độ phòng trong 1h Sau đó, pH của dung dịch được điều chỉnh đến 4 bằng NaOH 2N Dung dịch muối kẽm được chuẩn bị cùng lúc bằng cách hòa tan ZnSO4 vào

25mL nước cất ở các nồng độ như bảng 2.4 Tiếp theo, dung dịch muối được phân

tán vào hỗn hợp và khuấy liên tục trong 15 phút Dung dịch STPP được nhỏ giọt vào hỗn hợp trên với tốc độ khuấy 700 rpm Sau cùng, hỗn hợp được đồng nhất bằng sóng siêu âm với công suất 220W trong 10 phút

Hình 2.6 Quy trình tổng hợp nanochitosan mang ion kẽm Bảng 2.4 Các yếu tố khảo sát trong quy trình tổng hợp NCS-Zn

Nồng độ chitosan (%)

Tỉ lệ CS/STPP (g/g)

0,07; 0,11; 0,15;

2.7 Phương pháp phân tích vật liệu

2.7.1 Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng flavonoid tổng của cao chiết

Hiệu suất thu hồi cao lá trầu được xác định dựa trên khối lượng cao khô thu được và bột nguyên liệu ban đầu sử dụng (đã trừ hàm lượng ẩm), được xác định như biểu thức (1) bên dưới:

H = m2

Trong đó: H - hiệu suất thu hồi cao chiết, %

m1 - khối lượng bột lá trầu, g m2 - khối lượng cao thu được, g

Hàm lượng flavonoid tổng của cao chiết lá trầu được xác định bằng phương pháp đo màu của phức chất tạo ra giữa nhóm các hợp chất flavonoid và thuốc thử AlCl3 với sự có mặt của NaNO2, cơ chế phản ứng được biểu diễn như hình 2.7 [81] Độ hấp thụ của phức chất được đo tại bước sóng 510 nm bằng máy quang phổ UV-

Vis 754 Stech International, Trung Quốc (hình 2.8) Hàm lượng flavonoid tổng

được xác định như sau:

TFC = RU x V

Trong đó: TFC - tổng hàm lượng flavonoid, mg rutin/g cao khô

RU - nồng độ rutin dựa trên đường chuẩn, ppm

V - thể tích mẫu, ml

m: khối lượng cao khô, g