Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của oligochitosan lên sự sinh trưởng của lúa IR64 trong điều kiện mặn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

3 Phản biện 1: TS Bùi Thị Mỹ Hồng 4 Phản biện 2: TS Trần Thị Thanh Hiền 5 Ủy viên: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

Nguyễn Thị Thúy Hương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngày, tháng, năm sinh: 20/07/1998 Nơi sinh: Bến Tre

I TÊN ĐỀ TÀI:

Khảo sát ảnh hưởng của oligochitosan lên sự sinh trưởng của lúa IR64 trong điều kiện mặn (Effects of oligochitosan on the growth of IR64 rice under saline conditions)

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG :

1 Đánh giá khả năng tổng hợp các yếu tố điều hòa áp suất thểm thấu của cây mạ lúa trong điều kiện mặn với sự hỗ trợ của oligochitosan

2 Tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động đóng mở khí khẩu ở lá cây mạ lúa trong điều kiện mặn

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2023

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/07/2023 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Lê Thị Thủy Tiên

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi đã nhận được sự giúp dỡ tận tình và động viên từ thầy cô, anh chị và các bạn cũng như từ phía gia đình Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến

Toàn thể thầy, cô trường đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh; đặc

biệt là các thầy cô, cán bộ Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Kĩ thuật Hóa học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện luận văn tốt nghiệp

Cô Lê Thị Thủy Tiên đã giảng dạy, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh

nghiệm và luôn động viên tôi trong quá trình làm luận văn

Thầy Trần Trọng Tuấn đã cho phép tôi mượn và hướng dẫn tôi sử dụng thiết bị tại Viện Sinh học Nhiệt đới

Các thầy, cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến

cho luận văn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn với gia đình, bạn bè, những người đã luôn động viên, giúp đỡ trong cuộc sống và xuyên suốt quá trình thực hiện luận văn

Một lần nữa, tôi xin được gửi lời chúc sức khỏe, lời cảm ơn chân thành nhất đến thầy cô, các anh chị và các bạn

Chúc mọi người gặt hái được nhiều thành công! Tôi xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, ngày 06 tháng 07 năm 2023

Học viên thực hiện

Võ Trần Lâm

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu đánh giá ảnh hưởng của oligochitosan kích thước 5.994 Da ở nồng độ 75 ppm lên sự sinh trưởng của cây mạ lúa IR64 trong điều kiện mặn (NaCl 0,6%) trong điều kiện nhà lưới Trong điều kiện mặn, các chỉ tiêu sinh trưởng (số lượng lá, chiều cao cây, khối lượng tươi, khối lượng khô) bị suy giảm, nồng độ đường tan và proline được tăng cường tổng hợp ở lá để cân bằng áp suất thẩm thấu, mức độ biểu hiện của gen OsPP2C50 giảm, nồng độ acid abscisic tăng làm khí khẩu đóng để ngăn cản sự thoát hơi nước qua lá Khi xử lý với oligochitosan, các chỉ tiêu sinh trưởng không đổi so với điều kiện không xử lí, nồng độ proline cũng không thay đổi, nồng độ đường tan giảm nhưng vẫn ở mức cao để duy trì nước cho cây Nồng độ các sắc tố quang hợp tương tự như trường hợp không bị stress Kích thước của các thể silica trên bề mặt biểu bì tăng, các tinh thể sáp có kích thước nhỏ hơn và dày để làm giảm sự thoát hơi nước Mức độ biểu hiện của gen OsPP2C50 tăng cao cùng với sự mở khí khẩu để thực hiện sự trao đổi khí, duy trì hoạt động sống cho cây

ABSTRACT

The study was carried out with the aim of evaluating the effect of oligochitosan size 5,994 Da at 75 ppm concentration on the growth of IR64 rice seedlings under saline conditions (NaCl 0.6%) under net house conditions Under saline conditions, growth parameters (number of leaves, plant height, fresh weight, dry weight) were reduced, soluble sugars and proline are enhanced synthesis in leaves to balance osmotic pressure, the expression level of the OsPP2C50 gene decreases, the abscisic acid content increases, causing the stomata to close to prevent transpiration through leaves When treated with oligochitosan, the growth parameters remained unchanged compared to the untreated condition, the proline content also did not change, the soluble sugar content decreased but remained at a high level to maintain water for the plants The content of photosynthetic pigments was similar to the case without stress The size of the silica body on the epidermal surface increased, and the wax crystals were smaller and thicker to reduce transpiration The expression level of the OsPP2C50 gene increases with the opening of the stomata to carry out gas exchange and maintain plant life

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài ‘‘Khảo sát ảnh hưởng của oligochitosan lên sự sinh trưởng của lúa IR64 trong điều kiện mặn’’ là công trình nghiên cứu độc lập được thực hiện bởi chính bản thân tôi Số liệu và tài liệu dẫn chứng trong luận văn có nguồn gốc rõ ràng, công bố đúng quy định Các kết quả thu được của luận văn phản ánh khách quan, trung thực, hoàn toàn không sao chép và chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác Nếu phát hiện có gian dối, tôi xin chịu mọi trách nhiệm

Tp Hồ Chí Minh, ngày 6 tháng 7 năm 2023 Tác giả đề tài

Võ Trần Lâm

1.1.2 Đặc điểm sinh học cây lúa 3

1.1.3 Giống lúa IR64 5

1.2 Tình hình nhiễm mặn ở đồng bằng sông Cửu Long 5

1.5.2 Các con đường tín hiệu của chitosan trên thực vật 19

1.5.3 Phản ứng của thực vật dưới tác động chitosan trong điều kiện stress 20

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 24

2.1 Vật liệu 24

2.1.1 Giống lúa IR 64 (OM 89) 24

2.1.2 Oligochitosan 24

2.2 Phương pháp 24

2.2.1 Tạo hạt lúa nảy mầm in vitro 25

2.2.2 Thủy canh cây mạ lúa in vivo 26

2.2.3 Khảo sát chỉ tiêu sinh trưởng 26

2.2.4 Nồng độ sắc tố quang hợp (Chlorophyll a, b và carotenoid) 26

2.2.5 Nồng độ proline 27

2.2.6 Nồng độ đường tổng, đường tan 28

2.2.7 Nồng độ protein tổng 29

2.2.8 Đặc điểm bề mặt lá và khí khẩu 30

2.2.9 Yếu tố điều khiển đóng mở khí khẩu 31

2.2.10 Phương pháp phân tích thống kê 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.2 Bàn luận 423.2.1 Ảnh hưởng của muối lên sự sinh trưởng cây lúa 423.2.2 Vai trò của oligochitosan trong sự duy trì hoạt động quang hợp 443.2.3 Vai trò của oligochitosan lên sự sinh tổng hợp các chất điều hoà thẩm thấu của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 453.2.4 Ảnh hưởng của stress mặn lên hoạt động của khí khẩu ở cây mạ lúa 45CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 48PHỤ LỤC 57

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Sơ đồ cây lúa [7] 3

Hình 1.2 Căng thẳng thẩm thấu và con đường tín hiệu ABA [46] 12

Hình 1.3 Con đường tín hiệu stress ion [51] 14

Hình 2.1 Qui trình thực hiện thí nghiệm 25

Hình 3.1 Cây mạ lúa sau 14 ngày được trồng trong vườn ươm (thước đo 5cm) 33

Hình 3.2 Hình ảnh mặt dưới lá lúa dưới kính hiển vi điện tử soi nổi, độ phóng đại x164 38

Hình 3.3 Hình ảnh lớp sơn mặt dưới lá lúa dưới kính hiển vi quang học, độ phóng đại x 400 39

Hình 3.4 Hình ảnh mặt dưới lá lúa dưới kính hiển vi điện tử quét 40

Hình 3.5 Biểu đồ thể hiện mức độ phiên mã gen OsPP2C50 so với gen OsActin 41

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi [86] 31

Bảng 3.1 Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 34

Bảng 3.2 Nồng độ sắc tố quang hợp của cây mạ lúa trong điều kiện mặn (µg/g) 34

Bảng 3.3 Nồng độ proline của cây mạ lúa trong điều kiện mặn (µg/g) 35

Bảng 3.4 Nồng độ đường của cây mạ lúa trong điều kiện mặn (mg/g) 36

Bảng 3.5 Nồng độ protein của cây mạ lúa trong điều kiện mặn (µg/g) 36

Bảng 3.6 Mật độ khí khẩu (/mm2) 37

Bảng 3.7 Nồng độ ABA của cây mạ lúa trong điều kiện mặn (µg/g) 41

Bảng 3.8 Mức độ phiên mã gen OsPP2C50 so với gen OsActin của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 41

DANH MỤC VIẾT TẮT

ABA: acid abscisic

ABF: ABRE binding factor ABRE: ABA-responsive element AMY3: α-amylase3

BAM1: β-amylase1 CAT: catalase

COLD1: chilling-tolerance divergence 1 CPK: calcium-dependent protein kinases GA: gibberellic acid

MAPK: mitogen-activated protein kinase MDA: malondialdehyde

NCA1: no catalase activity1 NO: nitric oxide

OSCA1: reduced hyperosmolality - induced calcium increase 1 PAL: phenylalanine amoniac lyase

PLD: phospholipase POD: peroxidases

PP2CA: clade A type 2C protein phosphatases Rboh: respiratory burst oxidase homologs RLK: receptor-like kinases

ROS: reactive oxygen species

SAPK: osmotic Stress/ABA-activated protein kinases SLAC1: slow-type anion channel

SNF1: sucrose non-fermenting 1 SnRK: SNF1-related protein kinases SOD: superoxide dismutase

SOS: salt overly sensitive TF: transcription factor

MỞ ĐẦU

Đồng bằng sông Cửu Long là nơi sản xuất lúa chính của Việt Nam Trong những năm gần đây, tình hình biến đổi khí hậu ngày càng nghiêm trọng dẫn đến sự nhiễm mặn hàng năm ở vùng hạ lưu sông Mekong [1] Sự gia tăng lượng muối trong đất hạn chế hoạt động trao đổi chất của rễ, từ đó làm giảm năng suất cây trồng Lúa là loại cây mẫn cảm với mặn, chỉ có thể tồn tại trong điều kiện mặn thấp Khi độ muối trong đất tăng, sự sinh trưởng và và phát triển của lúa bị ức chế dẫn đến sự giảm mạnh năng suất [2]

Chitosan - một loại polymer sinh học, là mạch dài không phân nhánh hình thành từ hai tiểu đơn vị D-glucosamine và N-acetyl-D-glucosamine liên kết với nhau bằng cầu nối glycoside, có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua, mai mực, một số loại nấm … Những ứng dụng của chitosan trong nông nghiệp được nghiên cứu từ năm 1979 và được chứng minh là yếu tố giúp thực vật chống stress sinh học như bệnh do vi khuẩn, nấm hay virus cũng như stress phi sinh học như mặn, hạn hán, kim loại nặng … [3] Chitosan giúp tăng cường phản ứng sinh lý và làm giảm tác động bất lợi của stress phi sinh học thông qua các con đường truyền tín hiệu thứ cấp Gần đây, oligochitosan được quan tâm nghiên cứu do có khả năng hòa tan trong nước cùng với các hoạt tính sinh học vượt trội so với chitosan [4]

Nhằm tiếp tục các nghiên cứu về tác động hỗ trợ của oligochitosan với stress mặn của lúa, đề tài này thực hiện trên cây lúa IR64 14 ngày tuổi trong vườn ươm với phân đoạn oligochitosan 5.994 Da, nồng độ 75 ppm Mục tiêu đề tài:

1 Khảo sát ảnh hưởng của muối lên sự sinh trưởng cây lúa

2 Vai trò của oligochitosan lên sự sinh tổng hợp các chất điều hoà thẩm thấu của cây mạ lúa trong điều kiện mặn

3 Ảnh hưởng của stress mặn lên bề mặt lá ở cây mạ lúa

4 Ảnh hưởng của stress mặn lên hoạt động của khí khẩu ở cây mạ lúa

Nhằm giải thích cơ chế thích nghi giúp cây mạ lúa ngoài vườn ươm chống chịu với stress mặn với sự hỗ trợ của oligochitosan

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc phân bố

Lúa trồng (Oryza sativa L.) là cây trồng có từ lâu đời và gắn liền với quá

trình phát triển của xã hội loài người, nhất là vùng châu Á Lúa trồng hiện nay có

nguồn gốc từ lúa dại (Oryza fatua, Oryza offcinalis, Oryza minuta) do quá trình

chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo lâu dài tạo nên [5]

Lúa thuộc ngành thực vật có hoa (Angiospermes), lớp một lá mầm (Monocotyledones), bộ hoà thảo có hoa (Poales), họ hoà thảo (Proaceae) Lúa trồng thuộc chi Oryza, chi Oryza có 23 loài phân bố rộng khắp thế giới Loài Oryza sativa

L được trồng phổ biến ở khắp các nước trên thế giới và phần lớn tập trung ở châu

Á Loài Oryza gluberrima S được trồng một diện tích nhỏ ở một số nước thuộc

châu Phi [5]

Loài Oryza sativa L được chia làm ba loài phụ: japonica, indica, javanica Loài phụ japonica phân bố ở những nơi có vĩ độ cao (bắc Trung Quốc, Nhật Bản,

Triều Tiên), có những đặc điểm như chịu rét cao, nhưng ít chịu sâu bệnh Loài phụ

indica được trồng ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới (Việt Nam, Ấn Độ,

Mianma, Philippines) Loài phụ indica có đặc điểm: hạt dài, thân cao, mềm, dễ đổ, chịu sâu bệnh khá, năng suất thấp, mẫn cảm với chu kỳ ánh sáng Loài phụ javanica

có hình thái trung gian Hạt dài nhưng dày và rộng hơn hạt của Indica, chỉ được trồng ở một vài nơi thuộc Indonesia [5]

Ở Việt Nam, các kết quả khảo sát nguồn gen cây lúa trong những năm gần

đây ghi nhận được các loài là các loài O.granulata, O.nivara, O.ridleyi,

O.rufipogon Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam cũng có thể là cái nôi hình

thành cây lúa nước Từ lâu, cây lúa đã trở thành cây lương thực chủ yếu có ý nghĩa quan trọng trong nền kinh tế và xã hội của nước ta

1.1.2 Đặc điểm sinh học cây lúa

Mục này được trích từ Giáo trình sinh lý thực vật [6]

Hình 1.1 Sơ đồ cây lúa [7]

1.1.2.1 Rễ lúa

Cây lúa có 2 loại rễ: rễ mầm và rễ phụ Rễ mầm là rễ mọc ra đầu tiên khi hạt lúa nảy mầm Thường mỗi hạt lúa chỉ có một rễ mầm Rễ mầm không ăn sâu, ít phân nhánh, chỉ có lông ngắn, thường dài khoảng 10 - 15 cm Rễ mầm giữ nhiệm vụ chủ yếu là hút nước cung cấp cho phôi phát triển và sẽ chết sau 10 - 15 ngày, lúc cây mạ được 3 - 4 lá Rễ phụ (còn gọi là rễ bất định) mọc ra từ các mắt (đốt) trên thân lúa Mỗi mắt có từ 5 - 25 rễ phụ, rễ phụ mọc dài, có nhiều nhánh và lông hút Tại mỗi mắt có 2 vòng rễ: vòng rễ trên to và khỏe, vòng rễ dưới nhỏ và kém quan trọng hơn Trong giai đoạn tăng trưởng, các mắt này thường rất khít nhau và nằm ở dưới mặt đất, nên rễ lúa tạo thành một chùm, do đó, rễ lúa còn gọi là rễ chùm Tầng rễ phụ đầu tiên mọc ra ở mắt đầu tiên ngay trên trục trung diệp

1.1.2.2 Thân lúa

Thân lúa gồm những mắt và lóng nối tiếp nhau, lóng là phần thân rỗng ở giữa 2 mắt và thường được bẹ lá ôm chặt Thông thường các lóng bên dưới ít phát

triển nên các mắt rất khít nhau, chỉ có khoảng 3 - 8 lóng trên cùng bắt đầu vươn dài khi lúa trổ đòng (2 - 35 cm) Thiết diện của lóng có hình tròn hay bầu dục với thành lóng dày hay mỏng và lóng dài hay ngắn tùy từng loại giống và điều kiện môi trường, đặc biệt là nước

1.1.2.3 Lá lúa

Lúa là cây đơn tử diệp Lá lúa mọc đối ở 2 bên thân lúa, lá ra sau nằm về phía đối diện với lá trước đó Lá trên cùng (lá cuối cùng trước khi trổ bông) gọi là lá cờ hay lá đòng Lá lúa gồm phiến lá, cổ lá và bẹ lá (hình 1.1)

Phiến lá là phần lá phơi ra ngoài ánh sáng, bộ phận quang hợp chủ yếu của cây lúa nhờ vào các tế bào nhu mô có chứa nhiều hạt diệp lạp Bẹ lá là phần ôm lấy thân lúa Bẹ lá có nhiều khoảng trống nối liền các khí khẩu ở phiến lá thông với thân và rễ, dẫn khí từ trên lá xuống rễ giúp rễ có thể hô hấp được trong điều kiện ngập nước Cổ lá là phần nối tiếp giữa phiến lá và bẹ lá Cổ lá to hay nhỏ ảnh hưởng tới góc độ của phiến lá Cổ lá càng nhỏ, góc lá càng hẹp, lá lúa càng thẳng đứng và càng thuận lợi cho việc sử dụng ánh sáng mặt trời để quang hợp

1.1.2.4 Bông lúa

Bông lúa là loại phát hoa chùm gồm một trục chính mang nhiều nhánh gié bậc nhất, bậc hai và đôi khi có nhánh gié bậc ba Hoa lúa được mang bởi một cuống hoa ngắn mọc ra từng nhánh gié này

Hạt lúa (trái lúa) gồm có: phần vỏ lúa và hạt gạo Vỏ lúa gồm 2 vỏ trấu ghép lại (trấu lớn và trấu nhỏ) Ở gốc 2 vỏ trấu chỗ gắn vào đế hoa có mang hai tiểu dĩnh Phần vỏ chiếm khoảng 20 % trọng lượng hạt lúa Hạt gạo ở bên trong vỏ lúa Hạt gạo gồm 2 phần: phần phôi hay mầm (embryo) và phôi nhũ Phôi nằm ở góc dưới hạt gạo, chỗ đính vào đế hoa, ở về phía trấu lớn Phôi nhũ chiếm phần lớn hạt gạo chứa chất dự trữ, chủ yếu là tinh bột Bên ngoài hạt gạo được bao bọc bởi một lớp vỏ lụa mỏng chứa nhiều vitamin, nhất là vitamin nhóm B

1.1.2.5 Các giai đoạn sinh trưởng cây lúa

Thời gian sinh trưởng cây lúa được tính từ lúc nảy mầm cho đến khi chín có thời gian từ 80 ngày đến 180 ngày, tùy theo giống và điều kiện ngoại cảnh

Đời sống cây lúa bắt đầu từ lúc hạt nẩy mầm cho đến khi lúa chín Có thể chia làm 3 giai đoạn chính: giai đoạn tăng trưởng (sinh trưởng dinh dưỡng), giai đoạn sinh sản (sinh dục) và giai đoạn chín

Giai đoạn tăng trưởng bắt đầu từ khi hạt nảy mầm đến khi cây lúa bắt đầu phân hóa đòng Giai đoạn này, cây phát triển về thân lá, chiều cao tăng dần và ra nhiều chồi mới (nở bụi) Cây ra lá ngày càng nhiều và kích thước lá ngày càng lớn giúp cây lúa nhận nhiều ánh sáng mặt trời để quang hợp, hấp thụ dinh dưỡng, gia tăng chiều cao, nở bụi và chuẩn bị cho các giai đoạn sau

Giai đoạn sinh sản bắt đầu từ lúc phân hóa đòng đến khi lúa trổ bông Giai đoạn này kéo dài khoảng 27 – 35 ngày, trung bình 30 ngày và giống lúa dài ngày hay ngắn ngày thường không khác nhau nhiều

Giai đoạn chín bắt đầu từ lúc trổ bông đến lúc thu hoạch Giai đoạn này trung bình khoảng 30 ngày đối với hầu hết các giống lúa ở vùng nhiệt đới Tuy nhiên, nếu đất ruộng có nhiều nước, thiếu lân, thừa đạm, trời mưa ẩm, ít nắng trong thời gian nầy thì giai đoạn chín sẽ kéo dài hơn và ngược lại

1.1.3 Giống lúa IR64

Thời gian sinh trưởng 105 - 115 ngày Chiều cao cây trung bình 95 - 105 cm Dạng hạt dài (7,5 mm), khối lượng 1000 hạt trong khoảng 26 – 27 g Tỷ lệ gạo trên 70%, không bạc bụng, gạo trắng, cơm dẻo, ngon, đạt tiêu chuẩn xuất khẩu, được nhiều nước ưa chuộng Năng suất trung bình: vụ Hè thu 40 - 50 tạ/ha, vụ Đông xuân 60 – 65 tạ/ha, nếu thâm canh tốt có thể đạt 70 - 80 tạ/ha Kháng rầy nâu (cấp 3 - 5), rất kháng đạo ôn (cấp 1), hơi kháng bạc lá (cấp 3 - 5), nhiễm khô vằn (cấp 5 - 7), chịu phèn nhẹ

1.2 Tình hình nhiễm mặn ở đồng bằng sông Cửu Long

Quy luật khí hậu nhiệt đới gió mùa xứ sở châu Á đã ấn định quy luật mùa khô - kiệt trùng mùa gió Đông Bắc (tháng 12 - tháng 4 năm sau), mùa mưa lũ trùng mùa gió Tây Nam (tháng 5 đến tháng 11) diễn ra trên ĐBSCL hàng năm Trong mùa khô - kiệt, thường tổ hợp hạn, kiệt, mặn tác động mạnh nhất đến sản xuất và đời sống vào khoảng thời gian từ 15/2 đến cuối 15/4 (tùy từng năm)

Mùa mưa năm 2019 trên lưu vực sông MeKong xuất hiện muộn, thời gian mùa mưa ngắn, tổng lượng dòng chảy năm chỉ ở mức trung bình - thấp Dòng chảy về đồng bằng từ đầu mùa khô đến nay giảm nhanh, đang xuống ở mức rất thấp so với tài liệu trung bình nhiều năm từ 1980 đến nay

Hai yếu tố thượng lưu quan trọng chi phối chủ đạo đến nguồn nước, xâm nhập mặn mùa khô 2019 - 2020 ở vùng đồng bằng sông Cửu Long là lượng trữ trong Biển Hồ (TonleSap) và dòng chảy đến Kratie (đầu châu thổ MeKong) Lưu lượng về đồng bằng sông Cửu Long bị thiếu hụt nghiêm trọng so với trung bình nhiều năm, thậm chí thấp hơn cả năm 2015 - 2016 (năm xuất hiện xâm nhập mặn kỷ lục) Đây là nguyên nhân chính gây xâm nhập mặn sớm, sâu và kéo dài trong mùa khô 2019 - 2020

Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, xâm nhập mặn đã ảnh hưởng đến sản xuất và dân sinh từ tháng 12/2019 và liên tục tăng cao, đã ảnh hưởng đến 10/13 tỉnh ở đồng bằng sông Cửu Long (trừ An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ) Trong tháng 2/2020, xâm nhập mặn tăng cao từ ngày 8/2 đến 16/2/2020, với ranh mặn 4 g/L tại vùng 2 sông Vàm Cỏ từ 100 - 110 km, sâu hơn cùng kỳ năm 2016 từ 4 - 6 km; vùng cửa sông Cửu Long từ 66 - 75 km, sâu hơn cùng kỳ năm 2016 từ 3 - 10 km

1.3 Stress mặn

1.3.1 Stress ở thực vật

Khái niệm stress được dùng để chỉ những yếu tố bên ngoài gây ảnh hưởng bất lợi cho thực vật và những phản ứng của cơ thể thực vật đối với các tác nhân gây stress Đó là tính chống chịu của thực vật đối với điều kiện bất lợi của môi trường Các yếu tố gây stress đối với thực vật rất đa dạng: stress nóng, stress lạnh, stress hạn, stress muối, dư thừa phân bón và sâu bệnh Stress có thể làm giảm mạnh sự tăng trưởng và phát triển, qua đó làm giảm năng suất thực vật Tính chống chịu stress là quá trình hình thành các đặc điểm thích nghi, là những phản ứng tự vệ mang tính đặc thù Phản ứng trả lời của cây với các điều kiện bất lợi có thể rất khác nhau tùy thuộc vào đặc tính và cường độ của các nhân tố gây ra stress Cải thiện khả năng chống chịu căng thẳng của thực vật rất quan trọng đối với năng suất nông

nghiệp cũng như tính bền vững của môi trường vì cây trồng có khả năng chống chịu căng thẳng kém sẽ tiêu thụ quá nhiều nước, phân bón, thuốc bảo vệ thực vật do đó tạo gánh nặng lớn cho môi trường…

1.3.2 Stress phi sinh học và phản ứng của thực vật

Các yếu tố môi trường bao gồm nước, muối, ánh sáng, nhiệt độ và chất dinh dưỡng khi thiếu hoặc dư thừa có thể gây căng thẳng phi sinh học, gây thiệt hại đáng kể đến sự tăng trưởng và năng suất cây trồng, và thậm chí làm giảm tỷ lệ sống của chúng Các tác động bất lợi của các căng thẳng phi sinh học này càng trở nên trầm trọng hơn do biến đổi khí hậu, được dự đoán là tần suất thời tiết cực đoan tăng lên trong tương lai [8]

Stress phi sinh học làm giảm sự phát triển của thực vật vì điều kiện môi trường không tối ưu cho các quá trình tăng trưởng như phân chiavà gia tăng kích thước tế bào Ví dụ, hạn hán ức chế sự phát triển của thực vật vì gây thiếu hụt nước, yếu tố cần thiết cho sự trương lên của tế bào, từ đó cản trở quá trình tăng kích thước tế bào Stress lạnh cũng làm giảm sự phát triển của thực vật do hoạt động của các enzyme và protein bị ức chế ở nhiệt độ lạnh Lũ lụt và mưa lớn có thể gây ra sự nén chặt đất, làm giảm nồng độ oxy trong đất và dẫn đến căng thẳng do thiếu oxy gây ra thiệt hại cho cây trồng [9]

Cả ba loại stress hạn, mặn và lạnh đều gây ra 2 loại stress sơ cấp là stress thẩm thấu, stress ion và stress thứ cấp là stress oxi hóa Nguyên nhân gây mất nước của tế bào khác nhau giữa các stress: (i) sự giảm nồng độ nước trong tế bào khi hạn hán là do thiếu nước trong đất hoặc/và trong khí quyển, (ii) khi bị stress do mặn, khả năng thẩm thấu hoặc nước của vùng rễ xung quanh bị giảm bởi các chất hòa tan Na+ và Cl−, do đó tạo ra nhiều bất lợi trong hoạt động hấp thu của rễ và chuyển nước đến các tế bào cho hoạt động trao đổi chất; (iii) áp suất thẩm thấu được tạo ra trong điều kiện căng thẳng lạnh chủ yếu là do nhiệt độ thấp làm tăng độ nhớt của nước, ở nhiệt độ đóng băng, các tinh thể băng được tạo ra trong không gian ngoại bào của tế bào thực vật, làm giảm khả năng dẫn nước

Trong hệ thống thực vật, việc mất nước của tế bào không chỉ phá vỡ cân bằng thẩm thấu nội môi (osmotic homeostasis) mà còn làm tăng nồng độ chất tan

(đặc biệt là Na+) và phá vỡ cân bằng ion nội môi (ionic homeostasis) Căng thẳng do thiếu nước gây hại vì ức chế hoạt động quang hợp do ảnh hưởng đến màng thylakoid Lục lạp là nơi sản sinh gốc tự do (reactive oxygen species – ROS) bao gồm các gốc anion superoxide (O2−), gốc hydroxyl (OH) và oxy nhóm đơn (singlet oxygen - 1O2, một sản phẩm phụ quá trình quang hợp) Do đó căng thẳng môi trường tác động lên lục lạp sẽ làm trầm trọng thêm quá trình sản xuất ROS, lấn át hệ thống kiểm soát ROS và gây độc tế bào dưới dạng stress thứ cấp là stress oxi hóa (oxidative stress)

Trạng thái ngập lụt làm giảm nồng độ oxy trong đất, hạn chế sự khuếch tán khí và dinh dưỡng vào đất, đồng thời làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng [10] Khi thời gian ngập nước tăng lên thì số nhánh, số lá xanh và trọng lượng khô của lúa giảm Sự sống sót và sinh trưởng của cây lúa bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi tình trạng ngập nước [11, 12]

1.3.2.1 Tín hiệu thứ cấp và con đường tín hiệu

Khi tế bào thực vật cảm nhận được stress, tín hiệu được chuyển tiếp và khuếch đại bởi các chất truyền tin thứ cấp như calci, các loại ROS, phospholipid và nitric oxide (NO), cùng với các loại protein kinase khác nhau [13, 14] Sự gia tăng nồng độ calci do căng thẳng gây ra khác nhau về cường độ, tần suất và vị trí dưới tế bào Sự thay đổi nồng độ calci có thể được phát hiện trong các tế bào bảo vệ (guard

cell) của cây Arabidopsis trong vòng 15 giây sau khi xử lý gây áp suất thẩm thấu

[15] Các tín hiệu calci sau đó có thể được phát hiện bởi các protein liên kết với calci, thường cung cấp tín hiệu cho một protein kinase tương tác hoặc một protein kinase được hợp nhất trực tiếp với chúng, chẳng hạn như các protein kinase phụ thuộc calci (calcium-dependent protein kinases - CDPK hoặc CPK) ROS trong thực vật có thể được tạo ra từ nhiều bào quan bao gồm lục lạp, ty thể và peroxisome, hoặc bởi các Rboh NADPH oxydase cố định ở màng sinh chất Cụ thể, ROS bên ngoài màng sinh chất (apoplastic ROS) được sản xuất bởi RbohD và RbohF (respiratory burst oxidase homologs D và F) có thể kích thích các tín hiệu điện và calci cụ thể và làm trung gian truyền tín hiệu hệ thống phản ứng nhanh để đối phó với căng thẳng [16] Loại tín hiệu này được phát hiện lan truyền trong

Arabidopsis với tốc độ ~8,4 cm mỗi phút [17] Các căng thẳng phi sinh học khác

nhau cũng tạo điều kiện cho việc sản xuất phosphatidic acid (PA), được xúc tác bởi phospholipase Ds (PLDs) và đóng vai trò tích cực hoặc tiêu cực trong các điều kiện căng thẳng khác nhau [18, 19] Trong tế bào bảo vệ, việc sản xuất PA do hạn hán gây ra cần thiết để tích lũy ROS qua trung gian RbohD/F và đóng khí khẩu [20] Tín hiệu căng thẳng ở thực vật cũng liên quan đến các họ kinase khác nhau, bao gồm cả những họ thuộc nhóm protein kinase hoạt hóa phân bào (mitogen-activated protein kinase - MAPK) [21], protein kinase liên quan đến SNF1 (SNF1-related protein kinases - SnRK), CDPK và RLK (receptor-like kinases) Chẳng hạn, MPK3, MPK4 và MPK6 có thể được kích hoạt trong vòng 2 phút khi tiếp xúc với hạn hán, muối hoặc nhiệt độ thấp [22-24]

Ethylene cũng góp phần vào phản ứng của thực vật đối với các căng thẳng sinh học và phi sinh học khác nhau như nhiễm côn trùng hoặc vi vật, hạn hán và điều kiện muối [25, 26] Một số nghiên cứu đã chứng minh protein trên lưới nội chất Ethylene Insensitive 2 (EIN2) hoạt động như một bộ chuyển đổi tín hiệu chính truyền tín hiệu kích hoạt downstream tới các thành viên của họ các yếu tố phiên mã Ethylene Insensitive 3 (EIN3) ở trong nhân EIN3 tiếp tục liên kết với các promoter của các gen kích hoạt bởi ethylene [27, 28] Trong điều kiện thiếu oxy, ethylene đóng vai trò chính trong việc điều hòa ABA và gibberellic acid (GA) để ảnh hưởng đến sự kéo dài của tế bào [29] Hydrogen peroxide (H2O2) đóng vai trò là chất truyền tin thứ cấp ở cuối con đường truyền tín hiệu liên quan đến tín hiệu ethylene để thúc đẩy sự hình thành khí mô trong điều kiện thiếu oxy [30] H2O2 điều chỉnh việc tạo ra ethylene-responsive factor 73 (ERF73) và biểu hiện alcohol dehydrogenase 1 (ADH1) khi thiếu oxy [31]

1.3.2.2 Phản ứng của thực vật

Một cơ chế thích nghi để thực vật chống đỡ trong thời gian thiếu nước là điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào Có hai con đường chính để thực hiện điều này Đầu tiên, tế bào có thể cô lập các ion vào các ngăn tế bào Thứ hai, các chất thẩm thấu chuyên biệt như proline, glycine betaine, mannitol, trehalose, ononitol, và ectoine có thể được tổng hợp để điều hòa thẩm thấu của tế bào Những chất thẩm

thấu này cũng hoạt động tích cực trong việc loại bỏ ROS, đặc biệt nếu chúng nhắm vào lục lạp [32, 33] Sự mất nước cũng có thể tạo ra những thay đổi sinh hóa cụ thể như vận chuyển các chất lưỡng cực (amphiphilic substances) như các glycosylated flavonol và hydroquinone vào màng, làm tăng tính linh động của màng [34, 35] Proline và đường có thể bao phủ các phân tử protein, loại bỏ chất tan khỏi bề mặt của chúng, và do đó làm giảm tốc độ tháo các nếp gấp của protein [34] Trong điều kiện khô hạn, trehalose được tổng hợp với một lượng lớn, có thể tạo liên kết hydro với các amino acid hữu cực trên bề mặt phân tử protein để duy trì cấu trúc và hoạt hoạt động của pretein [36]

Khả năng chịu hạn dường như dẫn đến cả việc nén chặt và giãn nở thành tế bào Có ý kiến cho rằng một trong những phản ứng vật lý và cơ học chính của cây đối với tình trạng căng thẳng do mất nước là tăng cường hoạt động ở các mô cần thiết nhất cho hoạt động sinh lý, và hạn chế tối đa các hoạt động ở những mô không cần thiết, điều này cho phép thực vật duy trì hoạt động sống trong điều kiện thiếu nước [37, 38] Các nghiên cứu về tế bào của rễ ngô đang chịu ảnh hưởng hạn nghiêm trọng đã ghi nhận thành tế bào của mô vùng chóp rễ (0–3 mm tính từ đỉnh chóp) rất linh hoạt dẫn đến sự phát triển liên tục của mô [38, 39] Tuy nhiên, thành tế bào của các mô cách xa vùng chóp không được nới lỏng, điều này dẫn đến các mô này không kéo dài nữa [40]

Để bảo vệ bản thân khỏi tác hại của ROS, thực vật đã phát triển một số chiến lược, bao gồm sản xuất các chất chống oxy hóa, chẳng hạn như ascorbic acid, glutathione và α-tocopherol Các hợp chất này hoạt động bằng cách giảm nồng độ của các điện tử nguy hiểm Ngoài ra, các enzyme peroxidase và superoxide dismutase, cũng được tiết ra để dọn sạch các gốc tự do [33, 35, 41, 42] Các enzyme này thường sử dụng các kim loại như sắt, kẽm, đồng hoặc mangan làm chất nhận điện tử Do đó, các ion kim loại phải có sẵn nếu quá trình giải độc ROS bằng enzyme được tiến hành

Con đường tín hiệu ethylene ngoài tạo sự xuất hiện của rễ bất định ở ngô và lúa [43-45], tận dụng ROS sinh ra do ức chế để kích hoạt quá trình chết theo chương trình của tế bào Từ đó nhu mô biến đổi thành dạng xốp, dẫn đến sự hình

thành mô khí do sự chết tế bào (lysigenous arenchyma) để tăng cường trao đổi khí giữa chồi và rễ

1.3.3 Stress mặn và phản ứng của thực vật

1.3.3.1 Stress mặn

Đất mặn là loại đất chứa nồng độ muối cao (>0,2%) với nhiều ion độc Tuy nhiên, độ mặn cũng có thể biến thiên dựa vào nguồn gốc của mặn, pH đất, nồng độ các chất hữu cơ trong đất, chế độ tưới tiêu và nhiệt độ Thành phần các loại muối trong đất mặn phổ biến là NaCl, Na2SO2, Na2SO4, Na2CO3, MgCl2, MgSO4 các muối này ở nồng độ cao đều gây độc cho cây Cây lấy nước và khoáng chất trong đất nhờ vào sự chênh lệch áp suất thẩm thấu, áp suất thẩm thấu trong rễ cao hơn so với trong đất giúp cây lấy được nước và dưỡng chất Khi đất bị nhiễm mặn, áp suất trong đất tăng cao, vượt mức áp suất của cây, cây không thể hút được nước và khoáng chất nếu không có cơ chế thích nghi Bên cạnh đó hơi nước không ngừng thoát ra ở lá, gây nên hiện tượng hạn sinh lý

Quang hợp giảm mạnh do lá kém phát triển, sắc tố ít do các chất độc ức chế quá trình tổng hợp sắc tố, các quá trình xảy ra trong quang hợp bị giảm sút do ảnh hưởng của chất độc và thiếu nước Hô hấp tăng mạnh, các cơ chất bị phân huỷ mạnh nhưng hiệu quả năng lượng thấp, phần lớn năng lượng của các quá trình phân huỷ đều thải ra dưới dạng nhiệt, đồng thời không hấp thu được P từ khoáng chất trong đất nên không thể phosphoryl hóa tạo năng lượng, làm cho tế bào thiếu ATP để hoạt động Chênh lệch áp suất thẩm thấu làm thất thoát một vài ion ra ngoài môi trường, gây rối loạn quá trình tổng hợp protein, cây sẽ tích tụ amino acid và các amide Sự vận chuyển và phân bố các chất đồng hóa trong mạch libe bị kìm hãm nên các chất hữu cơ tích trữ trên lá, ảnh hưởng đến quá trình tích lũy của cơ quan dự trữ như quả, Cytokinin được tổng hợp nhờ vào hệ thống rễ Trên cây nguyên vẹn thì khi hệ rễ phát triển mạnh mẽ sẽ là lúc cây trẻ và sinh trưởng mạnh Nếu hệ thống rễ bị thương tổn thì cơ quan trên mặt đất sẽ chóng già, thoái hóa và chết

Khi bị stress mặn, thực vật bước đầu cũng có những thay đổi để thích nghi với môi trường Về hình thái, cây sẽ giảm diện tích lá, tăng độ mọng nước, giảm khí khẩu, tăng lớp cutin và lớp sáp trên lá, giảm mạch dẫn, rễ nhanh chóng bị lignin

hoá, giảm khối lượng thân và rễ Đồng thời, thực vật khắc phục áp suất thẩm thấu của đất cao bằng cách nâng cao áp suất trong rễ Rễ thực hiện nhiều hoạt động nhưnhư tích lũy các ion Na+ và K+, hoặc tăng tích trữ các chất hữu cơ đơn giản, phân tử lượng thấp như acid hữu cơ, amino acid và các loại đường

1.3.3.2 Tín hiệu của thực vật dưới tác động stress mặn

Stress muối bao gồm 1 loạt tác động gây căng thẳng cho thực vật như stress thẩm thấu và stress do nồng độ ion hoặc do ion gây độc cho tế bào Các tác động thứ cấp của stress hạn và stress do muối rất phức tạp và bao gồm stress oxy hóa, tổn thương các thành phần tế bào như lipid màng, protein và acid nucleic, rối loạn chức năng trao đổi chất Một đặc điểm quan trọng của stress do mặn là tín hiệu tăng thẩm thấu gây ra sự tích tụ acid abscisic (ABA), từ đó tạo ra nhiều phản ứng thích nghi ở thực vật Các phản ứng thích nghi đối với stress do muối có thể được nhóm thành ba quá trình: stress thẩm thấu, stress ion và phản ứng giải độc

a) Các con đường tín hiệu căng thẳng thẩm thấu

Hình 1.2 Căng thẳng thẩm thấu và con đường tín hiệu ABA [46]

Vì stress do muối cũng gây ra stress thẩm thấu trong tế bào thực vật, tín hiệu cần thiết để thiết lập lại trạng thái cân bằng thẩm thấu ở những cây này Một số protein gần đây đã được đề xuất đóng vai trò cảm nhận áp lực thẩm thấu ở thực vật

Trong điều kiện căng thẳng thẩm thấu, tất cả 10 đồng dạng SnRK2, ngoại trừ SnRK2.9 đều được kích hoạt Việc kích hoạt SnRK2.2/3/6/7/8 xảy ra qua trung gian con đường truyền tín hiệu phụ thuộc vào ABA [46] Cảm ứng hoạt động phiên mã của các tác nhân tác động xuôi dòng được trung gian bởi mô-đun báo hiệu SnRK2.2/3/6–yếu tố phản ứng ABA (ABA-responsive element - ABRE) gắn protein / ABRE binding factor (AREB/ABF) được kích hoạt ABA để đáp ứng với áp lực thẩm thấu [47]

Con đường truyền tín hiệu SnRK2 - AREB/ABF - BAM1/AMY3 amylase1/α-amylase3) phụ thuộc vào ABA có liên quan đến việc điều chỉnh quá trình thoái hóa tinh bột ở lá, điều này rất quan trọng đối với khả năng chống chịu áp lực thẩm thấu ở thực vật Với sự hiện diện của ABA, SnRK2 phosphoryl hóa và kích hoạt các yếu tố phiên mã ISB/ABF, liên kết với các ABRE trong các yếu tố thúc đẩy BAM1/AMY3 và kích hoạt biểu hiện của chúng BAM1/AMY3 sau đó phân hủy tinh bột thành đường và các chất thẩm thấu có nguồn gốc từ đường [48]

(β-Một chiến lược chính để thích ứng với áp lực thẩm thấu là tổng hợp các chất thẩm thấu tương thích (compatible osmolyte) làm giảm áp suất thẩm thấu và ổn định cấu trúc tế bào và protein [49] Một trong những sản phẩm của các con đường truyền tín hiệu thẩm thấu ở thực vật dưới áp lực của muối là sự tích tụ các chất thẩm thấu tương thích, rất quan trọng đối với sự điều hòa thẩm thấu do muối gây ra, bao gồm các chất chuyển hóa tích điện (ví dụ: proline, hydroxyproline, glycine betaine, b-alanine betaine), polyol (ví dụ: mannitol, sorbitol), đường (ví dụ: sucrose, fructose), đường phức tạp (ví dụ: trehalose, raffinose) và các ion (ví dụ:  K+) [50]

b) Các con đường tín hiệu ion stress

Nồng độ muối cao (chủ yếu là Na+) trong tế bào thực vật có thể gây ra stress ion Do đó, việc cảm nhận tín hiệu muối là điều kiện tiên quyết để bắt đầu thiết lập lại cân bằng nội môi ion của tế bào trong điều kiện căng thẳng

Hình 1.3 Con đường tín hiệu stress ion [51]

Con đường tín hiệu stress ion đã được mô tả dựa trên việc phát hiện ra các gen SOS (Salt Overly Sensitive) [52] Trong điều stress muối, lượng Na+ nội bào hoặc ngoại bào dư thừa sẽ kích hoạt tín hiệu Ca2+ tế bào Các protein liên kết Ca2+với tay EF (The EF-hand Ca2+-binding proteins), SOS3 và SCaBP8 (SOS3-like calcium binding protein8)/CBL10, giải mã tín hiệu Ca2+ và dịch nó thành SOS2, một protein kinase serine/threonine [53, 54]

SOS3 chủ yếu được biểu hiện ở rễ và SCaBP8 được ưu tiên biểu hiện ở các chồi [46, 54], nơi chúng tương tác và kích hoạt hoạt động SOS2 kinase trong màng sinh chất [53, 54] SOS2 được kích hoạt sau đó phosphoryl hóa và kích hoạt SOS1, một antiporter Na+/H+ trên màng sinh chất [53] Hoạt động của SOS1 tự động bị ức chế bởi sự tương tác giữa các phân tử ở nguyên sinh chất tế bào (cytosolic) và xuyên màng (transmembrane) của nó [55] Khả năng tự ức chế của SOS1 được giải tỏa và tự kích hoạt khi serine 1.044, trong đầu C miền tự ức chế của nó, bị SOS2 phosphoryl hóa [56, 57]

SOS1 là yếu tố chính tham gia vào quá trình vận chuyển Na+ từ tế bào chất đến apoplast [58] SOS2 và SOS3 cũng gây ảnh hưởng đến SOS1 Hơn nữa, dưới áp lực của muối, phức hợp SOS3-SOS2 điều chỉnh tích cực NHX, một chất trao đổi Na+/H+ trong không bào, cũng như hoạt động của H+-adenosine triphosphatase

(ATPase) [59] NHX là chất trao đổi Na+/H+ vận chuyển Na+ từ tế bào chất đến không bào, một quá trình được điều khiển bởi gradient H+ được thiết lập bởi H+-pyrophosphatase và H+-ATPase của không bào [60]

c) Các con đường giải stress oxi hóa

Căng thẳng do muối gây ra sự tích tụ ROS, gây ảnh hưởng bất lợi đến thực vật Bên cạnh tác dụng bất lơi, ROS còn có chức năng như các phân tử tín hiệu để đáp ứng với các kích thích môi trường ROS phải có mặt ở mức thích hợp trong tế bào thực vật Các đường truyền tín hiệu giải độc có liên quan đến việc kiểm soát cân bằng nội môi của các lượng ROS của tế bào trong các điều kiện căng thẳng khác nhau Tỉ lệ bị tổn thương do stress sẽ giảm đi khi cân bằng nội môi tế bào được thiết lập lại

Nhiều chất quét gốc tự do dưới dạng enzyme và không phải enzyme có liên quan đến việc giảm thiểu thiệt hại do ROS gây ra ở thực vật dưới áp lực của muối [61, 62] NCA1 (no catalase activity1) tương tác và tăng hoạt động của catalase2 (CAT2) để phân hủy H2O2, do đó kiểm soát cân bằng nội môi của nồng độ H2O2 trong tế bào dưới áp lực phi sinh học [62] Protein chaperone, Hsp17.6CII, kích hoạt hoạt động CAT2 theo cách phụ thuộc vào NCA1 và tăng khả năng chống chịu stress phi sinh học ở cây Arabidopsis [63] Phosphoryl hóa CatC, một catalase (CAT) trong lúa, bởi kinase giống thụ thể STRK1 (Receptor-Like Cytoplasmic Kinase 1) rất quan trọng đối với khả năng chịu mặn của cây trồng [64]

Stress do muối gây ra phản ứng và truyền tín hiệu ROS trong tế bào thực vật Các tầng MAPK, bao gồm một con đường truyền tín hiệu giải độc quan trọng, có liên quan đến các phản ứng bảo vệ chống oxy hóa và điều chỉnh cân bằng nội môi ROS để đối phó với stress do muối/oxy hóa Cascade MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4 đóng một vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệu căng thẳng do ROS và

SA khởi xướng ở Arabidopsis Phân tích phiên mã của các đột biến mekk1, mkk1/2,

và mpk4 gợi ý rằng chuỗi MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4 điều chỉnh hoạt động của các enzyme quét ROS để duy trì cân bằng nội môi ROS [65]

1.3.3.3 Phản ứng của thực vật dưới stress mặn

a) Dưới tác động stress thẩm thấu

Trong giai đoạn đầu tiên, giai đoạn thẩm thấu, bắt đầu ngay sau khi nồng độ muối xung quanh rễ tăng đến mức ngưỡng khiến rễ khó hút nước hơn, tốc độ phát triển của chồi giảm đáng kể Một phản ứng ngay lập tức đối với tình huống này là đồng thời làm giảm dòng ion đến chồi và đóng khí khẩu Tuy nhiên, do sự khác biệt về lượng nước giữa khí quyển và tế bào lá và nhu cầu cố định carbon, vì vậy, phương thức này không thể kéo dài [66] Sự phát triển của chồi nhạy cảm hơn so với sự phát triển của rễ đối với áp lực thẩm thấu do muối gây ra có lẽ vì sự giảm phát triển diện tích lá so với sự phát triển của rễ sẽ làm giảm lượng nước sử dụng của cây, do đó cho phép sự duy trì độ ẩm của đất và ngăn ngừa sự hấp thu lượng lớn muối vào cây [67]

b) Dưới tác động của stress ion

Ở phần lớn các loài thực vật khi ở trong điều kiện mặn, Na+ thường đạt đến nồng độ gây độc trước Cl−, và vì vậy hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào việc loại trừ Na+ và kiểm soát sự vận chuyển Na+ bên trong cây [67] Từ đó có thể thấy cơ chế chống chịu quan trọng khác liên quan đến khả năng giảm căng thẳng ion trên cây trồng là giảm thiểu lượng Na+ tích tụ trong nguyên sinh chất của tế bào đặc biệt ở lá, thông qua sự điều chỉnh tăng giảm hoạt động của các kênh ion và chất vận chuyển cụ thể, cho phép kiểm soát quá trình vận chuyển Na+ trong toàn bộ cây [67, 68] Việc hạn chế lượng Na+ dư thừa ở lá là một trong những cơ chế chống chịu mặn ở nhóm cây ngũ cốc bao gồm lúa, lúa mì cứng (durum wheat), lúa mì (bread wheat) và lúa mạch [69] Hạn chế lượng Na+ dư thừa ở lá được thực hiện bằng việc kiểm soát hấp thu Na+ với lượng thấp bởi các tế bào ở vỏ rễ và sự kiểm soát chặt chẽ việc nạp vào xylem qua các tế bào nhu mô xylem [70] Loại trừ Na+ từ rễ đảm bảo rằng Na+ không tích tụ đến nồng độ độc hại trong phiến lá [67]

Việc loại trừ Na+ trong tế bào hiệu quả cũng đạt được thông qua hoạt động của các kênh Na+/H+ ngược dòng (antiport) trên màng không bào (tonoplast) giúp di chuyển các ion có khả năng gây hại từ tế bào chất vào các không bào lớn Ngược lại, các ion này hoạt động như một chất thẩm thấu trong không bào, từ đó duy trì

dòng nước chảy vào tế bào, do đó cho phép thực vật phát triển trong đất có độ mặn cao Kênh ngược dòng sử dụng động lực proton được tạo ra bởi các enzyme vận chuyển H+ ở không bào (vacuolar H+-translocating enzymes), H+-adenosine triphosphatase (ATPase) và H+- inorganic pyrophosphatase (PPiase) AtNHX1 là kênh ngược dòng Na+/H+, hiện diện ở tonoplast, được ghi nhận có liên quan đến

việc kiểm soát tiềm năng thẩm thấu không bào ở cây Arabidopsis [71]

c) Dưới tác động stress oxi hóa

Ở thực vật, thành tế bào bao gồm các sợi cellulose được liên kết với nhau bằng hemicellulose, chẳng hạn như xyloglucan và arabinoxylan, và được gắn trong gel pectin [72] Thành tế bào cũng chứa phenolic; enzyme peroxidase, pectin esterase và các enzyme khác; protein nối dài (extensin), protein mở rộng (expansin) và các protein khác; và ion Ca2+ Muối, hạn hán và các căng thẳng thẩm thấu khác có thể gây ra sự tích tụ ROS và những thay đổi khác trong thành tế bào [72] Sự tích lũy ROS có thể gây ra liên kết ngang của phenolic và glycoprotein ở thành tế bào như extensin, dẫn đến cứng thành tế bào Mặt khác, stress làm tăng cường expansin và các enzyme biến đổi xyloglucan làm biến đổi cấu trúc thành tế bào [72] Ngoài ra, stress muối còn có thể làm thành tế bào bị mất Ca2+ Thực vật có thể được bảo vệ khỏi bị tổn thương bằng cách tăng khả năng chịu đựng căng thẳng bằng cách loại bỏ gốc tự do thông qua ba loại enzyme: ascorbate peroxidase, glutathione peroxidase và glutathione reductase

1.4 Vai trò của PP2CA (clade A type 2C protein phosphatases) với đóng mở khí khẩu

1.4.1 SLAC

Lỗ khí khẩu là một lỗ được bao quanh bởi hai tế bào bảo vệ, có thể mở rộng hoặc thu nhỏ do thay đổi áp suất trương Các kênh như kênh K+ - đưa K+ ra ngoài (K+-outward-rectifying channel - GORK), kênh K+- đưa K+ vào trong (K+-inward-rectifying channel - KAT1), kênh anion loại nhanh và kênh anion loại chậm (slow-type anion channel - SLAC1) điều chỉnh áp suất trương của các tế bào bảo vệ bằng cách vận chuyển các ion bao gồm K+, Cl− và malate [73-75] Trong số các kênh này,

SLAC1 đã được báo cáo là rất quan trọng để đóng khí khẩu ở Arabidopsis thaliana

(Arabidopsis) SLAC1 được kích hoạt sẽ khử cực màng sinh chất để kích hoạt GORK và đẩy K+ ra khỏi tế bào bảo vệ, do đó làm giảm áp suất trương và đóng lỗ khí khẩu [76]

1.4.2 SAPK

Tín hiệu ABA và Ca2+ điều chỉnh hoạt động của SLAC1 thông qua quá trình phosphoryl hóa (phosphorylation) và khử phosphoryl hoá (dephosphorylation) Serine 120 (Ser120) của Arabidopsis SLAC1 được phosphoryl hóa và được kích hoạt khi có mặt ABA, chủ yếu bởi Open Stomata 1 (OST1; còn được gọi là SnRK2E hoặc SnRK2.6), một loại protein thuộc họ protein kinase2 (SnRK2) liên quan đến SNF1 [77-79] Ngoài ra, protein kinase phụ thuộc calcium 21/6/23 (calcium-dependent protein kinase 21/6/23 - CPK 21/6/23) và protein kinase tương tác CBL (cbl-interacting protein kinase - CIPK), đóng vai trò trong tín hiệu phụ thuộc Ca2+, kích hoạt SLAC1 bằng cách phosphoryl hóa Ser59 để đáp ứng với tín hiệu Ca2+ [80-82]

OST1 (SnRK2–6) là một chất điều chỉnh tích cực quan trọng đối với quá trình truyền tín hiệu ABA trong các tế bào bảo vệ ở Arabidopsis [79, 82] Phiên bản của Arabidopsis SnRK2s trên cây lúa được gọi là Osmotic Stress/ABA-Activated Protein Kinases (SAPKs) và có mười SAPK có mặt trong bộ gen của cây lúa [83]

1.4.3 PP2CA

Các phosphatase protein loại 2C của nhánh A (clade A type 2C protein phosphatases - PP2CA) đóng vai trò kìm hãm việc đóng khí khẩu thông qua tín hiệu ABA và Ca2+ [84, 85] PP2CA triệt tiêu tín hiệu ABA bằng cách tương tác và vô hiệu hóa OST1 và CPK6 Mặt khác, các PP2CA tương tác trực tiếp và vô hiệu hóa SLAC1 bằng cách khử phosphoryl hoá, chống lại quá trình OST1 hoặc CPK phosphoryl hóa SLAC1 để đáp ứng với tín hiệu ABA hoặc Ca2+ [78, 79, 82]

Nghiên cứu của Min et al., (2019) [86] đã xác định rằng chỉ OsPP2C50 và OsPP2C53 trong số 9 OsPP2CA có thể liên quan đến tín hiệu đóng/mở khí khẩu dựa trên biểu hiện cụ thể của tế bào bảo vệ và quá trình định vị dưới tế bào Lúa biến đổi gen biểu hiện quá mức OsPP2C50 và OsPP2C53 cho thấy lượng nước mất đi cao hơn đáng kể so với đối chứng Nhóm tác giả tìm thấy hai con đường tương

tác giữa các thành phần tín hiệu: một con đường tương tác phân cấp (hierarchical interaction pathway) bao gồm OsPP2C50 và OsPP2C53, SAPK10 và OsSLAC1; và một lộ trình tương tác phân nhánh (branched interaction pathway) trong đó OsPP2C50 và OsPP2C53 tương tác trực tiếp với OsSLAC1

1.5 Chitosan

1.5.1 Đặc điểm cấu trúc

Chitosan thu được từ chitin, được coi là polysaccharide tự nhiên phổ biến thứ hai sau cellulose [3] Về mặt cấu trúc, chitin bao gồm đơn vị lặp lại monosaccharide của N-acetylglucosamine Sau khi khử acetyl chitin, sản phẩm chitosan thu được là một polymer mạch thẳng bao gồm hai đơn vị là D-glucosamine và N-acetyl-D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết glycoside Sự hiện diện của nhóm amine này tạo điều kiện sửa đổi cấu trúc và tổng hợp các dẫn xuất chức năng của thực vật [87] Về mặt thương mại, chitosan được điều chế bằng cách khử chitin bằng cách sử dụng acid sau đó là khử protein với base [88]

1.5.2 Các con đường tín hiệu của chitosan trên thực vật

Tín hiệu được tạo ra bởi phân tử chitosan được tiếp nhận bởi các thụ thể cụ thể của tế bào, sau đó được chuyển đi bởi chất truyền tin thứ cấp như các gốc tự do (reactive oxygen species-ROS), H2O2, Ca2+, nitric oxide (NO) và hormone thực vật trong tế bào để tạo ra các phản ứng sinh lý Tác dụng ức chế các gốc anion superoxide và gốc lipid tự do bằng cách xử lí bằng chitosan đã được nghiên cứu trước đây bởi Li và cộng sự [89] Sự giảm khối lượng phân tử và tăng mức độ khử acetyl của chitosan làm tăng sự ức chế anion superoxide và các gốc lipid tự do Pongprayoon và cộng sự [90] cho thấy H2O2 hoạt động như một phân tử truyền tín hiệu tạo ra khả năng chống lại stress thẩm thấu ở hai giống lúa, LPT123 và LPT123-TC171 bằng cách tăng cường sự phát triển của cây và tổng hợp các sắc tố quang hợp trong điều kiện stress thẩm thấu Bên cạnh đó, chitosan đã được nghiên cứu trên lúa mì để cải thiện tính ổn định của màng thông qua việc kích hoạt hệ thống chống oxy hóa, và trên đậu tương để tăng tổng hợp oligosaccharide và tăng cường khả năng chịu hạn Ca2+ điều chỉnh hoạt động tổng hợp callose ở cả cây một lá mầm và cây hai lá mầm để đáp ứng với kích thích chitosan

Tín hiệu nitric oxide đã được nghiên cứu ở cây cao lương được xử lý bằng chitosan, trong đó chất ức chế NO ngoại sinh LNAME (N-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) hoặc chất loại bỏ NO c-PTIO [2- (4-carboxyphenyl) -4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxy-3-ox] được sử dụng cho kết quả khả năng tự vệ của cây khỏi sự tấn công của mầm bệnh Chitosan cũng tạo ra sự tích tụ acid jasmonic

(JA) trong lúa và Phaseolus vulgaris Phân tích RT-PCR microarray/bán định lượng cDNA về biểu hiện gen Brassica napus cho thấy JA/ethylene đóng vai trò tín hiệu

trong phản ứng bảo vệ thực vật qua trung gian chitosan Sự hoạt hóa phiên mã của gen mã hóa phenylalanine amoniac lyase (PAL) và chất ức chế protease kích hoạt bởi cả chitosan và acid jasmonic [91] Chitosan có thể kích hoạt tổng hợp JA và ABA JA và ABA có các hoạt động tương tự, đóng vai trò không nhỏ trong việc điều tiết sử dụng nước của thực vật Ở cây lúa, có sự gia tăng sự tích tụ JA và 12-oxophytodieonic thông qua con đường octadecanoid khi được xử lý bằng chitosan, trong khi ABA cũng được cảm ứng thông qua tín hiệu hydrogen peroxide dẫn đến đóng khí khẩu [92] Ngoài ra, ứng dụng chitosan dẫn đến các phản ứng phòng vệ nâng cao liên quan đến việc kích hoạt hydrogen peroxide thông qua con đường octadecanoid và NO trong lục lạp, kích hoạt MAP-kinase, bùng nổ oxy hóa và phản ứng siêu mẫn cảm [93] Toàn bộ các phân tử tín hiệu này góp phần vào cơ chế thích ứng ở các cây được xử lý bằng chitosan để phản ứng với stress

1.5.3 Phản ứng của thực vật dưới tác động chitosan trong điều kiện stress

Chitosan và các dẫn xuất của nó kích thích tổng hợp hợp chất hữu cơ trên thực vật [92] Dưới tác động của stress sinh học, thực vật thực hiện phản ứng phòng vệ bao gồm sản xuất phytoalexin, các protein đối kháng bệnh thực vật như chitinase và b-glucanase, ức chế proteinase, hình thành callose, sinh tổng hợp lignin và kích hoạt các gen phản ứng với stress Bên cạnh đó, khi được xử lí với chitosan và oligomer của nó, nồng độ hợp chất phòng thủ thực vật này được tăng lên, tạo điều kiện cho việc sử dụng chitosan và các dẫn xuất của nó như các hợp chất kháng khuẩn mạnh và chất kích kháng để bảo vệ thực vật [4] Việc tạo ra enzyme chitinase và glucanase bằng cách xử lý chitosan đã được ghi nhận ở một số cây trồng, bao

gồm đào (Prunu persica L Batsch), cà chua, thanh long (Hylocereus undatus)

Chitinase và glucanase là các hợp chất liên quan đến tính kháng mầm bệnh, tuy nhiên, trong cây lúa, chitosan có trọng lượng phân tử khác nhau thúc đẩy sự biểu hiện ở mức độ khác nhau của protein liên quan đến tình trạng cây, điều này cho thấy chitosan có chức năng khác nhau nguồn gốc của nó [94] Hơn nữa, chitosan trọng lượng phân tử thấp (5 kDa) có thể cảm ứng thực vật tạo ra phytoalexin và các hợp chất liên quan đến tình trạng bệnh lý của cây như chitinase, β-glucanase, lipoxygenase và kích hoạt sự tạo ra các gốc oxy hóa Xử lý hạt giống bằng các phân đoạn chitosan và dẫn xuất oligosaccharide của nó đã làm tăng hoạt tính chitinase trong cây con lên 30% - 50% [95]

1.5.3.1 Phản ứng của thực vật dưới tác động chitosan trong điều kiện stress mặn

Các nghiên cứu khác nhau đã phát hiện ra rằng sự tích lũy MDA (malondialdehyde) ở cây bị ảnh hưởng bởi muối chủ yếu là do sự peroxy hóa lipid của màng gây ra bởi độc tính ion Tuy nhiên, một số nhà nghiên cứu đã cho rằng xử lí bằng chitosan ở nồng độ thấp có thể làm giảm bớt các tác động tiêu cực do stress

muối gây ra Hạt nghệ (Carthamus tinctorius L.) và hướng dương (Helianthus

annuus L.) được xử lý bằng chitosan nồng độ thấp có thể làm giảm stress oxy hóa

do muối bằng cách giảm hoạt động của enzyme trong cả hai loại cây trồng [96] Tương tự, tiền xử lý cây trồng với chitosan khi bị stress mặn dẫn đến tăng hoạt động của enzyme chống oxy hóa và nồng độ MDA thấp hơn, điều này làm giảm tác động tiêu cực do stress muối ở Oryza sativa, Zea mays, Vigna radiata, Trachyspermum ammi và Plantago ovata [97] Hơn nữa, thí nghiệm thủy canh được thực hiện trên lúa mì cho thấy hạt được xử lý 0,0625% oligochitosan mang lại hiệu quả tích cực bằng cách tăng đáng kể enzyme chống oxy hóa như superoxide dismutase (SOD), peroxidases (POD) và CAT trong quá trình stress do muối và có thể làm giảm stress oxy hóa [98] Oligochitosan là một trong những oligosaccharide hiệu quả bao gồm các đơn vị b-1, 4-amino-D-glucose liên kết 4 và chứa một lượng nhỏ đơn vị 2-acetomido-D-glucose thu được do phân cắt chitosan

1.5.3.2 Chitosan ảnh hưởng đến hoạt động sinh hóa của thực vật trong điều kiện stress mặn

Trong căng thẳng muối, thực vật thể hiện sự giảm đáng kể nồng độ chất diệp lục do sự mất ổn định của phức hợp protein và sự tích lũy của chlorophyllase [99] Mặt khác, tích lũy quá mức Na+ gây ra đóng khí khẩu có thể làm giảm CO2 bên trong và dẫn đến giảm tốc độ quang hợp Tuy nhiên, khi xử lý hạt giống bằng oligochitosan (0,0625%), tỷ lệ quang hợp và độ dẫn của khí khẩu đã được tìm thấy để tăng lúa mì do quá trình quang hợp phụ thuộc vào chuyển động của khí khẩu và protein được liên kết với chuyển hóa diệp lục [98] Trong khi trong một nghiên cứu khác, việc sử dụng chitosan trên lá dẫn đến giảm độ dẫn của khí khẩu và tốc độ quang hợp mà không làm thay đổi nồng độ CO2 bên trong [100] Những kết quả tương phản này có thể là do chức năng chitosan phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau như phương pháp ứng dụng, mức độ khử sắt, trọng lượng phân tử và các loài khác nhau nhận thấy các phản ứng khác nhau Tuy nhiên, trong điều kiện này, phương pháp ứng dụng rất quan trọng vì việc xử lý qua lá giúp giảm độ dẫn của khí khẩu và tốc độ quang hợp, trong khi trong xử lý hạt giống, điều ngược lại đã được thể hiện Thực vật có cơ chế loại bỏ gốc tự do tự nhiên bằng cách sản xuất các hợp chất chống oxy hóa enzyme và phi enzyme SOD, POD và CAT là các enzyme chống oxy hóa trong cây tăng khi thực vật chịu áp lực của muối [96] Cây được xử lý bằng chitosan có sự tăng nồng độ enzyme này và từ đó đóng vai trò quan trọng trong việc giảm tác hại do stress muối [98] Tương tự, sự peroxide hóa lipid gây ra bởi sự tích lũy MDA đã được tìm thấy trong tình trạng stress do muối [101] Tuy nhiên, khi xử lý bằng chitosan và các dẫn xuất của nó, nồng độ MDA giảm đã làm ổn định sự tổn thương ở màng tế bào, đây có thể là lý do để trung hòa ảnh hưởng stress muối [96] Tăng cường nồng độ proline cũng được ghi nhận dưới điều kiện stress muối có thể là do tăng cường sinh tổng hợp proline hoặc giảm quá trình oxy hóa proline thành glutamate hoặc giảm sử dụng nguyên liệu protein vào chuyển hóa Hạt giống được ngâm với oligochitosan ở nồng độ 0,0625% trong 5 giờ, dẫn đến sự tăng proline đáng kể [98] Quan sát tương tự đã được báo cáo trong xử lý hạt giống trước khi gieo chitosan ở cây rum và hướng dương, trong đó việc tăng nồng độ chitosan được

tìm thấy để tăng cường mức độ proline, trong khi sự giảm nồng độ proline được tìm thấy ở nồng độ thấp (0,25%) của chitosan [96]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Giống lúa IR 64 (OM 89)

Giống được chọn lọc từ tập đoàn giống nhập nội của IRRI, được công nhận giống theo quyết định số 402 BNN, ngày 27 tháng 11 năm 1986 Hạt giống được sử dụng trong thí nghiệm được cung cấp bởi Công ty Cổ phần Giống nông nghiệp Điện Biên

2.1.2 Oligochitosan

Oligochitosan phân đoạn 5.994 Da được cắt bởi bức xạ gamma liều xạ 150 kGy từ chitosan 5%, kích thước phân tử 573.170 Da (Funakoshi - Tokyo, Japan) với độ deacetyl hoá 80% (cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Vật liệu

và Nano thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh) 2.2 Phương pháp

Thí nghiệm được thực hiện theo quy trình ở hình 2.1

Hình 2.1 Qui trình thực hiện thí nghiệm

2.2.1 Tạo hạt lúa nảy mầm in vitro

Hạt lúa giống IR64 khử trùng với javel 15% trong 20 phút Đặt trên giấy thấm (đã làm ẩm với nước cất) trên đĩa petri đường kính 15 cm ở điều kiện tối trong 3 ngày Khi hạt lúa nảy mầm (diệp tiêu cao khoảng 1 cm, rễ nhô ra khỏi vỏ trấu 2-3 cm), lúc này các hạt lúa sẵn sàng chuyển sang điều kiện thủy canh

Hạt lúa Khử trùng Ngâm trong nước

Nảy mầm Chọn cây mầm Thủy canh trong nhà lưới

Trong javel 15% (15 phút) (1 ngày)

Trong đĩa petri 15 cm lót giấy thấm ẩm (3 ngày) Mầm cao 1 cm, rễ dài khoảng 2 - 3 cm

Cây con 7 ngày tuổi

Dd Yoshida (đối chứng)

Dd Yoshida + NaCl 0,6% + OC 5.994 Da 75 ppm (xử lí) Dd Yoshida + 0,6%NaCl (mặn) Dung dịch Yoshida (7 ngày)

(Ngày 1, 4)

2.2.2 Thủy canh cây mạ lúa in vivo

Hạt nảy mầm (rễ nhú ra khỏi hạt – 3 ngày sau khi gieo) được chuyển qua hệ thống thủy canh với dung dịch Yoshida [102] trong 7 ngày Hệ thống thủy canh bào gồm chậu nhựa chứa dịch (12 x 18 x 6 cm) và phần nổi bằng xốp có lớp lưới bên dưới để đỡ hạt Sau 7 ngày, cây con được xử lý với các điều kiện khác nhau như sau: (1) đối chứng (dung dịch Yoshida); (2) stress mặn (dung dịch Yoshida + NaCl 0,6%); (3) stress mặn kết hợp với xử lý oligochitosan Oligochitosan 5.994Da 75 ppm sẽ được phun vào ngày 1 và ngày 4 (ngày 1 là ngày bắt đầu xử lí) Cây con được nuôi trong điều kiện trên trong 7 ngày trước khi được thu nhận và phân tích các chỉ tiêu về sinh trưởng, sinh lý, sinh hoá… Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nghiên, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại gồm 20 cây

2.2.3 Khảo sát chỉ tiêu sinh trưởng

• Số lượng lá: đếm tất cả lá hiện diện trên cây

• Chiều cao cây: duỗi lá thẳng theo gốc cây, đo từ điểm bắt đầu ra rễ đến điểm lá dài nhất sau khi duỗi thẳng

• Chiều dài rễ: tương tự duỗi thẳng bộ rễ, đo từ điểm bắt đầu ra rễ đến điểm rễ dài nhất sau khi duỗi thẳng

• Hình thái rễ: độ dày bộ rễ, sự tồn tại của lông hút

• Khối lượng tươi, khối lượng khô: cân khối lượng tươi cây 14 ngày tuổi, sau đó sấy khô ở 70oC đến khối lượng không đổi, cân thu số liệu khối lượng khô

2.2.4 Nồng độ sắc tố quang hợp (Chlorophyll a, b và carotenoid)

Cơ sở phương pháp:

Sắc tố quang hợp được xác đinh nồng độ bằng phương pháp đo quang theo Wellburn [103] dựa vào tính chất hấp thụ năng lượng ánh sáng chọn lọc của chlorophyll (vùng ánh sáng xanh λ: 430 – 460 nm; vùng ánh sáng đỏ λ: 620 - 700 nm) và khả năng hòa tan trong dung môi ethanol

Tiến hành:

Bước 1 – Xử lý mẫu và chiết diệp lục tố:

Cân 0,2 gram lá lúa sau 14 ngày thủy canh, nghiền nát trong cối với 10 mL dung dịch ethanol 96%, lọc nhanh dịch chiết vào bình định mức và định mức thành 25 mL

Bước 2 – Định lượng sắc tố trong dịch thu được

Dung dịch sau khi định mức được tiến hành đo OD ở các bước sóng lần lượt là 470 nm, 649 nm, 665 nm sử dụng công thức phụ lục 1 mục 1 để tính nồng độ diệp lục tố và carotenoid

Đối với phản ứng định lượng proline, ở pH thấp (pH acid), sản phẩm có màu vàng nhạt và độ hấp thụ lớn nhất ở bước sóng 520 nm Thuốc thử: ninhydrin 1% (w/v) trong acetic acid 60% (v/v), ethanol 20% (v/v) Dung dịch cần tránh ánh sáng và ổn định trong 24 giờ

Tiến hành:

Bước 1 – Xử lý mẫu và chiết proline:

Proline có thể được chiết xuất bằng cách đun 0,4 g lá lúa sau 14 ngày thủy canh trong ethanol nguyên chất trong 20 phút

Bước 2 – Định lượng proline trong dịch thu được

Quy trình dựng đường chuẩn và định lượng proline trong mẫu thực vật thực hiện trong effendorf nắp vặn (1,5 mL) lần lượt theo mô tả trong bảng 2 (phụ lục 1) với các effendorf 1 – 5 để dựng đường chuẩn