thực tập vi sinh học đại cương

NOI DUNG THUC HANH VI SINH DAI CUONG GIỚI THIỆU CHUNG Phân lập, cấy chuyền VSV Làm tiêu bản, quan sát tế bào VSV Đếm tế bào men bằng buồng đếm hồng cầu Khao sat l số phản ứng sinh hoá c

TRUONG DAI HQC NONG LAM TP HO CHi MINH KHOA CONG

NGHE HOA HOC VA THUC PHAM

THUC TAP VI SINH HQC DAI CUONG

Dang Thi Kim Dung - DH20VT MSSV: 20125363 Nhom 5

Biên soạn: Th.S Nguyễn Minh Hiền

NOI DUNG THUC HANH VI SINH DAI CUONG

GIỚI THIỆU CHUNG

Phân lập, cấy chuyền VSV

Làm tiêu bản, quan sát tế bào VSV

Đếm tế bào men bằng buồng đếm hồng cầu

Khao sat l số phản ứng sinh hoá của vi khuân

3 Yêu cầu của GV với SV

Yêu cầu kiến thức: Chuẩn bị bài trước khi đến phòng thí nghiệm GV sẽ kiếm tra bài, nếu bất kỳ 5V nảo trong nhóm không chuẩn bị bài, cả nhóm sẽ bị nghỉ buổi học đó và không được dạy và học lại

Sau khi kết thúc môn học, SV có 5 -10 ngày để viết báo cáo Nộp bài cho I bạn (có chỉ định) trong nhóm Bài báo cáo ghi rõ họ tên, nhóm, tô Bài báo cáo SV có thể đánh máy hoặc viết tay

Yêu cầu kỹ năng: quan sát GV thực hiện thao tác và làm đúng các yêu cầu khi thực hiện thao tác nuôi cấy VSV, làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi (KHV)

Yêu cầu thái độ: nghiêm túc, nhanh nhẹn, thực hiện đúng quy định trong PTN và các yêu cầu của GV Tham gia tích cực trả lời câu hỏi của GV cũng như đặt câu hỏi trong buổi học

4 Yêu cầu của SV với GV

BÀI 1 MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG, PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 1.1 Các thiết bị trong PTN Vi sinh

Trong buôi học, yêu cau sinh viên quan sát và tìm hiệu (tên thiệt bị, mục dich sử dụng, cách

sử dụng ) rồi liệt kê các thiết bị có trong PTN Vi sinh vao Bang 1

Bảng 1 Một số thiết bị trong PTN vi sinh

Nồi hấp tiệt trùng Hấp, khử trùng các dụng cụ

Que cay Dùng trong thao tác cấy các loại nắm, vi sinh vat

Tủ Nuôi cấy, tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển

Máy dập mẫu Đồng nhất mẫu

1.2 Môi trường nuôi cấy VSV

1.2.1 Khái niệm:

Là các cơ chat dinh dưỡng được pha chê nhân tạo nhăm đáp ứng cho nhu câu sinh trưởng phát triển và sản sinh các sản phâm trao đôi chat cua vi sinh vat

1.2.2 Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV

Có đủ các chất dinh dưỡng cân thiết

Có đô pH thích hợp

Có độ nhớt nhất định

Không chứa các yếu tổ độc hại

Hoàn toàn vô trùng

1.2.3 Phân loại

1.2.3.1 Phân loại mỗi trường theo công dụng

- Môi trường tăng sinh (Enrichment): Môi trường mà ở đó có các chất dinh dưỡng như máu huyết thanh thích hợp với một số nhóm vi sinh vật sẽ được bồ sung lên môi trường cơ sở

- Môi trường chọn lọc (Selective): Được sử dụng cho từng nhóm sinh vật riêng biệt

- Môi trường phân biệt (Diferentiate): Phân biệt các vị sinh vật với nhau

- Môi trường tăng sinh chọn lọc (Selective Enrichment): Đề ngăn chặn ví khuân không mon:

muốn hoặc vi khuân lây nhiễm, øiúp khôi phục mầm bệnh từ hỗn hợp vi khuẩn

1.2.3.2 Phân loại môi trường theo thành phần hoá học

- Môi trường tự nhiên là loại môi trường chứa các chất hữu cơ khác nhau không biết rõ thành phân hóa học

- Môi trường tổng hợp là loại môi trường biết rõ về các thành phân hóa học (môi trường xác định)

- Môi trường bán tổng hợp là môi trường tự nhiên như một số thành phần hóa học đã được xác định rõ (một số hợp chất hóa học đã biết rõ thành phân hóa học)

1.2.3.3 Phân loại mỗi trường theo trạng thái vật ly

Bảng 2 Ảnh hưởng của agar tới trạng thái vật lý của môi trường

Môi trường thạch (rắn) 0.15-0.2% Phân lập, nhân giống

Môi trường bán rắn 0.04-0.05% Kiểm tra khả năng đi động của vi sinh

1.2.4 Công thức môi trường

Môi trường P.D.A (Potato Dextrose Agar): dùng đề nuôi cấy men, mốc

Khoai tây: 200 ø H2O: LL

Dextrose: 40 g pH: 4.5-5

Agar: 20 g 121°C /15’/ 0.1 Mpa

Cac thông tin có trong công thức môi trường:

Môi trường KIA (Kligler Iron Agar):

1.2.5 Các bước để nấu môi trường (GV hướng dẫn cách làm, SV thực hiện theo tổ)

1 Cân đong hóa chất

2 Dun néu can

3 Kiém tra pH

4 Phân phối môi trường vào dụns cụ thủy tính

5, Khử trùng theo yêu cầu.

1.3 Phương pháp khử trùng

1.3.1 Khử trùng môi trường

Phương pháp khử trùng môi trường: nhiệt âm, lọc, dùng tia U.V

Bảng 3 Khử trùng môi trường bằng phương pháp nhiệt âm

Phương pháp Nhiệt độ/ thời gian Nguyên lý khả năng diệt

VSV

Nhiệt độ: 121”C Thời gian: tôi thiêu 15p

1.3.1 Khử trùng dụng cụ

Dụng cụ thủy tính: dụng cụ thủy tính được khử trùng bằng phương pháp nhiệt âm (Autoclave),

nhiệt khô (160°C/2 tiéng, 180°C/30p)

Dụng cụ nhựa: Dụng cụ nhựa có khả năng chịu nhiệt tốt có thế cho vào nồi hấp tiệt trùng hoặc

sử dụng cồn đề khử trùng

khử trùng PTN: Tia UV

BAI 2 PHUONG PHAP PHAN LAP VA CAY CHUYEN VSV

2.2.3 Phương pháp cây chuyền (GV hướng dẫn thao tác)

Bảng 2 Phương pháp cấy chuyền VSV

Ho lira que cay sau đó lây vi sinh vật bang que tròn Mở nắp môi trường hơ đầu ô ông nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn sau đó lấy que cây đưa vào môi trường theo đường IZiczac

đó lấy que cấy vào môi trường đâm sâu xuống sau đó kéo que lên đến

bẻ mặt thạch thì cay theo hinh IZiczac

Hơ lửa que thăng sau đó lấy vi sinh vật Mở nắp môi trường hơ dau 6 éng nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn sau

đó đâm que cây vào môi trường sao cho que cach 1/3 day ống

Thach nghiéng Móc Đánh dấu 3 điểm trên bề mặt thạch

IĐâm que cây vào 3 điểm đó

2.3 Kết quả thực hành (có hình ảnh minh chứng):

Hình L: Acid (màu vàng) phần gốc và acid (màu vàng)

phân nghiêng của môi trường, khi đó cho thay vi sinh vat

lên men cả duong glucose va duong lactose

Hinh 2: Acid (mau vàng) phân gốc và kiểm (màu đỏ) phân

nghiêng của môi trường, khi đó cho thây vị sinh vật lên

men đường ølucose nhưng không lên men đường lactose

Có hiện tượng sinh hơi, có hơi ở phân gốc của ông môi

trường, môi trường bị chia cắt hoặc đây môi trường lên

khỏi đáy ống (sinh hơi trong quá trình lên men

carbohydrat)

Thay màu đen ở phần gốc ông (vi sinh vật đã sinh ra

hydrogen sulfid gas tr thiosulfid)

Phản ứng được đọc sau khi nuôi cây từ 18 — 24 gid, néu

môi trường được đọc quá sớm, vi sinh vật chỉ có thê lên

men đường glucose Nếu đọc qua muộn, các chất gây men

lactose có thê dùng hết lactose và bắt đầu đị hoá pepton,

phần nghiêng của môi trường trở lai mau do

Hình I Hình 2

Mật độ vi khuẩn giam dan tir vung | đến vùng 4 Trường hợp bệnh phẩm nhiều vi khuân, đến vùng 4 sẽ phân lập được vi khuân riêng rẽ Mỗi vi khuân riêng rẽ sẽ mọc thành khuẩn lạc riêng rẽ

BAI 3 PHUONG PHAP LAM TIEU BAN VA QUAN SAT TE BAO VSV 3.1 Quan sat dai thé

Quan sat khuẩn lạc bằng mat dé thay được đặc điểm của khuẩn lạc như màu sắc, hình dạng, đường kính, độ vun, bóng, nhăn, có sợi

Việc quan sát đại thê các khuân lạc điển hình trên môi trường phân lập chọn lọc giúp dự đoán được đó là VSV nào (phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm người quan sát)

Sinh viên mô tả khuẩn lạc cuả VSV mình đã phân lập ở Bài 2:

Khuân lạc của nắm men trên môi trường SAB

Hình dạng: tròn Bờ, mép khuẩn lạc: tròn đều

Đường kính: Imm Màu sắc: trắng đục

3.2 Quan sát vi thể

Làm tiêu bản và quan sát tiêu bản đó dưới kính hiển ví (KHV) đề thấy được:

Hình dang, cach sap xêp kích thước của tê bào

3.2.1 Làm tiêu bản nắm mốc (phương pháp giọt ép)

3.2.2 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm

đơn Bước 1: Ghi tên VSV Làm vết bôi

Bước 2: Cố định vết bôi: hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi vết bôi khô

Bước 3: Nhuộm mau (su dung | trong các loại thuốc nhuộm sau: Gentiant violet, Fuschin, Xanh metylen, Xanh coton ) Nhỏ thuốc nhuộm vào vết bôi đã có định, dé

3.2.3 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm kép (GV hướng dẫn thao tác)

Bước 1: Ghi tên VSV Làm vết bôi

Bước 2: Cố định vết bôi: hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi vết bôi khô

Mục đích cố định vết bôi:

+ Giết chết VSV + Giúp VSV dễ bắt màu thuốc nhuộm + Gan chat VSV trén lame + Giúp VSV không bị trôi khi rửa nước Bước 3: Nhuộm màu

Nhỏ thuốc nhuộm Gentiant Violet (Crystal violet) Đề I phút Rửa nước

Nhỏ Lugol Đề I phút Rửa nước Tây cồn Rửa nước

Nhỏ thuốc nhuộm Fuschin (hoặc Safranin) Đề 30 giây Rửa nước

Bước 4: Quan sát KHV vật kính 100 (vật kính dầu) Vẽ hình quan sát được Miêu tả hinh dang | té bao, cach sap xếp tế bào, tế bào bắt màu thuôc nhuộm nảo

Lưu ý: mỗi tiêu bản quan sát được phải có đầy đủ các thông tin sau: Tên VSV, vật kính quan sát, hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, màu sắc tế bào (nếu là vi khuẩn phải ghi

rõ đó là vi khuân Gram + hay VK Gram -)

Có tế giả Màu hông Màu hông tím

Sap xép: tu cau

Bài tập ở nhà: (SV làm bài này sau khi học thực hành)

1 So sánh phương pháp nhuộm đơn và nhuộm kép SV trả lời theo gợi ý trong bang 1

Bang 1 So sánh pp nhuộm đơn, nhuộm kép

Giống Là phương pháp giúp nhận định sơ bộ hình thê, kích thước, tính

bắt màu, cách sắp xếp của vi khuẩn và các cầu trúc đặc biệt của

tế bào khi quan sát đưới kính hiển vi quang học

Đều phải cô định vết bôi rồi mới nhuộm dé quan sát tiêu bản dưới kính hiến vi

Khác | Quy trình L Làm vết bôi - Làm vết bôi

- Cho thuốc nhuộm lên vết bôi |- Nhuộm lầm lượt theo thứ tự

và giữ trong I phút, rửa nước, |Getiant, dung dịch Lugol từ 30s

có định vét bôi - lp, rửa nước, nhúng nhanh

vào côn, rửa nước Nhuộm tiếp bằng dung dịch Fuschin từ 30s _ Ip, rửa nước, đê khô

Mục đích Quan sát hình thê, kích thước |Giúp phân chia các tê bào vi

và cách sắp xếp của vi khuân |khuẩn thành 2 nhóm Gram(+)

va Gram (-) dya trén cau tric

và thành phần hóa học của thành tế bào ví khuẩn

2 Tại sao phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu bản khi quan sat KHV ở vật kính 100?

Một số tia sáng đi từ mẫu, qua lamen ra môi trường không khí bị khúc xạ sẽ ổi ra ngoài và không lọt vào vật kính Nhưng khi dùng dâu xem kính, các tia sang di qua mau vat, qua mdi trường đông nhật giữa lamen và dâu soi kính, do đó không bị khúc xạ ngay khi chúng rời khỏi tam lamen

3 Giai thích cơ chế bắt màu tím của VK Gram + và mắt màu hồng cua VK Gram

BAI 4 BEM TRUC TIEP NAM MEN BANG BUONG DEM HONG CAU

4.1 Giới thiệu buồng đếm hồng cầu (BĐHC)

BĐHC là phiến kính thuỷ tỉnh hình chữ nhật, trên đó có khắc lưới đếm

Lưới đếm là l hình vuông, có cạnh Imm gồm 25 ô vuông lớn, I ô vuông lớn có I6 ô vuông nhỏ; các ô vuông lớn chia cắt nhau bởi 3 đường kẻ song song, chiều cao đường khắc trên lưới đếm là 0, mm

S lưới đếm= Imm? S ô vuông nhỏ = 1/400mm?

Š ô vuông lớn = I/25mm V ô vuông nhỏ = 1/4000mm”

SV Quan sát lưới đếm đưới KHYV ở vật kính 10 để thấy được “middle square” như Hình 1

1mm

CORNER

MIDOLE SOUARE

Từ vật kính 10, SV chuyén qua vat kinh 40 đề thấy được hình ảnh I ô vuông lớn

SV quan sát va tim đúng 4 ô vuông lớn ngoài cùng ở 4 góc

ae aes

Bước 2 Đưa dịch mẫu vào lưới đếm

Bước 3 Đếm tế bảo nắm men

Quan sát lưới đếm ở vật kính 10, chuyên qua vật kính 40 đề đếm các tế bào trong 5 ô vuông lớn theo vị trí đường chéo góc Ghi lại kết quả

Cách đếm: Đếm tắt cả tế bảo trong ô vuông lớn và tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp (hình 5)

@ Include cells touching middle line

on top and left

% Exclude

cells touching middle line

on bottom and right

Hình 5 Cách đếm tế bảo trong ô vuông lớn 4.3 Tính kết quả

A: Tổng tế bào đếm được ở 5 ô vuông lớn V: thể tích ô vuông nhỏ

10": nồng độ pha loãng được đếm 1000: hệ số chuyền mm? thành mL

Kêt quả của nhóm

Số tế bảo trong 5 ô vuông lớn

4.4 Ưu điểm của pp đếm trực tiếp tế bào nắm men bằng BDHC Kêt quả nhanh, đơn giản, dê thực hiện

4.5, Nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp nam men bang BDHC Sai so cao hon 10%

Chỉ phù hợp với tế bảo có kích thước lớn

4.6 Ứng dụng của đếm trực tiếp nắm men trên BĐHC

Đêm được sô lượng men

Vẽ được đường cong sinh sản

BÀI 5 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HOA CUA VSV 5.1 Mục đích

Góp phân định danh VK ;

Góp phân định danh VK va khảo sát một sô đặc tính sinh hóa cua vi sinh vat

5.2 Yêu cầu khi thực hiện phản ứng sinh hoá

Yéu cau vé VSV:

Phải thuần không tạp nhiễm

Lay vi sinh vat ở giai đoạn sinh trưởng

Yêu cầu thời gian đọc kết quả: sau 24 - 48 giờ nuôi cây

5.3 Một số phản ứng cơ bản

S V đọc tài liệu và trả lời bảng 1

Bảng 1 Một số phản ứng sinh hoá cơ bản

Simmon Kiêm tra Môi trường: Simmon Cây vi Citrate — | Ông nghiệm có Citrate xem VK citrate khuan theo VK—>_ | màu xanh lá > VI

CÓ su Thành phần chính: đường Piruvate, | khuẩn Gram- dụng Nacl,Ammonitum ZIczac Co2 Ống nghiệm có citrate như Dihyrogen Phosphate, trong méi | NH¿—VK | màu xanh dương nguồn C Sodium citrate, Agar trường —>NH;' | >vi khuân duy nhất pH: 6.9+0.2 thạch Gram+

trong môi Chất chỉ thị màu: nghiêng

trường vô Bromthymol blue Cay vi

co hay Đặc điểm chỉ thị màu: khuân

không AxIt: màu vàng trong nhiệt

Trung tính: xanh lá độ 37° để Bazo: xanh dương ủ(24h)

KIA Kiém tra Môi trường: Klieler Iron | Đâm vào Gluco,lacto

xem vi Agar thach —vk—

khuẩn có Thành phân chính: Sắt, | nghiêng >Axit

sử dụng Lacto, Gluco sâu Sau đó | pH trung

sắt, lacto, PH:7.4+0.2(15-259) cấy Ziczac | tính->pH

gluco, va Chat chi thi mau: Phenol | trén bé mat | axit

có sinh ra red nghiêng Pepton—vk

khi H2S Đặc điểm chỉ thị màu: | cia thạch | —>NH;'