Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng

Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: PGS.TS TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH Hướng dẫn 2: TS BÙI XUÂN VỮNG

Đà Nẵng, 2022

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa được công bố trong bất kì công trình khoa học nào khác

Tác giả thực hiện Luận án

Trước tiên, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh – Đại học Bách khoa – Đại học Đà Nẵng, TS Bùi Xuân Vững – Đại học Sư phạm Đà Nẵng – Đại học Đà Nẵng đã nhận hướng dẫn,

định hướng nội dung khoa học và giúp đỡ tôi đầy trách nhiệm trong suốt quá trình hoàn thành luận án

Xin được bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Ban giám đốc Đại học Đà Nẵng, Ban giám hiệu các trường Đại học Bách khoa, Đại học Sư phạm, Đại học Sư phạm Kỹ thuật cùng các phòng Ban, Khoa và đồng nghiệp của các Trường đã tạo

mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành nội dung nghiên cứu

Xin được bày tỏ sự mến mộ và lòng tri ân đến: Bộ môn Công nghiệp Dược – Đại học Dược Hà Nội; Phòng thí nghiệm hoạt tính sinh học – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Trung tâm nghiên cứu và ứng dụng đậu nành Vinasoy (VSAC); Quỹ đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF) và GS.TS Pau Loke Show – Đại học Nottingham – Malaysia đã đồng

hành hỗ trợ phương pháp nghiên cứu chuyên sâu có liên quan đến nội dung trong luận án, cũng như tài trợ một phần kinh phí trong tiến trình thực nghiệm

Xin trân trọng cảm ơn các GS, PGS, TS là chủ tịch, phản biện và ủy viên hội

đồng đã dành nhiều thời gian quý báu để đọc, nhận xét và tham gia hội đồng chấm luận án này

Cuối cùng, xin được tri ân thân thiết đến gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, động viên, khích lệ và hỗ trợ đầy hiệu quả giúp tôi trong suốt tiến trình hoàn thành luận án

Nghiên cứu sinh

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Phương pháp nghiên cứu 3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5

6 Bố cục của luận án 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 7

1.1 Giới thiệu về isoflavone 7

1.1.1 Cấu trúc hóa học của isoflavone 7

1.1.2 Công dụng của isoflavone trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 8

1.2 Một số nguồn thực vật giàu isoflavone 12

1.2.1 Đậu nành (Glycine max (L) Merrill) 12

1.2.2 Sắn dây (Pueraria benth thomsonii Benth) 12

1.2.3 Đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek) 13

1.3.4 Tinh sạch 17

1.3.5 Hoàn thiện sản phẩm 18

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về công nghệ thu nhận và ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone 18

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 18

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 22

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 25

2.1.1 Nguyên liệu 25

2.1.2 Hóa chất, chế phẩm sinh học và nhựa macroporous 26

2.1.3 Thiết bị sử dụng chính 28

2.2 Nội dung nghiên cứu và bố trí thí nghiệm 28

2.2.1 Đánh giá hàm lượng isoflavone và và một số thành phần hóa học của một số nguồn thực vật 30

2.2.2 Khảo sát các phương pháp trích ly isoflavone từ hạt và bã đậu nành 30

2.2.3 Khảo sát một số phương pháp tinh chế và nâng cao hoạt tính cao isoflavone tinh chế 31

2.2.4 Kiểm tra hoạt tính sinh học và tính an toàn thực phẩm của cao isoflavone (TN7) 32

2.2.5 Đề xuất quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ hạt và bã đậu nành 32

2.2.6 Ứng dụng cao isoflavone để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 32

2.2.7 Đề xuất giải pháp tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau trích ly isoflavone 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34

2.3.1 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu 34

2.3.2 Phương pháp toán học 37

2.3.3 Phương pháp đánh giá cảm quan 41

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 41

3.1 Đánh giá hàm lượng isoflavone và thành phần hóa học từ một số nguyên liệu

thực vật 42

3.1.1 Hàm lượng isoflavone 42

3.1.2 Thành phần hóa học của nguyên liệu 45

3.2 Ảnh hưởng của một số phương pháp trích ly đến hiệu quả thu nhận isoflavone từ hạt đậu nành 47

3.2.1 Phương pháp chiết khuấy 47

3.2.2 Phương pháp dùng sóng siêu âm 52

3.2.3 So sánh hiệu quả thu nhận isoflavone từ 2 phương pháp trích ly 55

3.3 Tối ưu hóa điều kiện trích ly isoflavone từ hạt và bã đậu nành bằng phương pháp chiết khuấy 57

3.5 Kiểm tra hoạt tính sinh học và tính an toàn thực phẩm của cao isoflavone 85

3.5.1 Kiểm tra hoạt tính sinh học của cao isoflavone 86

3.6 Đề xuất quy trình thu nhận isoflavone từ hạt và bã đậu nành 97

3.7 Ứng dụng cao isoflavone trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 99

3.7.1 Thử nghiệm sản xuất sữa chua đậu nành nước cốt dừa bổ sung isoflavone thu nhận từ đậu nành 99

3.7.2 Thử nghiệm sản xuất nectar chanh dây bổ sung cao isoflavone tinh chế từ bã đậu nành 115

3.8 Đề xuất giải pháp tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau trích ly isoflavone 130

3.8.1 Chỉ tiêu chất lượng phụ phẩm của phụ phẩm bột đậu nành 130

3.8.2 Đề xuất quy trình công nghệ chế biến các sản phẩm thực phẩm từ phụ phẩm bột đậu nành sau trích ly 131

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 134

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 138

TÀI LIỆU THAM KHẢO 140

Số hiệu

2.1 Đặc tính vật lý của các loại nhựa macroporous 27

3.1 Thành phần và hàm lượng nhóm isoflavone đậu nành hạt 42 3.2 Thành phần và hàm lượng nhóm isoflavone củ sắn dây 44 3.3 Thành phần và hàm lượng nhóm isoflavone bã đậu nành 45 3.4 Thành phần hóa học của các loại nguyên liệu trong nghiên cứu 45 3.5 Hàm lượng của 6 hợp chất isoflavone ở các mẫu phân tích 47 3.6 Hiệu quả quét gốc tự do DPPH• của các dịch trích ly ứng với

3.7 Kết quả thực nghiệm hàm lượng thu nhận isoflavone từ hạt đậu

3.8 Kết quả phân tích phương sai hàm lượng isoflavone tổng trích

3.9 Bảng quy hoạch theo hướng gradient từ hạt đậu nành 60 3.10 Kết quả thực nghiệm theo mô hình thí nghiệm TYT23 củahàm

3.11 Kết quả phân tích phương sai hàm lượng isoflavone trích ly ở

3.12 Bảng quy hoạch theo hướng gradient từ bã đậu nành 63 3.13 Các thông số đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir và Freundlich của

3.14 Các đại lượng hấp phụ trên cột mở D101 isoflavone hạt đậu

3.23 Khối lượng tử cung chuột ở các lô thí nghiệm 88 3.24 Hiệu quả bảo vệ tế bào HepG2 của các mẫu nghiên cứu 91 3.25 Khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid của các mẫu

3.27 So sánh các chỉ tiêu hóa học của cao isoflavone thô và tinh từ

3.28 Đặc tính cảm quan của các loại mẫu cao isoflavone 95 3.29 Chỉ tiêu vi sinh vật của các mẫu bột cao isoflavone 95 3.30 Khối lượng của chuột ở các lô thử nghiệm độc tính cấp 96 3.31 Ảnh hưởng của liều lượng nước cốt dừa bổ sung lên các chỉ

3.32 Phân tích cảm quan các mẫu sữa chua đậu nành-nước cốt dừa 103

3.36 Chất lượng cảm quan sữa chua đậu nành-dừa bổ sung

3.37 Các chỉ tiêu hóa lý chất lượng sữa chua đậu nành nước cốt dừa

3.38 Chỉ tiêu vi sinh vật của sản phẩm sữa chua đậu nành-nước cốt

3.40 So sánh các chỉ tiêu giữa các mẫu nectar chanh dây 122 3.41 Thành phần các isoflavone trong nectar chanh dây bổ sung

3.42 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến các chỉ tiêu hóa lý của

3.43 Ảnh hưởng thời gian bảo quản đến các đặc tính cảm quan

3.44 Các chỉ tiêu hóa lý chất lượng nectar chanh dây giàu

2.1 Nguyên liệu giàu isoflavone dùng trong nghiên cứu 25

2.3 Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu và bố trí thí nghiệm 29

hình Tên hình Trang

3.9 Ảnh hưởng của điều kiện siêu âm đến hàm lượng glycoside

3.10 Ảnh hưởng của mức NLSA và thời gian siêu âm đến hàm

3.11 Ảnh hưởng của mức NLSA và thời gian siêu âm đến hàm

lượng isoflavone tổng của các mẫu phân tích 54 3.12 So sánh hiệu quả giữa các phương pháp trích ly đến hàm

3.13 Phương trình hồi quy của isoflavone từ hạt đậu nành trên

3.14 Phương trình hồi quy của isoflavone từ bã đậu nành trên mặt

3.15 Hàm lượng isoflavone trong các mẫu cao phân đoạn 64 3.16 Hiệu suất thu hồi isoflavone trong cao trích ly phân đoạn 65 3.17 Sắc kí đồ HPLC của các dịch cân bằng và rửa giải D101 66 3.19 Đồ thị biểu diễn đại lượng giải hấp của các loại nhựa đối với

3.20 Đường đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir và Freundlich của

3.21 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng giải hấp

3.22 Đường cong hấp phụ trên sắc kí cột D101 của isoflavone từ

3.31 Đường cong hấp phụ trên sắc kí cột D101 của isoflavone từ

3.36 Tác động của các mẫu nghiên cứu đến sự sản sinh estradiol

3.37 Khả năng bao vây gốc tự do DPPH• của các mẫu cao isoflavone

93 3.38 Các mẫu cao isoflavone sấy thăng hoa từ hạt và bã đậu nành 95 3.39 Quy trình thu nhận isoflavone từ hạt và bã đậu nành 97 3.40 Hình ảnh các mẫu sữa chua đậu nành nước cốt dừa 103 3.41 Sắc ký đồ HPLC isoflavone của sữa chua SoCY và mẫu đối

hình Tên hình Trang

3.42 Số lượng vi khuẩn lactic trong mẫu sữa chua theo thời gian

3.43 Điểm thị hiếu các chỉ tiêu cảm quan sữa chua nước cốt dừa

3.44 Quy trình công nghệ chế biến sữa chua đậu nành nước cốt

3.46 Các mẫu nectar chanh dây bổ sung gellan gum 117

3.48 Ảnh hưởng của liều lượng GG-NaC đến chỉ số độ lắng các

mẫu nectar chanh dây theo thời gian bảo quản 120

3.50 Ảnh hưởng của liều lượng GG-NaC đến độ nhớt biểu kiến

của các mẫu nectar chanh dây theo thời gian bảo quản 121 3.51 Điểm thị hiếu các chỉ tiêu cảm quan của nectar chanh dây bổ

3.52 Quy trình công nghệ chế biến nectar chanh dây bổ sung

3.53 Quy trình công nghệ chế biến sản phẩm thực phẩm từ phụ

3.54 Phụ phẩm bột đậu nành trước và sau khi trích ly chất béo và

sản phẩm dầu đậu nành so với bột đậu nành nguyên liệu 132

Chữ viết tắt bằng tiếng Việt

AOAC : Association of Official Analytical Chemists

ATPS : Aqueous Two-Phase Extraction

BALB/c : Bagg Albino/c mice

DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

DMSO : Dimethyl sulfoxide (CH3)2SO

FRAP : Ferric Reducing Antioxidant Power

HPLC : High-Performance Liquid Chromatography

HRT : Hormone Replacement Therapy

LDL : Low density lipoprotein cholesterol

LOD : Limit of Detector

LOQ : Limit of Quantitation

MBMA : Model Based Meta-Analysis

MCF-7 : Michigan Cancer Foundation-7

MDA : Malondialdehyde

MeOH : Methanol

NaC : Natri Citrate (Na3C6H5O7)

PTFE : Polytetrafluoroethylene

R2 : Regression Sum of Squares

RNI : Recommended Nutrition Intakes

RSD : Relative Standard Deviation

SD : Standard Deviation

TLC : Thin Layer Chromatography

MỞ ĐẦU 1 Lý do chọn đề tài

Nhiều quốc gia châu Á có tín ngưỡng đạo Phật như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc từ bao đời nay sử dụng phổ biến dòng thực phẩm có nguồn gốc từ các loại hạt họ đậu, đặc biệt là từ đậu nành [1][2] Do đó, thực phẩm có xuất xứ thuần thực vật này đã và sẽ là tâm điểm cho nhiều đề tài nghiên cứu chuyên sâu nhằm khai thác những lợi ích còn ẩn chứa nhiều tiềm năng chưa được biết đến Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học công nghệ, giá trị cốt lõi của các sản phẩm được sản xuất từ đậu nành đã được khẳng định Đây không chỉ là nguồn cung cấp hàm lượng protein thực vật cùng với các khoáng chất cần thiết, mà nó còn bổ sung nhiều kiến thức mới cho nhân loại trong việc tìm nguồn và phương thức bổ sung các hoạt chất mang hoạt tính sinh học mà đậu nành là đại diện tiêu biểu Phát hiện này đã khơi mào cho việc tìm kiếm nguồn isoflavone thực vật và sự ra đời dòng sản phẩm bảo vệ sức khỏe có bổ sung hoạt chất này

Isoflavone là các hợp chất chuyển hóa thứ cấp, được phân bố nhiều trong các

cây họ đậu Leguminosae như đậu nành, đậu trắng, củ sắn dây, cỏ linh lăng, cỏ ba lá

đỏ, đậu xanh và một lượng nhỏ isoflavone cũng được chứa trong các sản phẩm thực vật khác như ở quả hạch [3][4] Với cấu trúc hóa học gần với estrogen-nội tiết tố nữ có vai trò quan trọng đối với phụ nữ tiền mãn kinh, isoflavone giúp chống lại các triệu chứng như loãng xương, trầm cảm, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, ung thư vú, v.v…mà không gây tác dụng phụ như các loại hormone tổng hợp Vì vậy isoflavone được sử dụng phổ biến trên thế giới và trong nước dưới dạng các sản phẩm thực phẩm chức năng, dược phẩm, mỹ phẩm, nước giải khát và đồ uống [3][5] Ngành công nghiệp thu nhận isoflavone hiện nay đã và đang ứng dụng nhiều phương pháp trích ly, tinh chế nhằm đạt được hiệu quả thu nhận isoflavone cao nhất đồng thời đảm bảo sự phát triển bền vững [6] Isoflavone được chia thành 4 nhóm chính, trong đó nhóm aglycone không chứa gốc đường, có hoạt tính sinh học cao nên cũng là một phần cần quan tâm trong nghiên cứu tinh chế [7]

Tại Việt Nam, nguồn đậu nành hạt nói riêng và phong phú các loại thực vật

họ đậu và có sản lượng lớn Theo báo cáo của Tổng cục Thống kê (GSO), sản lượng đậu nành trung bình đạt 150 ngàn tấn/năm [8] Do đó, những nghiên cứu theo định hướng nêu trên có cơ sở để phát triển thành công và bền vững

Mặc dù các nguồn nguyên liệu giàu isoflavone như đậu nành, củ sắn dây là loại thực vật sẵn có ở nước ta, nhưng các nghiên cứu trong nước về thu nhận và sản xuất thực phẩm chức năng giàu isoflavone còn khá mới mẻ Các công trình công bố trong nước về isoflavone còn ít, chủ yếu nghiên cứu về thành phần các hợp chất isoflavone và trích ly isoflavone từ hạt đậu nành nảy mầm, củ sắn dây và các phương pháp trích ly, tinh chế [9][10] Bên cạnh đó, một lượng lớn các phế liệu trong ngành chế biến các sản phẩm từ đậu nành hiện nay, cụ thể là bã đậu nành chỉ dùng trong chăn nuôi gia súc hay làm phân bón, trong khi chúng vẫn còn chứa một lượng các chất dinh dưỡng đáng kể như protein, hàm lượng xơ, glucid v.v…và đặc biệt là chứa isoflavone [11] Ngoài ra, những nghiên cứu về thực phẩm bảo vệ sức khỏe có bổ sung isoflavone ở Việt Nam chỉ mới dừng ở mức nghiên cứu cơ bản Do đó, các sản phẩm thực phẩm chức năng bổ sung isoflavone hiện nay trên thị trường Việt Nam hầu hết đều là nhập ngoại giá thành cao, chưa có nhiều dòng sản phẩm thực phẩm chức năng

Do đó “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng” nhằm mục đích góp phần làm phong phú thêm định hướng nghiên cứu ứng dụng, tạo ra những sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe trên nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước Các sản phẩm này với chất lượng đảm bảo sẽ tạo được sự cạnh tranh bền vững, đồng thời giúp cho phụ nữ - chiếm tỉ lệ gần 50% của nhân loại sẽ trẻ hơn, đẹp hơn và khỏe mạnh hơn

2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của luận án là xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone và quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone, góp phần tạo ra các sản phẩm bảo vệ sức khỏe từ nguồn nguyên liệu dồi dào trong nước

Từ đó, luận án đặt ra các mục tiêu cụ thể như sau:

1) Xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ nguồn nguyên liệu thực vật giàu isoflavone sẵn có tại khu vực miền Trung − Tây Nguyên, gồm có các

quá trình: trích ly, tinh chế và nâng cao hàm lượng hoạt tính sinh học cao isoflavone 2) Kiểm tra hoạt tính sinh học và an toàn thực phẩm của cao isoflavone 3) Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone 3 Nội dung nghiên cứu

Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài nhằm giải quyết các nội dung sau đây:

- Đánh giá thành phần và hàm lượng isoflavone trong một số nguyên liệu thực

vật sẵn có tại khu vực miền Trung − Tây Nguyên

- Khảo sát một số phương pháp trích ly isoflavone từ hạt và bã đậu nành - Khảo sát một số phương pháp tinh chế và nâng cao hoạt tính cao isoflavone

- Kiểm tra hoạt tính sinh học và an toàn thực phẩm của cao isoflavone

- Đề xuất quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ hạt và bã đậu nành - Ứng dụng cao isoflavone trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

- Đề xuất giải pháp tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau khi trích ly isoflavone

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

Thu thập, tổng hợp các tài liệu, sách báo, các công trình nghiên cứu khoa học trong nước và ngoài nước về các vấn đề liên quan đến đặc tính và các phương pháp xác định hoạt tính sinh học của isoflavone, phương pháp trích ly, tinh chế

isoflavone từ thực vật và các quy định đánh giá thực phẩm chức năng

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Các phương pháp trích ly isoflavone từ thực vật: với dung môi sử dụng là

ethanol, sử dụng 2 phương pháp trích ly bằng chiết khuấy, sóng siêu âm Hiệu quả trích ly được đánh giá qua hàm lượng isoflavone trên hàm lượng chất khô của mẫu ban đầu

- Các phương pháp tinh chế isoflavone từ cao trích ly isoflavone thô: phương

pháp trích ly lỏng-rắn, phương pháp sắc kí cột nhồi với nhựa hấp phụ macroporous Hiệu quả tinh chế được đánh giá qua hàm lượng isoflavone trong cao tinh chế và hiệu suất thu hồi

- Phương pháp khảo sát nâng cao hàm lượng aglycone: khảo sát điều kiện

thủy phân glycoside dựa vào nồng độ enzyme, hàm lượng isoflavone ban đầu, thời gian thủy phân Hiệu quả thủy phân được đánh giá qua hiệu suất thủy phân isoflavone và hiệu suất gia tăng aglycone

- Các phương pháp khảo sát tính an toàn thực phẩm và hoạt tính sinh học của isoflavone tinh chế: khảo sát tính an toàn thực phẩm của isoflavone tinh chế

(hàm lượng kim loại nặng, độc tính cấp), các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học của isoflavone tinh chế (hoạt tính estrogen, khả năng kháng oxi hóa thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH, v.v…)

- Các phương pháp sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Nghị

định chính phủ số 15/2018/NĐ-CP ngày 02/02/2018 của Chính phủ Quy định chi tiết thi hành một số điều của Luật an toàn thực phẩm, Thông tư số 43/2014/TT-BYT ngày 24/11/2014 của Bộ Y tế Quy định về quản lý thực phẩm chức năng đã lựa chọn ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe thuộc nhóm thực phẩm chức năng Khảo sát tỉ lệ bổ sung theo giới hạn cho phép, đề xuất quy trình công nghệ sản xuất từ 1 đến 2 sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone

- Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của nguyên liệu: Xác định

độ ẩm, hàm lượng tinh bột, hàm lượng protein, hàm lượng tro tổng, hàm lượng chất béo thô, hàm lượng xơ thô, hàm lượng đường tổng, hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng polyphenol tổng

- Các phương pháp phân tích các đặc tính hóa lý của sản phẩm thực phẩm - Phương pháp phân tích hàm lượng isoflavone bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ở các mẫu thí nghiệm

- Các phương pháp xử lý số liệu: sử dụng các thuật toán quy hoạch thực

nghiệm trực giao cấp 1 và tối ưu hóa bằng phương pháp leo dốc Box-Wilson Các

thí nghiệm đều được thực hiện ít nhất 3 lần, các số liệu đều được xử lý bằng phương pháp phân tích phương sai ANOVA, so sánh sự khác nhau có nghĩa với trị số P ở mức P  0,05 Phần xử lý số liệu được thực hiện trên phần mềm Minitab 18

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Luận án đã sử dụng quy hoạch thực nghiệm toàn phần 23 và mô hình thực nghiệm leo dốc Box-Wilson để tìm điều kiện trích ly isoflavone tối ưu từ hạt và bã đậu nành

Luận án đã nghiên cứu cụ thể sự hấp phụ và giải hấp phụ các hợp chất isoflavone từ cao trích ly hạt và bã đậu nành theo mô hình hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir và Freundlich và trên mô hình sắc kí cột đối với nhựa hấp phụ D101, là cơ sở để xây dựng quy trình tinh chế quy mô lớn

Cao isoflavon thô và tinh chế thu nhận từ hạt và bã đậu nành đã được thử

nghiệm hoạt tính nội tiết tố và hoạt tính chống oxi hóa bằng các mô hình in vitro,

in vivo khẳng định được các hoạt tính sinh học của isoflavone

5.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Luận án tập trung nghiên cứu nguồn nguyên liệu địa phương sẵn có, giá thành thấp và tận dụng được nguồn phế liệu trong sản xuất sữa đậu nành, đậu phụ để trích ly isoflavone-hoạt chất có giá trị sinh học cao

Luận án xây dựng được quy trình thu nhận isoflavone từ hạt và bã đậu nành với một số công đoạn được cải tiến: trích ly bằng chiết khuấy, tinh chế bằng nhựa macroporous D101 và nâng cao hàm lượng aglycone bằng chế phẩm enzyme Celluclast1.5L Quy trình thu nhận isoflavone dễ vận hành, chi phí thấp, an toàn và giảm thiểu ô nhiễm môi trường thông qua việc sử dụng dung môi ethanol và nước

Hai sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung giàu isoflavone từ cao isoflavone là sữa chua đậu nành nước cốt dừa và nectar chanh dây đã được đánh giá đảm bảo các tiêu chuẩn trong nước

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về isoflavone

1.1.1 Cấu trúc hóa học của isoflavone

Isoflavone có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng benzene (A và B) nối với nhau bởi một cầu ba carbon tạo thành dị vòng pyran (C) Trong cấu trúc của isoflavone, vòng benzene B được nối ở vị trí thứ 3 thay vì vị trí số 2 của dị vòng C như các flavonoid

khác [3][12][7]

Nguồn: Rostagno M.A và cộng sự [7]

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của các hợp chất isoflavone trong đậu nành

Các công thức cấu tạo phổ biến của isoflavone ở một số nguồn thực vật được trình bày ở hình 1.1 Các gốc R1, R2, R3 như [-H], [-OCH3], [-C6O5H11] tạo nên các hợp chất khác nhau của isoflavone Trong đó, aglycone là dạng đơn giản, không liên kết với phân tử đường, chiếm hàm lượng thấp Trái lại dạng glycoside (dạng aglycone liên kết với glucose bằng các liên kết -1,4-glycoside) hoặc dạng C-glycoside (puerarin) cùng các dạng este của glycoside là malonyl và acetyl glycoside chiếm lượng lớn trong thực vật

Các hợp chất isoflavone có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng max từ 250-270nm do có vòng phenol Đặc điểm này được ứng dụng để phân tích định tính, định lượng bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) vì các hợp chất isoflavone không màu rất khó phát hiện [13]

Về độ ổn định, isoflavone dễ bị thoái hóa bởi nhiệt độ và tia UV nên cần được bảo quản trong bóng tối, nhiệt độ thấp [13][14] Khi thực hiện quá trình trích

ly có gia nhiệt trong môi trường kiềm hoặc acid, các nhóm glycoside và đặc biệt nhóm malonyl, acetyl sẽ chuyển hóa dần sang các dạng đơn giản và cuối cùng thành dạng aglycone tương ứng, đặc biệt trong các điều kiện nhiệt độ cao, pH cao hơn 10 [15][16] Hình 1.2 minh họa quá trình chuyển hóa malonyldaidzin đến daidzein

Nguồn: Preedy (2013)[15]

Hình 1.2: Sơ đồ chuyển hóa giữa các hợp chất isoflavone

Trong sự chuyển hóa giữa các hợp chất isoflavone, nhờ sự thuỷ phân các hợp chất -glycoside isoflavone sang dạng aglycone tương ứng bằng các xúc tác thủy phân hóa học (acid HCl) hoặc sinh hóa (enzyme, vi sinh vật có hoạt tính -glycoside) nên đã nâng cao được hàm lượng aglycone, tăng giá trị sinh học cho các sản phẩm isoflavone

1.1.2 Công dụng của isoflavone trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

1.1.2.1 Vai trò của isoflavone đối với sức khỏe con người

Nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra có một mối tương quan giữa việc tiêu thụ nhiều các sản phẩm từ đậu nành với tỉ lệ mắc các bệnh ung thư (ung thư vú, tuyến tiền liệt và ung thư ruột kết) thấp của người dân ở các quốc gia như châu Á như Trung Quốc và Nhật Bản so với ở các nước châu Âu và Bắc Mỹ Từ phát hiện công dụng ban đầu này, isoflavone liên tục được nghiên cứu công thức cấu tạo và các khảo sát hoạt tính nội tiết tố để đánh giá lợi ích tiềm năng của chúng [1][2][3][17] Bên cạnh đó isoflavone còn được các nhà khoa học và người tiêu dùng quan tâm bởi khả năng kháng oxi hóa [18][19]

a Hoạt tính nội tiết tố nữ

Liệu pháp thay thế hormone (HRT) có hiệu quả trong hầu hết các trường hợp làm giảm bớt các triệu chứng tiền mãn kinh và mãn kinh Tuy nhiên lựa chọn này hiện không còn được ưa chuộng vì có liên quan đến khả năng tăng nguy cơ phát

triển ung thư vú [20].Vì vậy để trì hoãn thời kỳ mãn kinh, các phytoestrogen như isoflavone đậu nành đã được đề xuất như một giải pháp thay thế HRT và cũng có thể cải thiện chất lượng cuộc sống của phụ nữ sau mãn kinh[3][20][21]

Nguồn: C Bennetau & Pelissero (2013) [3]

Hình 1.3: Công thức cấu tạo và cấu hình không gian của 17-estradiol và S-equol

Công thức cấu tạo (a,b) và cấu hình không gian lần lượt của 17-estradiol và S-equol

Hình 1.3 đã chứng minh được isoflavone có cấu trúc gần giống với 17-β-estradiol-một loại nội tiết tố nữ [3], do đó isoflavone có hoạt tính estrogen yếu, cải thiện được sức khỏe cho phụ nữ thiếu hụt hormone này

Với vai trò là một nội tiết tố, isoflavone đã có vai trò tích cực làm giảm các triệu chứng tiền mãn kinh:

- Isoflavone làm giảm tần suất các cơn bốc hỏa Các cơn bốc hỏa là triệu

chứng phổ biến nhất của phụ nữ tiền mãn kinh và mãn kinh, cần được điều trị Adlercreutz và cộng sự (1992) đã quan sát thấy các cơn bốc hỏa ở phụ nữ Nhật có tỷ lệ thấp hơn các phụ nữ Mỹ gốc Phi, châu Âu [22] Li và cộng sự (2015) qua phân tích tổng hợp bằng mô hình MBMA từ 16 báo cáo đã chứng minh được hiệu quả của isoflavone về việc làm giảm cơn bốc hỏa và béo phì, kéo dài độ tuổi tiền mãn kinh [23]

- Tác dụng lên sự chuyển hóa của xương: Castelo-Branco và Cancelo

Hidalgo (2015) đã tổng hợp các thử nghiệm in-vitro, in vivo và trên con người đã chứng minh được công dụng tăng chuyển hóa xương, giảm nguy cơ loãng xương của isoflavone [24]

- Tác dụng lên các khối u phụ thuộc hormone: Các nghiên cứu về thực

nghiệm và lâm sàng đã chứng minh hiệu lực của phytoestrogen làm giảm nguy cơ ung thư ở màng trong tử cung, ở vú và buồng trứng Tuy vậy, kết quả nghiên cứu chưa chắc chắn hoàn toàn để kết luận rằng isoflavone từ đậu nành có thể ngăn ngừa hữu hiệu các loại u nêu trên mà cần nghiên cứu thêm [25]

- Tác dụng bảo vệ làn da: Theo y học cổ truyền Trung Quốc, lao động nữ

trong ngành đậu hũ có làn da đẹp nhất Netmiz và cộng sự phân tích các tác động tích cực và đề xuất các phương pháp nâng cao công dụng của isoflavone lên da [6]

b Hoạt tính chống oxi hóa

Hoạt động chống oxi hóa như chống peroxy hóa lipid màng tế bào để giảm các lipoprotein cholesterol tỉ trọng thấp (low denstity lipoprotein cholesterol - LDL cholesterol) chống xơ vữa động mạch hoặc khả năng quét gốc tự do DPPH •, FRAP, là cơ sở của việc chống lão hóa, bảo vệ các tế bào như tế bào gan, tế bào não của isoflavone[18][26]

1.1.2.2 Giới thiệu thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone

Theo Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA), thực phẩm bổ sung được định nghĩa là nguồn tập trung các chất dinh dưỡng hoặc các chất khác có tác dụng dinh dưỡng hoặc sinh lý, với mục đích bổ sung cho chế độ ăn uống bình thường [5][27] Theo Nghị định chính phủ số 15/2018/NĐ-CP ngày 02/02/2018 của Chính phủ Quy định chi tiết thi hành một số điều của Luật an toàn thực phẩm, “Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (health supplement, dieatary supplement) là những sản phẩm được dùng để bổ sung thêm vào chế độ ăn uống hàng ngày nhằm duy trì, tăng cường, cải thiện các chức năng của cơ thể con người, giảm nguy cơ mắc bệnh” [28]

Vì công dụng tuyệt vời là nguồn bổ sung nội tiết tố estrogen cho các chị em phụ nữ, nên lượng tiêu thụ isoflavone ngày càng gia tăng [3][5] Theo báo cáo của trang mạng Markets and Markets điều tra về thị trường trên thế giới, doanh thu isoflavone toàn cầu đạt 1,2 tỷ USD vào năm 2019, dự đoán tăng 4,7% vào năm 2025 [29] Các sản phẩm isoflavone bao gồm:

- Các sản phẩm dược phẩm (pharmaceutical) đạt doanh thu cao nhất

- Các sản phẩm thực phẩm dinh dưỡng có công dụng dược lý (nutraceutical)

bao gồm các sản phẩm bổ sung dinh dưỡng, sản phẩm tăng cường, sản phẩm mục đích y học

- Isoflavone cũng được bổ sung vào mỹ phẩm làm đẹp da - Nhóm thực phẩm và đồ uống

Theo thống kê, thị trường Bắc Mỹ dẫn đầu về tiêu thụ isoflavone và cung cấp nguyên liệu đậu nành lớn nhất cho ngành công nghiệp này, kế đến là thị trường các nước châu Âu như Đức, Anh và Pháp và khu vực châu Á Thái Bình Dương Thị trường tiêu thụ isoflavone ở Ấn Độ, Nhật Bản và Trung Quốc có thể vượt 8,5 tỷ USD vào cuối năm 2025 [29]

Với lợi thế về quy định trong sản xuất dòng thực phẩm bảo vệ sức khỏe cũng như nhu cầu tiêu thụ isoflavone trong nước ngày càng tăng, cho nên hiện nay dòng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone trên thế giới tăng nhanh

Trong báo cáo của Andres và cộng sự (2015) đã khảo sát trên 6 loại thực phẩm bảo vệ sức khỏe tại Đức có nguồn gốc từ đậu nành với hàm lượng isoflavone tổng số nằm trong khoảng 31,9-53,6 mg/viên, và 5 loại có nguồn gốc từ cỏ ba lá

(Trifolium pratense L.) có hàm lượng 34,9-79,3 mg isoflavone/viên từ thông tin nhà

sản xuất Các hợp chất isoflavone thường không đồng đều tùy theo phương pháp chế biến và nguyên liệu chiết xuất [17]

Uifălean và cộng sự (2015) đã có báo cáo về 7 sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone tại Rumania Dựa vào thông tin trên nhãn, các sản phẩm này gồm hợp chất isoflavone từ đậu nành (4 sản phẩm), cỏ ba lá (2 sản phẩm) và củ sắn dây (1 sản phẩm) và các thành phần dinh dưỡng khác (vitamin, khoáng, các chiết xuất thực vật khác) [30]

Tương tự, Almeida và cộng sự (2015) đã có báo cáo điều tra về 15 mẫu sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone theo tiêu chuẩn châu Âu hoặc có xuất xứ từ các nước Mỹ và châu Âu Theo thông tin nhà sản xuất, các sản phẩm này là hỗn hợp các hợp chất isoflavone từ đậu nành, cỏ ba lá, củ sắn dây và các vi chất khác cùng tá dược ở dạng viên uống [5]

Việc kết hợp giữa các hợp chất isoflavone và các vi chất khác, cùng lúc bổ

sung sự thiếu hụt các dưỡng chất cho phụ nữ ở độ tuổi tiền mãn kinh

Thị trường thực phẩm như đồ uống, bánh kẹo hiện nay cũng chú trọng vào các sản phẩm có bổ sung isoflavone dành cho người tiêu dùng không muốn sử dụng các sản phẩm từ đậu nành Các sản phẩm bổ sung isoflavone không làm thay đổi các đặc tính cảm quan của sản phẩm nên không ảnh hưởng đến công nghệ chế biến nhưng hiện nay chưa có các dạng sản phẩm này ở thị trường trong nước

1.2 Một số nguồn thực vật giàu isoflavone

Isoflavone được phân bố nhiều trong các cây họ đậu Leguminosae như đậu

nành, đậu trắng, củ sắn dây, cỏ linh lăng, cỏ ba lá đỏ, đậu xanh và một lượng nhỏ isoflavone cũng được chứa trong các sản phẩm thực vật khác như ở quả hạch, ngũ cốc Thành phần isoflavone trong nguyên liệu phụ thuộc vào các điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng, giống cây trồng, tạo nên sự đa dạng về thành phần và hàm lượng

isoflavone [3][7]

1.2.1 Đậu nành (Glycine max (L) Merrill)

Đậu nành (Glycine max (L) Merrill) còn gọi là đậu tương thuộc chi Glycine,

có nguồn gốc đông bắc Trung Quốc, cách đây 4000-5000 năm [31] Đậu nành là nguồn lương thực cung cấp cho thế giới, chỉ đứng sau lúa mì, lúa và bắp Đậu nành giàu cả 2 thành phần protein và lipid, không có cholesterone, cung cấp các acid amin thiết yếu, các nguyên tố vi lượng và đặc biệt là hàm lượng isoflavone [32] Isoflavone đậu nành được dùng phổ biến nhất do có hàm lượng dồi dào (chiếm từ 0,1-0,4% trong hạt đậu nành) với 12 hợp chất là aglycone (daidzein, genistein và glycitein) chiếm hàm lượng 10-20% isoflavone tổng số Glycoside trong đậu nành bao gồm daidzin, genistin và glycitin cùng 2 dạng malonyl và acetyl tương ứng [33][34] Phần lá mầm chiếm hơn 90% trọng lượng hạt đậu nành và chiếm 88% tổng số isoflavone, lại giàu hàm lượng glucoside trong khi phần phôi hạt chỉ chiếm 2% trọng lượng đậu nành, nhưng chúng lại có nồng độ isoflavone cao gấp 5 đến 6 lần so với phần lá mầm và giàu aglycone [33]

1.2.2 Sắn dây (Pueraria benth thomsonii Benth)

Sắn dây (Pueraria benth thomsonii Benth) thuộc họ đậu Leguminosae, là

dược liệu truyền thống được trồng phổ biến ở các nước Đông Nam Á và Trung Quốc Trong y học cổ truyền, sắn dây được dùng chữa các bệnh sốt phong nhiệt, sởi mọc, viêm ruột Tinh bột sắn dây có tính mát, giải nhiệt mùa hè Ở nước ta, một mùa vụ sắn dây mất khoảng 8-9 tháng Hàm lượng isoflavone tổng số trong củ sắn dây chiếm khoảng 2%, chủ yếu là hợp chất puerarin (chiếm đến 88%) và các hợp chất daidzin, daidzein, genistin, genistein [31][35][36]

1.2.3 Đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek)

Đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek) thuộc họ đậu Leguminosae, được trồng

ở khắp châu Á Hạt đậu xanh giàu protein và là nguồn cung cấp tốt các axit béo cần thiết, tocopherol, sterol, đường, axit hữu cơ, axit amin Ngoài ra, đậu xanh cũng được đánh giá là nguyên liệu tiềm năng cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là ở giá đậu xanh [31][37] Silva và cộng sự (2013) đã báo cáo hàm lượng isoflavone tổng của 4 hợp chất genistein, daidzein, genistin, daidzin trong giá đậu xanh là 287 mg/kg nguyên liệu, thấp hơn 2,24 lần so với đậu nành [37] Trái lại, báo cáo của Prokudina (2012) đã cho thấy rằng trong giá đậu xanh có hàm lượng genistin đạt 10 g/gchất khô và các thành phần daidzin, genistein chiếm lượng rất thấp (2-3 g/g chất khô) [38] Landete và cộng sự (2015) đã chỉ ra không có các hợp chất isoflavone trong hạt đậu xanh tại thị trường Tây Ban Nha [39] Các công bố về các hợp chất isoflavone trong đậu xanh chưa nhiều, và cần nhiều thực nghiệm để xác định hơn

1.2.4 Bã đậu nành

Bã đậu nành là phụ phẩm của quá trình chế biến sữa đậu nành, đậu hũ Quá trình chế biến các sản phẩm từ đậu nành còn sót lại từ 30-50% hàm lượng isoflavone trong bã đậu nành Mặc dù còn giá trị dinh dưỡng cao và sản lượng bã thải ra hằng ngày rất lớn nhưng bã đậu nành chỉ dùng trong chăn nuôi hoặc làm phân bón mà chưa được chú trọng thu hồi các thành phần dinh dưỡng [11][40] Lena Jankowiak và các cộng sự (2014) đã nghiên cứu và trích ly isoflavone từ bã đậu nành tự sản xuất quy mô phòng thí nghiệm [11] Nkurunziza và cộng sự (2019) đã khai thác isoflavone ở bã đậu nành và chỉ ra tiềm năng khai thác các hợp chất này [40]

1.2.5 Cỏ ba lá đỏ (Trifolium pratense L)

Cỏ ba lá đỏ (Trifolium pratense L) có nguồn gốc ở Bắc Mỹ, được trồng ở

một số khu vực ôn đới thuộc Châu Âu, Tây Á và Bắc Mỹ để làm thức ăn cho gia súc Trong vài năm gần đây, cỏ ba lá đỏ được xem là nguồn cung cấp isoflavone tiềm năng do chúng rất giàu hàm lượng các isoflavone aglycone, có thể từ 0,2-2% phân bố nhiều nhất trong lá, kế đến là hoa và thân Các thành phần biochanin A, irilone và formononetin chiếm từ 40-50% trong tổng số isoflavone, trong khi hàm lượng daidzen, glycitein và genistein thấp hơn so với đậu nành [3] [17]

Ngoài ra, một số loại cây họ đậu như cỏ linh lăng (Medicargo spp), đậu gà (Cicer arietinum L) giàu hợp chất aglycone (biochanin A, formononetin), là những

nguyên liệu tiềm năng cung cấp isoflavone [3][12]

1.3 Cơ sở về công nghệ thu nhận isoflavone

Ngành công nghiệp trích ly isoflavone nói riêng và các hợp chất thiên nhiên nói chung hiện nay đều tuân theo các kỹ thuật trích ly “xanh”, dựa vào các yếu tố về nguồn nguyên liệu và công nghệ khai thác “xanh”, giảm thiểu tác động môi trường

Nguồn: Nemitz và cộng sự (2015) [6], Cho và cộng sự (2009)[41]

Hình 1.4: Quy trình tổng quát sản xuất chế phẩm isoflavone thương mại

Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm isoflavone thương mại từ nguồn nguyên liệu thực vật được tiến hành như ở sơ đồ Hình 1.4 với các quá trình sau

1.3.1 Xử lý nguyên liệu

Nguyên liệu được loại bỏ tạp chất, sấy khô, nghiền nhỏ và bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thấp nhằm làm giảm thiểu sự suy thoái các hợp chất thiên nhiên nói chung và hợp chất isoflavone nói riêng Một số nghiên cứu sử dụng đậu nành khử béo bằng hexane để tăng cường quá trình trích ly [14][42]

Nguồn: Rostagno và cs (2010) [7]

Hình 1.5: Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly (phương pháp truyền thống)

1.3.2.2 Trích ly hiện đại

Một số kỹ thuật trích ly hiện đại đã được phát triển trong những thập niên gần đây thông qua việc ứng dụng các nguồn năng lượng vi sóng, siêu âm, áp suất cao đã được áp dụng vào trích ly isoflavone từ thực vật nhằm rút ngắn thời gian, giảm thiểu ô nhiễm môi trường

Trích ly sử dụng sóng siêu âm (Ultrasound-Assisted Extraction-UAE)

Quá trình trích ly sử dụng sóng siêu âm dựa vào sự hình thành hiện tượng “cavitation”, là hiện tượng tạo thành các bong bóng nhỏ, là tác nhân đóng một vai trò trung gian để nhận năng lượng và tập trung năng lượng của sóng siêu âm Hiện tượng này sẽ tác động đến thành tế bào như quá trình phân mảnh, bào mòn thành tế bào, phá vỡ tế bào nên dung môi dễ dang thâm nhập sâu vào nguyên liệu, nhanh chóng giải phóng các vật chất bên, do đó đã nâng cao hiệu quả trích ly [43]

Trích ly sử dụng vi sóng (Microwave-Assisted-Extraction-MAE)

Phương pháp trích ly isoflavone dùng năng lượng vi sóng dựa vào nguyên tắc là khi các phần tử trong nguyên liệu thực vật hấp phụ năng lượng vi sóng, làm tăng nhiệt độ bên trong của tế bào thực vật và tăng áp suất dẫn đến thành tế bào bị phá vỡ, giải phóng isoflavone từ không bào vào dung môi trích ly [4] Ưu điểm của phương pháp này là thời gian trích ly rất ngắn, hiệu quả cao Cụ thể mẫu bột đậu nành được ngâm trong metanol 70% khoảng 30 phút, rồi trích ly hỗ trợ vi sóng (11 phút, 600 W) đã thu được hàm lượng isoflavone tăng đáng kể so với phương pháp trích ly tuyền thống

Trích ly lỏng cao áp (Pressurized-Liquid-Extraction-PLE)

Trích ly lỏng cao áp PLE dựa vào sự gia tăng nhiệt độ và áp suất cao của dung môi trích ly khi đi qua nguyên liệu, dẫn đến gia tăng sự hòa tan và khuếch tán isoflavone vào dung môi trích ly Phương pháp này cho hiệu suất trích ly isoflavone cao, thời gian trích ly ngắn Tuy nhiên với nhiệt độ trích ly cao, cần trích ly nhiều lần và lựa chọn dung môi phù hợp, nên gây thoái hóa cho các nhóm malonyl, acetyl, glycoside kém bền nhiệt [10][69]

Trích ly siêu tới hạn (Supercritical-Fluid-Extraction-SFE)

Nguyên lý của quá trình trích ly siêu tới hạn dựa vào đặc tính của dung môi ở

trạng thái siêu tới hạn, có khả năng hòa tan tốt các hợp chất ở cả 3 dạng rắn, lỏng và khí Khí CO2 được sử dụng nhiều nhất trong trích ly siêu tới hạn với ưu điểm thu được mẫu khá tinh khiết do CO2 tự bay đi và không độc hại với môi trường CO2

hòa tan rất tốt các aglycones nhưng hiệu quả trích ly các glycoside liên hợp rất thấp do độ phân cực của CO2 kém [45][46] Do đó phương pháp đồng dung môi thường được sử dụng bằng cách bổ sung methanol 80%, chiếm khoảng 10% so với dung môi CO2 để tăng độ phân cực nên đã trích ly được tất cả các dạng isoflavone

Các kỹ thuật trích ly hiện đại với nhiều ưu điểm như thuận tiện, nhanh chóng, khả năng tái sử dụng dung môi và ít tác động đến biến đổi khí hậu do giảm phát thải carbon dioxide và ít sử dụng dung môi độc hại Tuy nhiên việc ứng dụng kỹ thuật này còn có hạn chế, chưa thực hiện được do chi phí thiết bị lớn và cần nhiều nghiên cứu quy trình ở quy mô công nghiệp

1.3.3 Thủy phân glycoside

Dạng isoflavone aglycone là nhóm có hoạt tính sinh học cao hơn, hấp thụ nhanh nên được xét vào nhóm isoflavone có giá trị nhưng lại chiếm hàm lượng rất thấp (dưới 5%) trong hạt đậu nành [33] Các xúc tác sinh học (enzyme β-glucosidase) hoặc xúc tác hóa học như acid HCl đã được ứng dụng để thủy phân hoàn toàn glycoside đồng thời kết hợp với phương pháp kết tinh để thu được aglycone tinh khiết [42][47][48]

1.3.4 Tinh sạch

Với mục đích gia tăng hàm lượng trong chế phẩm isoflavone hoặc phân lập từng cấu tử, một số phương pháp tinh chế được sử dụng như trích ly rắn-lỏng, trích ly lỏng-lỏng, sắc kí, siêu lọc, kết tinh

Các phương pháp trích ly isoflavone từ cao chiết rắn hay cao lỏng dựa vào độ hòa tan vào các dung môi giữa các hợp chất isoflavone và các hợp chất còn lại Hệ dung môi 2 pha nước và các dung môi thường dùng như là ethyl acetate, n-butanol, dichloromethane v.v…[41][49][50]

Phương pháp sắc kí được xem là hữu hiệu cho tinh chế, phân tách và định lượng từng đơn chất trong hỗn hợp, đặc biệt là nhóm sắc kí lỏng Sắc kí cột mở với các pha tĩnh thường dùng như silica gel, alumin, nhựa macroporous D101, XAD,

AB8, Diaion HP, H103 v.v…đã được sử dụng để tinh chế isoflavone từ dịch trích ly [14][51][52][53][54] Các loại sắc kí bản mỏng điều chế (preparative TLC), sắc kí lỏng hiệu năng cao điều chế (preparative HPLC) hoàn toàn phân tách từng hợp chất isoflavone, là phương pháp hữu hiệu để thu nhận isoflavone tinh khiết [55]

Nhờ vào độ tan thấp và khả năng hình thành tinh thể của các hợp chất daidzein, genistein, glycitein trong nước lạnh (4oC), các hợp chất này đã được kết tinh và lọc thu hồi, tăng hàm lượng aglycone >90% [41][48][57]

Phương thức sấy thường là bước kế tiếp loại bỏ dung môi thu nhận được cao khô hoặc chế phẩm bột thô Hiện nay các phương pháp sấy chân không hoặc sấy thăng hoa được ứng dụng đối với các hợp chất có hoạt tính sinh học [42][58]

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về công nghệ thu nhận và ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trích ly là bước đầu tiên và quan trọng để thu nhận các hợp chất thiên nhiên từ nguyên liệu, với mục tiêu là đạt hiệu suất thu hồi cao nhất và giữ được hoạt tính sinh học của chúng

Trích ly truyền thống

Các phương pháp trích ly truyền thống như như ngâm, lắc, khuấy, chiết soxhlet dựa trên nguồn nhiệt và khuấy đảo để tăng quá trình khuếch tán isoflavone vào dung môi được sử dụng Các phương pháp ngâm, lắc, chiêt soxhlet, chiết hồi lưu vẫn được sử dụng trong các nghiên cứu do dễ thực hiện trong các phòng thí

nghiệm nhưng hiệu suất trích ly không cao, thấp hơn so với các phương pháp trích ly hiện đại như sử dụng sóng siêu âm, sử dụng vi sóng [35][59][60]

Kế tiếp, đặc tính của dung môi trích ly ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly Fan và cộng sự (2011) đã khảo sát khả năng hòa tan của daidzin và genistin tinh khiết trong các dung môi có các độ phân cực khác nhau cũng như hệ 2 dung môi Nghiên cứu cho thấy rằng độ tan của daidzin và genistin trong các dung môi ít phân cực như trichloromethane và cyclohexane tương đối thấp hơn trong các dung môi phân cực như methanol, isopropanol, n-butyl alcohol, ethanol và acetone, đặc biệt khả năng hòa tan tăng khi tăng nồng độ ethanol trong nước [49][61] Tương tự các nhóm daidzein, genistein là những hợp chất ít phân cực có độ hòa tan sắp xếp giảm dần theo propanone > methanol > ethyl ethanoate > hexane > trichloromethane > nước, trong khi thứ tự phân cực của dung môi là nước > methanol > propanone > ethyl ethanoate> trichloromethane > hexane [62] Những kết quả này chỉ ra rằng không chỉ độ phân cực của dung môi mà còn các yếu tố khác như tương tác giữa các phân tử, khả năng hình thành liên kết hydro giữa dung môi và chất tan có thể ảnh hưởng đến khả năng hòa tan [49][61][62] Do trong nguyên liệu thực vật giàu isoflavone còn các thành phần khác như các hợp chất đường, protein v.v cũng sẽ hòa tan vào dung môi và cản trở sự khuếch tán của các hợp chất isoflavone Do đó các thành phầ này sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả thu nhận isoflavone Nhìn chung các hệ dung môi phân cực được ưu tiên sử dụng, thường là hệ 2 dung môi giữa nước và các dung môi phân cực như ethanol, methanol, acetonitril, acetone [60][63] Hiện nay hệ dung môi ethanol-nước được sử dụng rộng rãi trong trích ly do tính an toàn, thân thiện với môi trường cũng như ethanol được thu hồi tái sử dụng, giảm thiểu được tình trạng ô nhiễm môi trường [11][47][64]

Yếu tố pH của môi trường trích ly cũng ảnh hưởng đến thành phần isoflavone thu nhận Wang và cộng sự (2013) đã khảo sát khoảng pH 7-11 cho thấy pH 9 cho hàm lượng glycoside đạt cực đại do các malonyl được thủy phân trong môi trường kiềm Bên cạnh đó, Murphy (2002) cũng đã báo cáo khi trích ly isoflavone bằng acetonitrile có bổ sung dung dịch HCl 1M cho hàm lượng

isoflavone tổng thấp hơn so với môi trường không bổ sung acid [63]

Giữa các yếu tố công nghệ trong quá trình trích ly là nhiệt độ trích ly, thời gian trích và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu có mối tương quan với nhau, chia ra 2 xu hướng Các báo cáo của Zhang và cộng sự [48], Seung Yong Cho và cộng sự [41] đã thực hiện trích ly isoflavone từ hạt đậu nành ở nhiệt độ 80-90oC nhưng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 5/1, dẫn đến thời gian trích ly kéo dài (90-180 phút) và có thể ảnh hưởng đến thành phần do chuyển đổi malonyl isoflavone thành glycoside tương ứng của chúng Hiện nay các nghiên cứu có xu hướng tăng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu để không cần trích ly lặp lại, giảm thời gian trích ly và nhiệt độ trích ly [42][47]

Lee và Lin (2007) đã thực hiện trích ly 3 hợp chất puerarin, daidzin và daidzein từ củ sắn dây cho thấy phương pháp sử dụng sóng siêu âm có hiệu suất thu hồi cao (gấp 3 lần cho puerarin và 2,1 lần cho daidzin và 4,1 lần cho daidzein so với phương pháp lắc) khi cùng nhiệt độ trích ly [35] Trích ly sử dụng sóng siêu âm tần số thấp (20kHz) phù hợp với các hợp chất isoflavone, cho hiệu quả trích ly cao hơn trích ly truyền thống ở nhiệt độ phòng [66] Các phương pháp trích ly hiện đại có xu hướng trích ly nhanh, thuận tiện, sử dụng các dung môi không gây ô nhiễm mô trường (dùng nước, khí CO2) hoặc ít thất thoát dung môi là xu hướng bền vững Tuy nhiên so với phương pháp trích ly truyền thống, các phương pháp này còn nhiều hạn chế như sau:

- Xét về hiệu suất thu hồi isoflavone, các phương pháp trích ly hiện đại

thường được so sánh với các phương pháp chiết soxhlet, khuấy-lắc ở nhiệt độ phòng

nên cho hiệu quả cao hơn và theo sự hiểu biết của chúng tôi là chưa có công bố của các phương pháp này với chiết khuấy có gia nhiệt

- Các phương pháp trích ly như UAE, MAE, PLE đều gây tăng nhiệt độ cao,

ảnh hưởng đến các hợp chất isoflavone kém bền nhiệt, gây giảm hoạt tính, chuyển hóa sang các dạng khác

- Các phương pháp trích ly hiện đại còn nhiều rào cản kỹ thuật trong thiết kế,

đòi hỏi chi phí đầu tư thiết bị, chi phí năng lượng cao khi thực hiện ở quy mô công nghiệp [64]

Tinh chế isoflavone

Phương pháp trích ly lỏng-lỏng, rắn-lỏng thực hiện đơn giản nhưng sử dụng dung môi độc hại với số lượng lớn và được áp dụng để tinh chế cho nhóm aglycone [42][47][48]

Phương pháp sắc kí được đánh giá là công cụ chính để tinh chế và phân lập các hợp chất isoflavone nói riêng và các hợp chất thiên nhiên nói chung Trong các phương pháp sắc ký, sắc kí cột mở được áp dụng nhiều nhất do dễ thực hiện trong phòng thí nghiệm và ở quy mô công nghiệp Wang (1971) lần đầu đã sử dụng sắc kí bản mỏng với pha tĩnh silica gel và aluminum oxide, đã phân lập được các hợp chất daidzin, genintin, daidzein, genistein và formotine có độ tinh sạch cao [67] Một số phương pháp sắc kí điều chế như pre-HPLC, pre-TLC, sắc kí phân bố ngược dòng hiện nay đều phân lập được các đơn chất isoflavone cho độ tinh khiết lên đến 99% Hạn chế của các phương pháp này là cần sử dụng các thiết bị chuyên dùng và chi phí hạt pha tĩnh khá cao cũng như các hợp chất được tinh chế có thể bị hấp phụ ở pha tĩnh dẫn đến hiệu suất thu hồi thấp

Những năm gần đây các loại nhựa macroporous được sử dụng để tinh chế như AB-8, XAD2, XAD4, XAD16, Diaion HP, H103 đã được đưa ứng dụng trong việc tinh chế isoflavone từ cao chiết thô [14][41][51] Nhìn chung các loại nhựa macrporous được sử dụng trong các báo cáo này có vai trò làm tiền đề cho các phương pháp gia tăng isoflavone mà chưa đi sâu vào nghiên cứu cụ thể về các thông số hấp phụ, giải hấp của các loại nhựa lên hỗn hợp dịch chứa isoflavone và các

thành phần khác, nhất là trong cao chiết isoflavone từ hạt đậu nành và bã đậu nành Đây là một phần nghiên cứu quan trọng để đưa vào ứng dụng hạt nhựa macrporous trong tinh chế isoflavone quy mô công nghiệp

Nâng cao hàm lượng aglycone

Hai loại xúc tác cho phản ứng phân cắt liên kết 1,4-β-glycoside giữa gốc đường glucose và aglycones là các enzyme có hoạt tính β-glucosidase và acid HCl Dung dịch HCl có thể thủy phân glycoside với chi phí thấp nhưng có nhiều hạn chế như do hiệu suất thủy phân thấp do các hợp chất isoflavone bị phân hủy và sản sinh các độc tố furural, cần thực hiện công đoạn tinh chế [68] Các xúc tác sinh học là các enzyme có hoạt tính β-glucosidase đặc hiệu, nên đã thủy phân dễ dàng liên kết liên kết 1,4-β-glycoside, có hiệu suất thu hồi lên đến 90% và có giá thành đắt [69][70]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Mặc dù ngành công nghiệp isoflavone đã phát triển từ nhiều thập kỷ nay trên thế giới nhưng các nghiên cứu trong nước thật sự khởi sắc trong các năm gần đây

Về trích ly isoflavone từ nguồn nguyên liệu trong nước, Đỗ Thị Hoa Viên và cộng sự (2005) đã chiết tách isoflavone từ củ sắn dây, sử dụng các dung môi như ethanol 96%, chloroform, ethylacetate và nước Trích ly bằng ethanol 96%, kết quả đã thu nhận được 28,38 mg isoflavone tinh chế (chiếm 14,19% hỗn hợp cao chiết), trong đó có 9,69 mg genistein và 12,40 mg daidzein Dịch chiết từ củ sắn dây được

nghiên cứu in-vivo tác dụng nội tiết kiểu oestrogen lên chuột nhắt trắng cái, cho

thấy hoạt tính estrogen của hỗn hợp isoflavone khá rõ rệt [9] Nhóm tác giả này gần đây nhất đã thực hiện tối ưu hóa điều kiện trích ly mầm đậu nành với 4 yếu tố và đạt được điều kiện tối ưu là tỉ lệ DM/NL=12, thời gian là 90 phút sử dụng ethanol 65%-pH 9 [71] Cao thô từ mầm đậu nành là nguyên liệu để sản xuất chế phẩm mầm đậu nành giàu phytoestrogen với hàm lượng 20mg phytoestrogen/viên nén Sản phẩm cũng đã được đánh giá hoạt tính estrogen in vivo cho kết quả tốt [72]

Vũ Văn Tuấn và cộng sự (2018) đã tinh chế isoflavone với thành phần chủ yếu là puerarin từ củ sắn dây Nhóm tác giả này đã phân lập và nâng cao độ tinh