luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm đánh giá kết quả tạo phôi trong ống nghiệm và sàng lọc bất thường số lượng nhiễm sắc thể ở phôi giai đoạn tiền làm tổ từ noãn trữ lạnh tại bệnh viện quốc tế sản nhi hải phòng giai đoạn 052021 082023

 Sự trưởng thành của nhân Să phát triÅn cąa trćng đòi hßi mát lo¿t các să kián cąa nhân và tÁ bào chÃt dißn ra cùng vãi các giai đo¿n giÁm phân đÅ có thÅ thă tinh, sao chép DNA và hình

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HàC VIỆN KHOA HàC VÀ CÔNG NGHỆ

'toi xin cant doan di ttri nghiAn cti-n trong ludn vdn ndy td c6ng trinh

nghiAn ct|u cua toi clVa tuAn nhting tdi liQu, tA heu do chfnh t6i tu tim hiAu vir nghiAn ctl'u Chlnh vi vQy, cdc k& qud nghi\n cint ddm bdo trung thryc vd khdch quan nhdt D6ng thdi, kAt qua ndy chtta nbng xudt hiQn trong bat ca mQt nghiAn cil'u ndo cdc sri ti'€u, k€t qua nau ftong ludn ttdn ld n'ung thwc nau sai toi hodn

ch.it.t trdch nhi€nt tru'6c phdt luqt.

Hd N\i, ngdy]'lthdng'lO ndm 2023

rAC GIA LUAN VAN

DAO THI PHUONG

d

i I

Trong qu6 trinh hodn thdnh 1u4n vdn ndy, t6i da nhan

qu.v b6Lr cua c6c thAy cd grito, citcnhd khoa hqc, c6c ddng nghiQp cirng gia dinh vii ban be.

Tru6c ti€n, t6i xin bdy to ldng bitlt on s6u s6c t6i TS Nguy6n v6n Hph

dd trgc ti5p huOng ddn, chi d4y cho t6i v0 chuy6n m6n, d6ng thoi dQng vi6n, khich lo t6i trong su6t qu6 trinh hgc t6p, nghi0n cf'u vd hoDrn thdnh lu6n v5n.

T6i xin trdn trong c6m on Ban Ldnh dao BQnh viQn Qudc tri SAn Nhi Hai Phong d5 tpo nhfr'ng c1i6u kiQn thuQn lqi nh6t AO tOi thqc hiQn nghiOn cuu ndy'

'foi xin cdm on c6c d6ng nghiQp t4i Khoa FI6 trq Sinh sdn, BCnh viQn Qu6c t6

San Nhi Hai Irhdng dd dua ra nhirng loi khuyOn trong thoi gian t6i thuc hi6n nghi0p cf'u rpi Khoa vir tao di6u kiOn thuqn lcri nh6t cho tdi de hodn thdnh qu6 trinh hgc tdp vd thUc hiqn nghiCn cuu.

'f6i xin tr6n trong cam on Ban LSnh dao, c6c thay c6 gi6o, gi6ng vi0n vd cdc cdn bo dang c6ng t6c t4i I{gc viQn Khoa hqc vd C6ng nghe, Vi6n Hdn lAm

Khoa hoc vd C6ng nghQ ViQt Nam dd 1u6n giirp dd t6i trong qu6 trinh hgc tap vir thuc hiQn lupn vdn.

Cudi cung, t6i xin bdy t6 ldng bi5t crn ch6n thAnh tor circ thdnh viOn trong gia dinh vd ban be, nhirn! ngudi dd lu6n o b6n t6i, c6 vfr vh dQng vi0n t6i nhfl'ng

lurc kh6 khdn cI6 c6 th€ hodn thdnh luOn vin ndry.

f6i xin tr6n trong c6m on!

,! Hii NQi, ngdy ]lthting lC niim 2023

DAO THI PHUONG

Danh m ăc bÁng

Danh m ăc các hình

Danh m ăc biÃu đß

M æ ĐÄU 1

Ch°¢ng 1 T àNG QUAN NGHIÊN CĆU 3

1.1 TàNG QUAN VÂ THĂ TINH TRONG àNG NGHIàM 3

1.1.1 Khái niám và thă tinh trong áng nghiám 3

1.1.2 Đánh giá să phát triÅn cąa phôi 3

1.2 SINH LÝ NOÃN 6

1.2.1 Să sinh noãn 6

1.2.2 Đánh giá hình thái noãn 8

1.3 BÀO QUÀN L¾NH NOÃN 12

1.3.1 Đánh ngh*a 12

1.3.2 Các ph°¢ng pháp trā l¿nh và rã đông noãn 12

1.3.3 Các nghiên cću và tác đáng cąa quá trình trā rã đái vãi noãn 14 1.4 CÁC NGHIÊN CĆU ĐÁNH GIÁ TÁC ĐàNG CĄA QUÁ TRÌNH TRĀ Rà ĐàI VâI KÀT QUÀ PHÔI HâC VÀ LÂM SÀNG 18

1.4.1 KÁt quÁ phôi hãc 18

1.4.2 KÁt quÁ sÁn khoa và chu sinh 20

Ch°¢ng 2 ĐÞI T¯ĀNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU 21

2.1 ĐàI T¯ĀNG NGHIÊN CĆU 21

2.1.1 Tiêu chu¿n lăa chãn 21

2.1.2 Tiêu chu¿n lo¿i trừ 21

2.1.3 ThiÁt kÁ nghiên cću 21

2.1.4 Cÿ mÁu và chãn mÁu 22

2.2 HOÁ CHÂT VÀ THIÀT Bà 23

2.2.1 Hoá chÃt 23

2.2.2 VÃt t°, thiÁt bá 23

2.3 PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU 24

2.3.1 Ph°¢ng pháp trā l¿nh noãn/phôi 24

2.3.2 Ph°¢ng pháp rã đông noãn/phôi 24

2.3.3 Ph°¢ng pháp vi tiêm tinh và nuôi cÃy phôi 24

2.3.5 Ph°¢ng pháp sinh thiÁt phôi 25

2.3.6 ChuyÅn phôi trā đông 26

2.3.7 Phân tích sá liáu nghiên cću 26

2.4 VÂN ĐÂ Đ¾O ĐĆC TRONG NGHIÊN CĆU 27

Ch°¢ng 3 K¾T QUÀ VÀ THÀO LUÀN 28

3.1 ĐÀC ĐIÄM CHUNG CĄA ĐàI T¯ĀNG NGHIÊN CĆU 28

3.2 KHÀ NNG SàNG SÓT CĄA NOÃN SAU RÃ ĐÔNG 30

3.3 KÀT QUÀ PHÔI HâC 33

3.3.1 ĐÁc điÅm thă tinh 33

3.3.2 KhÁ nng t¿o phôi phân chia (ngày 3) 35

3.3.3 KhÁ nng t¿o phôi nang 37

3.3.4 ChÃt l°āng di truyÃn 38

3.4 KÀT QUÀ LÂM SÀNG 41

3.4.1 Phân bá phôi chuyÅn theo chÃt l°āng di truyÃn và hình thái 41

3.4.2 KÁt quÁ thai 42

3.4.3 Ành h°çng cąa chÃt l°āng di truyÃn phôi tãi tß lá có thai 44

3.5 ĐÁNH GIÁ CÁC YÀU Tà NG¯äI M TIÊN L¯ĀNG PHÔI NGUYÊN BàI 45

3.5.1 Nhóm tiên l°āng kém 46

3.5.2 Nhóm tiên l°āng tát 47

3.5.3 Tiên l°āng phôi nguyên bái theo ng°ÿng AMH 47

K¾T LUÀN VÀ KI¾N NGHà 50

KÀT LUÂN 50

KIÀN NGHà 51

DANH MĂC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN Đ¾N LUÀN VN 52

DANH MĂC TÀI LIÆU THAM KHÀO 53

PHĂ LĂC i

Vi¿t tÃt Ti¿ng ViÇt Ti¿ng Anh

AFC ĐÁm sá nang noãn thć cÃp Antral follicle count

AMH Hoóc môn bußng trćng Anti-Mullerian Hormone

AUC Dián tích d°ãi đ°ång cong Area under curve

Azoospermia Vô tinh

COH Kích thích bußng trćng có

kiÅm soát

Controlled Ovarian Stimulation

CPA ChÃt bÁo quÁn l¿nh Cryoprotectant agent

Cryptospermia Tinh trùng đ°āc tìm thÃy sau

ly tâm tinh dách

FSH Kích noãn bào tá Follicle Stimulating Hormone

Gran Đá mán bào t°¢ng chÃt Granularity

GVBD Vÿ túi mầm Germinal vesicle breakdown

HSA Albumin huyÁt thanh ng°åi Human serum albumin

ICM Khái tÁ bào nái phôi Inner cell mass

ICSI Tiêm tinh trùng vào bào t°¢ng

noãn

Intra-Cytoplasmic Sperm Injection

IVF Thă tinh trong áng nghiám In vitro fertilization

LH Hoóc môn hoàng thÅ hoá Luteinizing hormone

M-SER M¿ng l°ãi nái chÃt tr¢n cąa ty

thÅ

Mitochondrial-Smooth Endomedium Reticulum

MV Phćc hāp ty thÅ-túi Mitochondrial vesicle

OCC Khái phćc hāp tÁ nào noãn Oocyte-cumulus complex

sắc thÅ ç phôi tiÃn làm tá

PVS Khoanh quanh noãn Perivitelline space

characteristic

Reticulum

SOAT Tinh trùng ít, yÁu, dá d¿ng

nghiêm trãng

Severe OligoAsthenoTeratozoospermia

TEM Kính hiÅn vi đián tÿ truyÃn

qua

Transmission electron microscopy

BÁng 1.1 Đánh giá hình thái phôi phân chia (ngày 3) theo đßng thuÃn Alpha 4

BÁng 2.1 Đánh giá hình thái và xÁp lo¿i chÃt l°āng phôi ngày 3 25

BÁng 3.1 ĐÁc điÅm chung cąa đái t°āng nghiên cću 28

BÁng 3.2 Tß lá noãn sáng sót sau rã đông 31

BÁng 3.3 Tß lá thă tinh 34

BÁng 3.4 ĐÁc điÅm phôi phân chia (ngày 3) 36

BÁng 3.5 KhÁ nng t¿o phôi nang 37

BÁng 3.6 Phân bá phôi theo chÃt l°āng di truyÃn và ngußn gác noãn 39

BÁng 3.7 Phân bá phôi chuyÅn theo chÃt l°āng di truyÃn 41

BÁng 3.8 Phân bá phôi chuyÅn theo chÃt l°āng hình thái 41

BÁng 3.9 ĐÁc điÅm thai ç 2 nhóm noãn 42

BÁng 3.10 Tß lá có thai chuyÅn phôi nguyên bái 44

BÁng 3.11 Tß lá có thai chuyÅn phôi thÅ khÁm 45

BÁng 3.12 Tiên l°āng phôi nguyên bái theo ng°ÿng AMH 48

Hình 1.1 Các giai đo¿n phôi nang 5

Hình 1.2 OCC tr°çng thành và ch°a tr°çng thành 8

Hình 1.3 Noãn ç các giai đo¿n 9

Hình 1.4 Phân lo¿i hình thái thÅ căc thć nhÃt 9

Hình 1.5 Phân lo¿i hình thái khoang quanh noãn 10

Hình 1.6 Các bÃt th°ång chÃt l°āng bào t°¢ng chÃt 11

Hình 2.1 S¢ đß lăa chãn mÁu trong nghiên cću 23

Hình 3.1 Phân biát hình thái noãn sáng sót và noãn thoái hoá sau rã đông 30

Hình 3.2 ĐÁc điÅm hình thái hāp tÿ thă tinh 33

Hình 3.3 ChÃt l°āng hình thái phôi nuôi cÃy ngày 3 35

Hình 3.4 KÁt quÁ phân tích sá l°āng NST bằng NGS 38

BiÅu đß 3.1 So sánh tß lá sáng sót sau rã đông vãi các nghiên cću khác 32BiÅu đß 3.2 Tß lá các d¿ng bÃt th°ång NST theo ngußn gác noãn 40BiÅu đß 3.3 KÁt căc lâm sàng theo ngußn gác noãn 43BiÅu đß 3.4 Đ°ång cong ROC xác đánh các yÁu tá tiên l°āng kém cho mô hình tiên l°āng phôi nguyên bái 46

BiÅu đß 3.5 Đ°ång cong ROC xác đánh các yÁu tá tiên l°āng tát cho mô hình tiên l°āng phôi nguyên bái 47BiÅu đß 3.6 Phân bá tß lá phôi nguyên bái theo ng°ÿng AMH 1,36 48

M æ ĐÄU

Kỹ thuÃt thă tinh trong áng nghiám t¿i phòng thí nghiám bắt đầu bằng viác thu nhÃn giao tÿ đăc (tinh trùng) và giao tÿ cái (noãn) Tùy thuác vào mong muán và tình tr¿ng bánh lý cąa từng đái t°āng, bác s* và chuyên viên phôi hãc s¿ đ°a ra các ph°¢ng h°ãng thăc hián các kỹ thuÃt đái vãi giao tÿ Noãn đ°āc thă tinh vãi tinh trùng thành phôi và sau đó đ°āc chuyÅn vào tÿ cung cąa bánh nhân Tr°ång hāp sau khi thu nhÃn giao tÿ không thăc hián thă tinh ngay thì giao tÿ cần đ°āc bÁo quÁn l¿nh đÅ bÁo tßn hình thái và chćc nng Bác s* lâm sàng có thÅ lăa chãn trā l¿nh noãn nh° mát ph°¢ng án dă phòng cần thiÁt cho nhāng phă nā có nguy c¢ cao bá suy bußng trćng do quá trình điÃu trá ung th° [1-3], hoÁc nhóm phă nā có nguy c¢ mắc hái chćng quá kích bußng trćng Bên c¿nh đó, khÁ nng sinh sÁn giÁm theo đá tuái là yÁu tá đáng cân nhắc trong viác thăc hián trā noãn chą đáng vãi măc đích bÁo tßn khÁ nng sinh sÁn cho nhāng phă nā đang trong đá tuái sinh sÁn nh°ng ch°a s¿n sàng mang thai [4] Trā l¿nh noãn nhiÃu lần (gom noãn) đÅ đ¿t đ°āc sá l°āng noãn tái °u cho mát chu kỳ t¿o phôi là lăa chãn phù hāp vãi nhóm bánh nhân đáp ćng kích thích bußng trćng kém [5] Viác t° vÃn thăc hián trā l¿nh noãn nên đ°āc cá thÅ hóa và dăa trên nhiÃu yÁu tá, chẳng h¿n nh° tuái cąa bánh nhân, tình tr¿ng dă trā bußng trćng, mćc đá kh¿n cÃp cąa điÃu trá và lo¿i điÃu trá ung th° cũng nh° nguy c¢ suy sinh dăc [6]

T¿i Viát Nam, mát sá nghiên cću và noãn trā l¿nh đã đ°āc thăc hián Lê Thanh HuyÃn và cáng să (2018) đánh giá biÁn đái hình thái noãn và khÁ nng phát triÅn cąa noãn trā l¿nh bằng ph°¢ng pháp thuỷ tinh hoá cho kÁt quÁ tß lá noãn sáng sau rã đông 89,09%, tß lá thă tinh 71,28%, tß lá phôi tát ngày 3 là 38,71%, tß lá có thai lâm sàng 29,41%, tß lá làm tá 12,94% [7] Mát nghiên cću khác cąa Lê Thuỵ Hßng KhÁ và cáng să (2020) báo cáo kÁt quÁ đông l¿nh noãn

ç bánh nhân điÃu trá thă tinh trong áng nghiám vãi tß lá noãn sáng sau rã đông đ¿t 95,59 ± 13,60%, tß lá thă tinh 78,96 ± 24,88%; tß lá thai lâm sàng và tß lá làm tá lần l°āt là 30,8% và 21,61% [8]

Trên thÁ giãi đã có nhiÃu bằng chćng khoa hãc đã chćng minh trā l¿nh noãn là mát kỹ thuÃt an toàn và hiáu quÁ [9-11] Tuy nhiên, hầu hÁt các báo cáo đÃu nghiên cću trên nhóm noãn trā có ngußn gác từ noãn hiÁn Viác so sánh kÁt quÁ phôi hãc, lâm sàng và kÁt quÁ di truyÃn giāa nhóm noãn trā l¿nh và nhóm noãn t°¢i tă thân trong cùng mát điÃu kián t¿i cùng mát thåi điÅm thă

tinh có thÅ cąng cá vai trò và hiáu quÁ cąa trā l¿nh noãn Trên c¢ sç đó, chúng tôi thăc hián đà tài:

<Đánh giá kết quả tạo phôi trong ống nghiệm và sàng lọc bất thường

số lượng nhiễm sắc thể ở phôi giai đoạn tiền làm tổ từ noãn trữ lạnh tại Bệnh viện Quốc tế Sản Nhi Hải Phòng giai đoạn 05/2021 – 08/2023= vãi măc tiêu:

1 So sánh kÁt quÁ t¿o phôi trong áng nghiám (kÁt căc phôi hãc và lâm sàng)

và kÁt quÁ sàng lãc bÃt th°ång sá l°āng nhißm sắc thÅ ç phôi tiÃn làm tá (PGT-A) cąa noãn trā rã so vãi noãn t°¢i

2. Đánh giá mát sá yÁu tá ng°åi mà tiên l°āng phôi nguyên bái ç các bánh nhân thăc hián tích luỹ noãn bằng ph°¢ng pháp thuỷ tinh hoá

Ch°¢ng 1 T àNG QUAN NGHIÊN CĆU 1.1 TàNG QUAN VÀ THĂ TINH TRONG ÞNG NGHIÆM

1.1.1 Khái niÇm vÁ thă tinh trong ßng nghiÇm

Thă tinh trong áng nghiám (IVF) bắt đầu vãi kích thích bußng trćng đÅ thu đ°āc nhiÃu noãn trong cùng mát chu kỳ giúp tng xác suÃt thành công và tng hiáu quÁ điÃu trá so vãi viác chß có 1-2 noãn răng trong chu kỳ tă nhiên Noãn đ°āc thă tinh vãi tinh trùng đÅ t¿o phôi và đ°āc nuôi cÃy theo dõi trong các tą nuôi cÃy chuyên biát mô phßng các điÃu kián trong tÿ cung cąa ng°åi

mà trong thåi gian từ 3-6 ngày Phôi có chÃt l°āng hình thái tát s¿ đ°āc cân

nhắc đÅ chuyÅn vào tÿ cung cąa ng°åi mà Viác lăa chãn sá l°āng phôi chuyÅn còn tuỳ thuác vào chÃt l°āng phôi, tuái phôi và điÃu kián tiÁp nhÃn cąa niêm

m¿c tÿ cung Các phôi hāu dăng còn d° ch°a sÿ dăng đÁn s¿ đ°āc trā l¿nh đÅ dùng cho các lần chuyÅn phôi sau mà không cần thăc hián thêm chu kỳ kích thích bußng trćng nào Sau khi cÃy vào tÿ cung, phôi có thÅ làm tá trong niêm

m¿c tÿ cung và dần phát triÅn thành thai nhi KhoÁng 10-12 ngày sau cÃy phôi,

bánh nhân có thÅ thÿ thai que thÿ thai hoÁc xét nghiám máu đÅ biÁt kÁt quÁ Sau khi phôi đ°āc xác nhÃn đã làm tá, viác theo dõi thai kì và sÁn khoa cąa thai

từ IVF hoàn toàn giáng nh° mát thai bình th°ång Mát điÅm l°u ý rằng, tß lá

đa thai (từ hai thai trç lên) th°ång cao h¢n đái vãi nhāng tr°ång hāp thăc hián IVF so vãi thai tă nhiên Mãi nß lăc đÅ giÁm tß lá đa thai và các biÁn chćng thai

kỳ liên quan nh° đái tháo đ°ång, tng huyÁt áp thai kỳ, tiÃn sÁn giÃt có thÅ đ¿t đ°āc nhå giÁm sá l°āng phôi chuyÅn, tng c°ång cÁi thián hiáu quÁ nuôi cÃy

đÅ phôi đ¿t chÃt l°āng tát

1.1.2 Đánh giá să phát triÃn cąa phôi

 Giai đoạn hợp tử (tiền nhân)

Noãn thă tinh th°ång có hình cầu, vãi 2 thÅ căc và 2 tiÃn nhân (pronuclei

- PN) có màng bao riêng biát, kích th°ãc bằng nhau, nằm sát nhau ç vùng trung tâm cąa noãn PN có chća các h¿t nhân NPB (Nucleolar Precursor Body) vãi

sá l°āng và kích th°ãc t°¢ng đ°¢ng nhau, sắp xÁp thẳng hàng t¿i vùng giao nhau cąa màng 2 tiÃn nhân Nhāng đÁc điÅm nh° sá PN khác 2; PN cách xa nhau, quá khác biát nhau và kích th°ãc hoÁc có NPB quá nhß đÃu đ°āc xem là

nhāng đÁc điÅm bÃt th°ång cąa PN

 Phôi phân chia

 Hình thái và số lượng phôi bào

Phôi bào phân chia theo quy luÃt luỹ thừa cąa 2, nên sá l°āng phôi bào th°ång là ch¿n Sá l°āng phôi bào có thÅ là sá lẻ 3, 5, 7 khi quan sát ç giai đo¿n phân chia hay khi xuÃt hián să phân chia không đßng bá Thông th°ång, phôi

gßm các phôi bào có kích th°ãc gần nh° bằng nhau sắp xÁp c¿nh nhau t¿o thành hình tròn NhiÃu há tháng điÅm đánh giá phôi đã đ°āc phát triÅn, trong đó há tháng đánh giá phôi theo đßng thuÃn cąa hiáp hái Alpha đ°āc dùng phá biÁn

nhÃt ç Viát Nam và châu Âu [12] (Xem BÁng 1.1)

 Mảnh vỡ bào tương

MÁnh vÿ bào t°¢ng là mát khái bào t°¢ng có màng bao, nằm ngoài tÁ bào, có kích th°ãc <45μm đái vãi phôi ngày 2 và <40μm đái vãi phôi ngày 3 Các mćc đá cąa mÁnh vÿ bào t°¢ng bao gßm: nhà (<10%), vừa phÁi (10 – 25%)

và nÁng (>25%) Giá trá % đ°āc tính dăa trên thÅ tích cąa phôi bào, ví dă ç phôi 4 tÁ bào, 25% mÁnh vÿ bào t°¢ng s¿ t°¢ng đ°¢ng vãi thÅ tích 1 phôi bào

BÁng 1.1 Đánh giá hình thái phôi phân chia (ngày 3) theo đßng thuÃn Alpha

2 Trung

bình

10-25% mÁnh văn tÁ bào Phần lãn phôi bào có kích th°ãc phù hāp vãi giai đo¿n phát triÅn

Không có phôi bào đa nhân

>25% mÁnh văn tÁ bào Kích th°ãc phôi bào không phù hāp giai đo¿n phát triÅn

Có phôi bào đa nhân

 Phôi nang

Hình thái phôi nang đ°āc đánh giá dăa trên 3 tiêu chu¿n là đá nç ráng

cąa khoang phôi, khái tÁ bào nái phôi (ICM – Inner cell mass) và lãp tÁ bào lá nuôi (TE – Trophectoderm)

 Độ nở rộng khoang phôi

Hián t°āng tích lũy dách giāa các tÁ bào xÁy ra vào giai đo¿n ngày 4 và ngày 5 trong quá trình nuôi cÃy phôi Să tng lên cąa dách trong khoang phôi nang và sá l°āng tÁ bào làm tng kích th°ãc cąa phôi, làm mßng màng ZP

Cuái cùng, màng ZP vÿ giÁi phóng khái tÁ bào gãi là să thoát màng Quá trình hình thành khoang phôi nang là nhå să ho¿t đáng cąa kênh xuyên màng Na/K-ATPase Các kênh này b¢m Na+ và K+vào khoang phôi nang làm tng áp suÃt th¿m thÃu, kÁt quÁ là n°ãc th¿m thÃu vào khoang phôi nang, từ đó làm gia tng

áp lăc n°ãc và làm tng dần kích th°ãc cąa khoang trong suát giai đo¿n phôi nang Đá nç ráng khoang phôi đ°āc chia thành 6 giai đo¿n [13] (Hình 1.1)

Hình 1.1 Các giai đo¿n phôi nang

 Hình thái ICM

Khi phôi nang đ¿t đ°āc nç ráng đá 3 hoÁc cao h¢n thì có thÅ dß dàng quan sát 2 quần thÅ tÁ bào mãi hình thành Phần tÁ bào ç bên ngoài phôi giúp đánh hình cÃu trúc phôi nang đ°āc gãi là lãp tÁ bào lá nuôi phôi TE, phần tÁ bào còn l¿i nằm bên trong khoang phôi nang th°ång t¿o thành mát căm tÁ bào đ°āc gãi là khái tÁ bào ICM s¿ phát triÅn thành phôi thai Hình thái ICM đ°āc phân thành 3 lo¿i [12] Lo¿i A chća nhiÃu tÁ bào và tÁ bào đ°āc nén chÁt vãi nhau, lo¿i B có sá l°āng tÁ bào ít h¢n và tÁ bào có liên kÁt lßng lẻo, lo¿i C có

rÃt ít tÁ bào và chúng liên kÁt vãi nhau mát cách lßng lẻo Să thay đái và sá

l°āng các tÁ bào liên kÁt vãi nhau trong khái ICM Ánh h°çng đÁn hình d¿ng

cąa ICM

 Đánh giá TE

T°¢ng tă nh° khái ICM, lãp tÁ bào TE có thÅ đ°āc phân biát rõ ràng khi phôi đã nç ráng (đá 3 hoÁc cao h¢n) Vai trò cąa các tÁ bào TE ch°a rõ ràng trong giai đo¿n đầu phát triÅn cąa phôi nang nh°ng trong giai đo¿n hình thành khoang phôi nang TE đóng vai trò t¿o ra chÃt lßng chća đầy khoang phôi nang MÁt khác, vai trò TE thÅ hián rõ ç giai đo¿n làm tá cąa phôi giúp phôi bám dính

và n sâu vào lãp nái m¿c tÿ cung æ giai đo¿n sau cąa phôi thai, các tÁ TE phát triÅn thành màng ái và nhau thai TÁ bào TE cũng đ°āc phân thành 3 lo¿i:

Lo¿i A chća nhiÃu tÁ bào gắn kÁt vãi nhau hình thành biÅu mô, lo¿i B chća sá l°āng tÁ bào ít h¢n t¿o thành lãp biÅu mô mßng, lo¿i C, sá l°āng các tÁ bào rÃt

ít, các tÁ bào có kích th°ãc lãn và liên kÁt lßng lẻo

1.2 SINH LÝ NOÃN

1.2.1 Să sinh noãn

Quá trình sinh noãn đ°āc bắt đầu từ giai đo¿n bào thai và kÁt thúc khi

phă nā b°ãc vào thåi kỳ mãn kinh Să sinh noãn phát triÅn qua 4 giai đo¿n: (1)

tÁ bào mầm sinh dăc nguyên thuỷ hình thành và di chuyÅn tãi c¢ quan sinh dăc; (2) gia tng sá l°āng tÁ bào mầm sinh dăc bằng c¢ chÁ nguyên phân; (3) giÁm phân đÅ giÁm vÃt chÃt di truyÃn; (4) tr°çng thành noãn và cÃu trúc chćc nng

 Tế bào mầm sinh dục nguyên thuỷ hình thành và di chuyển tới cơ

quan sinh d ục

Các tÁ bào mầm sinh dăc đầu tiên có bá nhißm sắc thÅ l°ÿng bái, đ°āc

gãi là các tÁ bào mầm sinh dăc nguyên thuỷ Nhāng tÁ bào này xuÃt hián đầu tiên ç thành túi noãn hoàng vào khoÁng cuái tuần thć 3 sau khi thă tinh Vào khoÁng tuần thć 5, đôi tuyÁn sinh dăc bắt đầu xuÃt hián ç trung thÃn, hình thành nên gå sinh dăc và là n¢i duy nhÃt các tÁ bào mầm sinh dăc nguyên thuỷ có thÅ

sáng sót Từ tuần thć 4 đÁn tuần thć 6, tÁ bào mầm sinh dăc nguyên thuỷ bắt đầu di chuyÅn cąa từ thành túi noãn hoàng đÁn gå sinh dăc Cuái tuần thć 6, quá trình nguyên phân đã làm tng sá l°āng tÁ bào mầm sinh dăc nguyên thuỷ

từ vài trm tÁ bào lên đÁn khoÁng 10.000 tÁ bào

 Gia tăng số lượng tế bào mầm sinh dục bằng cơ chế nguyên phân

Các tÁ bào mầm sinh dăc nguyên thuỷ đ°āc tiÁp tăc nguyên phân trong giai đo¿n từ tuần thć 6 đÁn tuần 16 - 20 T¿i c¢ quan sinh dăc, các tÁ bào mầm nguyên thuỷ đang nguyên phân đ°āc gãi là nguyên bào noãn Nguyên bào noãn

chća bá nhißm sắc thÅ 2n vãi 23 cÁp nhißm sắc thÅ gßm 46 nhißm sắc thÅ Nhå vào c¢ chÁ nguyên phân, các nguyên bào noãn tng dần và sá l°āng, đ¿t khoÁng 600.000 tÁ bào vào tuần thć 8 và 7 triáu tÁ bào vào tuần thć 20 [14]

 Sự trưởng thành của nhân

Să phát triÅn cąa trćng đòi hßi mát lo¿t các să kián cąa nhân và tÁ bào

chÃt dißn ra cùng vãi các giai đo¿n giÁm phân đÅ có thÅ thă tinh, sao chép DNA

và hình thành hāp tÿ l°ÿng bái Quá trình giÁm phân đ°āc tái dißn dăa trên báo

hiáu bằng să phá vÿ túi mầm (Germinal vesicle breakdown - GVBD) Sau đó,

tÁ bào trćng tiÁn triÅn thông qua kỳ giāa I, trong đó các nhißm sắc thÅ t°¢ng đßng đ°āc ghép đôi sắp xÁp ç giāa mÁt phẳng xích đ¿o phân bào Sau đó, các nhißm sắc thÅ kép tách ra, mát nÿa vÃt liáu di truyÃn đ°āc đ¿y vào thÅ căc thć

nhÃt, dÁn đÁn să hình thành tÁ bào trćng tr°çng thành, có bá nhißm sắc thÅ đ¢n

bái (n kép) Hình thái cąa thoi phân bào bình th°ång trong tÁ bào trćng metaphase II (MII) đ°āc đánh giá bằng kính hiÅn vi ánh sáng phân căc Khi să hình thành thoi phân bào dißn ra bình th°ång thì có nhiÃu khÁ nng dÁn đÁn phôi nguyên bái Mát phân tích táng hāp cąa 10 nghiên cću đã xác đánh rằng khi thoi phân bào đ°āc hình thành và có chćc nng bình th°ång thì tß lá thă tinh (P<0,0001), tß lá phôi phân chia (P<0,0001) và tß lá phôi phân phân chia có hình thái tát (P = 0,003) cao h¢n đáng kÅ æ ng°åi, quá trình lắp ráp trăc chính th°ång dißn ra ~10 giå sau GVBD và cần khoÁng 14 đÁn 20 giå giāa GVBD

và quá trình giÁi phóng thÅ căc Táng thåi gian tr°çng thành cąa nhân bao gßm

cÁ thåi gian GVBD đ°āc °ãc tính là khoÁng 20 đÁn 22 giå TÁ bào trćng sau

đó s¿ bá giā l¿i ç kỳ giāa II cho đÁn khi thă tinh

 Sự trưởng thành của tế bào chất

Să tr°çng thành cąa tÁ bào chÃt chu¿n bá cho să tr°çng thành cąa nhân

vãi các hình thái nhißm sắc chÃt că thÅ cho thÃy khÁ nng tÁ bào trćng tiÁp tăc quá trình phân bào Să tr°çng thành cąa nhân chą yÁu bao gßm să phân chia nhißm sắc thÅ, trong khi să tr°çng thành cąa tÁ bào chÃt liên quan đÁn să phân

phái l¿i c¢ quan, nhāng thay đái và đáng lăc hãc cąa bá khung x°¢ng tÁ bào,

bá máy Golgi, ho¿t đáng giÁi phóng canxi, dă trā mRNA, protein và các yÁu

tá phiên mã

Nhāng thay đái và bá khung tÁ bào trong các vi áng, sāi Actin và chÃt nhißm sắc t¿o ra să bÃt đái xćng cąa tÁ bào và cho phép nhô ra khßi c¢ thÅ căc vãi să mÃt tÁ bào chÃt ç mćc tái thiÅu

 Duy trì sự nghỉ của quá trình giảm phân

TÁ bào trćng cąa con ng°åi bá bắt giā ç kỳ đầu giÁm phân I cho đÁn khi

LH tng vãt giāa chu kỳ báo hiáu mát lo¿t thay đái nái bào, bao gßm nhāng thay đái và nßng đá cAMP/cGMP cąa tÁ bào h¿t và tÁ bào h¿t dÁn đÁn trong

viác nái l¿i quá trình giÁm phân và phát triÅn tÁ bào trćng ç kỳ giāa II

1.2.2 Đánh giá hình thái noãn

Sau khi thu nhÃn, noãn th°ång ç nhiÃu tr¿ng thái chÃt l°āng, giai đo¿n tr°çng thành và khÁ nng sáng khác nhau

1.2.2.1 Đánh giá phức hợp tế bào noãn (OCC)

Phćc hāp noãn – tÁ bào h¿t (OCC) th°ång đ°āc thu nhÃn vào thåi điÅm

36 giå sau khi tiêm tr°çng thành noãn và kích thích răng noãn Khái OCC đ°āc đánh giá să tr°çng thành thông qua đá giãn nç cąa lãp tÁ bào h¿t và tÁ bào vành tia [15]

Hình 1.2 OCC tr°çng thành và ch°a tr°çng thành (Ngußn: HP Fertility) (A) OCC tr°çng thành có tÁ bào h¿t và tÁ bào vành tia giãn ráng (B) OCC ch°a tr°çng thành tÁ bào h¿t và tÁ bào vành tia nén chÁt

1.2.2.2 Đánh giá độ trưởng thành của noãn

 Trưởng thành nhân

Tr°çng thành nhân cąa noãn đ°āc đánh giá sau khi lo¿i bß các tÁ bào h¿t

và tÁ bào vành tia Noãn ç giai đo¿n túi mầm (GV) có nhân vÁn d¿ng túi hình

cầu chća 1 h¿t nhân to Giai đo¿n kỳ giāa giÁm phân I (metaphase I) đ°āc xác đánh túi nhân biÁn mÃt và ch°a phóng thích thÅ căc thć nhÃt Noãn tr°çng thành

(MII) đ°āc xác đánh bçi să hián dián cąa thÅ căc thć nhÃt trong khoang quanh noãn

Hình 1.3 Noãn ç các giai đo¿n (Ngußn: HP Fertility) (A) Noãn GV có túi nhân

(mũi tên) (B): Noãn MI (C) Noãn MII vãi thÅ căc thć nhÃt (mũi tên)

 Trưởng thành tế bào chất

Tr°çng thành tÁ bào chÃt đ°āc xác nhÃn khi quan sát thÃy nhāng thÅ h¿t

vß (CG) từ bá Golgi đã di chuyÅn đÁn rìa ngoài màng bào t°¢ng vãi vai trò quan trãng trong ngn ngừa hián t°āng đa thă tinh [16]

1.2.2.3 Một số hình thái bất thường của noãn

 Đánh giá thể cực thứ nhất

Mát sá nghiên cću đã chß ra Ánh h°çng cąa bÃt th°ång thÅ căc thć nhÃt đÁn khÁ nng thă tinh và chÃt l°āng phôi [17, 18] Ngoài ra, noãn có thÅ căc

kháng lß khi thă tinh có khÁ nng t¿o ra phôi lách bái nhißm sắc thÅ cao [12]

Hình 1.4 Phân lo¿i hình thái thÅ căc thć nhÃt (Ngußn: HP Fertility) (A) PB 1:

BÃ mÁt tr¢n nh¿n (B) PB 2: BÃ mÁt nhn (C) PB 3: ThÅ căc phân mÁnh (D)

PB 4: To, bÃt th°ång

 Đánh giá khoang quanh noãn (PVS)

Đá ráng cąa PVS đ°āc cho là có Ánh h°çng đÁn khÁ nng sáng cąa noãn sau ICSI [19, 20], tß lá thă tinh [21] và đá phân mÁnh bào t°¢ng chÃt cąa phôi

Hình 1.5 Phân lo¿i hình thái khoang quanh noãn (Ngußn: HP Fertility) (A) PVS1: Bình th°ång, ráng vừa phÁi, không có h¿t (B) PVS2: Ráng mát phần quanh noãn, không có h¿t (C) PVS3: Ráng toàn bá chu vi quanh noãn (D) PVS4: T°¢ng tă PVS3 và xuÃt hián thêm h¿t trong khoang PVS

 Đánh giá chất lượng bào tương chất

Đá mán bào t°¢ng: Să hián dián cąa các quầng h¿t thô là mát trong nhāng

yÁu tá có thÅ Ánh h°çng đÁn kÁt quÁ thă tinh và să phát triÅn phôi Tuỳ theo đá dày đÁc cąa quầng h¿t bào t°¢ng thô từ d¿ng nhà (Gran 1) cho đÁn nghiêm

trãng (Gran 4)

ThÅ vùi (Incls): Các thÅ vùi quan sát d°ãi kính hiÅn vi là các túi nhß d¿ng lipofuscin, đ°āc cho là phćc hāp giāa lipid và vÃt liáu cô đÁc, đÃm màu từ bào t°¢ng [22] Nhāng thÅ vùi này khi có kích th°ãc lãn (>5µm) có khÁ nng Ánh h°çng đÁn să thă tinh cũng nh° quá trình phát triÅn cąa phôi nang [23]

L°ãi nái chÃt tr¢n (SER): SER là mát thành phần bào quan cąa tÁ bào, ç

d¿ng đ*a, có chćc nng táng hāp carbohydrate và lipid và đóng vai trò trung gian vÃn chuyÅn các sÁn ph¿m từ l°ãi nái chÃt đÁn các c¢ quan khác trong tÁ bào chÃt Noãn tr°çng thành s¿ có thÅ thă tinh bình th°ång nÁu không làm vÿ SER trong quá trình thao tác [24]

Không bào: Không bào là mát d¿ng thÅ vùi hình cầu có màng bao quanh

chća đầy dách cÁn bã cần lo¿i bß ra khßi tÁ bào noãn Các không bào lãn >14µm th°ång gây ra bÃt lāi đái vãi tß lá thă tinh và quá trình phát triÅn cąa phôi [25] Không bào xuÃt hián sau giai đo¿n 2PN có thÅ gây trç ng¿i đái vãi các mÁt

phẳng phân bào, dÁn đÁn giÁm tß lá t¿o phôi nang

Hình 1.6 Các bÃt th°ång chÃt l°āng bào t°¢ng chÃt (Ngußn: HP Fertility) (A) Gran 4 (B) Incls 2 (C) SER 4 (D) VAC 4

 Đánh giá chất lượng màng trong suốt (ZP)

Màng ZP bÃt th°ång hay gÁp ç d¿ng màng hình bầu dăc, màng kép, ZP quá dày hoÁc quá mßng Đá dày ZP 13-15µm đ°āc coi là bình th°ång, nÁu kích th°ãc nhß h¢n ZP đ°āc xem là mßng, các tr°ång hāp còn l¿i đ°āc xem là ZP dày [26, 27]

1.2.2.4 Cơ chế hình thành lệch bội ở noãn

Các con đ°ång phân chia giÁm nhißm khác nhau đ°āc cho là góp phần vào nguyên nhân gây ra tình tr¿ng lách bái ç tÁ bào trćng Să không phân ly

xÁy ra khi các nhißm sắc thÅ t°¢ng đßng hoÁc các nhißm sắc tÿ chá em không

thÅ phân tách t°¢ng ćng trong kỳ giāa I hoÁc kỳ giāa II, dÁn đÁn tng hoÁc

giÁm nhißm sắc thÅ [28] Ngoài ra, mát sá nghiên cću đã báo cáo rằng lách bái trong kỳ giāa I là kÁt quÁ cąa să phân tách sãm nhißm sắc tÿ chá em cąa mát nhißm sắc thÅ t°¢ng đßng và să phân chia ngÁu nhiên cąa các nhißm sắc thÅ đ¢n [29-31] Các phân tích và các thÅ căc cąa noãn bào cho thÃy các lßi phân chia giÁm nhißm do să phân tách nhißm sắc tÿ chá em sãm xÁy ra th°ång xuyên h¢n so vãi các lßi do să không phân ly nhißm sắc thÅ gây ra [32, 33] Gần đây,

kiÅu phân ly nhißm sắc thÅ thć ba góp phần gây ra lách bái, đ°āc gãi là phân

ly ng°āc đã đ°āc báo cáo [34] Trong tr°ång hāp này, các nhißm sắc tÿ chá em

cąa cÁ hai nhißm sắc thÅ t°¢ng đßng tách ra ç kỳ giāa I dÁn đÁn mát noãn l°ÿng

bái có mát nhißm sắc tÿ chá em từ mßi nhißm sắc thÅ t°¢ng đßng thay vì cÁ hai nhißm sắc thÅ từ mát nhißm sắc thÅ t°¢ng đßng Các nhißm sắc tÿ chá em này

vÁn không liên kÁt và có thÅ không xÁp thẳng hàng vãi trăc chính trong kỳ giāa

II hoÁc trÁi qua să phân chia ngÁu nhiên ç kỳ sau II [35] Să phân tách nhißm

sắc tÿ chá em sãm và phân ly ng°āc không phÁi lúc nào cũng dÁn đÁn lách bái

và mát sá tÁ bào trćng vÁn có sá l°āng nhißm sắc thÅ chính xác ç cuái kỳ giāa

II ThÃt vÃy, gần đây đã có báo cáo rằng 78% trćng có phân ly ng°āc ç kỳ giāa

II phân tách chính xác [36] Các tác giÁ t°¢ng tă đã chćng minh rằng să không phân ly trong kỳ giāa I giÁm theo tuái phă nā, să phân tách nhißm sắc tÿ chá

em sãm tng tuyÁn tính theo tuái, trong khi phân ly ng°āc tng chą yÁu theo

tuái mà cao [36] Do đó, tần sá t°¢ng đái cąa ba kiÅu phân chia này trong quá trình giÁm phân hình thành giao tÿ cái dÁn đÁn biÅu hián lách bái ç tÁ bào trćng ng°åi và phôi tiÃn làm tá

1.3 BÀO QUÀN L¾NH NOÃN

1.3.1 Đánh ngh*a

Trā l¿nh noãn là quá trình thay đái từ nhiát đá sinh lý 37oC xuáng -196oC trong nit¢ lßng, làm ng°ng trá tÃt cÁ các ho¿t đáng sinh hãc cąa tÁ bào sáng, duy trì khÁ nng tßn t¿i cąa noãn cho viác sÿ dăng trong t°¢ng lai

1.3.2 Các ph°¢ng pháp trā l¿nh và rã đông noãn

Trā l¿nh noãn đ°āc phát triÅn từ ph°¢ng pháp h¿ nhiát đá chÃm cho đÁn gần đây nhÃt là ph°¢ng pháp thąy tinh hóa, chúng đÃu có nhāng tác đáng đÁn ho¿t đáng chćc nng sau này cąa noãn và Ánh h°çng đÁn khÁ nng phát triÅn sau rã đông [37] Hai ph°¢ng pháp đÃu bao gßm các b°ãc chính sau: sÿ dăng chÃt bÁo vá đông l¿nh, làm l¿nh, cÃt trā, rã đông Să khác biát chą yÁu là ç sÿ dăng chÃt bÁo vá đông l¿nh (CPA) và quá trình làm l¿nh

1.3.2.1 Hạ nhiệt độ chậm

Tr°ång hāp sinh sáng đầu tiên từ noãn trā l¿nh bằng ph°¢ng pháp h¿ nhiát đá chÃm đ°āc báo cáo vào nm 1986 [38] Trong ph°¢ng pháp này, tr°ãc khi giÁm nhiát đá tÁ bào xuáng d°ãi 0oC, noãn s¿ đ°āc cho tiÁp xúc vãi môi tr°ång có chća CPA nßng đá 1,0-1,5 mol/L đÅ làm mÃt n°ãc nái bào Ng°åi

ta chß sÿ dăng mát chÃt bÁo vá đông l¿nh nh° propanediol (PROH), dimethylsulfoxide (DMSO) hay ethylene glycol Do tính thÃm qua màng cąa n°ãc cao h¢n CPA nên n°ãc ra khßi tÁ bào nhanh h¢n CPA đi vào tÁ bào khiÁn ban đầu thÅ tích tÁ bào giÁm sau đó s¿ phăc hßi dần dần l¿i Giai đo¿n mÃt n°ãc thć hai dißn ra khi cho noãn tiÁp xúc vãi môi tr°ång có CPA ban đầu kÁt hāp vãi mát sá CPA không có khÁ nng thÃm qua màng tÁ bào, th°ång là sucrose hay các oligosaccharide khác Sau đó noãn đ°āc làm l¿nh xuáng d°ãi 0oC

æ nhiát đá -30oC đÁn -40oC, khi n°ãc nái bào đã gần nh° đ°āc lo¿i bß

và hầu hÁt n°ãc ngo¿i bào đã chuyÅn thành tinh thÅ đá, noãn và dăng că chća

đ°āc nhúng trăc tiÁp vào ni t¢ lßng và l°u giā ç nhiát đá -196oC Quá trình rã đông nên đ°āc tiÁn hành ç tác đá cao đÅ h¿n chÁ să lãn lên cąa các tinh thÅ đá nái bào đÁn kích th°ãc có thÅ làm tán th°¢ng tÁ bào noãn Quá trình rã đông noãn dißn ra vãi nguyên lý hoàn toàn ng°āc l¿i trā l¿nh, trong đó, quá trình bù n°ãc phÁi dißn ra theo từng b°ãc mát vãi nßng đá CPA giÁm dần Trong thåi gian qua, nhiÃu nghiên cću đ°āc thăc hián nhằm cÁi thián hiáu quÁ cąa trā l¿nh noãn Nm 2001, Fabbri và cáng să cho thÃy nÁu tng nßng đá sucrose lên 0,3

M và tng thåi gian tiÁp xúc cąa noãn vãi môi tr°ång trā l¿nh lên 15 phút thì

tß lá sáng sau rã đông cÁi thián đáng kÅ (82% so vãi 60%, p<0,05) [39]

1.3.2.2 Thuỷ tinh hoá

Tr°ång hāp có thai và sinh sáng đầu tiên từ noãn trā l¿nh bằng thąy tinh hóa đ°āc báo cáo vào nm 1999 [40] Thąy tinh hóa dăa vào khÁ nng làm l¿nh căc nhanh thông qua să tiÁp xúc trăc tiÁp cąa môi tr°ång thąy tinh hóa (chća CPA nßng đá cao) vãi ni t¢ lßng Tuy nhiên, đÅ đ¿t đ°āc tr¿ng thái này, tác đá

làm l¿nh phÁi rÃt nhanh và nßng đá CPA tng đáng kÅ so vãi ph°¢ng pháp h¿ nhiát đá chÃm Các CPA sÿ dăng trong ph°¢ng pháp thąy tinh hóa cũng t°¢ng

tă ph°¢ng pháp h¿ nhiát đá chÃm Tuy nhiên, do nßng đá CPA cao nên ng°åi

ta °u tiên chãn CPA có đác tính thÃp và thÃm qua màng tÁ bào tát Ethylene glycol trç thành thành phần chu¿n trong phác đß trā l¿nh bằng ph°¢ng pháp thąy tinh hóa, đßng thåi phái hāp vãi mát hay hai CPA không thÃm qua màng

tÁ bào khác đÅ làm giÁm đác tính cąa từng lo¿i CPA nÁu sÿ dăng riêng lẻ CPA không thÃm màng th°ång đ°āc chãn là sucrose [41]

Mát cách khác đÅ h¿n chÁ tán th°¢ng do đác tính cąa CPA là cho noãn tiÁp xúc vãi môi tr°ång có nßng đá CPA tng dần Môi tr°ång thć nhÃt th°ång

có nßng đá CPA 20-50% so vãi môi tr°ång thć hai Noãn tiÁp xúc vãi môi tr°ång thć nhÃt khoÁng 5-15 phút và vãi môi tr°ång thć hai từ vài chăc giây đÁn mát phút tr°ãc khi môi tr°ång và noãn đ°āc nhúng trăc tiÁp vào ni t¢ lßng Tuy thåi gian tiÁp xúc vãi môi tr°ång ngắn, nh°ng do nßng đá th¿m thÃu cąa môi tr°ång cao đą đÅ kéo n°ãc ra khßi tÁ bào, tránh hình thành tinh thÅ đá nái bào MÁt khác, thåi gian tiÁp xúc ngắn giúp h¿n chÁ CPA vào tÁ bào, làm giÁm đác tính và các khó khn trong viác lÃy CPA ra khßi tÁ bào trong quá trình rã đông [42]

Hiáu quÁ cąa mát chu kỳ trā l¿nh – rã đông noãn có thÅ đ°āc đánh giá qua tß lá noãn sáng sau rã đông, tß lá t¿o phôi, tß lá mang thai và trong điÃu kián

lý t°çng là tß lá trẻ sinh sáng Nm 2006, Oktay và cáng să đã tiÁn hành mát phân tích gáp đÅ so sánh hiáu quÁ cąa h¿ nhiát đá chÃm so vãi thąy tinh hóa trong trā l¿nh noãn ng°åi, các sá liáu ban đầu cho thÃy thąy tinh hóa có khÁ nng cÁi thián c¢ hái thành công [43] Trong mát nghiên cću ngÁu nhiên có nhóm chćng, Cao và cáng să cho thÃy să khác biát có ý ngh*a tháng kê và tß lá noãn sáng sau rã đông giāa hai nhóm noãn trā l¿nh bằng h¿ nhiát đá chÃm và thąy tinh hóa (61% so vãi 91,8%, p<0,01) [44] Tß lá thă tinh ç hai nhóm là t°¢ng đ°¢ng nh°ng tß lá phôi phân chia ç nhóm h¿ nhiát đá chÃm là 54,4%, thÃp h¢n so vãi 78% ç nhóm thąy tinh hóa KÁt quÁ cũng cho thÃy tß lá phôi có chÃt l°āng tát và tß lá hình thành phôi nang cao h¢n đáng kÅ ç nhóm sÿ dăng ph°¢ng pháp thąy tinh hóa khi trā l¿nh Mát báo cáo cąa Cobo và cáng să nm

2010 cho thÃy trên 50% các trung tâm IVF t¿i Mỹ có triÅn khai th°ång quy trā l¿nh noãn, trong đó khoÁng 2/3 chu kỳ là thąy tinh hóa [45] Vãi lāi thÁ và hiáu quÁ cao h¢n cũng nh° chi phí ban đầu thÃp, thąy tinh hóa đang ngày càng đ°āc khuyÁn khích áp dăng trong trā l¿nh, nhÃt là trā l¿nh noãn

1.3.3 Các nghiên cću vÁ tác đáng cąa quá trình trā rã đßi vãi noãn

 Tiếp xúc với tác động của CPA và sốc thẩm thấu

dăng că l°u trā, các ph°¢ng pháp h¿ nhiát đá, bÁo quÁn và rã đông đã đ°āc đà cÃp và bàn luÃn [41] Các quy trình này khác nhau và nßng đá và đá pha loãng các lo¿i chÃt bÁo quÁn l¿nh (EG, DMSO, propylene glycol-PrOH, sucrose và trehalose) [46]

Cho đÁn nay, mát trong nhāng quy trình đ°āc sÿ dăng nhiÃu nhÃt đÅ thąy tinh hóa tÁ bào trćng ç ng°åi là să kÁt hāp cąa 15% DMSO (2,1 M), 15% EG (2,7 M) và 0,5 M sucrose (hoÁc trehalose) trong thÅ tích tái thiÅu (1 μl) [47], và nhāng thay đái và đá th¿m thÃu căc đ¿i gÁp phÁi trong quá trình tiÁp xúc và lo¿i bß CPA đ°āc sÿ dăng trong quá trình thąy tinh hóa và rã đông có thÅ đ°āc

dă đoán tr°ãc Trong quy trình bÁo quÁn l¿nh này, să thay đái áp suÃt th¿m thÃu có thÅ thay đái từ 280 mOsM (đá th¿m thÃu cąa môi tr°ång nuôi cÃy) sang

2700 mOsM (đá th¿m thÃu cąa dung dách cân bằng) trong pha cân bằng Đá th¿m thÃu tng lên đáng kÅ lên đÁn 5600 mOsM cąa dung dách thąy tinh hóa

tr°ãc khi tÁ bào trćng đ°āc đ°a dăng că chća và nhúng vào nit¢ lßng Trong quá trình làm Ãm, nhāng thay đái th¿m thÃu đát ngát đ°āc đÁo ng°āc, vãi să pha loãng nhanh chóng từ 5600 mOsM đÁn 1280 mOsM trong dung dách rã đông và sau đó là hai b°ãc khÿ CPA thay thÁ bằng phân tÿ n°ãc vãi áp suÃt th¿m thÃu lần l°āt là 780 mOsM và 280 mOsM Trong suát quá trình làm l¿nh – rã đông, màng tÁ bào cąa tÁ bào trćng phÁi có đą đá bÃn đÅ cháu đ°āc să th¿m thÃu hai chiÃu cąa dung dách qua màng tÁ bào mát cách đát ngát Viác thąy tinh hóa tÁ bào trćng có thÅ thăc hián đ°āc phần lãn là do tÁ bào trćng có thÅ cháu đ°āc să dách chuyÅn chÃt lßng m¿nh và nhanh mà không bá xÃp xuáng

Cũng quan trãng nh° các lo¿i CPA, các điÃu kián tiÁp xúc vãi CPA có thÅ Ánh h°çng đÁn chćc nng và khÁ nng sáng sót cąa tÁ bào, vãi các yÁu tá nh° nßng đá, nhiát đá tiÁp xúc và thåi gian tiÁp xúc là các biÁn sá quan trãng Tuy nhiên, không phÁi tÃt cÁ CPA đÃu ho¿t đáng tát nh° nhau đái noãn

vãi kích th°ãc và tính thÃm đÁc biát cąa màng tÁ bào trćng cũng nh° đác tính cąa CPA Sÿ dăng duy nhÃt mát chÃt bÁo quÁn l¿nh th¿m thÃu vãi nßng đá cao

có thÅ gây chÁt tÁ bào [48] ĐÅ lo¿i bß nhāng tác đáng tiêu căc từ CPA, mát sá ph°¢ng pháp đã đ°āc triÅn khai và tích hāp vào các quy trình thąy tinh hóa tÁ bào trćng NhiÃu chÃt bÁo quÁn l¿nh đã đ°āc sÿ dăng kÁt hāp ç nßng đá thÃp h¢n đÅ cÁi thián đác tính cąa từng chÃt bÁo quÁn l¿nh đßng thåi đ¿t đ°āc dung dách có đá nhãt cao Hián nay, ph°¢ng pháp thąy tinh hóa tÁ bào trćng ç ng°åi đ°āc sÿ dăng nhiÃu nhÃt là sÿ dăng kÁt hāp EG và DMSO đÅ đ¿t đ°āc nßng

đá thÃp nhÃt cần thiÁt từ mßi CPA riêng lẻ [49-51]

 Thay đổi siêu cấu trúc

thay đái và siêu cÃu trúc sau quá trình thąy tinh hóa – rã đông trong tÁ bào trćng

ç giai đo¿n kỳ giāa II Nhāng thay đái và siêu cÃu trúc chą yÁu liên quan đÁn viác tng không bào, m¿ng l°ãi nái chÃt tr¢n cąa ty thÅ (M-SER) kÁt hāp vãi phćc hāp ty thÅ-túi (MV) và các h¿t vß (CG) [52] Không bào xuÃt hián trong

tÁ bào trćng sau thąy tinh hóa cũng có thÅ đ°āc t¿o ra từ ty thÅ bá biÁn đái, s°ng tÃy hoÁc từ să hāp nhÃt cąa các CG thoái hóa, liên quan đÁn să mÃt đi đáng kÅ hàm l°āng h¿t đÃm đÁc electron Không bào ngo¿i vi cũng có thÅ bắt ngußn từ

să xâm lÃn cąa noãn bào và/hoÁc căm túi nái bào hình thành trong vß tÁ bào trćng, bçi nó chß xuÃt hián ç tÁ bào trćng khi tiÁp xúc vãi chÃt bÁo quÁn l¿nh

[53] Không bào cũng hián dián trong các tÁ bào trćng quá tr°çng thành hoÁc trćng thoái hóa, trong khi ç các tÁ bào trćng tr°çng thành t°¢i có rÃt ít hoÁc hầu nh° không có không bào Do đó, să xuÃt hián cąa không bào trong tÁ bào trćng thąy tinh hóa có thÅ đ°āc coi là mát d¿ng tán th°¢ng cÃu trúc nh° mát phÁn ćng không đÁc hiáu cąa tÁ bào trćng đái vãi tán th°¢ng l¿nh và/hoÁc áp suÃt th¿m thÃu

Các liên kÁt táng hāp đ°āc xác đánh rõ ràng giāa ty thÅ và màng tÁ bào chÃt đ°āc tìm thÃy mát cách đÁc tr°ng trong tÁ bào trćng tr°çng thành ç ng°åi,

có thÅ điÃu chßnh nßng đá canxi và sÁn xuÃt ATP cąa ty thÅ, do đó có khÁ nng góp phần điÃu chßnh các đ°ång dÁn truyÃn tín hiáu phă thuác canxi khi thă tinh

M-SER và phćc hāp MV có thÅ dÁn đÁn giÁm khÁ nng thă tinh cąa tÁ bào trćng Vì cÁ tÃp hāp M-SER và phćc hāp MV đÃu có thÅ biÁn đái lÁn nhau nên đây là mát quá trình tái cÃu trúc màng đáng rÃt nh¿y cÁm vãi nhāng thay đái cąa môi tr°ång [57] TÁ bào trćng ng°åi sau khi thąy tinh hóa th°ång xuÃt hián các tÃp hāp M-SER điÅn hình, t°¢ng tă và kích th°ãc, hình d¿ng và vá trí vãi các kÁt quÁ quan sát đ°āc trong đái chćng mãi

Các CG là các bào quan có màng bao quanh, có ngußn gác từ Golgi, đ°āc hình thành trong giai đo¿n đầu cąa quá trình phát triÅn tÁ bào trćng và chća glycosaminoglycan, protease, axit phosphatase và peroxidase Khi thă

(PVS), dÁn đÁn să cćng l¿i cąa màng trong suát (ZP) giúp ćc chÁ să xâm nhÃp cąa nhiÃu tinh trùng vào tÁ bào trćng cùng mát lúc Să chuyÅn tiÁp canxi khi thă tinh có liên quan đÁn viác kích ho¿t phÁn ćng táng hāp CG vãi tÁ bào trćng, dÁn đÁn giÁi phóng CG vào PVS Să giÁi phóng CG sãm đã đ°āc phát hián trong quá trình thąy tinh hóa-rã đông và điÃu này chß ra rằng viác kích ho¿t tÁ bào trćng sãm có thÅ xÁy ra sau quá trình bÁo quÁn l¿nh [54]

 Tác động tới trục tế bào trứng

Trăc giÁm phân căc kỳ nh¿y cÁm vãi nhiát đá thÃp Trong quá trình bÁo quÁn l¿nh tÁ bào trćng, trăc noãn bào không chß tiÁp xúc vãi nhiát đá thÃp mà còn có thÅ bá h° hßng do să hình thành các tinh thÅ bng Trong mô hình thí nghiám trên chuát, ng°åi ta đã chß ra rằng quá trình thąy tinh hóa có thÅ làm xáo trán chćc nng điÅm kiÅm tra să lắp ráp trăc chính trong tÁ bào trćng cąa

chuát thông qua viác kích ho¿t lysome cathepsin B [58] Mát sá nghiên cću

cÁm vãi nhiát đá thÃp bçi să khÿ polyme nhanh chóng khi tiÁp xúc vãi nhiát

đá d°ãi mćc sinh lý [59-61]

 Noãn tự hoạt hoá

Nguy c¢ tiÃm ¿n vãi viác bÁo quÁn l¿nh tÁ bào trćng là gây ra hián t°āng kích ho¿t tÁ bào trćng Să thă tinh bắt đầu từ điÅm tinh trùng xâm nhÃp và lan

phần lãn là do să giÁi phóng các ion canxi từ ngußn dă trā bên trong tÁ bào,

trùng không thÅ liên kÁt hoÁc duy trì liên kÁt vãi tÁ bào trćng Tuy nhiên, nÁu

yÁu tá môi tr°ång, nó có thÅ gây ra tă ho¿t hóa khiÁn tÁ bào trćng không thÅ thă tinh T°¢ng tă nh° vÃy, các chÃt bÁo quÁn l¿nh th°ång đ°āc sÿ dăng trong quá trình thąy tinh hóa, DMSO và EG, có thÅ gây ra să gia tng lãn và nßng đá canxi nái bào trong tÁ bào trćng tr°çng thành cąa chuát [62]

 Tính toàn vẹn của deoxyribonucleic acid (DNA)

MÁc dù hầu hÁt các ph°¢ng pháp thąy tinh hóa tÁ bào trćng thành công đÃu yêu cầu sÿ dăng nßng đá CPA cao, nh°ng mát sá hāp chÃt CPA này có thÅ

tă gây ra tác dăng đác h¿i, chẳng h¿n nh° tán th°¢ng DNA Ba CPA th°ång đ°āc sÿ dăng trong ph°¢ng pháp thąy tinh hóa là EG, DMSO và PrOH đã đ°āc đánh giá và tác dăng gây đác gen trong tÁ bào soma và tÁ bào trćng Ng°åi ta

đã chćng minh rằng nßng đá PrOH cao (7,5 và 15%) gây ra tán th°¢ng DNA đáng kÅ ç tÁ bào trćng chuát bÃt kÅ thåi gian tiÁp xúc vãi CPA [63] Quá trình thąy tinh hóa tÁ bào trćng bằng PrOH gây ra tán th°¢ng DNA nhiÃu h¢n đáng

kÅ so vãi các ph°¢ng pháp thąy tinh hóa EG và/hoÁc DMSO [63] Các c¢ chÁ gây ra đác tính gen cąa các chÃt bÁo quÁn l¿nh vÁn đang đ°āc xác đánh và do

đó chúng ta nên thÃn trãng khi chãn CPA cho quá trình thąy tinh hóa tÁ bào trćng cho đÁn khi có thêm nghiên cću và đác tính CPA và đánh giá dài h¿n

 Sự cứng lại của màng ZP sau quá trình đông rã

Mát vÃn đà tiÃm ¿n hián nay vãi đông l¿nh tÁ bào trćng là gây ra mát să kián kích ho¿t, làm cćng màng trong suát, có thÅ Ánh h°çng đÁn quá trình làm

tá Să cćng l¿i cąa ZP đ°āc t¿o ra do să kÁt hāp cąa các h¿t vß vãi màng tÁ bào và giÁi phóng các thành phần cąa chúng vào các lãp màng trong cąa màng trong suát Să hāp nhÃt màng tÁ bào phă thuác vào canxi và th°ång đ°āc kích ho¿t bçi să gia tng canxi nái bào đ°āc bắt đầu bçi să hāp nhÃt giāa tinh trùng

và trćng Sau khi xâm nhÃp vào noãn bào, tinh trùng kích ho¿t mát lo¿t dao đáng canxi Să gia tng canxi làm cho các h¿t vß não hāp nhÃt vãi màng sinh chÃt và giÁi phóng các thành phần cąa chúng vào các lãp màng trong cąa ZP [64] Các enzym phân giÁi protein nhắm vào các protein liên kÁt vãi tinh trùng

đÅ ngn không cho tinh trùng tiÁp tăc thă tinh vãi trćng Kỹ thuÃt tiêm tinh

trùng vào tÁ bào chÃt (ICSI) có thÅ khắc phăc să cćng l¿i cąa màng ZP, nh°ng thăc tÁ là trćng đã trÁi qua phÁn ćng h¿t vß cho thÃy tÁ bào trćng đã đ°āc kích ho¿t nhân t¿o tr°ãc khi thă tinh thăc să

 Tác động của quá trình thủy tinh hóa tế bào trứng đến biểu hiện gen

Các mô hình nghiên cću trên bò và lān tÃp trung vào các yÁu tá chÁt theo chu trình, biÅu hián cąa gen BAX tiÃn chÁt theo chu trình hầu hÁt đ°āc điÃu

chßnh tng lên và gen BCL2 cháng chÁt theo chu trình đ°āc điÃu hòa giÁm sau quá trình thąy tinh hóa tÁ bào trćng tr°çng thành [65-67] Tuy nhiên, mát sá nghiên cću chß ra không tìm thÃy să khác biát trong biÅu hián gen liên quan đÁn

chÁt theo chu trình sau quá trình rã đông bằng ph°¢ng pháp thąy tinh hóa

Trong các mô hình nghiên cću trên bò, mát nghiên cću gần đây đã báo cáo să biÅu hián quá mćc cąa gen Eg5 liên quan đÁn phân chia tÁ bào và gen p53 liên quan đÁn tÁ bào chÁt theo lÃp trình [68], trong khi mát nghiên cću khác

mô tÁ să giÁm biÅu hián cąa CD9 sau quá trình thąy tinh hóa, có khÁ nng dÁn đÁn khÁ nng thă tinh giÁm

1.4 CÁC NGHIÊN CĆU ĐÁNH GIÁ TÁC ĐàNG CĄA QUÁ TRÌNH

TR Ā RÃ ĐÞI VâI K¾T QUÀ PHÔI HâC VÀ LÂM SÀNG

1.4.1 K¿t quÁ phôi hãc

nng phát triÅn cąa noãn trā l¿nh bằng ph°¢ng pháp thuỷ tinh hoá cho kÁt quÁ

tß lá noãn sáng sau rã đông 89,09%, tß lá thă tinh 71,28%, tß lá phôi tát ngày 3

là 38,71% [7] Mát nghiên cću khác cąa Lê Thuỵ Hßng KhÁ và cáng să (2020)

báo cáo kÁt quÁ đông l¿nh noãn ç bánh nhân điÃu trá thă tinh trong áng nghiám

vãi tß lá noãn sáng sau rã đông đ¿t 95,59 ± 13,60%, tß lá thă tinh 78,96 ± 24,88% [8]

Hầu hÁt các nghiên cću và hiáu quÁ cąa quá trình thąy tinh hóa tÁ bào trćng đã đ°āc thăc hián bằng cách sÿ dăng trćng cąa ng°åi hiÁn tÁng vãi chÃt l°āng trćng đ°āc mong đāi là gần tái °u RÃt ít nghiên cću sÿ dăng tÁ bào trćng tă thân đÅ so sánh các chu kỳ đ°āc thăc hián vãi trćng t°¢i và thąy tinh hóa KÁt quÁ là, chúng ta biÁt rÃt ít và kÁt quÁ thąy tinh hóa khi sÿ dăng tÁ bào trćng tă thân ç bánh nhân vô sinh Tuy nhiên, mát nghiên cću từ Ý d°ång nh° cũng có kÁt quÁ t°¢ng tă vãi tÁ bào trćng đ°āc thąy tinh hóa Trong giai đo¿n

tÁ bào trćng [69] Chß ba tÁ bào trćng có thÅ đ°āc thă tinh trong các chu kỳ IVF mãi, nên các tÁ bào trćng d° phÁi đ°āc bÁo quÁn l¿nh đÅ sÿ dăng sau hoÁc lo¿i

bß H¿n chÁ pháp lý này đã t¿o ra c¢ hái tă nhiên đÅ so sánh kÁt quÁ cąa tÁ bào trćng t°¢i và đông l¿nh phát sinh từ mát lần lÃy tÁ bào trćng và đ°āc thă tinh vãi cùng mát ngußn tinh trùng Nm 2010, Ubaldi và cáng să đã tiÁn hành mát nghiên cću thuần tÃp theo chiÃu dãc trong t°¢ng lai bằng cách sÿ dăng tß lá thai dißn tiÁn cáng dßn thu đ°āc bằng cách thă tinh noãn t°¢i và noãn thąy tinh hóa

từ cùng mát đoàn há làm th°ãc đo cho kÁt quÁ chính Các tác giÁ kÁt luÃn rằng

thąy tinh hóa không có Ánh h°çng rõ rát đÁn khÁ nng phát triÅn in vitro, phát

biÅu dăa trên kÁt quÁ và tß lá thă tinh và tß lá noãn phát triÅn thành phôi chÃt l°āng tát giāa noãn t°¢i và noãn rã đông không có să khác biát có ý ngh*a tháng kê [51]

ĐiÃu quan trãng khi nghiên cću Ánh h°çng cąa quá trình thąy tinh hóa

lâm sàng cąa quá trình, ngo¿i trừ kỹ thuÃt thąy tinh hóa Bên c¿nh đó, mát sá yÁu tá có thÅ Ánh h°çng đÁn să phát triÅn cąa phôi và kÁt quÁ lâm sàng, bao gßm chÃt l°āng cąa giao tÿ (do tuái mÃ, kích thích bußng trćng, chÃt l°āng và

ngußn gác tinh trùng) Nm 2013, Chang và cáng să báo cáo kÁt quÁ nghiên

cću điÃu tra tác đáng cąa quá trình thąy tinh hóa ç nhāng bánh nhân vô sinh vãi đá tuái mà từ trung bình đÁn cao (30–39 tuái) [70] Nhāng ng°åi tham gia

đã đßng ý thąy tinh hóa mát nÿa sá tÁ bào trćng cąa hã và sÿ dăng nÿa còn l¿i (tÁ bào trćng anh chá em) làm nhóm đái chćng t°¢i Các tÁ bào trćng đ°āc thąy

tinh hóa và rã đông trong vòng <30 phút, đÁm bÁo điÃu kián thă tinh và nuôi

cÁ điÃu kián và chÃt l°āng trćng, tinh trùng, thåi điÅm thu hßi trćng, tinh trùng đ°āc thăc hián trong cùng mát ngày, các thao tác vãi phôi và giao tÿ đ°āc kiÅm soát theo tiêu chu¿n đÅ đÁm bÁo să đßng bá khi so sánh hai nhóm Do tß lá thoái hoá sau rã đông gần 20%, các tác giÁ đã báo cáo các kÁt quÁ lâm sàng là hàm

sá cąa sá l°āng tÁ bào trćng ban đầu tr°ãc khi đông l¿nh chć không phÁi là hàm sá cąa sá l°āng tÁ bào trćng sáng sót sau rã đông Cách tiÁp cÃn này ngn chÁn să thiên vá đái vãi noãn thąy tinh hóa bằng cách đ°a các noãn thoái hoá sau rã đông vào mÁu sá MÁc dù cách tính toán này đã t¿o ra xu h°ãng tß lá thă tinh cao h¢n ç nhóm t°¢i, tß lá thă tinh và phát triÅn phôi vÁn có thÅ so sánh và mÁt tháng kê giāa nhóm t°¢i và thąy tinh hóa KÁt quÁ cho thÃy să thă tinh và phát triÅn phôi sãm (đ°āc xác đánh bằng tß lá phôi chÃt l°āng tát ç ngày thć 3

đáng tiêu căc tiÃm tàng cąa quá trình thąy tinh hóa lên tÁ bào trćng có thÅ đ°āc giÁm thiÅu

1.4.2 K¿t quÁ sÁn khoa và chu sinh

MÁc dù, thąy tinh hóa là mát cÁi tiÁn đáng kÅ so vãi đông l¿nh chÃm và hiáu quÁ bÁo quÁn l¿nh tÁ bào trćng tă thân [51, 70], vÁn ch°a biÁt liáu quá trình thąy tinh hóa có gây ra tán th°¢ng lâu dài hay không, biÅu hián ç sćc khoẻ

thành <tiêu chu¿n vàng= trong ch°a đầy mát thÃp kỷ và không có nghiên cću

có bÃt kỳ dā liáu nào và să phát triÅn cho đÁn tuái tr°çng thành Phân tích kÁt quÁ chu sinh cũng nh° să phát triÅn lâu dài cąa trẻ sinh ra là cần thiÁt đÅ lo¿i trừ bÃt kỳ tác đáng bÃt lāi nào đái vãi trẻ sinh sáng Nm 2014, Cobo và cáng

să đã báo cáo mát nghiên cću vãi mát nhóm sá l°āng lãn trẻ em đ°āc sinh ra sau khi sÿ dăng tÁ bào trćng thąy tinh hóa (1027 trẻ từ 804 tr°ång hāp mang thai) và tÁ bào trćng t°¢i (1224 trẻ từ 996 tr°ång hāp mang thai) [71] KÁt quÁ khÁ quan khi không có să gia tng các kÁt quÁ bÃt lāi và sÁn khoa và chu sinh

ç trẻ đ°āc thă tinh bằng tÁ bào trćng thąy tinh hoá khi so sánh vãi tÁ bào trćng t°¢i Viác theo dõi lâu dài nhāng đća trẻ sinh ra từ tÁ bào trćng thąy tinh hóa

vÁn cần thiÁt đÅ thiÁt lÃp să an toàn chung cąa quy trình Quá trình thąy tinh hóa trćng không nhāng không Ánh h°çng xÃu đÁn să phát triÅn và sćc khße cąa con cái sau giai đo¿n s¢ sinh mà còn cho thÃy să phát triÅn hoàn thián và tinh thần và thÅ chÃt cąa trẻ đ°āc so sánh vãi dā liáu cąa nhóm tham khÁo trong nghiên cću sau quá trình 6 nm theo dõi [72]

Ch°¢ng 2 ĐÞI T¯ĀNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU 2.1 ĐÞI T¯ĀNG NGHIÊN CĆU

Bánh nhân thăc hián thă tinh trong áng nghiám t¿i Bánh vián Quác tÁ SÁn Nhi HÁi Phòng trong giai đo¿n 05/2021 – 08/2023 đáp ćng các tiêu chu¿n lăa chãn và tiêu chu¿n lo¿i trừ

2.1.1 Tiêu chuẩn lăa chãn

 Bánh nhân có hß s¢ bánh án l°u trā đầy đą thông tin,

 Bánh nhân có noãn rã đông đ°āc t¿o phôi t¿i cùng thåi điÅm vãi noãn t°¢i ç chu kỳ chãc hút noãn t°¢i sau cùng,

 Bánh nhân có kÁt quÁ sàng lãc bÃt th°ång sá l°āng nhißm sắc thÅ ç phôi giai đo¿n tiÃn làm tá (PGT-A),

 CÁp vā chßng có kÁt quÁ karyotype bình th°ång và không mắc các bánh

lý tâm thần, tim m¿ch

2.1.2 Tiêu chuẩn lo¿i trĉ

 Bánh nhân thăc hián thă tinh bằng ph°¢ng pháp IVF cá điÅn,

 CÁp vā chßng vô sinh do yÁu tá nam giãi: tinh trùng đ°āc thu nhÃn từ thą thuÃt, tinh dách đß kÁt luÃn SOAT [73],

 Bánh nhân xin tinh trùng, noãn, phôi,

 Bánh nhân có đông phôi ngày 3,

 Bánh nhân không đáp ćng các tiêu chu¿n lăa chãn

2.1.3 Thi¿t k¿ nghiên cću

 Nghiên cću hßi cću: Sá liáu nghiên cću đ°āc thu thÃp sau khi bánh nhân

đã kÁt thúc chu kỳ điÃu trá Các thông sá và kÁt quÁ điÃu trá thă tinh trong áng nghiám bao gßm sá l°āng trćng t°¢i, sá l°āng trćng sáng sau rã đông, sá l°āng phôi ngày 3, sá l°āng phôi nang, sá l°āng phôi đ°āc sàng

lãc di truyÃn đ°āc hßi cću thông qua PhiÁu táng kÁt phôi cuái chu kỳ thă

tinh trong hß s¢ bánh nhân KÁt quÁ sàng lãc bÃt th°ång nhißm sắc thÅ đ°āc thu thÃp thông qua PhiÁu kÁt quÁ phân tích ADN trong hß s¢ bánh nhân Các thông sá và đÁc điÅm ng°åi mà đ°āc hßi cću thông qua PhiÁu khám sćc khoẻ sinh sÁn nā trong hß s¢ bánh án

 Mô tÁ cắt ngang: Nghiên cću cắt ngang từ tháng 05/2021 đÁn tháng 08/2023 TÃt cÁ bánh nhân thăc hián thă tinh vãi noãn t°¢i và noãn rã tă thân trong khoÁng thåi gian trên đ°āc đ°a vào nghiên cću Mßi chu kỳ

thă tinh đ°āc thu thÃp thông tin mát lần duy nhÃt vào thåi điÅm hßi cću

hß s¢ bánh án và không theo dõi xuôi theo thåi gian

2.1.4 Cÿ m¿u và chãn m¿u

Tß lá thă tinh trung bình cąa noãn trā - rã đ°āc sÿ dăng tính cÿ mÁu là

mát biÁn đánh l°āng Do đó, công thćc cąa Yamane [74] đ°āc sÿ dăng đÅ °ãc tính cÿ mÁu cho mát giá trá trung bình vãi đá chính xác tuyát đái

Sÿ dăng công thćc tính cÿ mÁu:

p: Tß lá phôi nang lách bái nhißm sắc thÅ

d: Sai sá tuyát đái cho phép

Đá chính xác tuyát đái (p) đ°āc sÿ dăng là tß lá thă tinh trung bình cąa noãn trā - rã trong nghiên cću cąa Joseph O Doyle và cáng să (2016) vãi giá

trá là 0,695 [11] Sÿ dăng đá tin cÃy 95% và sai sá tuyát đái là 5% Theo tính toán, cÿ mÁu tái thiÅu cho nghiên cću đánh giá kÁt quÁ thă tinh trong áng nghiám và kÁt quÁ sàng lãc bÃt th°ång sá l°āng nhißm sắc thÅ ç phôi giai đo¿n tiÃn làm tá trên nhóm đái t°āng trā l¿nh noãn là 76 noãn rã

Trong giai đo¿n từ tháng 05/2021 đÁn 08/2023, nghiên cću cąa tôi ghi nhÃn đ°āc 83 chu kỳ t¿o phôi vãi noãn rã đông và thăc hián sinh thiÁt phôi có kÁt quÁ PGT-A phù hāp vãi tiêu chu¿n lăa chãn (Xem Hình 2.1) Nh° vÃy, sá l°āng noãn rã đông trong nghiên cću này đã đÁm bÁo cÿ mÁu tái thiÅu

Hình 2.1 S¢ đß lăa chãn mÁu trong nghiên cću

2.2 HOÁ CHÂT VÀ THI¾T Bà

2.2.1 Hoá chÃt

 Hoá chÃt thao tác vãi giao tÿ, phôi [75]

 Hoá chÃt tách noãn khßi phćc hāp OCC [76]

 Hoá chÃt nuôi cÃy phôi [77]

 Hóa chÃt sinh thiÁt phôi và rÿa phôi bào

 Hoá chÃt đông và rã phôi noãn có chća các chÃt bÁo quÁn l¿nh (CPA)

2.2.2 VÁt t°, thi¿t bá

 Há tháng tą nuôi cÃy tích hāp camera theo dõi phôi liên tăc (timelapse)

 Há tháng kính hiÅn vi đÁo ng°āc và bá vi tiêm đ ICSI và sinh thiÁt phôi

 Tą thao tác IVF có bà mÁt gia nhiát Astec – NhÃt BÁn AITT có gắn kính hiÅn vi soi nái SMZ1270 NIKON NhÃt BÁn sÿ dăng cho quy trình trā rã phôi, noãn và quy trình rÿa phôi bào sau sinh thiÁt phôi

 Các vÃt t° trong IVF: áng đáy tròn, áng đáy nhãn, đ*a petri các kích th°ãc, đ*a timelapse, đ*a 4 giÁng, đầu côn có màng lãc, áng effendorf&

B°ãc 2 Quy trình trā l¿nh bắt đầu vãi noãn đ°āc cân bằng trong môi tr°ång

ES chća 7% EG (ethylene glycol), 7% DMSO (dimethyl sulfxide) trong tái đa 15 phút tr°ãc khi đ°āc chuyÅn sang môi tr°ång thuỷ tinh hoá (VS) chća 14.5% EG, 14.5% DMSO, 0.5 M trehalose trong tái

đa 90 giây Noãn đ°āc chuyÅn lên dăng că chća Cryotec vãi thÅ tích môi tr°ång tái thiÅu và nhúng trăc tiÁp vào háp xáp chća ni t¢ lßng

và đ°āc l°u giā trong bình l°u trā mÁu

2.3.2 Ph°¢ng pháp rã đông noãn/phôi

B°ãc 1 Quy trình rã đông đ°āc thăc hián vãi môi tr°ång rã (TS) chća 1.0 M

trehalose đ°āc làm Ãm đÁn 37oC ít nhÃt 1 giå

B°ãc 2 Nhúng thÃt nhanh cãng phôi/noãn từ ni t¢ lßng vào TS cho tãi khi

noãn trên cãng nái lên bà mÁt môi tr°ång Sau 1 phút, noãn/phôi đ°āc chuyÅn sang và giā trong môi tr°ång trung hoà (DS) chća 0.5

M trehalose trong 3 phút tr°ãc khi đ°āc chuyÅn sang môi tr°ång tráng (WS1) Noãn ç trong WS1 trong 5 phút và trong WS2 1 phút B°ãc 3 ChuyÅn noãn vào đ*a nuôi cÃy, đánh giá hình thái d°ãi kính hiÅn vi

2.3.3 Ph°¢ng pháp vi tiêm tinh và nuôi cÃy phôi

Tiêm tinh trùng vào bào t°¢ng noãn (ICSI) đ°āc thăc hián vãi noãn tr°çng thành (MII) sáng sót sau quá trình rã đông Noãn sau khi ICSI đ°āc nuôi cÃy liên tăc trong môi tr°ång đ¢n b°ãc trong tą nuôi cÃy 37oC sÿ dăng khí trán

có nßng đá 7% CO2, 5% O2

2.3.4 Ph°¢ng pháp đánh giá să phát triÃn cąa phôi

2.3.4.1 Đánh giá hợp tử vào ngày 1 (17±1 giờ sau ICSI)

Noãn thă tinh bình th°ång có hình cầu vãi 2 thÅ căc và 2 tiÃn nhân (pronuclei – PN) có màng bao riêng biát

2.3.4.2 Đánh giá phôi phân chia vào ngày 3 (68±1 giờ sau ICSI)

BÁng 2.1 Đánh giá hình thái và xÁp lo¿i chÃt l°āng phôi ngày 3

X¿p lo¿i Sß l°āng phôi bào (phôi bào) bào t°¢ng chÃt (%) Đá phân mÁnh

2.3.4.3 Đánh giá phôi nang vào ngày 5 (116±2 giờ sau thụ tinh)

ho ặc ngày 6 (140±2 giờ sau thụ tinh)

Phôi đ°āc đánh giá dăa trên đá nç ráng cąa khoang phôi, khái tÁ bào nă phôi (ICM) và lãp tÁ bào lá nuôi Sau khi chÃm điÅm 3 yÁu tá trên, phôi s¿ đ°āc xÁp thành 3 lo¿i dăa trên hình thái theo đßng thuÃn Alpha 2011 [12]:

 Lo¿i I: 3/4/5/6 AA, AB, BA

 Lo¿i II: 3/4/5/6 BB, AC, CA

 Lo¿i III: 3/4/5/6 CC, BC, CB

NÁu đá nç ráng khoang phôi f 2 thì chÃt l°āng phôi s¿ bá h¿ 1 bÃc

2.3.5 Ph°¢ng pháp sinh thi¿t phôi

Sinh thiÁt đ°āc tiÁn hành trên lãp tÁ bào lá nuôi (TE) vào ngày 5 hoÁc ngày 6 sau khi thă tinh Quy trình sinh thiÁt phôi đ°āc tiÁn hành vãi các b°ãc c¢ bÁn bao gßm: (1) sÿ dăng kính hiÅn vi đÁo ng°āc có gắn kèm bá vi thao tác

và há tháng laser đÅ ngắt 2-3 tÁ bào TE ra khßi phôi, (2) các tÁ bào TE sau khi sinh thiÁt đ°āc rÿa qua 3 giãt môi tr°ång đám tr°ãc khi đ°āc đÁt vào áng PCR, (3) các áng PCR chća phôi bào đ°āc ghi mã sinh thiÁt phôi, (4) vÃn chuyÅn các mÁu phôi bào tãi phòng xét nghiám di truyÃn đÅ thăc hián PGT-A [79]

2.3.6 ChuyÃn phôi trā đông

Bánh nhân s¿ đ°āc bác s* t° vÃn và đ°a ra quyÁt đánh lăa chãn phôi chuyÅn TiÁn hành rã phôi và chuyÅn vào tÿ cung cąa bánh nhân Theo dõi kÁt quÁ thă thai bằng xét nghiám máu đánh l°āng β-hCG Theo dõi thai kỳ bằng siêu âm

KÁt căc lâm sàng đ°āc ghi nhÃn bçi các biÁn sá sau [80] :

 Có thai: kÁt quÁ xét nghiám β-hCG d°¢ng tính (>25IU)

 Thai sinh hoá: không có túi thai trên hình Ánh siêu âm sau khi có

 Thai lâm sàng: xuÃt hián túi thai trên hình Ánh siêu âm

 Thai dißn tiÁn: thai phát triÅn đÁn tuần tuái thć 12

 Trẻ sinh sáng: trẻ sinh ra có dÃu hiáu cąa să sáng

2.3.7 Phân tích sß liÇu nghiên cću

2.3.7.1 Phương pháp thu thập số liệu

 ChÃt l°āng phôi, noãn đ°āc đánh giá bằng hình Ánh phôi từ tą nuôi cÃy Timelapse hoÁc quan sát trăc tiÁp d°ãi kính hiÅn vi đÁo ng°āc

 KÁt quÁ sàng lãc bÃt th°ång sá l°āng nhißm sắc thÁ (PGT-A) và kÁt quÁ thai trên hß s¢ bánh án t¿i Bánh vián Quác tÁ SÁn Nhi HÁi Phòng

 Các biÁn sá nghiên cću chính gßm: (1) Sá l°āng noãn trā đông, (2) Sá l°āng noãn sáng sau rã đông, (3) Sá l°āng noãn thă tinh, (4) Sá l°āng phôi hāu dăng, (5) KÁt quÁ PGT-A, (6) các yÁu tá ng°åi mà (tuái, thåi gian vô sinh, AMH, BMI

2.3.7.2 Phương pháp xử lý số liệu

Các sá liáu đ°āc mã hóa, thu thÃp và xÿ lý bằng phần mÃm SPSS 20.0 KiÅm đánh t-test đ°āc sÿ dăng đÅ so sánh các giá trá trung bình Sÿ dăng kiÅm đánh χ2 so sánh să khác biát giāa các tß lá ç hai nhóm noãn t°¢i và noãn rã bao gßm tß lá thă tinh, tß lá t¿o phôi ngày 3, tß lá t¿o phôi nang, tß lá phôi nguyên bái, tß lá phôi lách bái, tß lá phôi khÁm, tß lá có thai, tß lá thai sinh hoá, tß lá thai lâm sàng, tß lá thai dißn tiÁn, tß lá trẻ sinh sáng Vùng d°ãi đ°ång cong ROC (AUC) đ°āc sÿ dăng đÅ xác đánh giá trá cąa yÁu tá tiên l°āng và chß sá Youden

°ãc tính ch¿n đoán đÅ xác đánh ng°ÿng ch¿n đoán có hay không có phôi nang nguyên bái Tß suÃt chênh Odds ratio (OR) đánh giá mćc t°¢ng quan Các test

tháng kê đ°āc kiÅm đánh vãi să khác biát P < 0,05 đ°āc coi là có ý ngh*a tháng

kê Các tß lá đ°āc tính theo công thćc sau:

Tß lß thÿ tinh bình thường = Số lưÿng noãn đưÿc thÿ tinhSố lưÿng hÿp tử 2 PN

Tß lß có thai =

Số lưÿng ca

có kết qu¿ xét nghißm β − hCG dương (> 25IU)

Số chu kỳ chuyßn phôi

Tß lß thai sinh hóa = Số lưÿng ca �㔤þô�㔧ý có túi thai trên siêu âmSố chu kỳ chuyßn phôi

Tß lß thai lâm sàng = Số lưÿng ca có túi thai trên siêu âm Số chu kỳ chuyßn phôi

Tß lß thai dißn tiến = Số lưÿng ca thai có tuổi thai ≥ 12 tu¿n

Số chu kỳ chuyßn phôi

Tß lß trẻ sinh sống =

Số lưÿng ca

có ít nh¿t 1 trẻ sinh ra có d¿u hißu sự sống

Số chu kỳ chuyßn phôi

2.4 VÂN ĐÀ Đ¾O ĐĆC TRONG NGHIÊN CĆU

 Nghiên cću đ°āc să cho phép cąa lãnh đ¿o Khoa Hß trā Sinh sÁn, Bánh vián Quác tÁ SÁn Nhi HÁi Phòng và tuân theo các quy đánh và đ¿o đćc trong nghiên cću y sinh

 Các vn bÁn pháp lý, quy trình lâm sàng, cÃn lâm sàng đ°āc thăc hián theo đúng quy đánh cąa phát luÃt Viát Nam và thă tinh trong áng nghiám, sàng lãc phôi

 Bánh nhân đßng ý, tă nguyán ký đ¢n đà nghá thăc hián thă tinh áng nghiám, phiÁu đà nghá phân tích di truyÃn phôi tiÃn làm tá và đ°āc thông báo và măc đích nghiên cću Thông tin cá nhân cąa đái t°āng nghiên cću đ°āc bÁo mÃt tuyát đái

 Quá trình đánh giá thă tinh và chÃt l°āng phôi đÁm bÁo không Ánh h°çng tãi chÃt l°āng phôi

 Kỹ thuÃt sinh thiÁt phôi, tiêm tinh trùng vào bào t°¢ng noãn và PGT-A không Ánh h°çng đÁn sćc khße cąa trẻ s¢ sinh

Ch°¢ng 3 K ¾T QUÀ VÀ THÀO LUÀN 3.1 Đ¾C ĐIÂM CHUNG CĄA ĐÞI T¯ĀNG NGHIÊN CĆU

Từ tháng 05/2021 đÁn tháng 08/2023, trung tâm Hß trā sinh sÁn – Bánh vián Quác tÁ SÁn Nhi HÁi Phòng đã thăc hián 94 chu kỳ rã đông noãn vãi 88 chu kỳ sÿ dăng trćng tă thân Áp dăng tiêu chu¿n lo¿i trừ, 79 bánh nhân vãi táng cáng 83 chu kỳ thă tinh có sÿ dăng noãn trā rã thoÁ tiêu chu¿n nhÃn đ°āc đ°a vào nghiên cću

BÁng 3.1 ĐÁc điÅm chung cąa đái t°āng nghiên cću

Các thông sß đánh giá Giá trá trung bình KhoÁng tin cÁy 95%

Đá tuái dân sá trong nghiên cću cąa tôi t°¢ng đßng vãi mát sá nghiên cću cąa Goldman và cs., 2015 [81] và Doyle và cs., 2016 [11] thăc hián đánh giá kÁt quÁ trā l¿nh noãn vãi đá tuái trung bình đÃu trên 35 tuái