nghiên cứu sử dụng enzym vi sinh vật để tăng hiệu suất tách vỏ hạt cà phê

Luận văn tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Sự sống của con người và các loài sinh vật phụ thuộc vào mạng lưới chuyển hoá vật chất vô cùng phức tạp và có liên quan chặt chẽ với nhau, hầu như không có

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ _ BÁN CÔNG TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ENZYM VI SINH VẬT ĐỂ TĂNG HIỆU SUẤT

TÁCH VỎ HẠT CÀ PHÊ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: SINH HOÁ

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN : TH.S ĐẶNG VŨ BÍCH HẠNH SINH VIÊN THỰC HIỆN : NGÔ ĐÌNH LY NA

KHOÁ HỌC: 2001-2005

Lời Cảm Ơn

Xin kính gởi những lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến:

✔ Cô Th.s Đặng Vũ Bích Hạnh đã nhiệt tình hướng dẫn, động viên,

giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn này

✔ Quý thầy cô Khoa Công Nghệ Sinh Học đã mang hết những tâm

huyết của mình để truyền đạt cho em những kiến thức quý báu

✔ Anh Nguyễn Văn Hưng đã truyền đạt những kinh nghiệm cho em

trong quá trình làm luận văn

✔ Các anh chị ở phòng thí nghiệm sinh hoá đã nhiệt tình giúp đỡ

em hoàn thành luận văn này

Luận văn tốt nghiệp

LỜI MỞ ĐẦU

Sự sống của con người và các loài sinh vật phụ thuộc vào mạng lưới chuyển hoá vật chất vô cùng phức tạp và có liên quan chặt chẽ với nhau, hầu như không có một quá trình hoá học nào trong cơ thể sống lại không liên quan mật thiết đến các quá trình xúc tác sinh học do tác dụng của enzym, có thể nói rằng sự sống gắn liền với vai trò của enzym

Trong các ngành công nghệ thực phẩm, và một số ngành công nghệ khác enzym cellulase có một giá trị sử dụng rộng rãi.Việc sử dụng cellulase đã trở thành việc rất phổ biến và quan trọng trong công tác nghiên cứu chọn giống thực vật

Sản xuất Glucose từ chế phẩm cellulose sản xuất ra Glucose tinh khiết làm chất bổ dưỡng cho người ; hoặc làm dịch Glucose thô rồi sử dụng dịch này để chế biến thức ăn gia súc, hoặc dùng nó để lên men nấm men cho gia súc, làm phân bón cho cây trồng

Có thể thu nhận cellulase từ nhiều nguồn, trong đó vi sinh vật là đáng kể

nhất Hiện nay nấm mốc là đối tượng đang được quan tâm như: Asp.niger,

Asp.awamori, Asp.orizae, Tri.viride, Penicillium notatum…

Ơû Việt Nam đã có một số nghiên cứu về khả năng sinh cellulase ở nấm mốc

như Trichoderma và xạ khuẩn…Cellulase còn được ứng dụng trong các lĩnh vực

như y học, xử lý môi trường, chế biến thực phẩm, trong đó nâng cao hiệu quả thu nhận các sản phẩm sau thu hoạch cũng đang được chú ý Vì vậy, chúng tôi chọn hướng nghiên cứu ứng dụng cellulase trong tách vỏ cà phê Đó là lý do ra đời của đề tài “nghiên cứu ứng dụng enzym vi sinh vật để tăng hiệu suất tách vỏ hạt cà phê”

Luận văn tốt nghiệp

Phạm vi nghiên cứu của đề tài:

1 Xác định khả năng tổng hợp enzym cellulase của Aspergillus trên 3

chủng: Asp.oryzae, Asp.awamori, Asp.niger

2 So sánh khả năng tổng hợp enzym cellulase của 3 chủng

3 Xác định hiệu quả bóc vỏ của chế phẩm enzym thô trên 3 chủng vi sinh vật

Thời gian thực hiện là 6 tháng, từ tháng 8 đến tháng 2 năm 2006

Luận văn tốt nghiệp

PHẦN I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận văn tốt nghiệp

Luận văn tốt nghiệp

1.1 ENZYM

1.1.1 Định nghĩa enzym

Enzym hay còn gọi là MEN là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein.Vì có nguồn gốc từ các hoạt động sinh học do đó enzym thường được gọi là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác

1.1.2 Cấu tạo hóa học của enzym:

❖ Cấu tạo của enzym:

Dựa vào thành phần hóa học của enzym, người ta chia enzym ra làm 2 nhóm lớn:

✔ Enzym một cấu tử: là enzym trong thành phần cấu tạo chỉ có protein

Ví dụ:urease, amylase…

✔ Enzym hai cấu tử: là enzym trong thành phần của nó ngoài protein

(gọi là “feron” hay “apoenzym”) còn có một phần phi protein (không phải protein) gọi là “nhóm ngoại” (hay “Agon”, hay “coenzym”) Bản chất hóa học của nhóm ngoại enzym rất đa dạng, phong phú Thường nhóm ngoại enzym là các dẫn xuất của vitamin, các kim loại, nucleotide…Vidụ: catalase, b peroxydase, cytocrom…

Apoenzym quyết định tính đặc hiệu cao của enzym và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzym Coenzym quyết định kiểu phản ứng mà enzym xúc tác, trực tiếp tham gia trong phản ứng và làm tăng độ bền apoenzym đối với các yếu tố gây biến tính

❖ Trung tâm hoạt động của enzym

Trung tâm hoạt động là một phần của phân tử enzym trực tiếp kết hợp với cơ chất, tạo thành và chuyển hóa phức chất trung gian giữa enzym và cơ

Luận văn tốt nghiệp

chất Phần này thường có kích thước rất nhỏ so với toàn bộ phân tử enzym Số trung tâm hoạt động của phân tử enzym có thể là một hay nhiều hơn

Với enzym một cấu tử thì trung tâm hoạt động gồm một số nhóm chức của acid amin liên kết lại với nhau Nhờ có cấu trúc bậc 3,4 các nhóm này tuy nằm xa nhau trong mạch polypeptide, nhưng do xoắn cuộn mạch mà được gần nhau Với enzym hai cấu tử, ngoài một số nhóm chức của acid anim còn có nhóm ngoại tham gia trong trung tâm hoạt động của enzym

Một số nhóm định chức thường tham gia tạo thành trung tâm hoạt động của enzym như: -SH của cystein, OH của serin, vòng imidazol của histidin, ε -NH2 của lizin, ω -COOH của aspartic và glutamic, α-COOH của acid anim cuối mạch

❖ Cơ chế tác dụng của enzym:

Bản chất của các phản ứng enzim là khi có sự tham gia xúc tác của các enzim, các cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hóa học của cơ chất, kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra những sản phẩm của phản ứng Dưới tác dụng của enzim cơ chất có thể có những thay đổi, không chỉ về cấu trúc hóa học mà còn thay đổi tính chất hóa học Quá trình xúc tác của enzim xảy ra qua 3 giai đoạn :

✔ Giai đọan thứ nhất : Enzim sẽ kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu,

nhờ đó tạo ra phức hệ enzim-cơ chất Phức hệ này thường không bền, phản ứng tạo ra phức hệ enzim-cơ chất thường xảy rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng

✔ Giai đọan thứ hai: Khi cơ chất tạo phức với enzim sẽ bị thay đổi cả cấu

hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết Kết quả là các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm

✔ Giai đọan thứ ba :Đây là cuối cùng, sản phâm phản ứng được tạo thành

Luận văn tốt nghiệp

E + S ⇔ES → E + P E-enzim S-cơchất (substrate) P-sản phẩm(products)

❖ Xác định khả năng xúc tác của enzim:

Người ta xác định khả năng xúc tác của enzim thông qua việc xác định hoạt độ hoạt động của enzim Người ta cũng không thể định lượng enzym trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng Hiện nay nhiều phòng thí nghiệm sử dụng một trong ba nhóm phương pháp sau để xác định khả năng xúc tác của enzym

Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phảm tạo thành sau một thời gian nhất định và lượng enzim đã xác định trước

Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận một long biến đổi nhất định của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzim nhất định

Tiến hành chọn nồng độ enzim cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm

1.2 ENZYM TỪ VI SINH VẬT

Enzym thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao

1.2.1 Một số Vi Sinh Vật tổng hợp enzym cellulase:

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong điều kiện hiếu khí và cả trong điều kiện yếm khí Các loài vi sinh vật thay phiên nhau

phân huỷ cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose Altenaria tenuis,

Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sydovii, Aspergillus terrus, Celluvibrio gilvus, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Trichoderma koningi, Trichoderma lignorum, Trichoderma roseum, Trichoderma reesei, Actnomyces spp, Penicillium spp

Luận văn tốt nghiệp

Chúng thuộc nấm sợi xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp, các nhàkhoa học, còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trình phân giải này Trong đó, những vi sinh vật được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ nhất:

Đối tượng chủ yếu trong các nghiên cứu về cellulose hiện nay thường là nấm (nấm mốc và nấm có qủa thể), một số loài được chú ý nhiều :

Nghiên cứu của suguira và đồng sự (1966) cho biết cellulose của nấm này phân huỷ giấy lọc và hoạt tính enzim có t° opt = 40°C, pH opt = 4,5, ổn định ở nhiệt độ 37-50°C

• Aspergillus oryzae • Aspergillus terreus • Aspergillus sydovii…

Theo nghiên cứu của Wa-tanabe(1968) thì cellulose của nấm này có trọng lượng phân tử (MW) =25800, họat tính enzim có t°opt=40°C, pHopt=4,0 và một số các chủng vi sinh vật khác

❖ Ưùng dụng VSV trong công nghiệp:

VSV được ứng dụng nhiều trong công nghiệp vì:

⮚ Tốc độ sinh sản của VSV rất mạnh:

Trong một thời gian ngắn, ta có thể thu được một lượng sinh khối rất lớn Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng trong một ngày đêm tốc độ tạo sinh khối ở VSV cao gấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng sinh khối ở động vật và thực vật Để đạt

Luận văn tốt nghiệp

cơ chất Bởi vì, mọi chuyển hóa cơ chất trong tế bào là do enzym đảm nhận Chính vì thế, nếu sử dụng VSV như nguồn sinh học để sản xuất enzim rất có lợi

⮚ Enzym thu nhận từ VSV có họat tính rất cao:

Ưu điểm này gắn liền với tốc độ chuyển hóa cơ chất và gắn liền với tốc độ sinh sản và phát triển của VSV

❖ Một số ứng dụng của enzim:

✔ Ưùng dụng enzim trong chế biến bột và sản xuất bánh kẹo

✔ Ưùng dụng enzim trong sản xuất sirô và các sản phẩm chứa đường ✔ Ưùng dụng enzim trong công nghệ sản xuất bánh mì

✔ Ưùng dụng enzim trong sản xuất nước quả, rượu vang, bia, sữa, nước mắm…

1.3 CELLULOSE _CELLULASE

1.3.1 Cấu tạo cellulose:

Cellulose là một loại homopolime của β-D-glucose Các góc β-D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucan Mức độ polime hóa của phân tử cellulose thay đổi nhiều (từ vài trăm đến 15000) trung bình là 3000

Tùy theo từng loại thực vật mà các phân tử cellulose có trong lượng phân tử khác nhau rất nhiều (từ 50.000 đến 2.500.000) Phương pháp xác định cũng đưa lại những kết quả rất khác nhau Nhờ phương pháp phân tích bằng tia rơnghen người ta biết rằng cellulose có cấu tạo dạng sợi Các sợi này liên kết lại thành những bó nhỏ gọi là các microfibin có cấu trúc không đồng nhất, chúng có những phần đặc (phần kết tinh) và những phần xốp hơn (phần vô định hình)

Các sợi microfibin có chiều rộng khoảng 100-300Å Chiều dài của một phân tử cellulose tự nhiên thường lớn hơn hàng chục lần so với chiều dài của một phần kết tinh Cellulose là một trong những hợp chất tự nhiên khá bền vững Nó không tan trong nước mà chỉ có thể phồng lên do hấp thụ nước, cellulose bị phân hủy khi đem đun nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ khá cao Cellulose bị phân hủy ở

Luận văn tốt nghiệp

nhiiệt độ bình thường hoặc ở nhiệt độ 40-50oC nhờ các enzim phân hủy cellulose được gọi chung là cellulase

Trong tế bào thực vật, cellulase liên kết chặt chẽ vơi hemicellulase, pectin, lignin Điều này ảnh hưởng rất nhiều đến sự phân hủy cellulose của enzim, chỉ trong một số trường hợp (ví dụ như sợi bông) cellulose mới tồn tại trong trạng thái một polime gần tinh khiết

❖ Cơ chế tác dụng:

Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50.000-2.500.000 Dalton Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der war và liên kết hydro Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3mm Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi (microfibrin) Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất Chúng thường tồn tại hai vùng:

Vùng kết tinh Ở vùng kết tinh, cellulose có cấu trúc trật tự rất cao và rất bền vững với tác động của điều kiện bên ngoài Enzym cellulase chỉ có tác dụng bề mặt hệ sợi ở vùng này

Vùng vô định hình Ở vùng này, cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzym cellulase rất dễ tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng

Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài của phân tử cellulose kết tinh

Trong thiên nhiên, khi thực vật và vi sinh vật có chứa cellulose bị chết, cellulose của chúng chỉ bị phân hủy bởi một tập đoàn vi sinh vật Các loài vi sinh vật sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo ra mùn và từ đó các thành phần cấu tạo của cellulose lại được đi vào các con đường chuyển hóa trong chu trình chuyển hóa vô tận của thiên nhiên

Trong thực vật, cellulose thường tồn tại một lượng rất lớn Số lượng cellulose

Luận văn tốt nghiệp

lượng cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây, đặc biệt ở sợi bông, cellulose có thể chiếm tới 80-90%

Ơû vi sinh vật, cấu trúc của cellulose không bền và không theo một trật tự như ở thực vật Ở đó, cellulose thường thuộc loại cellulose vô định hình Chính vì thế, việc phân hủy chúng thường rất dể thực hiện

1.3.2 Cellulase:

❖ Phân loại enzym:

Enzym tham gia phân hủy cellulose được các nhà khoa học phân ra làm ba nhóm:

1,4 β-D-glucan cellobiohydrolase Enzym cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Enzym này còn có một loạt các tên khác như: cellobiohydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và avicellase

Enzym này không có khả năng phân giải cellulose dang kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzym endocellulose phân giải chúng

1,4 β-D-glucan 4 glucanohydrolase Enzym này tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose trong lichenin và β-Dgluccan Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình tác động yếu đến kết tinh

Enzym này còn có một loạt tên khác như: endoglucanase, endo glucanase, C-cellulase

1,4β-β-D glucoside glucohydrolase Enzym này tham gia phân hủy cellulose, tạo thành glucose Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy Trong các tài liệu khoa học, chúng còn có tên là cellobiase và β-glucosidase

Luận văn tốt nghiệp

❖ Cơ chế tác dụng của cellulase:

Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzym: cellulase như endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase Một trong ba loại enzym trên không thể tự thủy phân đến cùng phân tử cellulose Mỗi một loại enzym chỉ tham gia thủy phân một phần nào đó trong cellulose

Trong thiên nhiên cũng tồn tại những loài vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tổng hợp một loại enzym trong hệ enzym cellulase Hoạt tính enzym này thường mạnh hơn các loài enzym còn lại Chính vì thế, trong điều kiện tự nhiên, một loài vi sinh vật không thể tham gia thủy phân triệt để cellulose được

Từ những nghiên cứu riêng lẻ từng loài enzym đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzym cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loài enzym cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Có nhiều cách trình bày khác nhau, cách trình bày cơ chế tác động của cellulase do Erikson đưa ra được nhiều người công nhận hơn cả

Luận văn tốt nghiệp

Glucose a: Những vùng có mức độ kết tinh thấp trong sợi cellulose bị các Endo-

glucanase tấn công tạo ra các đầu tự do

b: Các Exo-glucanase mở đầu sự phân giải từ đầu tự do của các chuỗi tạo các cellobiose

a

Endoglucanase

Endogluconase Exo-glucanase

β -glucosidase b

c

Exo-glucanase

Luận văn tốt nghiệp

Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu Chính vì thế, việc thủy phân cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, sảy ra rất chậm

Ta có thể minh họa tóm tắt toàn bộ quá trình thủy phân cellulose như sau: Cellulose

kết tinh Enzym cellulase C1 Endoglucanase Cellulose

vô định hình Oligomer

Các oligomer chuỗi ngắn Exocellulose

Cellobiose

β-glucosidase Glucose

❖ Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của enzym.: ✔ Aûnh hưởng của độ ẩm:

Nước là một thành phần cơ bản cấu thành nên cơ thể sinh vật Nếu thiếu nước sẽ sảy ra hiện tượng mất nước, trao đổi chất giảm, làm cho tế bào vi sinh vật sẽ bị chết

✔ Aûnh hưởng của nhiệt độ:

Luận văn tốt nghiệp

Hoạt động sống và trao đổi chất của tế bào vi sinh vật phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố nhiệt độ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sống và sinh tổng hợp của vi sinh vật

✔ Aûnh hưởng của pH môi trường:

pH môi trường ảnh hưởng rất mạnh đến sự sinh trưởng mà còn tác động sâu sắc đến quá trình trao đổi chất

pH môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng của enzym vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzym, và ảnh hưởng đến độ bền protein enzym

✔ Aûnh hưởng của thời gian nuôi cấy:

Thời gian nuôi cấy thích hợp cho mỗi loại vi sinh vật thì khác nhau, chúng được xác định bằng thời gian cho phép tích tụ enzym tối đa Ngoài ra thời gian còn tác động đến khả năng sinh tổng hợp cellulase

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy cellulose bằng enzym, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, lượng enzym…, một yếu tố hết sức quan trọng cần phải được quan tâm, đó là tính đồng bộ của hệ enzym cellulse từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau Quá trình thủy phân cellulose chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ ba loại enzym cellulase trong hệ enzym cellulase Mỗi loài vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tổng hợp ưu việt một loài enzym Chính vì thế ta phải khai thác enzym cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật

1.3.3 Nấm mốc aspergillus niger, aspergillus awamori, aspergillus oryzae:

Hiện nay người ta sử dụng rộng rãi loài Aspergillus vào trong công nghiệp

thực phẩm và một số nghành kinh tế khác để thu acid hữu cơ và enzym

Loài Aspergillus phân bố rất nhiều trong tự nhiên, chúng ở đất, ở xác thực

vật, hoa quả và đặc biệt có nhiều ở vùng có khí hậu ấm áp

❖ Aspergillus niger:

Aspergillus niger thuộc :

Luận văn tốt nghiệp

Nhóm Aspergillus niger

Giống Aspergillus Họ Aspergillaceae

Bộ Moniliales

Lớp Fungi imperfecti

Aspergillus niger có thể bình hai tầng Khuẩn lạc mọc không lan nhanh trên

môi trường Czapek, khuẩn lạc nhìn bằng mắt thường có màu đen như than Đính bào tử trưởng thành có hình cầu, phần lớn 4,0-5,0 µm, xù xì, không đều với những gờ rõ và gai không sắp thành vạch kẻ sọc theo chiều dài

Theo nghiên cứu của Sugiura và đồng sự (1966) cho biết cellulase của nấm này phân giải giấy lọc, CMC

+ Pepton ức chế việc tạo thành cellulase của các loài Aspergillus và Murothecium verrucaria

+ Cao ngô với lượng 0.5% kích thích sự tích luỷ cellulase ở Aspergillus

Luận văn tốt nghiệp

Aspergillus niger là một trong những loài nấm mốc có khả năng sinh nhiều

enzym trong quá trình phát triển của nó như enzym proteinase, pectinase và cellulase… và tùy theo điều kiện môi trường nuôi cấy mà nó tạo enzym nào với hàm lượng nhiều

❖ Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae thuộc:

Nhóm Aspergillus flavus Giống Aspergillus Họ Aspergillaceae Bộ Moniliales

Lớp Fungi imperfecti

Aspergillus oryzae: bọng không có hình chùy, bông khi non có màu lục-vàng

sáng, dạng hình tia lỏng lẻo, đa số có thể bình hai tầng Cuống coniđi thường xù xì không màu, khuẩn lạc biến đổi thành màu lục nhạt khi già trên môi trường

Luận văn tốt nghiệp

Czapek Coniđi lớn, phần lớn 4,5-7,0 µm nhưng có thể tới 8 hoặc 10µm, mới đầu hình elip, rồi dần đến hình cầu, nhẵn hoặc xù xì không đều

❖ Aspergillus awamori:

Aspergillus awamori thuộc:

Nhóm Aspergillus awamori Giống Aspergillus

Họ Aspergillaceae Bộ Moniliales

Lớp Fungi imperfecti

Aspergillus awamori có thể bình hai tầng, khuẩn lạc màu nâu, hơi xám

hoặc nâu, đậm khi còn non, khuẩn lạc nhanh chóng có màu nâu đen đậm hoặc hơi đỏ Đính bào tử có đường kính dưới 5 µm, dẹt theo chiều ngang, có kẻ sọc khi trưởng thành cuống đính bào tử phần lớn dài 1,0-1,5 µm, đính bào tử phần lớn có đường kính khoảng 4,0-4,5 µm.

1.4 CÂY CÀ PHÊ

1.4.1 Đặc tính sinh thái:

Cây cà phê lúc đầu là những cây dại mọc trong rừng thưa hoặc ven bờ các con sông vùng Bắc và Trung phi như: Abissinia, Libilia, Công-gô Ở những nơi nguyên sản này người ta đã phát hiện ra nhiều cây cà phê dại.

Nguồn gốc những loại hình cà

phê có giá trị kinh tế cao ngày nay là ở Bắc và Trung phi Ở Bắc Aán Độ cũng có một số cây cà phê dại nhưng giá trị kinh tế của những giống cà phê từ những cây dại này không lớn lắm

Hình 1.1: Hạt cà phê

Luận văn tốt nghiệp

Hình 1.2: Hoa cà phê

Cà phê được con người biết đến giá trị mới gần 300 năm nay, tức là muộn hơn rất nhiều so với những cây lương thực, thực phẩm khác Mặc dù vậy, cây cà phê đã trở thành cây trông có giá trị kinh tế cao; sản phẩm của nó là mặt hàng xuất khẩu quan trọng, thu nhiều ngoại tệ

Năm 1735, De Jussieu đã phát hiện ra các cây cà phê và phân loại nó thuộc giống Coffea, họ Rubiaceae Sau đó, các nhà thực vật học tiếp tục tìm ra gần một trăm loài thuộc họ Rubiaceae, xong chỉ có một số ít được đưa vào sản xuất, trong đó phổ biến hơn cả là 2 loài: Coffea arabica L và Coffea canephora Pierre Hai loài này có phẩm chất thơm ngon hơn cả, vì vậy chúng được trồng tới hơn 11 triệu ha ở các nước thuộc châu Phi, châu Á,

Nam và Trung Mỹ

Ngoài ra, còn loài cà phê mít Coffea exselsa, nhưng vị chua và kém thơm nên dần dần người ta loại bỏ

Cây cà phê là loại cây thuộc dạng bụi, nhiều cây, cao 2-3m, tán lá bền, cành đối xứng, dài, mềm mại, mảnh dẻ, khi mới mọc có hướng thẳng, sau vươn dài thì rủ xuống

Lá mọc đối xứng, hình trứng dài, đầu nhọn, rìa lá quăn, gợn sóng, màu xanh đậm, bóng, dài 10-15cm, rộng 4-6cm, hoa trắng,mùi thơm ngát hơi hắt, mọc chụm lại ở nách lá từ 8 đến 15 hoa Cuống hoa ngắn, đài hoa có 5 cánh nhỏ trùm lên phía trên noãn sào

Tràng hoa hình ống dài, phía đầu nở ra thành 5 cánh hẹp Nhụy gồm vòi có 2 đầu vươn ra ngoài tràng hoa Noãn sào sẽ phát triển thành quả Quả hình trứng, dài 10-18mm, rộng 8-12mm

Khi bổ dọc quả cà phê, ngoài cùng là vỏ mỏng, tiếp theo là lớp thịt quả, khi quả chín thịt quả có vị ngọt, trong cùng là 2 nhân xếp úp vào nhau, nhân có dạng

Luận văn tốt nghiệp

bán cầu: một mặt dẹp phẳng ở giữa có rảnh thẳng, ở một đầu nhân có phôi, nhân cà phê được bao bọc một lớp vỏ lụa và bên ngoài là vỏ thóc, khi bóc vỏ thóc thì nhân có màu xanh xám, xanh lục, xám cốm, xám lục nhạt, tùy vào chủng cà phê và cách chế biến và bảo quản

Thân cây có vỏ sần sùi, có giống phân cành cao, bộ rễ cây cà phê khá phát triển, gặp đất tơi xốp và có độ sâu lớn thì rễ cọc mọc thẳng và sâu tới trên 1m

1.4.2 Đặc tính sinh lý:

Cây cà phê bình thường có thể sống kéo dài tới 30-40 năm, tuy nhiên trong thực tế sản xuất người ta điều chỉnh cây mọc theo nhiệm kỳ kinh tế 12 năm và khai thác 2 nhiệm kỳ rồi phá bỏ để trồng lại

Hạt cà phê sau khi thu hoạch, khi đem gieo ươm gặp điều kiện thích hợp, hạt có thể nảy mầm ngay

Hạt nẩy mầm thuận lợi ở nhiệt độ 30-32o C, dưới giới hạn đó quá trình nảy mầm sẽ kéo dài và đến 10oC thì hạt giống không nảy mầm Bên cạnh nhiệt độ và ẩm độ, thì oxy cũng rất cần cho hạt nẩy mầm Sau khi ươm 5-7 tháng, gặp các yếu tố thuận lợi, cây con đạt chiều cao 25-30cm và có 6-7 cặp lá thật, sau hơn 1 năm, cây cao hơn 1m và có 12-18 cặp cành ngang và sau khi trồng 2-3 năm, cây cà phê bói quả

1.4.3 Giá trị kinh tế của càphê:

❖ Giá trị nhu phẩm:

Cà phê là một trong ba nguồn uống chủ yếu nhất trên thế giới hiện nay:chè cà phê, cacao Cà phê có một hương vị độc đáo và có một tác dụng sinh lý đặc biệt Kích thích thần kinh, thông tiểu tiện, tăng cường họat năng của các bắp thịt, xúc tiến tốc độ tuần hoàn máu

Ở Thụy Điển, Đức cà phê là một nhu yếu phẩm phổ cập không thể thiếu được trong mọi tầng lớp nhân dân

Luận văn tốt nghiệp

❖ Giá trị khác:

Trong quả cà phê chứa nhiều chất dinh dưỡng có thể dùng làm rượu, thức ăn gia súc, phân bón Cà phê có thể tinh chế được cafein dùng trong dược liệu làm thuốc mê Gần đây người ta phát hiện trong nước cà phê có một hàm lượng rất đáng kể các sinh tố thuộc nhóm B nhất là vitamin PP (trong 100g cà phê rang có từ 10-40g vitaminPP)

1.4.4 Tình hình sản xuất cà phê:

Trên thế giới, những nước có mức tiêu thu cà phê nhiều là những nước không trồng cà phê: từ năm 1985 đến 1990, bình quân mỗi năm, cà phê thế giới tiêu thụ gần 4,2 triệu tấn, riêng các nước Bắc Mỹ và Châu Aâu đã sử dụng hơn 3,6 triệu tấn

So với nhiều cây trồng khác trên đất vùng núi thì cây cà phê vẫn là cây có giá trị kinh tế cao, mặc dù giá bán trên thị trường thế giới có nhiều biến động, trong mấy chục năm qua, thấp nhất là 600-700USD/tấn và cao nhất 3500-4200USD/tấn

Ơû nước ta, trong 5-7 năm tới cây cà phê là cây công nghiệp, được coi là cây thuộc chương trình phủ xanh đất trồng đồi núi trọc với ý nghĩa 3 mặt:

✔ Kinh tế: Trồng cà phê thu lợi nhuận cao

✔ Xã hội: Trồng cà phê là một trong các giải pháp tạo công ăn việc làm cho hàng triệu lao động miền núi hiện nay đang thiếu việc làm, đây chính là cách xóa đói giảm nghèo có ý nghĩa nhân văn sâu sắc

✔ Môi trường: Trồng cà phê là góp phần phủ xanh cho hơn 6 triệu ha rừng bị phá hủy trong vòng 40-50 năm qua, đưa độ che phủ từ hơn 20% hiện nay lên 40-42% trong 5-10 năm tới, góp phần quan trọng để cải tạo môi sinh, chống lũ lụt, xói mòn

Luận văn tốt nghiệp

Nhà nước ta có chủ trương phát triển mạnh hơn nữa việc sản xuất cà phê Đến năm 2000, diện tích và sản lượng cà phê nói chung sẽ tăng từ 140.000ha với 165.000-170.000 tấn sản phẩm lên 200.000-250.000 tấn sản phẩm

Thành phần hóa học của hạt cà phê (Sản xuất cà phê hiện đại)

tươi(%)

Cà phê rang (%) Tro

Tổng lượng đạm Protid

Cellulose Đường Glucose Đường Saccharrose Chất dầu

Tinh bột

Cafein C8H10N4O2

3,62 2,55 15,94 13,77 0,23 7,83 18,24 5,8 1,27

3,10 2,22 13,88 17,94 0,17 1,87 11,97 6,76 1,31

Luận văn tốt nghiệp

PHẦN II

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Luận văn tốt nghiệp

Hình 1.4: Bản đồ khu vực Đồng Nai

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1.Vi sinh vật:

Nguyên liệu thu nhận enzym từ canh trừơng nuôi các chủng nấm mốc:

-Aspergillus niger - Aspergillus oryzae -Aspergillus awamori

Các chủng nấm mốc trên được nhận từ phòng Công nghệ thực phẩm, phòng vi sinh –Trường Đại Học Mở- Bán Công tp Hồ Chí Minh

2.1.2 Cây cà phê:

Mùa lấy trái :đông Tháng : 12

Vùng : ĐỒNG NAI

Loại cà phê: cà phê mít

2.1.3 Môi trường giữ giống và nuôi nấm mốc:

❖ Môi trường giữ giống PGA(Potato Glusose Agar)

- Khoai tây 200g -Thạch 20g -Glucose 20g -Nước cất 1lit

Khoai tây gọt vỏ, cắt hạt lựu, cho 500ml nước cất vào đun sôi 15 phút, lọc bỏ bã Pha các thành phần khác vào rồi chuân đến 1000ml

❖ Môi trường phân lập giống Czapek:

Luận văn tốt nghiệp

-Glucose 30 g -NaNO3 3 g-KH2PO4 1 g -MgSO4 0,5 g -FeSO4 0,01 g -Thạch 20 g -Nước cất 1000ml pH =6 Khử trùng 1atm/30 phút

❖ Môi trường nuôi nấm mốc ( không có chất cảm ứng) -Cám gạo 65% -Trấu 25%

-Muối(NH4)2SO4 2% -Độ ẩm ban đầu 60%

Chỉnh pH= 5,5, chia môi trường vào các bình tam giác, khử trùng ở 1atm/30phút

❖ Môi trường thử khả năng phân giải cellulose CMC

-CMC 2 g - Agar 20g Dung dịch đệm pH =4,5 (đủ) 1000ml

❖ Cơ chất :CMC, cám, trấu

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy các chủng nấm mốc và tách chiết enzym từ môi trường nuôi cấy:

❖ Phương pháp nuôi cấy:

Việc giữ giống và nuôi cấy được tiến hành theo các dạng môi trường trên Sau khi thanh trùng môi trường cám trấu trong các bình tam giác được làm nguội

Luận văn tốt nghiệp

đến 30-40oC rồi cấy bằng cách cho: cho thêm vào mỗi ống thạch nghiêng 10ml dung dịch nước cất vô khuẩn, dùng que cấy đã vô trùng lướt nhẹ trên mặt thạch, đánh nhẹ cho bào tử ở dạng huyền phù, đổ vào bình tam giác đã chuẩn bị môi trường, rồi trộn đều

Nhiệt độ nuôi nấm mốc là nhiệt độ (230-440 C)

❖ Phương pháp tách chiết enzym:

Sau thời gian nuôi cấy các chủng nấm mốc, enzym cellulase được tách chiết bằng cách như sau:

Canh trường nấm mốc nghiền và khuấy trộn với nước (tỉ lệ giữa nước cất và canh trường là 1: 6), lọc lấy dịch lọc, đem dịch lọc ly tâm (4000 vòng/ phút trong 10 phút), phần trên thu được là dung dịch chứa enzym

❖ Phương pháp thu nhận enzym cellulase:

Để thu nhận enzym cellulase từ nấm sợi và xạ khuẩn, người ta thường nuôi cấy theo phương pháp bề mặt môi trường xốp (còn gọi là môi trường bán rắn) Cả xạ khuẩn và nấm sợi đều phát triển rất tốt trên môi trường xốp có độ ẩm là 60-65%, có cơ chất là cellulose Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn và nấm sợi rất đa dạng, trong đó đó phải vừa đủ chất dinh dưỡng, vừa phải có cơ chất là cellulose và phải có độ xốp nhất định để không khí có thể lưu thông từ bên ngoài môi trường vào trong khối môi trường Cả hai nhóm xạ khuẩn và nấm sợi đều là những vi sinh vật hiếu khí nên quá trình nuôi thường xuyên phải được cung cấp oxy

Điểm khác biệt lớn nhất trong khi nuôi nấm sợi và xạ khuẩn là xạ khuẩn phát triển mạnh trong môi trường kiềm và môi trường acid yếu, còn nấm sợi phát triển trong môi trường acid Do đó, khi chế tạo môi trường cần lưu ý tạo pH môi trường cho xạ khuẩn từ 6,2-6,7, còn pH môi trường ban đầu cho nấm sợi từ 4,5-5,5

Luận văn tốt nghiệp

Sau khi nuôi cấy trong những điều kiện kỹ thuật tối ưu, người ta thu được chế phẩm cellulase ở dạng thô Chế phẩm này chứa nước, sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và enzym

1./ Khuyếch tán trên mặt thạch:

Dùng môi trường thạch CMC đỗ đĩa, dùng ống đục lỗ có đường kính=8mm, cho dịch enenzymvào đầy lỗ đục Đặt trong tủ ấm ở 37oC trong 24h Sau đó đem thử phản ứng màu với Lugol để đo đường kính vòng phân giải Thí nghiệm được lặp 3 lần

D’=D – d với : D’: đường kính vòng phân giải

D : đường kính ngoài vòng phân giải d : đường kính lỗ đục

2./ Ứng dụng enzym cellulose vào thực nghiệm:

Cân 100g cà phê tươi, lên men với các nồng độ enzym khác nhau, sau thời gian thích hợp, kiểm tra khả năng tách vỏ hạt của từng chủng VSV Thí nghiệm được lặp 3 lần Hiệu suất tách vỏ hạt được xác định như sau:

H= (Tổng số các hạt đã tách vỏ)/ (Tổng số các hạt không tách vỏ)*100

2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp Scheffer- Hartman:

a/ Định nghĩa:

❖ Hoạt tính của enzym cellulase được định nghĩa như sau:

Một đơn vị hoạt tính (UI) tương đương số mg đường (glucose hay manose) được tạo thành khi thuỷ phân cơ chất (CMC hay galactomanan) trong thời gian 1 giờ ở nhiệt độ và pH xác định bởi 1g chất khô (nguyên liệu)

b/ Nguyên tắc:

Nếu pha trộn một dung dịch những ion ở Cu++ với KI thì ta có một cân bằng hoá học như sau theo định luật tác dụng khối lượng:

Luận văn tốt nghiệp

2Cu++ + 2OH- → 2Cu+ + H2O + O

c/Tiến hành:

- Hút 3ml dung dịch đệm natri acetac 0,1M pH 4,8 vào một ống nghiệm - Thêm vào 3ml dung dịch cơ chất CMC 1% pha trong đệm natri acetac 0.1M pH4,8

- Lắc đều, thêm 1ml dịch chiết enzym - Lắc đều, ử ở 500 trong 15 phút

- Định lượng đường khử bằng phương pháp Scheffer- Hartman - Dịch từ phản ứng thuỷ phân lọc qua giấy lọc

- Hút 5ml dịch lọc cho vào ống nghiệm

- Hút thêm vào 5ml thuốc thử Scheffer- Hartman - Lắc đều, đun sôi cách thuỷ 15 phút

Luận văn tốt nghiệp

- Lần lượt cho vào mỗi ống 5ml H2SO4 2N và định phân bằng Na2S2O3N/200

Dùng hồ tinh bột làm chất chỉ thị màu và chỉ cho hồ tinh bột vào khi màu vàng của Iod nhạt bớt

❖ Tiến hành dựng đường chuẩn với dung dịch glucose mẫu 0,5mg/ml :

- Hút dung dịch theo bảng sau:

mlglucose(hoặc mannose) 0,5 mg/ml

ml đường dung dịch định phân

5 5 Nồng độ đường

trong mỗi ống (mg/ml)

0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 x x

- Thêm 5ml thuốc thử Schaffer- Hartman và tiến hành tương tự như trên - Từ đường chuẩn dựng được ta sẽ tính được hàm lượng đường khử trong mẫu phân tích

Như vậy hoạt tính của enzym được tính như sau: Số ml đường sinh ra trong 7ml dịch phản ứng là:

Cũng chính là số mg đường sinh ra do 1ml dịch enzym 1%(0,01 g enzym) 1g enzym sẽ có hoạt tính:

Luận văn tốt nghiệp

Vậy A gram enzym thô sẽ có hoạt tính: 01,0*5

Thời gian thuỷ phân là t phút, vậy trong một giờ sẽ có hoạt tính là: X(UI)=

* (mg glucose/ 1g nguyên liệu/ 1 giờ)

Kết quả định phân hàm lượng đường khử từ dung dịch phản ứng thuỷ phân của enzym:

Vo -Vt (Na2S2O3)ml Nồng độglucose

V0 - Vt

02468101214

Luận văn tốt nghiệp

Đồ thị 2.1: Đường chuẩn của glucose mẫu 0.5mg/ml

Chiếu giá trị y là thể tích Na2S2O3 dùng để dịnh phân lên đường chuẩn để tìm được giá trị hàm lượng đường khử a:

Hoạt tính được xác định theo công thức: 15*

a (mg/ml) : hàm lượng đường khử xác định được

A(g) : khối lượng enzym thô thu được từ B g nguyên liệu khô B (g) : khối lượng nguyên liệu khô

t(phút) : thời gian thuỷ phân

Ghi chú: do đây là thí nghiệm dịch chiết enzym nên A (khối lượng enzym thô,

thu được từ Bg nguyên liệu khô ban đầu) được xem như là toàn bộ dịch chiết thu được (ml)

2.3 DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHẤT 2.3.1 Dụng cụ:

- Oáng nghiệm - Bình định mức - Erlen

- Đũa khuấy - Phễu lọc - Máy ly tâm - Cối, chày

Luận văn tốt nghiệp

-Cân phân tích - Bếp đun

- Cân 18,4 g oxalat kalium (hay 2,6g (COOH)2 và 11,2g KOH) hoà tan trong 125ml nước cất vừa đun nóng nhẹ Đưa dung dịch này về pH=7,2-7,4 bằng cách thêm KOH 2N (giấy thảo lam đỏ hoá xanh) Ta được dung dịch C

- Trộn 2 dung dịch Bvà C, ta được dung dịch D hoàn toàn không màu

- Trộn 2 dung dịch A và D và thêm nước cất cho đủ 1 lít Ta được thuốc thử Schaffer- Hartman, thuốc thử phải có màu xanh trong

❖ Đệm natri acetac 0,1M pH 3,6- 5,6:

- Dung dịch acid acetic 0,1M (A)

5,8ml acid acetic đậm đặc, tinh khiết thêm nước cất vừa đủ 1000ml - Dung dịch Natri acetic 0,1M:(B)

8,2 g CH3COONa hoặc 13,6g CH3COONa.3H2O hoà tan trong nước cất vừa đử 1000ml