21126014 nguyễn thị lan anh

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH PHÁT TRIỂN SẢN PHẨM SINH HỌC Ngành học Mã ngành Chuyên ngành Sinh v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH PHÁT TRIỂN SẢN PHẨM SINH HỌC

Ngành học

Mã ngành Chuyên ngành Sinh viên thực hiện

Mã số sinh viên Niên khóa

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC : D420201

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC : NGUYỄN THỊ LAN ANH : 21126014

: 2021 – 2025

TP Thủ Đức, 3/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH PHÁT TRIỂN SẢN PHẨM SINH HỌC

TP Thủ Đức, 11/2023

i

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Mục tiêu môn học 1

1.2 Nội dung thực hiện 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về nấm Trichoderma 2

2.1.1 Vị trí phân loại 2

2.1.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của nấm Trichoderma 2

2.1.3 Hình thức sinh sản của nấm Trichoderma 3

2.1.4 Chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma 3

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus Thuringiensis 3

2.2.1 Vị trí phân loại 3

2.2.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis 4

2.2.3 Hình thức sinh sản của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis 4

2.3 Tổng quan về thuốc bảo vệ thực vật sinh học 4

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 6

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 6

3.2 Vật liệu 6

3.2.1 Chủng nấm đối kháng 6

3.2.2 Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu 6

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ 6

3.3 Phương pháp nghiên cứu 6

3.3.1 Nhân sinh khối nấm Trichoderma 8

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13

4.1 Kết quả 13

4.1.1 Nhân sinh khối nấm Trichoderma 13

4.1.2 Kiểm tra chế phẩm sinh học Bacillus Thuringiensis 13

iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả mật độ khuẩn lạc trên đĩa petri ở nồng độ 10-4, 10-5, 10-6

14

iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Chủng nấm Trichoderma trên môi trường PDA 2

Hình 2.2 Chủng vi khuẩn Bacillus Thuringiensis 3

Hình 3.1 Nguyên liệu làm môi trường nhân sinh khối nấm 6

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma 7

Hình 3.3 Sơ đồ cấy chuyền nấm Xanh từ đĩa nấm cấp I sang bọc 7

Hình 3.4 Chuẩn bị nguyên liệu 8

Hình 3.5 Môi trường sau khi đóng nút bông 8

Hình 3.6 Hấp tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp 9

Hình 3.7.Giống nấm Trichoderma 9

Hình 3.8 Đổ giống nấm vào môi trường đã tiệt trùng 10

Hình 3.9 Chế phẩm sinh học Bacillus Thuringiensis 10

Hình 3.10 Dịch mẫu sau khi lắc đều 11

Hình 3.11 Pha loãng dịch mẫu 11

Hình 3.12 Cấy trang dịch mẫu trên đĩa petri 12

Hình 4.1 Nấm Tricoderma sau 1 tuần cấy 13

Hình 4.2 Bacillus Thuringiensis sau 1 ngày nuôi cấy ở nồng độ 10-4 13

Hình 4.3 Bacillus Thuringiensis sau 1 ngày nuôi cấy ở nồng độ 10-5 14

Hình 4.4 Bacillus Thuringiensis sau 1 ngày nuôi cấy ở nồng độ 10-6. 14

1

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Mục tiêu môn học

Xác định được quy trình tạo chế phẩm sinh học từ nấm, vi khuẩn Nhân sinh khối

nấm Trichodema và xác định số khuẩn lạc bằng phương pháp cấy trang trên đĩa petri

1.2 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Nhân sinh khối nấm Trichoderma

Nội dung 2: Xác định số khuẩn lạc trên đĩa petri ở từng nồng độ pha loãng

2.1.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của nấm Trichoderma

Trichoderma là nhóm những loài nấm sợi, hiện diện ở khắp mọi nơi trên trái đất,

chúng chiếm ưu thế trong hầu hết các loại đất Khuẩn ty của Trichoderma không màu,

ban đầu có màu trắng, khi sinh ra bảo tử có màu xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng

Hình dạng chủ yếu của Trichoderma là hình cầu, hình elip hoặc oval, kích thước

không quá 5m

Trichoderma là loại nấm hoại sinh có sợi nấm phát triển nhanh và có khả năng

thích ứng mạnh với môi trường Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm

Trichoderma tương đối rộng, pH tối ưu là từ 3,5 – 5,6, nhiệt độ tối ưu từ 25 – 35 C

Nó có thể nắm bắt phần xâm lấn của nấm gây bệnh trong rễ cây, do đó cản trở sự xâm lấn của nấm gây bệnh Nó cũng có thể hấp thụ nhanh chóng các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của nấm mầm bệnh, dẫn đến thiếu hụt chất dinh dưỡng và ức

chế sự phát triển và sinh sản của nấm mầm bệnh (Guo và ctv, 2019) Trichoderma có

thể tạo ra hàng trăm chất chuyển hóa thứ cấp có tính kháng khuẩn, bao gồm trichomycin, gelatinomycin, chlorotrichomycin và peptide kháng khuẩn Các chất chuyển hóa thứ cấp này có thể hoạt động như chất kháng khuẩn, thúc đẩy tăng trưởng

Hình 2.1 Chủng nấm Trichoderma

trên môi trường PDA

3

thực vật và cung cấp nguyên liệu phong phú cho việc phát triển kháng sinh nông nghiệp (Maruyama và ctv, 2020)

2.1.3 Hình thức sinh sản của nấm Trichoderma

Nấm Trichoderma sinh sản vô tính bằng bào tử Nấm Trichoderma sau khi nuôi

cấy 12 giờ ở 26 ± 2°C trên môi trường YM-Agar có hình cầu, elip; khuẩn lạc có màu trắng đến vàng, xanh đồng tâm; một số chủng có mùi dừa đặc trưng; Cuống sinh bào

tử dài, phân nhánh nhiều hoặc ngắn, ít phân nhánh; Thể bình có dạng hình trụ, phồng ít

hoặc nhiều ở phần giữa

2.1.4 Chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma

Trichoderma có khả năng thích ứng mạnh với môi trường, Thông qua sự tăng

trưởng và sinh sản nhanh chóng, nó có thể thu giữ chất dinh dưỡng và không gian gần vùng rễ thực vật, tiêu thụ oxy trong không khí và làm suy yếu sự phát triển của nấm

gây bệnh thực vật Tốc độ sinh trưởng của Trichoderma nhanh hơn nhiều so với nấm

gây bệnh thực vật; do đó, nó có thể ức chế hiệu quả sự phát triển của nấm gây bệnh

thực vật Sau khi vào đất 24 giờ, Trichoderma có thể nhanh chóng hấp phụ vào rễ cây

trồng để nhân giống, sợi nấm nhanh chóng quấn quanh rễ cây trồng tạo thành lớp bảo

vệ, bảo vệ rễ cây trồng khỏi sự xâm nhập của mầm bệnh và tiêu diệt các mầm bệnh lân

cận Trichoderma có thể thu giữ nước và chất dinh dưỡng, chiếm không gian và tiêu

thụ oxy, v.v thông qua sự tăng trưởng và sinh sản nhanh chóng, làm suy yếu và loại trừ mầm bệnh mốc xám trong cùng môi trường sống (Yao và ctv, 2019)

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus Thuringiensis

Hình 2.2 Chủng vi khuẩn Bacillus

Thuringiensis

4

2.2.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis

Vi khuẩn Bacillus thuringiensis là loại vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, có kích

thước tế bào 1 – 1,2  3,5 μm, tiêm mao phủ mỏng, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi Chúng có tính chất đặc biệt là khả năng gây chết côn trùng do sản sinh protein nội độc tố cry (Schnepf và ctv, 1998) chuyên biệt cho một số loại côn trùng gây hại, không ảnh hưởng đến con người, động vật hữu nhũ và môi trường sinh thái (Mazid và ctv, 2011) Ngoài ra, các sản phẩm không độc hại của các protein này không tích tụ trong môi trường và hoàn toàn có thể phân hủy sinh học (Oberemok và ctv, 2015) Tinh thể protein hay còn gọi là “thể kèm bào tử” có kích thước khoảng 0,6 – 2 µm, tùy vào từng loài khác nhau mà hình dạng tinh thể có khác nhau như hình tròn, hình quả trám, hình thoi hoặc có hình dạng không xác định (Phạm Thị Thùy, 2008) Bình thường mỗi tế bào có 1 tinh thể chung, đôi khi có 2 hoặc 3 tinh thể độc đối với côn trùng B thuringiensis phát triển tốt trong điều kiện có nhiệt độ là 36 C ±

2 (Knowles, 1994)

B thuringiensis là vi khuẩn sản sinh độc tố dưới dạng protein chuyên biệt cho

các loại côn trùng gây hại, nhưng không ảnh hưởng đến con người, động vật hữu nhũ,

và môi trường sống B thuringiensis có hiệu quả diệt sâu chậm, phổ ký chủ hẹp, thời

gian hiệu lực ngắn, chúng lại dễ bị ức chế bởi tia UV và mưa làm rửa trôi bào tử

2.2.3 Hình thức sinh sản của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis

Bacillus Thuringiensis sinh sản bằng bào tử Hình thái khuẩn lạc Bacillus Thuringiensis điển hình trên môi trường LB ở 30°C trong 18 - 24h là các khuẩn lạc có dạng hình tròn hoặc dẹt, màu trắng sữa, kích thước khuẩn lạc 1 mm – 7 mm có tâm dày, viền mỏng

2.3 Tổng quan về thuốc bảo vệ thực vật sinh học

Trong quy trình canh tác cây trồng truyền thống, việc sử dụng quá nhiều thuốc trừ sâu và phân bón hóa học cũng như việc trồng một loại cây trồng trên quy mô lớn trong thời gian dài đã dẫn đến sự tàn phá môi trường sinh thái đất nông nghiệp, bệnh cây, vấn đề côn trùng gây hại, dư lượng thuốc trừ sâu cây trồng và ô nhiễm môi trường đất, nước (Bardin và ctv, 2015) Với sự phát triển nông nghiệp xanh, người dân đang khẩn trương tìm kiếm các biện pháp phòng trừ dịch bệnh cây trồng an toàn, hiệu quả

và thân thiện với môi trường Kiểm soát sinh học chủ yếu được sử dụng để kiểm soát sinh vật gây hại trong thực vật thông qua sinh vật có ích và sản phẩm của chúng nhằm

Trichoderma, một loại nấm được sử dụng làm thuốc trừ bệnh sinh học để kiểm

soát dịch hại thực vật, chủ yếu tồn tại trong đất, không khí, bề mặt thực vật và các môi trường sinh thái khác và có thể kiểm soát hiệu quả nhiều loại bệnh thực vật

Trichoderma chủ yếu được sử dụng để kiểm soát các bệnh truyền qua đất ở nhiều loại

cây khác nhau và một số bệnh trên lá và cành Trichoderma có thể ngăn ngừa bệnh tật,

thúc đẩy tăng trưởng thực vật, cải thiện hiệu quả sử dụng chất dinh dưỡng, tăng cường sức đề kháng của cây và khắc phục tình trạng ô nhiễm hóa chất nông nghiệp (Yao và ctv, 2023)

6

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện nghiên cứu từ ngày 23/02/2023 đến ngày 01/3/2023

Địa điểm được thực hiện tại Xưởng Thực nghiệm Vi sinh Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Chủng nấm đối kháng

Nấm đối kháng Trichoderma và chủng vi khuẩn Bacillus Thuringiensis được

cung cấp bởi Xưởng Thực nghiệm Vi sinh, viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2.2 Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu

Gạo tấm, trấu, nitơ

Hình 3.1 Nguyên liệu làm môi trường nhân sinh khối nấm a) gạo tấm và trấu; b) nitơ

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: cân đồng hồ, nồi hấp tiệt trùng, tủ cấy vi sinh, máy lắc ổn nhiệt

Dụng cụ: khay trộn, đĩa petri, que cấy trang, bình tam giác 250ml, micropipet, ống pha loãng

3.3 Phương pháp nghiên cứu

a) b)

7

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma

Hình 3.3 Sơ đồ cấy chuyền nấm Xanh từ đĩa nấm cấp I sang bọc

8

3.3.1 Nhân sinh khối nấm Trichoderma

Cân 100g nitơ hòa vào 1L nước, cân 8kg tấm, 150g trấu và trộn đều Phân phối vào từng bịch nilon 400g hỗn hợp, cố định bịch bằng kim bấm và đậy kín bằng nút bông

Hình 3.4 Chuẩn bị nguyên liệu a) gạo tấm; b) nitơ; c) trấu

Hình 3.5 Môi trường sau khi đóng nút bông

Các bịch môi trường được hấp tiệt trùng ở 121 C trong 2 giờ và để nguội Sau

đó cho 40mL dung dịch nấm gốc đã được pha loãng vào từng bịch, lắc đều Túi giống được đặt ở nơi có điều kiện nhiệt độ thích hợp

b) a)

c)

9

Hình 3.6 Hấp tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp

Hình 3.7 Giống nấm Trichoderma a) dịch nấm trước khi pha loãng; b) dịch nấm sau khi

pha loãng

10

Hình 3.8 Đổ giống nấm vào môi trường đã tiệt trùng

3.3.2 Kiểm tra chế phẩm sinh học Bacillus Thuringiensis

Cho 10mL chế phẩm sinh học Bacillus Thuringiensis vào 90mL nước muối sinh

lý 0,9% đã hấp tiệt trùng Lắc đều trong 10 phút, thu được dịch mẫu gốc 100

Hình 3.9 Chế phẩm sinh học

Bacillus Thuringiensis

11

Hình 3.10 Dịch mẫu sau khi lắc đều

Pha loãng dịch mẫu gốc theo nồng độ từ 10-1 đến 10-6 với tỷ lệ 9mL nước cất và 1mL dịch mẫu từ nồng độ lớn hơn liên tiếp

Hình 3.11 Pha loãng dịch mẫu

12

Hút 200 μL dịch từ các ống nghiệm của ba nồng độ liên tiếp (10-4, 10-5,10-6) vào đĩa petri và cấy trang trên môi trường dinh dưỡng PCA với 2 lần lặp lại Ủ trong 24 giờ

và quan sát số khuẩn lạc trên đĩa petri

Hình 3.12 Cấy trang dịch mẫu trên đĩa petri

Mật số bào tử được tính theo công thức:

Mật độ (CFU/g) = (𝑛 𝐶1+𝐶2+𝐶3+𝐶4

1 +0,1𝑛2)×𝑉×10 −𝑛Trong đó:

C1, C2: số khuẩn lạc đếm được trên đĩa 1 và đĩa 2 ở nồng độ 10-4

C3, C4: số khuẩn lạc đếm được trên đĩa 1 và đĩa 2 ở nồng độ 10-5

n1, n2: số đĩa cấy ở nồng độ 10-4 và 10-5

n: nồng độ thấp nhất

V: thể tích dịch khuẩn cấy ở mỗi đĩa (mL)

13

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Nhân sinh khối nấm Trichoderma

Sau một tuần nhân sinh khối nấm Trichoderma spp., nấm phát triển tốt, bào tử

nấm xanh lan đều túi giống

Hình 4.1 Nấm Tricoderma sau 1 tuần cấy

4.1.2 Kiểm tra chế phẩm sinh học Bacillus Thuringiensis

Hình 4.2 Bacillus Thuringiensis sau 1 ngày nuôi cấy ở nồng độ 10-4

14

Hình 4.3 Bacillus Thuringiensis sau 1 ngày nuôi cấy ở nồng độ 10-5

Hình 4.4 Bacillus Thuringiensis sau 1 ngày nuôi cấy ở nồng độ 10-6

Theo kết quả ghi nhận đƣợc từ quan sát mật độ trên đĩa petri có đƣợc:

Bảng 4.1 Kết quả mật độ khuẩn lạc trên đĩa petri ở nồng độ 10-4, 10-5, 10-6

4.2 Thảo luận

4.2.1 Nhân sinh khối nấm Trichoderma

Nấm Trichoderma sau một tuần nhân giống có màu xanh đặc trƣng, tơ nấm lan rộng khắp túi giống

15

4.2.2 Kiểm tra chế phẩm sinh học Bacillus Thuringiensis

Sau khi cấy trang trên đĩa petri với các nồng độ 10-4, 10-5, 10-6 và ủ trong 24 giờ, mật độ được tính khi số lượng khuẩn lạc trong khoảng 25-250 khuẩn lạc

Ở nồng độ 10-4, 2 đĩa petri có mật độ lớn hơn 250 khuẩn lạc, không thể đếm được số khuẩn lạc

Ở nồng độ 10-5, có khuẩn lạc đơn và số lượng nằm ttrong phạm vi 25 - 250 nên đếm được

Ở nồng độ 10-6, ở lần lặp lại 1 số khuẩn lạc đơn có thể đếm được nhưng ở lần lặp lại 2 số lượng khuẩn lạc nằm ngoài phạm vi 25 – 250 nên không đếm được

Số lượng khuẩn lạc chênh lệch giữa các đĩa trong cùng nồng độ cho thấy trong quá trình cấy, thao tác pha loãng mẫu và cấy trang không chuẩn làm cho số lượng khuẩn lạc ở các đĩa có sự chênh lệch và mọc không đều không rõ khuẩn lạc đơn

Ở các nồng độ 10-4, 10-5, 10-6 đều có xuất hiện Bacillus Thuringiensis Tuy

nhiên, số khuẩn lạc đơn ở các nồng độ không thỏa điều kiện để tính mật độ khuẩn trong mẫu theo phương pháp CFU

13

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1 Sơn, N V (2020) Thực trạng và phát triển thuốc bảo vệ thực vật sinh học ở Việt Nam

2 Hùng, T N (2020) Thử nghiệm sản xuất men tiêu hóa phytase từ Trichoderma

asperellum trên quy mô pilot Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam 10, 119

3 Phạm Thị Thùy, 2008 Nghiên cứu công nghệ sản xuất và sử dụng thuốc sâu

sinh học (Bt, NPV, nấm Bb, Ma) thế hệ mới trừ sâu trong sản xuất rau an toàn

Nhà xuất bản Nông nghiệp, 201 – 211

Tài liệu tiếng nước ngoài

4 Tilocca, B., Cao, A., & Migheli, Q (2020) Scent of a killer: microbial

volatilome and its role in the biological control of plant pathogens Frontiers in

Microbiology, 11, 509409

5 Bardin, M., Ajouz, S., Lopez-Ferber, M., Graillot, B., Siegwart, M., & Nicot, P

C (2015) Is the efficacy of biological control against plant diseases likely to be

more durable than that of chemical pesticides? Frontiers in Plant Science, 6,

140367

6 Harman, G., Khadka, R., & Doni, F (2021) Benefits to plant health and

productivity from enhancing plant microbial symbionts Frontiers in Plant

Science, 11, 610065

7 Yao, X., Guo, H., Zhang, K., Zhao, M., Ruan, J., & Chen, J

(2023) Trichoderma and its role in biological control of plant fungal and

nematode disease Frontiers in microbiology, 14, 1160551

https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1160551

8 Guo, Y., Ghirardo, A., Weber, B., Schnitzler, J P., Benz, J P., & Rosenkranz, M (2019) Trichoderma species differ in their volatile profiles and in antagonism

toward ectomycorrhiza Laccaria bicolor Frontiers in microbiology, 10, 448972

9 Maruyama, C R., Bilesky-José, N., de Lima, R., & Fraceto, L F (2020) Encapsulation of Trichoderma harzianum preserves enzymatic activity and