nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và kháng khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây lúa của vi khuẩn bacillus subtilis

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ THỊ PHƯƠNG DUNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN VÀ KHÁNG KHUẨN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ TRÊN CÂY LÚA CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS LUẬN VĂ

Trang 1

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LÊ THỊ PHƯƠNG DUNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN VÀ KHÁNG KHUẨN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ TRÊN CÂY LÚA

CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Đà Nẵng – Năm 2023

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

Trang 2

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LÊ THỊ PHƯƠNG DUNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN VÀ KHÁNG KHUẨN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ TRÊN CÂY LÚA

CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số : 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD 1: TS Nguyễn Thị Đông Phương GVHD 2: TS Phạm Thị Mỹ

Đà Nẵng – Năm 2023

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

Trang 3

Trang 4

Trang 5

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

Trang 6

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

Trang 7

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TRANG THÔNG TIN LUẬN VĂN THẠC SĨ iii

INFORMATION PAGE OF MASTER THESIS iv

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

1.1.3 Ứng dụng của bacteriocin trong nông nghiệp 9

1.2 Tổng quan về Bacillus subtilis 9

1.2.1 Lịch sử phát hiện và phân loại 9

1.2.2 Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên 10

1.2.3 Đặc điểm hình thái 10

1.2.4 Ứng dụng 11

1.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về khả năng kháng bệnh của vi khuẩn Bacillus subtilis 12

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới 12

1.3.2 Nghiên cứu ở Việt Nam 14

1.3.3 Kháng bệnh đốm lá 15

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

Trang 8

1.4 Tình hình sử dụng phân bón và thuốc bảo vệ thực vật cho cây lúa nước ở Việt

Nam 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng và vật liệu 21

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 21

2.2.1 Hóa chất 21

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Xác định khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis được phân lập từ nước thải 21

2.3.2 Xác định yếu tố pH ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis 24

2.3.3 Xác định độ mặn của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis 24

2.3.4 Xác định nguồn nitơ của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis 24

2.3.5 Xác định yếu tố thời gian ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis 25

2.3.6 Xác định khả năng đối kháng khuẩn hại lúa theo phương pháp đối kháng trực tiếp 25

2.3.7 Thử nghiệm đối kháng khuẩn hại lúa trên cây lúa 25

2.3.8 Khảo sát nồng độ bacteriocin ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn hại lúa 26

2.3.9 Xử lý số liệu 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Xác định khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis được phân lập từ nước thải 27

3.1.1 Xác định khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis 27

3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng kháng khuẩn của

Trang 9

3.1.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng

hợp bacteriocin của B subtilis 35

3.2 Thử nghiệm khả năng đối kháng khuẩn hại lúa 36

3.2.1 Khảo sát khả năng đối kháng khuẩn hại lúa 36

3.2.2 Khảo sát nồng độ bacteriocin đến khả năng kháng khuẩn hại lúa 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 10

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

B subtilis Bacillus subtilis

Trang 11

DANH MỤC BẢNG Số hiệu

Trang 12

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Đề xuất sơ đồ phân loại vi khuẩn được tạo ra bởi vi khuẩn Gram dương và Gram âm

5

Hình 1.2 Cấu trúc bậc 03 của bacteriocin được chọn [14] 7

Hình 1.3 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis nhuộm Gram quan sát dưới

kính hiển vi

11

Hình 1.5 Bệnh đốm lá do Alternaria crassa NB573 gây ra trên cây: a cà

chua (A), rau mùi (B), mùi tây (C), cỏ dại jimson (D), và các triệu chứng trên cuống và thân cỏ dại jimson (E) (F, G) Bào tử hình thành trên lá hoại tử được quan sát bằng kính hiển vi với kích thước lần lượt là 40X và 100X

16

Hình 3 1 Khả năng đối kháng của B subtilis MT300405 với vi khuẩn

chỉ thị; (A) Hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn chỉ thị; (B) Hoạt tính kháng khuẩn của mẫu đối chứng và mẫu xử lý bằng enzyme catalase

27

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh bacteriocin của

B subtilis MT300405

28

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh

bacteriocin của B subtilis MT300405; Các chữ cái khác nhau

thể hiện sự khác nhau có nghĩa (p<0,05)

30

Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh bacteriocin của

B subtilis MT300405; Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác

nhau có nghĩa (p<0,05)

31

Hình 3.5 Ảnh hưởng của độ mặn môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh

bacteriocin của B subtilis MT300405; Các chữ cái khác nhau

thể hiện sự khác nhau có nghĩa (p<0,05)

33

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ môi trường nuôi cấy đến khả năng

sinh bacteriocin của B subtilis MT300405; Các chữ cái khác

nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa (p<0,05)

35

Hình 3.7 Khả năng kháng khuẩn hại lúa của B subtilis MT300405 A:

Chủng chỉ thị phát triển trên môi trường TSA; B: Chủng chỉ

thị bị hạn chế bởi sự hiện diện của B subtilis MT300405

37

Trang 13

Hình 3.8 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chỉ thị hại lúa 38

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ bacteriocin đến khả năng kháng khuẩn hại lúa

39

Trang 14

MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết của đề tài

Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria, LAB) được xem là vi sinh vật an toàn

(Generally Recognized as Safe, GRAS) và được sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, y tế, Những năm gần đây, nhóm vi khuẩn này được đánh giá là nguồn tiềm năng to lớn sản sinh các hợp chất kháng khuẩn, được quan tâm nhiều nhất trong số đó là bacteriocin [1][2]

Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất protein được tổng hợp ở ribosome ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương [3] Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan làm suy yếu thành tế bào của vi khuẩn gây hại [4][5] Mặc khác, các bacteriocin được vi khuẩn tổng hợp có khả năng ức chế các loài vi khuẩn khác loài (phổ rộng) và các loài vi khuẩn có quan hệ gần gũi (phổ hẹp) [6] Bateriocin dễ dàng bị phân hủy bởi enzyme proteases có trong hệ tiêu hóa của người và động vật nên có thể nói là vô hại đối với con người, không ảnh hưởng đến môi trường [7]

Hầu hết các loài từ chi Bacillus cũng được coi là vi khuẩn sản xuất bacteriocin

quan trọng trong công nghiệp, có lịch sử sử dụng an toàn và chúng cũng là vi sinh vật GRAS [1][2] Nhiều vi khuẩn và các chất ức chế giống bacteriocin đã được phân loại

cho LAB nhưng hiện nay vẫn còn hạn chế về sơ đồ phân loại cho vi khuẩn Bacillus [8] Vi khuẩn B subtilis với khả năng sinh nhiều loại enzyme, kháng sinh tự nhiên phổ

rộng cũng như khả năng hình thành nha bào tử đã trở thành đối tượng được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu nhằm phục vụ công tác bảo vệ cây trồng chống lại nhiều loại mầm bệnh khác nhau [9][10]

Quá trình sinh tổng hợp bacteriocin chịu ảnh hưởng của một số yếu tố như nguồn nitơ (N), nồng độ muối và các điều kiện khác Trong phân tử bacteriocin bao giờ cũng có phần protein hoạt tính, quá trình sinh tổng hợp bacteriocin luôn cần nguồn nguyên liệu nitơ hữu cơ hoặc nitơ vô cơ Các acid amin khác nhau cũng có ảnh hưởng khác nhau đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin Sự thiếu hụt các thành phần này ảnh

Trang 15

hưởng xấu đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin Giống như hầu hết các vi sinh vật

khác, sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis còn phụ thuộc nhiều

vào nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy [10]

Bệnh do vi sinh vật gây ra trên thực tế có thể dẫn đến thiệt hại kinh tế lên tới trên 200 tỷ USD [11] Hiện nay, để phòng và trị các bệnh do vi sinh vật gây ra trên cây trồng, người dân chủ yếu sử dụng các hóa chất nông nghiệp Việc sử dụng nhiều loại hóa chất bảo vệ thực vật đã để lại nhiều hệ quả nguy hại trong sản xuất và môi trường, hình thành tính kháng của các tác nhân gây bệnh và để lại tồn dư trong sản phẩm Nhiều nghiên cứu nhằm tìm kiếm các phương pháp kiểm soát và phòng trừ vi sinh vậy gây bệnh thực vật đảm bảo và ít nguy hại hơn đến môi trường sinh thái được thực hiện [12] Trong đó, biện pháp khống chế sinh học sử dụng vi sinh vật đối kháng cho thấy vừa mang lại hiệu quả, vừa đảm bảo sự thân thiện với môi trường và đặc biệt là an toàn cho con người, phù hợp với nguyên tắc canh tác nông nghiệp hữu cơ, hướng đến một nền nông nghiệp phát triển bền vững

Xuất phát từ những luận điểm khoa học trên đây chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và kháng khuẩn gây bệnh đốm

lá trên cây lúa của vi khuẩn Bacillus subtilis”

2 Mục tiêu của đề tài

Đề tài được thực hiện nhằm đạt mục tiêu cụ thể như sau:

- Xác định được khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis phân lập từ

Trang 16

- Xác định độ mặn của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng

hợp bacteriocin của B subtilis

- Xác định nguồn nitơ của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh

tổng hợp bacteriocin của B subtilis

- Xác định thời gian nuôi cấy B subtilis ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp

Kết quả nghiên cứu đề tài sẽ là những dẫn liệu khoa học mới nhằm bổ sung đầy

đủ hơn các đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus sp., từ đó định hướng ứng

dụng thực tiễn

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin đối kháng vi sinh vật gây bệnh trên thực vật, đảm bảo sinh trưởng, phát triển và năng suất cho cây trồng, góp phần phát triển một nền nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường

4 Bố cục đề tài

Luận văn gồm 3 chương:

Chương 1 Tổng quan tài liệu

Chương 2 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu Chương 3 Kết quả và biện luận

Trang 17

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về Bacteriocin

1.1.1 Giới thiệu chung về Bacteriocin

Trong quá trình đấu tranh sinh tồn, vi sinh vật thường tiết ra những chất có khả năng kìm hãm, ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật khác có sự cạnh tranh với chúng về nơi sống và nguồn dinh dưỡng như các acid hữu cơ, diacetyl, acetoin, peroxide hidro, reuterin, reutericyclin, các peptide kháng nấm… trong số đó phổ biến nhất là bacteriocin [1][2][3]

Bacteriocin bản chất là các peptit tự nhiên do nhiều loại vi khuẩn sản sinh ra nhằm mục đích tiêu diệt các vi khuẩn khác Bacteriocin được A Gratia phát hiện vào năm 1925 trong quá trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này đã thúc đẩy sự phát triển những nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn Ông gọi chất phát hiện ra đầu tiên là Colicin vì nó có khả

năng tiêu diệt E coli Thuật ngữ bacteriocin được Jacob và cộng sự đề xuất từ năm

1953 [1] Các bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí ở nồng độ rất thấp Hiệu quả kháng khuẩn của bacteriocin với tế bào vi khuẩn mẫn cảm không phụ thuộc vào số lượng acid amine có trong phân tử Đặc tính diệt khuẩn cao hơn ở pH thấp, tương đối bền ở nhiệt độ cao và không bị ảnh hưởng bởi các dung môi hữu cơ Các anion ở nồng độ cao có thể làm giảm hiệu quả diệt khuẩn của một số bacteriocin tích điện dương nhờ sự loại bỏ cạnh tranh Các enzyme thủy phân protein tích điện âm có thể thủy phân các peptide này, từ đó dẫn đến sự mất hoạt tính Bacteriocin được tạo ra

bởi cả vi khuẩn Gram dương (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus,

Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus và Propionibacterium) và vi khuẩn Gram âm

(Escherichia coli, Shigella, Serratia, Klebsiella và Pseudomonas) [1][13]

Bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn Gram dương được Klaenhammer phân loại lần đầu tiên vào năm 1993 Việc phân loại vi khuẩn trải qua những thay đổi liên tục, liên quan đến các nghiên cứu về cấu trúc, trình tự acid amin và cơ chế hoạt động của chúng Trong nghiên cứu của TM Karpin ́ski and AK Szkaradkiewicz năm 2016, phân

Trang 18

loại bacteriocin được nêu ra, có tính đến một số đặc điểm bao gồm trọng lượng phân tử của chúng, biểu hiện của mô-típ YGNGVXC, sự hiện diện của cầu nối disulfua,

hoạt động đối với vi khuẩn thuộc giống Listeria, và nhạy cảm với nhiệt độ Cây phân

loại bacteriocin được sản xuất bởi vi khuẩn Gram dương và Gram âm được đề xuất trong Hình 1.1 [14]

nghiên cứu trên 40 chủng Lactococcus lactis cho thấy 35 chủng sinh ra nisin (Hurst,

1981) Nisin được phép sử dụng ở hơn 40 quốc gia và đã được sử dụng làm chất bảo

Class I:

Sau dịch mã, có chứa các acid amin bất thường (thuốc kháng sinh)

Class II:

Ổn định nhiệt, không biến tính,

không chứa lanthionine

Class III:

Khối lượng phân tử trên

30 kDa

Class IV:

Chứa chất béo hoặc carbohydrate

Bacteriocin sản xuất bởi Gram (-)

Trang 19

quản thực phẩm trong hơn 50 năm Tuy nhiên, nó không được coi là sản phẩm tự nhiên khi nó được sử dụng với nồng độ cao hơn những gì có trong thực phẩm được lên men tự nhiên, bằng cách nuôi cấy để sản xuất nisin Thuật ngữ ‘tự nhiên’ này cũng tạo một áp lực lớn khi bacteriocin được sản xuất bởi vi khuẩn biến đổi gen Mặc dù nisin hiện là bacteriocin duy nhất được sử dụng ở Hoa Kỳ, nhiều bacteriocin khác được sản xuất bởi các thành viên của LAB có ứng dụng mạnh mẽ trong các sản phẩm thực phẩm

1.1.2 Đặc tính của bacteriocin

1.1.2.1 Thành phần hóa học

Một vài loại enzyme cụ thể như proteinases, lipases…được sử dụng để xác định thành phần hóa học của bacteriocin Một trong những bacteriocin đã được xác định thành phần hóa học là Streptosin STH1 Thành phần của nó gồm protein, lipid và nhóm photphat (Hình 1.2)

Bản chất protein của vi khuẩn được xác định sớm bởi sự phân hủy các chế phẩm thô bởi các enzym phân giải và trọng lượng phân tử gần đúng của chúng được xác định bởi khả năng khuếch tán của các chất ly giải qua thạch hoặc màng bán thấm Nghiên cứu từ rất sớm về bản chất sinh hóa của bacteriocin đã nêu ra được colicin trong một số nghiên cứu Hai loại colicin tinh khiết khác nhau thu được; một là phức

hợp protein lipopolysaccharide liên kết với O soma kháng nguyên của vi khuẩn E coli

sản sinh như colicin K-K235, và sau khi tách ra khỏi liên kết, hoạt động được kết hợp với gốc cacboxyal (CHO) Nhóm colicin khác được tìm thấy là một protein chứa ít hoặc không chứa carbohydrate, chẳng hạn như colicin E2-P9, được tìm thấy là một protein có khối lượng phân tử khoảng 60 kDa Các colicin liên quan khác, E2-CA42 và colicin A, cũng được tinh chế và cho thấy là một protein có hàm lượng carbohydrate thấp (khoảng 10%) Hai chất này khác với colicin K-K235 [13][14]

Trang 20

Hình 1.2 Cấu trúc bậc 03 của bacteriocin được chọn [14]

(a) nisin A; (b) glycocin F; (c) plantaricin F; (d) pediocin PA-1; (e) salivaricin A; (f) enterocin 96; (g) helveticin J; (h) enterolysin A

Phân tích hóa học cho thấy bacteriocin là loại protein đơn giản có trọng lượng

phân tử thấp Tuy nhiên với nhiều chủng khác như Clostridia, Staphylococci,

Lactobacillus thành phần hóa học của bacteriocin bao gồm protein, lipid và

carbohydrate Bản chất sinh hóa của các nhóm bacteriocin khác cũng đã được xác

định: Pyocins loại R do P aeruginosa tạo ra đã được tinh chế bởi Kageyama và Egami

vào năm 1962 và được chỉ ra là các hạt protein tYee của carbohydrate và acid nucleic Quá trình tổng hợp pyocin này là cảm ứng và kèm theo quá trình ly giải tế bào Một nhóm pyocins khác, còn được gọi là S pyocins, đã được tinh chế từ sản phẩm phân

giải do mitomycin C của P aeruginosa Chúng được phân biệt với pyocins loại R bởi

tốc độ khuếch tán của chúng qua thạch, độ nhạy của chúng với quá trình tiêu thụ protease và thực tế là chúng không bị trung hòa với kháng huyết thanh chống lại bất kỳ pyocins loại R nào Mặt khác, Cloacin C5 là một đại phân tử tương tự như R pyocin Tất cả các bacteriocin dường như đại diện cho một nhóm không đồng nhất của các chất từ một protein nhỏ đến một hạt cao phân tử với cấu trúc và thành phần phức tạp, nhưng phần chịu trách nhiệm chính cho hoạt động kháng khuẩn dường như chỉ là protein trong mọi trường hợp [15][14]

Trang 21

1.1.2.2 Phổ hoạt động của bacteriocin

Bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm được xem là những chất kháng khuẩn phổ hẹp, chủ yếu tác động với những vi khuẩn có quan hệ gần gũi trong cùng nơi sống, gây chết tế bào đích bằng cách tạo lỗ trên màng sinh chất hoặc bằng phân cắt acid nucleic

(DNA, rRNA và tRNA) [13]

Đối với bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương có hoạt tính ức chế các loại vi khuẩn Gram dương Tuy nhiên một vài loại vi khuẩn Gram âm bị ức chế bởi bacteriocin hay chất giống bacteriocin được sinh ra bởi vi khuẩn Gram dương Những vi khuẩn Gram dương có khả năng ức chế vi khuẩn Gram âm như

Lactobacillus acidophilus, Bacillus cereus, Streptococci, Staphylococci, Corynebacteria [15][14]

1.1.2.3 Phương thức hoạt động của bacteriocin

Cơ chế kháng khuẩn được thực hiện trên các plasmids Có 2 lớp plasmid, lớp lớn là những plasmid có số lượng sao chép thấp và lớp nhỏ là những plasmid có số lượng sao chép cao Những plasmid lớn mang những gen khác như colicin operon Colicin operon thường được cấu tạo bởi một số gen chính Những gen này bao gồm gen miễn dịch, một gen cấu trúc colicin và một Brp (bacteriocin release protein) Nghiên cứu cho thấy việc duy trì plasmid colicin rất quan trọng đối với tế bào có họ hàng với chúng bởi vì nếu một tế bào mất gen miễn dịch nó nhanh chóng bị phá hủy bởi colicin Cùng lúc colicin được phóng ra từ tế bào phân chia bằng việc sử dụng lysis protein làm chết tế bào

Bản thân colicin bao gồm 3 phần hình cầu, phần thứ nhất quy định mục tiêu và gắn với cơ quan cảm nhận của tế bào nhạy cảm Phần thứ 2 liên quan đến chuyển mã hợp tác với tế bào mục tiêu Phần thứ 3 là có chức năng tiêu diệt và tạo ra một lỗ trong màng tế bào mục tiêu hoặc hoạt động như một hạt nhân để phân giải DNA hoặc RNA của tế bào mục tiêu Bởi vì chúng nhằm vào cơ quan cảm nhận nhất định và sử dụng cơ chế chuyển mã nhất định nên các tế bào có thể tự thân kháng lại colicin bằng cách ức chế hoặc xóa bỏ gen cho những protein này [14]

Trang 22

1.1.3 Ứng dụng của bacteriocin trong nông nghiệp

Hàng năm trên thế giới các bệnh ở cây trồng đã gây thiệt hại từ 12 – 15% tổng giá trị mùa màng Phần lớn các bệnh này là do vi khuẩn có hại gây ra Hệ vi khuẩn sống trên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Nơi sống và phương thức sống của chúng cũng rất khác nhau Chúng có thể ký sinh trên lá hoặc rễ, hay nhiễm vào trong các mô thực vật như các vi khuẩn kí sinh, cộng sinh hoặc vi khuẩn gây bệnh Trong quá trình sống, nhiều vi khuẩn đã tiết ra bacteriocin nhằm cạnh tranh không gian sống và nguồn dinh dưỡng, tuy nhiên mới chỉ có một số ít bacteriocin từ những vi khuẩn này được nghiên cứu, mô tả đặc tính di truyền và hóa sinh Dựa trên cơ sở này, các nhà khoa học đã đề xuất một phương pháp kiểm soát bệnh cây trồng do vi khuẩn gây ra bằng cách sử dụng các chủng sinh bacteriocin hoặc sử dụng trực tiếp các bacteriocin đã điều chế Hiện nay, một số bacteriocin nhóm này đã được sản xuất và bán trên thị

trường, điển hình là agrocin K48, một bacteriocin do Agrobacterium radiobacter K48 sinh ra, có khả năng kháng Agrobacterium tumifaciens gây bệnh mụn cây cho nhiều

loại cây trồng

Ngoài vi khuẩn gây bệnh, nấm cũng là một mối đe dọa lớn đối với cây trồng Magnusson (2003) đã nghiên cứu các vi khuẩn lactic phân lập từ nhiều môi trường khác nhau và thấy rằng 10% các chủng vi khuẩn này sinh ra bacteriocin có khả năng

ức chế Aspergillus fumigatus và 4% tiết bacteriocin có hoạt tính kháng loại mốc này

rất nhanh

1.2 Tổng quan về Bacillus subtilis

1.2.1 Lịch sử phát hiện và phân loại

B subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và

tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis” Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium” Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis

Theo phân loại của Bergey (1974), B subtilis thuộc: – Giới (Kingdom): Bacteria

– Ngành (Division): Firmicutes

Trang 23

– Lớp (Class): Bacilli – Bộ (Order): Bacillales – Họ (Family): Bacillaceae – Giống (Genus): Bacillus

– Loài (Species): Bacillus subtilis

1.2.2 Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên

Vi khuẩn B subtilis có mặt trong hầu hết các môi trường tự nhiên, phần lớn cư

trú trong đất, rơm rạ và cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô” Thông thường đất trồng có khoảng 106 - 107 CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng như vùng sa mạc thì vi khuẩn này gần như không hiện diện Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản

xuất như bột mì (trong bột mì B subtilis chiếm 75 - 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo,

trong các thực phẩm như mắm, tương, chao [16]

B subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi một

số loài khác như B sphaericus, B cereus cần các hợp chất hữu cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng Đặc biệt các loài như B popilliae, B lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy thông thường

như nutrient agar (NA) hay nutrient broth (NB) [17]

1.2.3 Đặc điểm hình thái

B subtilis là trực khuẩn Gram (+), kích thước 0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8 µm Bào từ phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 1000C trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm [17]

Trang 24

Hình 1.3 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis nhuộm Gram quan sát dưới kính hiển vi 1.2.4 Ứng dụng

Năm 1941, B subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi của

Đức Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần khiết

của B subtilis Gần đây, B subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế giới

B subtilis có tác dụng có lợi đối với vật chủ của chúng, điều này phụ thuộc vào

tiềm năng của chúng để chịu đựng sự căng thẳng oxy, nhiệt và stress thẩm thấu trong quá trình bảo quản và xử lý

B subtilis là một loại vi khuẩn đã được lên kế hoạch thành công để biểu hiện các

yếu tố kháng nguyên không đồng nhất về mặt di truyền với protein của bào tử, như một loại vacxin được ưu tiên chống lại nhiệt và ảnh hưởng như một sinh vật probiotic cho cả động vật và con người

Nhóm B subtilis, có tiềm năng sản xuất các sản phẩm thương mại ứng dụng

trong y học, trong nông nghiệp và trong công nghiệp thực phẩm [18] Một loại enzyme

đông máu hiệu quả mới (BY-1) được sản xuất từ B subtilis PNG27 Phân tích của

MALDI-TOF-MS/MS cho thấy nó thuộc họ M4 peptidase và có 521 acid amin Ngoài ra BY-1 có thể làm giảm thời gian đông của sữa đông, UHT, sữa lạnh và sữa hoàn nguyên Hơn nữa, hai loại phô mai tương ứng được sản xuất bởi BY-1 và Rennet Kết quả cho thấy các chất thủy phân protein (WSN, CTA-N và PTA-N) của phô mai do BY-1 sản xuất cao hơn Rennet [19]

Trang 25

Các chủng B subtilis cũng được sử dụng trong việc tạo ra các vacxin hoặc các kháng nguyên hoặc sản xuất tế bào kháng nguyên Việc áp dụng các bào tử B subtilis

làm phương tiện vacxin, phân phối qua miệng, đã thu hút sự chú ý vì các hiệu ứng probiotic của nó và thời hạn sử dụng kéo dài [20]

1.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về khả năng kháng bệnh của vi

khuẩn Bacillus subtilis

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới

B subtilis tạo ra một phổ rộng các hợp chất bền với nhiều hoạt tính sinh học

Chúng là vi sinh vật phổ biến trong tự nhiên và có thể được tìm thấy trong đất, nước,

không khí Bacillus dễ dàng sản sinh hợp chất kháng khuẩn và các enzym có phổ rộng chống lại tác nhân gây bệnh Tiềm năng của các chủng thuộc nhóm B subtilis là tạo ra

nhiều chất chuyển hóa thứ cấp làm trung gian cho quá trình kháng khuẩn đã được công

nhận trong nhiều thập kỷ Đối với bất kỳ chủng nào thuộc nhóm B subtilis, hiện nay

người ta ước tính rằng ít nhất 4-5% bộ gen của nó được dành cho việc sản xuất các hợp chất kháng vi khuẩn (Antimicrobial compounds - AMCs) [21] Các phân tử này chủ yếu là các peptit kháng khuẩn (Antimicrobial peptides-AMPs) Cấu trúc của chúng thường là mạch vòng, kỵ nước và chứa các chất đặc biệt như D-acid amin (AA) hoặc liên kết thioether nội phân tử [14] [3]

Ngoài AMPs, các chất chuyển hóa dễ bay hơi cũng tạo thành một lượng lớn các chất kháng khuẩn thể hiện nhiều vai trò chuyển hóa và chức năng Các peptit được tổng hợp ribosom (RP) thường có nguồn gốc từ các tiền chất ngắn (khoảng 100 AA) và được xử lý thành các hợp chất lớn hơn thông qua các biến đổi sau dịch Các enzym khác nhau làm trung gian cho những thay đổi này và do đó tạo ra nhiều cấu trúc hóa học đa dạng Hầu hết các peptit này ban đầu được gọi là “bacteriocins”, có đặc điểm là các phân tử trọng lượng phân tử thấp có tác dụng ức chế các hoạt động phát triển chống lại vi khuẩn có liên quan chặt chẽ đến chủng sinh sản

Ngoài vi khuẩn, các loại enzyme khác thể hiện hoạt động đối kháng cũng được tổng hợp từ ribôxôm Tuy nhiên, những hợp chất đó thể hiện các hoạt động trao đổi chất đa dạng như trung gian cảm nhận số lượng (QS), ly giải tế bào hoặc cảm ứng

Trang 26

năng lực di truyền (Schmidt, 2010; Shafi và cộng sự, 2017) Cũng cần lưu ý rằng các phân tử được gọi là BLIS (chất ức chế giống vi khuẩn) bao gồm các AMPs mà quá trình tổng hợp ribosome vẫn chưa được xác nhận (Abriouel và cộng sự, 2011)

Bacteriocin là một trong những hợp chất kháng khuẩn được tổng hợp bởi vi

khuẩn probiotic B subtilis như một chất chuyển hóa thứ cấp B subtilis là thành viên

của trực khuẩn là một trong những chế phẩm sinh học quan trọng nhất được sử dụng

thương mại Theo FDA (Food and Drug administrated), B subtilis thường được công

nhận sử dụng an toàn (GRAS) Và theo những nghiên cứu của họ để đưa ra những

thông báo của tổ chức này thì B subtilis có thể được coi là vi khuẩn probiotic cho

động vật và con người

Hiện nay việc nghiên cứu, ứng dụng bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm, đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công, góp phần vào việc nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại Bacteriocin là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này mà việc ứng dụng của vi khuẩn lactic đa dạng và phong phú hơn

Theo Hammami, A Rhouma, B Jaouadi, A Rebai và X Nesme (2009) kết luận

rằng B subtilis 14B và bacteriocin do nó sản sinh ra có tác dụng trong việc giảm tỷ lệ nhiễm trùng ở thực vật do Ag.tumefaciens gây ra [22]

Theo kết quả nghiên cứu Liu và cs (2015), đặc tính của bacteriocin được sản xuất

bởi B subtilis EMD4 được phân lập từ Ganjang (dịch đậu nành), có hoạt tính kháng

khuẩn mạnh Khả năng kháng khuẩn ổn định ở pH 3 - 9 nhưng không hoạt động ở pH từ 10 trở lên Sau 15 phút ở 80oC vẫn còn khả năng kháng khuẩn nhưng giảm 50% [23]

Salum, Hwang, Kyeong và Jeong (2012) cho thấy các thuộc tính bacteriocin của

vi khuẩn B subtilis H27 phân lập từ Cheonggukjang (đậu nành lên men) có khả năng ức chế vi khuẩn Listeria monocytogenes ATCC 19.111 Các bacteriocin của B subtilis H27

ổn định nhất ở pH 7 và ổn định giữa pH 3 ÷ 6 và 8 ÷ 9 nhưng không hoạt động ở pH 10

Bacteriocin từ B subtilis H27 có thể được dùng một chất bảo quản thực phẩm để ức chế

Bacillus cereus và Lactobacillus monocytogenes, đây là hai tác nhân gây bệnh trên thực

phẩm [24]

Trang 27

1.3.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Kết quả nghiên cứu của Đào Văn Thông, Nguyễn Thu Hà, Phạm Văn Toản và

Phạm Thu Thủy (2011) kết luận: Từ 15 chủng Bacillus nghiên cứu đề tài đã tuyển chọn được chủng B subtilis B16 có hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh

cho cây khoai tây cao, có khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật (IAA); đồng thời là chủng vi sinh vật có mức độ an toàn sinh học cao (cấp độ 1) Đây là chủng vi sinh vật có giá trị sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh vật chức năng

Thử nghiệm trên cây khoai tây cho thấy, chủng B subtilis B16 có khả năng hạn chế

bệnh héo xanh vi khuẩn, tăng khả năng sinh trưởng và phát triển đối với cây khoai tây [25]

Kết quả nghiên cứu của Hoàng Xuân Quang, Vũ Thị Thanh Hoàn, Nguyễn Hiếu

Hạnh cho thấy 125 dòng vi khuẩn Bacillus được phân lập từ các loại rau họ thập tự, trong đó có 18 dòng Bacillus đối kháng mạnh với vi khuẩn Xanthomonas gây bệnh đốm lá trên rau họ thập tự Và xác định được 2 dòng B subtilis trên Cải Ngọt và Rau Dền, 3 dòng Bacillus licheniformis trên Cải Xang, Cải Ngọt và Rau Muống [26]

Kết quả nghiên cứu của Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Hồng Phấn, Trần Anh

Thư (2018): Sàng lọc khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của

180 chủng vi khuẩn, kết quả thu được 2 chủng vi khuẩn lactic (SU31, SU41) và 9

chủng vi khuẩn Bacillus (CARE2, BT32, BSU21, BSU22, BSU51, BSU63, BA21,

BV1) thể hiện tính chất đối kháng thông qua cơ chế sinh hợp chất bacteriocin [27]

Nghiên cứu của Đỗ Thị Hiền (2018), B subtilis là chủng vi khuẩn có khả năng

sinh bacteriocin có hoạt lực cao nhất trong môi trường LB, tốc độ lắc 180 vòng/phút, nguồn nitơ là cao nấm men và pepton, nồng độ muối NaCl 3.5%, pH = 7, trong thời gian 24 giờ, phương pháp nuôi cấy động Bacteriocin sinh ra có khả năng kháng

khuẩn cao với Vibrio spp Khả năng kháng khuẩn với Staphylococus spp.,

Pseudomonas spp thấp hơn so với Vibrio spp Vì vậy, có thể sử dụng chế phẩm thô

thu được sau quá trình nuôi cấy B subtilis đưa vào thử nghiệm trên ao nuôi tôm, cá

để ngăn ngừa một số loại bệnh hiệu quả do các vi khuẩn này gây nên và thay thế cho các chất kháng sinh [28]

Trang 28

1.3.3 Kháng bệnh đốm lá

Thương mại toàn cầu gia tăng, cùng với biến đổi khí hậu và những hạn chế trong các sản phẩm bảo vệ thực vật, đã tạo điều kiện cho sự xuất hiện và hình thành của các bệnh thực vật mới, từ đó gây ra thiệt hại đáng kể cho cây trồng [29][30] Việc nuôi trồng trái cây đang bị đe dọa bởi một số bệnh thực vật do vi khuẩn như bệnh thối nhũn

trên quả kiwi do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv actinidiae (Psa) gây ra, đốm vi khuẩn trên quả đá do Xanthomonas arboricola pv pruni (Xap) và đốm lá ở dâu tây do

Xanthomonas fragariae (Xf) gây ra [29]

Bệnh đốm lá trên nhóm rau họ thập tự với triệu chứng bệnh điển hình là đốm

xanh giọt dầu, sũng nước, hơi lõm so với bề mặt lá do vi khuẩn Xanhthomonas sp gây

ra (Hình 1 4) Bệnh đốm lá là một trong những nguyên nhân làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm đáng kể, đặc biệt trong giai đọan mùa mưa Thuốc hóa học thường được sử dụng trong phòng trừ bệnh do có hiệu quả cấp tính cao nhưng có nhiều rủi ro cho sức khỏe con người, suy thoái môi tường sinh thái, hình thành tính kháng của các tác nhân gây bệnh và để lại tồn dư trong sản phẩm Sử dụng các vi sinh vật đối kháng trong việc phòng và trừ bệnh có nhiều triển vọng, đáp ứng với yêu cầu sản xuất rau an toàn và hướng đến một nền nông nghiêp phát triển bền vững

Ngoài ra, bệnh đốm lá do vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas syringae pv

syringae gây ra, là một trong những bệnh hại lá gây hại nhiều nhất đối với các vùng

trồng đậu tương và lúa trên thế giới và khả năng gây bệnh của chúng cũng gia tăng trong điều kiện khí hậu thay đổi hiện nay Người ta ước tính rằng trong nông nghiệp,

gần 20% thiệt hại có thể trực tiếp do chi Pseudomonas gây ra [36] Trong khi đó,

Akhtar và cộng sự cũng chỉ ra rằng các triệu chứng bao gồm các đốm tròn, màu đen, hoại tử, đường kính từ 2 đến 4 mm, được quan sát thấy trên lá của một giống lúa thường trồng, Basmati-198, trên ruộng lúa tư nhân ở Lahore (Punjab) Bệnh do

Pseudomonas spp được quan sát thấy trên giống lúa KSK-133 trồng tại Faisalabad

(Punjab) trong cùng vụ mùa Tỷ lệ mắc bệnh lần lượt là ~ 35% và 25% đối với Basmati-198 và KSK-133 [37]

Trang 29

Hình 1.4 Bệnh đốm lá nâu hại lúa

Mặc khác, theo nghiên cứu của Bessadat và cộng sự năm 2020, bệnh đốm lá do

Alternaria sp đã gây thiệt hại đến năng suất thu hoạch của cà chua, ngò tây và rau mùi

với những hình ảnh gây trên lá như Hình 1.5 Các vết hoại tử phát triển trên ngọn lá và dọc theo mép lá Đối với mỗi cây, tất cả các dòng phân lập đều có tính gây hại tương tự nhau, ngoại trừ trên cà chua nơi phân lập NB325 ở 21 ngày giờ từ cỏ dại jimson có khả năng gây bệnh tương đối, gây ra các vết hoại tử trên khoảng 35-40% diện tích lá [38]

Hình 1.5 Bệnh đốm lá do Alternaria crassa NB573 gây ra trên cây: a cà chua (A),

rau mùi (B), mùi tây (C), cỏ dại jimson (D), và các triệu chứng trên cuống và thân cỏ dại jimson (E) (F, G) Bào tử hình thành trên lá hoại tử được quan sát bằng kính hiển

vi với kích thước lần lượt là 40X và 100X

Trang 30

Các tác nhân kiểm soát sinh học (Biological control agents – BCAs hay còn được gọi ở trên là AMCs) và các hợp chất hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ BCA là các tác nhân được nghiên cứu và phát hiện nhằm kiểm soát bệnh đốm lá (Vorholt, 2012; Zamioudis và Pieterse, 2012) Thực vật có rất nhiều vi sinh vật trên lá của chúng, và một số có khả năng đối kháng với các mầm bệnh trên lá thông qua các cơ chế như tạo ra kháng sinh, ký sinh, cạnh tranh nguồn dinh dưỡng và không gian, và gây ra sự đối kháng (Paulitz và Belanger, 2001; Elad, 2003) Các chủng vi khuẩn và nấm có khả năng tạo BCA được tìm kiếm và nghiên cứu, với sự quan tâm ngày càng tăng đối với những chủng có chung môi trường sống với vi khuẩn gây bệnh mục tiêu, nhằm tận dụng năng lực của môi trường sống (Compant et al., 2005) Quan sát thấy rằng một sản phẩm từ vi khuẩn tạo BCA như thuốc diệt nấm sinh học Serenade (thành phần hoạt

tính B subtilis, do vi khuẩn sản xuất lipopeptide trong quá trình tạo sản phẩm) cho hiệu quả nhiều hơn hơn là do hoạt động của vi khuẩn B subtilis trên bề mặt lá thực vật

(Marrone, 2002; Glare và cộng sự, 2012) Các nghiên cứu này đã thúc đẩy cho những nghiên cứu khác tìm kiếm những giải pháp bảo vệ thực vật dựa trên sinh học từ các hợp chất được tạo ra từ BCA chứ không phải là BCA tổng hợp (Glare và cộng sự,

2012) Vi khuẩn B subtilis, amyloliquefaciens, hoặc các loài nấm/men như

Aureobasidium pullulans, Beauveria bassiana, Ampelomyces quisqualis và Trichoderma harzianum sản xuất BCA đã được thử nghiệm trong đối kháng với mầm

bệnh dâu tây trên lá (Sylla và cộng sự, 2015) Một số nghiên cứu cũng đã cho hiệu quả

của việc đối kháng của các loài này đối với các loài Xanthomonas là mầm bệnh trên lá

trên các loại cây trồng khác ngoài dâu tây (Mishra và Arora, 2012; Naue và cộng sự, 2014; Van Hop và cộng sự, 2014)

1.4 Tình hình sử dụng phân bón và thuốc bảo vệ thực vật cho cây lúa nước ở Việt Nam

Lúa là một trong những cây trồng chủ lực của thế giới, với sản lượng tăng từ 225 triệu tấn năm 1961 lên 755 triệu tấn năm 2019 (FAO, 2021), trở thành một trong những cây trồng quan trọng nhất Do đó, diện tích thu hoạch cũng tăng từ 115 triệu lên 162 triệu ha trong cùng kỳ Diện tích đồng lúa mở rộng dẫn đến nhiều vấn đề môi trường (ví dụ như phát thải khí nhà kính, xói mòn đất, sử dụng quá mức thuốc trừ sâu), và một trong những vấn đề lớn là xử lý bệnh đốm lá của cây lúa

Trang 31

Theo số liệu của Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam, nước ta có khoảng 26 triệu ha đất nông nghiệp, nhu cầu sử dụng phân bón trung bình mỗi năm khoảng trên 10 triệu tấn Kết quả điều tra của Tổ chức Lương thực và nông nghiệp Liên hiệp quốc cho thấy, hiệu quả sử dụng phân bón ở Việt Nam chỉ đạt 45-50% Số lượng phân bón bị rửa trôi mà cây không hấp thụ được chính là một trong những nguồn gây ô nhiễm đất Một số loại phân bón có tồn dư axít làm chua đất, giảm năng suất cây trồng và tăng độc tố trong đất Có một thực trạng nữa là việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật không đúng cách, đúng liều lượng, sử dụng loại thuốc có độ độc cao đã bị cấm sử dụng trong sản xuất nông nghiệp, đang làm phát sinh khoảng 9.000 tấn chất thải nguy hại ảnh hưởng đến môi trường Thực trạng sử dụng phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) không đúng, vừa làm tăng chi phí sản xuất, vừa ảnh hưởng đến môi trường và dẫn tới nguy cơ mất an toàn vệ sinh thực phẩm Những cánh đồng lúa của huyện Điện Biên là nơi người nông dân thường xuyên dùng thuốc bảo vệ thực vật trong mỗi mùa vụ Thuốc bảo vệ thực vật được phun phòng chống sâu bệnh, bệnh đạo ôn do nấm, mốc trên đồng ruộng ở nhiều thời điểm khác nhau: Phun trừ cỏ trước khi cấy lúa; phun phòng chống sâu bệnh hại khi lúa mới cấy khoảng 15 – 20 ngày, phun thuốc khi lúa trổ đòng, khi lúa phơi màu và phun thuốc bảo vệ khi bông lúa uốn câu

Đối với nông nghiệp nước nhà, nông dân tiến hành phun trừ rầy nâu trước khi gặt khoảng 1 tuần Mỗi vụ lúa, trung bình người nông dân phun thuốc bảo vệ thực vật từ 5 đến 7 lần Không hiểu nhiều về phản ứng của các chất hóa học độc hại, nhiều hộ gia đình còn tự mua các loại thuốc khác nhau, pha chế vào cùng một bình để phun phòng trừ sâu bệnh cho lúa (Hình 1.6)

Trang 32

Hình 1.6 Người nông dân phun thuốc bảo vệ thực vật

Ở tỉnh Điện Biên do địa hình, địa chất chia làm các khu vực đất đai có tính chất khác nhau Mỗi loại đất đều chứa đựng trong đó các nguyên tố hóa học cần thiết cho đời sống cây trồng Theo nghiên cứu của các nhà khoa học, một gram đất bất kỳ nào cũng đều chứa ít nhất trên 30 nguyên tố hóa học Bà con nông dân muốn canh tác lâu dài, bền vững, cần bổ sung các khoáng chất cho đất Trong quá trình canh tác, không chú ý tới điều này sẽ làm cho đất nghèo dinh dưỡng, cây mất sức đề kháng, sâu bệnh hoành hành dẫn đến mùa màng bị ảnh hưởng

Theo khuyến nông Việt Nam, mức độ hấp thu dinh dưỡng khoáng qua lá thường bị giảm theo tuổi lá, lá càng già thì khả năng hấp thu dinh dưỡng càng kém Từ đó, ta chọn thời điểm phun phân bón lá khi cây có diện tích lá non và hiệu suất hoạt động, tốc độ hấp thu dinh dưỡng qua lá tốt nhất Ví dụ như trên cây ăn trái thì có thể phun khi lá trên đọt non đang chuyển sang giai đoạn lá lụa và ở lúa thì chọn thời điểm khi xuất hiện lá cờ Tổng lượng hấp thu dinh dưỡng khoáng của cây trong giai đoạn này lớn và mang lại hiệu quả tốt cho cây Đáp ứng của cây đối với dưỡng chất phun lên lá cũng tùy thuộc vào điều kiện đủ hay thiếu dưỡng chất trong cây (tình trạng của dưỡng

Trang 33

chất đó và những chất có tác động tương trợ hay đối kháng với dưỡng chất đó ở trong cây) Lá cây có thể hấp thu chọn lọc các chất dinh dưỡng tùy thuộc vào nhu cầu của chúng Cây sẽ hấp thu khoáng chất nhanh hơn khi cây đang thiếu chất khoáng đó (Huỳnh Thị Chí Linh, 2008) Mức độ hấp thu lân qua lá ở những cây bị thiếu lân cao gấp hai lần so với cây được cung cấp lân đầy đủ qua rễ (Nguyễn Bảo Vệ và Nguyễn Huy Tài, 2010) Lân có thể di chuyển từ lá tới rễ, đặc biệt ở những cây thiếu lân

Các kết quả nghiên cứu cho thấy, các dòng vi khuẩn sống ở vùng rễ hoặc nội sinh

cây lúa như: Rhizobium, Azotobacter, Pantoae agglomerans, Pseudomonas

fluorescens, B subtilis và Paenibacillus ngoài khả năng cố định đạm, hòa tan lân còn

có khả năng tiết ra các chất điều hòa sinh trưởng kích thích sự phát triển thực vật: khả năng cố định đạm (IAA), cytokinin, gibberellin, được ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp (Glick, 2012), Malik et al (1997) cho biết việc chủng các vi khuẩn

Azotobacter, Azospirilium, Acetobacter, Bacillus và Pseudomonas vào cây lúa nước đã

giúp cây gia tăng khả năng sinh tổng hợp IAA, giúp rễ lúa phát triển nhiều hơn để hấp thu nhiều nước và chất dinh dưỡng, do đó cây phát triển tốt hơn với đối chứng Araújo

et al (2005) cho thấy hai dòng B subtilis có khả năng tạo IAA có tác dụng kích thích

sự phát triển cây lúa, ngoài ra còn có tác dụng kháng nấm gây bệnh cho cây

Với mô hình sản xuất lúa theo hướng hữu cơ sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh và khoáng Quế Lâm vụ Đông Xuân 2021-2022 đang được nghiên cứu và triển khai tại hợp tác xã An Lộng, xã Triệu Hoà, huyện Triệu Phong, Quảng Trị, quá trình thực hiện mô hình các hộ dân đã áp dụng theo quy trình sản xuất lúa theo hướng hữu cơ sử dụng công cụ sạ hàng, giống lúa HC95 cho những thành quả về mặt kinh tế phẩm cấp, năng suất cao, chất lượng tốt Về mặt xã hội, việc sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh không sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, phân hóa học nên sức khỏe người sản xuất được đảm bảo, tạo ra được sản phẩm sạch, chất lượng cho người tiêu dùng Về mặt nhận thức, phát triển nông nghiệp theo phương pháp canh tác hữu cơ không chỉ góp phần tạo ra những sản phẩm hữu cơ có lợi cho sức khỏe con người mà còn nâng cao nhận thức, thay đổi phương thức canh tác trong việc sản xuất lúa theo hướng hữu cơ, bền vững đảm bảo sản phẩm an toàn, môi trường đất nước không bị ô nhiễm, góp phần bảo vệ môi trường, hệ sinh thái đồng ruộng

Trang 34

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và vật liệu

- Chủng vi khuẩn B subtilis MT300405 được phân lập từ nước thải và được giữ

giống tại phòng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Công nghệ Hoá học - Môi trường, trường Đại học Sư phạm kỹ thuật – Đại học Đà Nẵng

- Chủng vi khuẩn gây bệnh (chủng chỉ thị) Pseudomonas syringae pv syringae Pss9097 (P s pv syringae) được Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm khoa học

công nghệ Việt Nam cung cấp

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất

Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi sinh vật:

- Hóa chất: Pepton (Merck, Việt Nam), Trypton (Merck, Việt Nam), cao nấm men (Merck, Việt Nam), Tryptone Soya Broth (Merck, Việt Nam), muối (NaCl)

- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:

+ LB (Luria Bertani) gồm: 10 g/l trypton; 5g/l cao nấm men, 5 g/l NaCl + LBA gồm: 10 g/l trypton; 5g/l cao nấm men, 5 g/l NaCl và 17g/l agar + TSA gồm: 30g/l Tryptone Soya Broth và 17g/l agar

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị

Dụng cụ, thiết bị thực hiện đề tài được liệt kê trong phần phụ lục

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xác định khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis được phân lập từ nước thải

a Xác định khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis

Để thử nghiệm khả năng đối kháng với vi khuẩn chỉ thị, đề tài này sử dụng

phương pháp khuếch tán của Moore và cộng sự có điều chỉnh như sau: vi khuẩn B

subtilis được nuôi trong môi trường LB khống chế độ hấp thụ ở mật độ quang 600nm

dưới 1.0 (dung dịch huyền phù được gọi là dung dịch mẹ) Sau một đêm nuôi cấy, dịch huyền phù được cho vào ống ependorf vô trùng 2,0 ml, ly tâm lạnh ở 5000 vòng/phút

Trang 35

trong thời gian 30 phút để loại bỏ hết cặn dưới và thu dịch nổi Hút dịch nổi và đo pH

ban đầu, tiến hành chuẩn độ cho pH = 7

Chuẩn bị các đĩa chứa môi trường thạch dinh dưỡng (TSA) Tiến hành bơm 100μl huyền phù vi khuẩn lên các đĩa thạch và dùng que tran trải đều Sau đó dùng khoan vô trùng tạo những giếng có đường kính 5 – 8 mm trên đĩa thạch (có vi khuẩn gây bệnh) bằng cách bỏ agar đi Bơm 80 μl dịch nổi đã thu được ở trên vào các giếng và đem ủ ở 37 0C trong 24 giờ Khả năng đối kháng được đo bằng đường kính vòng ức chế vi khuẩn gây bệnh theo đơn vị mm

Để xác nhận bản chất protein của bacteriocin, các thí nghiệm được tiến hành như

sau: (1) dịch vi khuẩn B subtilis sau khi li tâm được thử nghiệm khả năng đối kháng

với vi khuẩn chỉ thị như đã trình bày ở trên được gọi là dịch nổi control hay là mẫu

control; (2) dịch vi khuẩn B subtilis sau khi li tâm được trung hoà pH và tiến hành cho

thêm enzyme phân giải protein E (Merck, Việt Nam) ở nồng độ cuối cùng 1mg/ml và tiến hành ủ trong vòng 6 giờ được gọi là dịch nổi đã xử lý hay là mẫu đã xử lý bằng enzyme; (3) Dịch nổi được làm nóng đến 30 oC, 40 oC, 60 oC, 80 oC, 90 oC và 121 oC Cả ba dịch nổi này đều được đánh giá khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn chị thị như đã trình bày ở trên

b Xây dựng phương trình tương quan của sự tăng trưởng B.subtilis và mật độ quang

Để tiến hành các thí nghiệm về tính đối kháng sau này, mối quan hệ giữa sự tăng

trưởng B subtilis MT300405 và mật độ quang đo được ở bước sóng 600nm được xây

dựng Mặt khác, việc xây dựng đường chuẩn sự tăng trưởng của vi khuẩn giúp cho quá trình thí nghiệm đơn giản hơn khi quy đổi tương đương độ hấp thụ ở bước sóng 600 nm hay còn gọi là mật độ quang ở bước sóng 600 nm (OD600) với mật độ tế bào CFU/ml Như đã được biết, các nghiên cứu về sự tăng trưởng vi khuẩn yêu cầu cấy các tế bào sống sót vào môi trường nuôi cấy vô trùng và ủ nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ, pH và khí tối ưu Trong điều kiện này, các tế bào phân chia nhanh chóng và động lực của sự phát triển của vi sinh vật có thể được lập biểu đồ bằng đường cong tăng trưởng quần thể, được xây dựng bằng cách vẽ biểu đồ sự gia tăng số lượng tế bào so

Trang 36

Nó cũng tạo điều kiện thuận lợi cho việc đo đếm số lượng tế bào và tốc độ phát triển của vi sinh vật trong các điều kiện tiêu chuẩn được biểu thị bằng thời gian pha của nó, thời gian cần thiết để một quần thể vi sinh vật tăng gấp đôi Các giai đoạn phát triển của vi sinh vật được phân thành 4 giai đoạn: pha lag, pha log, pha lũy thừa, pha tĩnh, pha chết

Dựa vào nguyên lý tăng trưởng của vi sinh vật, mối quan hệ tăng trưởng của vi sinh vật và mật độ quang có biểu hiện ở pha lag Vì thế, đường chuẩn thể hiện quan hệ này được thiết lập để có thể đo nhanh số lượng tế bào vi sinh vật còn sống qua mật độ quang ở bước sóng 600 nm mà không cần trải qua 24 giờ ủ và đếm khuẩn lạc Quá trình thiết lập mối quan hệ này là rất cần thiết cho các phân tích và xử lý số liệu sau này Các bước tiến hành được thiết lập như sau:

- Cấy phần nuôi cấy thuần khiết của một loài vi khuẩn trên đĩa thạch và ủ trong 24 giờ

- Lấy khuẩn lạc ra khỏi đĩa và tăng sinh cho đến khi đạt được mật độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm bằng máy quang phổ trong khoảng 1-1,5

- Pha loãng huyền phù bằng môi trường LB và ghi lại các giá trị OD khác nhau sử dụng máy quang phổ

- Lại pha loãng nối tiếp từng huyền phù đã pha loãng từ 10-3 - 10-7 để tiến hành trải khuẩn lên đĩa petri chứa môi trường

- Lấy 100µl huyền phù đã pha loãng và trải lên đĩa thạch rồi ủ 24 giờ ở nhiệt độ môi trường cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn cụ thể Nếu số khuẩn lạc nhiều hơn 300, cần tiến hành pha loãng tiếp tục Đếm số khuẩn lạc vào tạo đường chuẩn so với các giá trị OD đo được ở trên Một đường thẳng tuyến tính và phương trình là y = ax + b (với y, x là OD600 hoặc CFU/ml) được vạch theo số liệu thu được Bằng cách thiết lập đường chuẩn này và có thể giả định mật độ/số lượng vi khuẩn bằng cách chỉ đo giá trị OD

Trong nghiên cứu này, trước khi tiến hành các thí nghiệm trên đối tượng MT300405, đường thẳng của MT300405 được thiết lập nhằm xác định mối quan hệ

Trang 37

giữa mật độ tế bào MT300405 (CFU/ml) và mật độ quang ở bước sóng 600nm (OD600) Với mật độ quang của dịch gốc chứa MT300405 có giá trị 1,0 OD600, pha loãng thành các mật độ 0,1; 0,4; 0,85… Tiến hành đo đếm tế bào vi khuẩn của các dịch huyền phù này bằng phương pháp cấy trang trên đĩa petri Sau một đêm, đếm số khuẩn lạc trên đĩa petri ở các hệ số pha loãng liền kề, ta thu được kết quả mật độ tế bào CFU/ml và mật độ quang OD600 tương ứng Kết quả của mối quan hệ này được biểu diễn bởi phương trình đường thẳng bậc 1: y = 14,219x + 0,2139; R2 = 0,9917

2.3.2 Xác định yếu tố pH ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis

Môi trường tăng sinh B subtilis được chọn là LB với các nồng độ pH được chuẩn

bị lần lượt từ 6 – 8 Các bình tam giác có chứa môi trường LB có thể tích xác định được điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1M và HCl 1M với bước nhảy là 0.5 Sau khi các bình tam giác chứa môi trường LB đã được điều chỉnh pH đem đi tiệt trùng và

tiến hành cho thêm vào thể tích xác định dịch B subtilis Các bình tam giác được tăng

sinh trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ 37 0C và lắc ở 120 rpm Sau 24 giờ, hỗn hợp trong ống nghiệm được ly tâm và thu dịch nổi, thử hoạt tính bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch

2.3.3 Xác định độ mặn của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis

Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis trong môi trường chứa muối, chuỗi thí nghiệm tăng sinh B subtilis trong các môi trường LB đã tối ưu ở

thực nghiệm pH chứa các nồng độ muối khác nhau gồm 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5% và 4% NaCl Tiến hành ủ ở pH tối ưu ở thực nghiệm 2 trong vòng 24 giờ Ly tâm, thu dịch nổi và thử hoạt tính bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch

2.3.4 Xác định nguồn nitơ của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis

Nuôi vi khuẩn B subtilis trong môi trường LB có nguồn Nitơ thay đổi 0%, 0.1%,

0.5%, 1%, 1.5%, 2% ở 37 oC trong vòng 24 giờ Ly tâm, thu dịch nổi và thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch

Trang 38

2.3.5 Xác định yếu tố thời gian ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis

Nuôi vi khuẩn B subtilis trong môi trường LB đã tối ưu ở thí nghiệm pH, nồng

độ muối, nguồn nitơ tối ưu ở thực nghiệm trên, thời gian thay đổi là 12, 24, 36, 48 và 52 giờ Ly tâm, thu dịch nổi và thử hoạt tính bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch

2.3.6 Xác định khả năng đối kháng khuẩn hại lúa theo phương pháp đối kháng trực tiếp

Chủng B subtilis MT300405 được tăng sinh trong môi trường LB đã nêu trên

trong vòng 18 – 24 giờ Dịch tăng sinh được chiết bằng cách ly tâm ở 5000 vòng/phút trong thời gian 30 phút để loại bỏ hết cặn dưới và thu dịch nổi Dịch nổi giữ lại để tiến hành thử nghiệm kháng khuẩn hại lúa

Vi khuẩn gây bệnh (chủng chỉ thị) Pseudomonas được thả lên bề mặt thạch của

môi trường TSA và được ủ ở nhiệt độ 30 2,0 oC trong vòng 24 – 48 giờ Sau thời

gian này, dịch nổi B.subtilis MT300405 được cấy theo hình chữ nhật để bao quanh chủng chỉ thị Tiếp tục ủ đĩa ở 32 2,0 oC cho tới 72 giờ thì quan sát vòng lan bào tử của chủng Một đĩa thạch chứa môi trường TSA cũng được cấy khuẩn hại lúa mà

không xử lý bằng chủng B.subtilis MT300405 làm mẫu đối chứng, các thử nghiệm

được thao tác trong cùng một điều kiện

2.3.7 Thử nghiệm đối kháng khuẩn hại lúa trên cây lúa

Sau 03 ngày lúa giống được đem ủ cho nảy mầm và được gieo vào các khay đã đựng sẵn đất nông nghiệp Để khay vào nơi có ánh sáng mặt trời, 02 ngày một lần tiến hành bổ sung nước vào các mẫu, mỗi lần bổ sung 5 ml, theo dõi sự phát triển của cây lúa

Sau 4 tuần canh tác, tiến hành tước bỏ bẹ lá thứ hai của cây lá cây lúa bị mẫn cảm Hỗn dịch bào tử đã được chuẩn bị như mô tả ở trên Sau đó, 200 μL huyền phù bào tử được tiêm chậm vào bẹ lá lúa [39] Ở thời điểm 2, 12, 24 và 36 giờ sau khi cấy, khả năng lây nhiễm của bào tử đối với bẹ lá được quan sát dưới kính hiển vi Bào tử

Trang 39

phát triển và biểu hiện ổn định được nuôi cấy trên môi trường thạch TSA như đã mô tả trong phần 2.3.5 Thử nghiệm này được tiến hành theo mô tả của Li và cộng sự, 2015 [39] với một số thay đổi Các cây lúa đã được cấy bào tử chỉ định được giữ trong buồng tối ở độ ẩm 95% và 28 – 30 oC trong chu kỳ quang 12 giờ sáng/12 giờ tối Sau 24 giờ, lá được thu hoạch để làm thí nghiệm đối kháng như đã trình bày ở trên, một vài

bẹ lá được chọn để phun trực tiếp dịch nổi B subtilis MT300405 đã được nuôi cấy

trong 48h Sau khi phun dịch 01 ngày, mẫu được chọn được phun tiếp 50 ml huyền

dịch bào tử vi khuẩn gây bệnh (chủng chỉ thị) Pseudomonas (nồng độ 105 CFU/ml) Bảy ngày sau khi phun dịch, khoảng 10 – 20 cây lúa được thu thập bằng phương pháp lấy mẫu năm điểm để đánh giá chỉ số bệnh và các mẫu này được gọi là mẫu xử lý Cùng số lượng bẹ lá khác cũng được chọn để phun H2O2 trước khi tiến hành phun huyền dịch bào tử như thí nghiệm vừa nêu Mỗi thí nghiệm có 03 lần lặp lại

2.3.8 Khảo sát nồng độ bacteriocin ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn hại lúa

Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bacteriocin đến khả năng kháng khuẩn hại lúa, thí nghiệm được tiến hành tương tự như với phần 2.3.6 nhưng chia ra các nồng độ của MT300405 với OD600 là 0,2; 0,4; 0,6 và 0,8 tương ứng với nồng độ tế bào là 2,2.107 CFU/ml; 5,2 107 CFU/ml; 8,2.107 CFU/ml; 1,1 108 CFU/ml

2.3.9 Xử lý số liệu

Tất cả các thí nghiệm được tiến hành lặp lại ba lần Các phân tích thống kê đều được xử lý bằng Anova Tất cả dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± SD Các chữ cái khác nhau thể hiện khác biệt đáng kể theo thí nghiệm khác biệt ít có ý nghĩa nhất của Fisher (P <0,05) Phép thử các mẫu độc lập được sử dụng để kiểm tra ý nghĩa của sự khác biệt: *, P <0,05

Trang 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xác định khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis được phân lập từ

nước thải

3.1.1 Xác định khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của B subtilis

Kết quả sinh tổng hợp bacteriocin thể hiện ở Hình 3.1

(A) (B)

Hình 3 1 Khả năng đối kháng của B subtilis MT300405 với vi khuẩn chỉ thị; (A)

Hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn chỉ thị; (B) Hoạt tính kháng khuẩn của mẫu

đối chứng và mẫu xử lý bằng enzyme catalase

Dựa vào kết quả thử nghiệm khả năng sinh bacteriocin của chủng B subtilis

MT300405 đã nêu rõ trong phần 2.3.1 có thể thấy rằng sau khi bị phân giải protein bởi enzyme catalase, mẫu xử lý có khả năng chống lại vi khuẩn chỉ thị suy yếu thể hiện thông qua việc có vòng ức chế nhỏ với hoạt tính đo được là 105,8 ±1,5 Au/ml Trong khi đó mẫu dịch nổi không xử lý bằng enzyme pronase E vẫn cho vòng ức chế với hoạt tính kháng khuẩn đo được 280 Au/ml Điều này chứng tỏ sự hiện diện của protein có trong dịch nổi không xử lý bằng catalase thể hiện đặc tính ức chế vi khuẩn chỉ thị của bacteriocin

Mẫuxử lý