Luận văn thạc sĩ khoa học: Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Vũ Thị Trang

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHÓI PHỎ (LC-MS/MS) XÁC ĐỊNHDƯ LƯỢNG MOT SO KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES

TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẢM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Vũ Thị Trang

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHÓI PHÔ (LC-MS/MS) XÁC ĐỊNH

DƯ LƯỢNG MOT SO KHANG SINH NHÓM SULFONAMIDES

TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẢM

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.29

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYEN XUAN TRUNG

Hà Nội - 2012

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS Nguyễn XuânTrung đã tận tình hướng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu, tạo mọi điều kiệngiúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học,đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân Tích, đã cho em những kiến thứcquý giá, tạo điều kiện cho em được học tập và nghiên cứu trong môi trường hiện

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệmAn toản vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi đề tôi được họctập và hoàn thành đề tài này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại labo Hóa — Viện kiểmnghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình

làm thực nghiệm.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn be đã luôn động viên,

chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi.

Hà Nội, năm 2012Học viên

Vũ Thị Trang

MỤC LỤC

97.10000055 1CHUONG 1: TONG QUAN .cccccccccceecceee) ceuueeeeueeeeueeeeueeereeeuenes 3

1.1 Giới thiệu về kháng sinh nhóm sulfonamid (SAS) 00 0000eeeeeeeeeee ee eee 3

1.1.1 Lich sử phát hiện - c2 eee eee ened ng nh nh nh khe31.1.2 Phân loại SAÁs - Q02 eee eeeeeeeeeeeeeeeepeeeeeneaes 3

1.1.3 Cau tao ctla ƯƯIIadađadađiiia 4

1.1.4 Tác dụng của SÀS cQQQ ng HH TT n nn n EEE Eee Ene eet 61.1.5 Tình hình sử dụng khang sinh Sulfonamid - - 5 55s + + +++sesseesseess 8

1.1.6 Giới hạn tồn dư tối đa cho phép của SAs trong thực phẩm . - 9

1.2 Các phương pháp xác định Š As - Sà ng HH kh 9I AM lo 0v 10

1.2.2 Thế giới 5-5251 S1 SE EEE112112112717171211211111111211 111111111111 xeye 10CHUONG 2: NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 192.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu + ¿+ x+++++£x++zxtzx+erxesrxrrxees 19

2.2 Phương pháp nghiÊn CỨU - 2c 22c 32213213313 351 39111 1115511111 1 E1 key 19

2.2.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng cc c7 72212222 192.2.2 Detector khối phô - -cc 1122011122111 1221111115111 11 5511 xk ha 212.2.3 Phân tích định tính và định lượng bằng LC/MS 262.3 Thiết bi, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu 26

2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn -ccc c2 21122212211 121111 1111111111211 1 2xx kky 272.4 LAY mẫu - - 2-52 S2+SEEEEEE2E2112712171211211271111112111111111171 11111 28CHUONG 3: KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN 5-55 se se =sessessesseses 293.1 Tối ưu điều kiện tách và xác định Sulfonamid trên thiết bị LC/MS/MB 293.1.1 Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (M®S) 29

3.1.2 Lựa chọn cột tách - c2 Q22 HS SE nhe 323.1.3 Khảo sát chương trình gradient -:-ccccsssscs2 32

3.1.4 Khảo sát tốc độ pha động -¿- 2 ©s s2 E2 1211271 1717121121121 363.1.5 Khao sát thành phan acid formic trong pha động - 2-2 2 +52 38

3.2 Tối ưu quá trình xử lý mẫu phân tích các SAS -¿ ¿©sz©5++cs+¿ 403.2.1 Khảo sat qui trình chiẾt -¿- 5-52 ©S22Ex2EEEEESEEE2EEEEE E21 2EE21121eEkcrrrees 433.2.2 Khảo sát nồng độ acid acetic trong dung môi chiẾt 2 ¿- 5z: 463.2.3 Khảo sát thành phan MeOH trong dung môi chiết 2-5525 22 483.2.4 Khảo sát khối lượng pha rắn PSA 2-2-2 ©E++E£2EE+EE+EE+EEeEEEEerrrerkerkee 49

3.3 Đánh giá phương pháp phân tÍch 5 +2 + + + **EEEvEEseerseerererrersreerre 52

3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tinh và lập đường chuẩn -¿ ¿©255zc: 52

3.3.2 Giới han phát hiện (LOD), giới han định lượng (LOQ) của phương phap 56

3.3.2 Đánh giá độ chum (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi) -5-5- 583.3 Phân tích mẫu thực c2 S111 1151 1E SE SE SE TT TT ng ngu 650009077 73TÀI LIEU THAM KHẢO 2° o2 2Ÿ 5° ©5252 S2£SS£Es£ES2ESsEssexserserserserssre 75

PHU LỤC 5-5 5 < << HH II HH 0010090 g0 80

Phụ lục 1: Sac đồ khảo sát nồng độ acid formic trong pha động - 80Phụ lục 2: Kết quả khảo sát qui trình chiết mẫu ¿2-5 t+EExcEvEEcEEEererxereree 82Phu luc 3: Két quả khảo sat nồng độ acid acetic trong dung môi chiết - 87Phụ luc 4: Kết quả khảo sát nồng độ MeOH trong dung môi chiết

Phụ lục 5: Sac đồ thâm định phương pháp (độ lặp lại, độ thu hồi) eee 94Phụ lục 6: Một SỐ sắc đồ phân tích mẫu thực.— 104

DANH MỤC CÁC BÁNG

Bang 1.1: Cấu trúc hoá học của một số SAs được xác định trong đề tài 4Bảng 1.2: Giới hạn tồn dư tối đa cho phép đối với SAs tại một số thị trường 9Bang 3.1: Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh 29Bảng 3.2: Các thông số tối ưu cho nguồn và khí 31

Bang 3.3: Ảnh hưởng nồng độ acid formic tới diện tích pic SAs 38

Bảng 3.4: Các qui trình chiết dự kiến chiết các SAs 44Bảng 3.5: Ảnh hưởng của qui trình chiết đến hiệu suất thu hồi các SAs 45Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi các SAs 46Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ MeOH đến hiệu suất thu hồi các SAs 48Bảng 3.8: Ảnh hưởng của khối lượng PSA đến hiệu suất thu hồi của các SAs 49Bảng 3.9 : Cách pha các dung dịch chuẩn đề lập đường chuẩn có chứa IS 53Bang 3.10: Đường chuẩn của các SAs (có IS) 53Bảng 3.11: Đường chuẩn các SAs (không có IS) 55

Bang 3.12: Giới han phat hiện va giới han định lượng của các SAs 56

Bang 3.13: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các SAs trên nền mẫu thịt lợn

tại 5ppb 59

Bảng 3.14: Độ lặp lại va hiệu suất thu hồi của các SAs trên nền mẫu thịt lợn 61

tai 10ppb

Bang 3.16: Qui định độ chum của các phương pháp định lượng phụ thuộc 65

nông độ chât theo 2002/657/EC

Bảng 3.17: Kết quả phân tích mẫu thực 67

DANH MỤC HÌNH VE

Hình 2.1: Sơ đô khôi của khôi phô kê 21

Hình 2.2: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI 23Hình 2.3: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực MS/MS 25Hình 3.1: Sắc ký đồ các SAs theo chương trình gradient 1 33Hình 3.2: Sắc ký đồ các SAs theo chương trình gradient 2 34Hình 3.3: Sắc ký đồ các SAs theo chương trình gradient 3 34Hình 3.4: Sắc ký đồ các SAs theo chương trình gradient 4 35Hình 3.5: Sắc ký đồ các SAs theo chương trình gradient 5 35Hình 3.6: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dong 0,2 ml/phút 36Hình 3.7: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dòng 0,3 ml/phút 37Hình 3.8: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dòng 0,4 ml/phút 37Hình 3.9: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dòng 0,5 ml/phút 37Hình 3.10: Sắc đồ các SAs tại nồng độ acid formic 0,15% 39Hình 3.11: Ảnh hưởng của quy trình chiết đến hiệu suất thu hồi của SIM 45Hình 3.12: Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi 47

Hình 3.18Hình 3.19Hình 3.20Hình 3.21

: Đường chuẩn SMM (R’ = 1,0000): Đường chuẩn SSA (R” = 0,9991): Đường chuẩn SIM (R’ = 0,9999): Đường chuẩn SSA (R” = 0,9998)

Hình 3.22: Sắc đồ SMM tại giới hạn phát hiện LOD 0,025ppb (S/N = 3,5)

Hình 3.23Hình 3.24:Hình 3.25:Hình 3.26:Hình 3.27:Hình 3.28:Hình 3.29:

: Sắc đồ STZ tại giới hạn phát hiện LOD 0,025ppb (S/N = 3.3)Sắc đồ SP tại giới hạn định lượng LOQ 0,05ppb (S/N = 10,5)Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs tại mức nồng độ 5ppbSắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs tại mức nồng độ 10ppbSắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs tại mức nồng độ 20ppbSắc đồ mẫu gan lợn không nhiễm SAs

Sắc đồ mẫu phủ tạng gà nhiễm SDM

545455565757586062647273

DANH MỤC TU VIET TAT

ACN Acetonitrile

CE Collision energy Nang luong va cham

EI Electron Ionization lon hóa bang dong electron

ESI Eelectrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tửEU European Union Chau Au

HPLC High performance liquid | Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IUPAC International Union of Pure and | Liên minh quốc tế về hóa hoc

Applied Chemistry cơ bản và ứng dụngLOD Limit of detection Giới han phát hiệnLOQ Limit of quantity Giới han định lượng

MeOH Methanol metanol

MRL Maximum Residue Limit Giới hạn dư lượng tối đa

PSA Primary and secondary amine Các amin bậc 1, bậc 2

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đốiSPE solid phase extraction Chiết pha rắn

U.S NRP | United States National Residue | Chương trình quốc gia về tồn

Program dư chât độc của Mỹ

UPLC- Ultral performance liquid | Sắc ky lỏng siêu hiệu năng kết

MS/MS _ | chromatography tandem mass | nôi khôi phô

UV Ultraviolet Tử ngoại

MO DAU

An toàn thực phẩm dang là mối quan tâm hàng đầu của toàn xã hội An toànthực phẩm trong sản phẩm chăn nuôi không chỉ đơn thuần là sản phẩm (thịt, trứng,sữa) không nhiễm ban, ôi thiu, nhiễm khuẩn (yếu tố gây ngộ độc cấp tinh), mà cònở chỗ sản phẩm chứa các chất gây ra ngộ độc tích luỹ, mãn tinh hay trường diễn(hocmon, kháng sinh, độc chat).

Trong vô số các nguyên nhân dẫn đến việc mat an toàn vệ sinh thực phẩm _,thì van đề về dư lượng thuốc kháng sinh và tồn dư chất kích thí ch tăng trọng trongthịt gia súc gia cầm cũng là thực trạng nan giải và đáng báo động _ Với một lượngthực phẩm không 16 từ động vật dang được tiêu thụ trên thị trường _, ít ai nghĩ đếnviệc mỗi ngày trong cơ thê chúng ta đa ng phải dần tích lũy dư lượng chất kích thíchtăng trọng và thuốc kháng sinh Nguyên nhân do người dân sử dụng rất tùy tiện cácloại thức ăn tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa _, trị bệnh và giúp vậtnuôi mau ăn chó ng lớn Hậu quả là dư lượng chất kích thích và thuốc kháng sinh

trong thịt gia súc, gia cam vượt ngưỡng cho phép gấp nhiều lần , tuy không gây ngộđộc cấp tính tức thời, nhưng sẽ gây nguy hại về lâu dài cho sức khỏe của ngườ¡ tiêu

Sulfonamid (SAs) là một nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp đóng một vai tròquan trọng và hiệu quả trong việc hạn chế sự nhiễm trùng do vi khuẩn và vi sinh vậttrong hệ thống tiêu hóa của vật nuôi Vì vậy, chúng được sử dụng trong thức ănchăn nuôi nhăm kích thích tăng trưởng, ngăn chặn và điều trị một loạt các bệnh ởgia súc gia cầm như các bệnh về tiêu hóa hay hô hấp Song hệ quả không thể tránhkhỏi khi sử dụng nhóm các chất kháng sinh này là tồn dư của chúng trên thịt gia súcgia cầm, gây nguy cơ kháng thuốc kháng sinh của vi sinh vật, làm giảm sức đềkháng của vật nuôi, và gây hại cho sức khỏe con người như: ung thư tuyến giáp, sốcphản vệ và kháng thuốc [1].

Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra do thiếu sót trong công tác kiểm tra, thanh

tra từ nguyên liệu dùng đê chê biên thực pham, do sơ xuât trong nau nướng, vệ sinh.

10

Việc nghiên cứu xác định dư lượng SAs trong thịt gia súc gia cầm đã được nhiềutác giả trên thế giới quan tâm Tuy nhiên, ở Việt Nam, van dé này vẫn chưa được

nghiên cứu sâu Việc nghiên cứu và đưa ra phương pháp xác định nhanh, chính xác

SAs giúp cho công tác thanh tra kiểm tra được chặt chẽ, đảm bảo an toàn cho ngườitiêu dùng Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp hiện đại, có độ nhạy

cao, cho phép xác định nhanh và chính xác Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài:Phương pháp sắc ký lỏng khối phố(LC-MS/MS) xác đỉnh dự lượng một sốkháng sinh nhóm Sulfonamid trong thịt gia súc gia cam ” Với nội dung nghiên

cứu như sau:

- Tối ưu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS dé tách và xác định các

- _ Tối ưu quá trình xử lý mẫu.

- Ung dụng phân tích trên một số mẫu thực tế.

11

CHƯƠNG 1: TONG QUAN

1.1 Giới thiệu về kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs)

1.1.1 Lịch sử phát hiện [6]

Năm 1935 người ta thay chất màu prontosil được chuyển hóa invitro thànhhoạt chất sulfanilamide, một dẫn xuất ngăn ngừa được nhiễm liên cầu ở chuột Sauđó các sulfonamid khác được tổng hợp, là những chất chuyền hóa của sulfanilamidevới các vị trí thế N1 và N4.

Trong đó sulfanilamide và sulfadiazine được cấp phép vào năm 1939 và

Theo các nhà Dược hoc phân loại thì Sulfonamid là một nhóm thuốc có tácđộng tĩnh khuẩn miễn dịch giữ vai trò chủ yêu trong việc loại bỏ tận gốc sự nhiễmtrùng Do đó, các sulfonamid trở thành những tác nhân hóa trị liệu đầu tiên được

dùng để ngăn ngừa và điều trị nhiễm khuẩn toàn thân ở người Từ đó tới nay, mộtloạt sulfonamid khác được cấp phép, mặc dù hiện nay, hiếm khi chúng được dùngđơn độc mà thường hay kết hợp với một vài chất khác.

1.1.2 Phân loại SAs

Các SAs được phân loại theo khả năng hấp thu và thời gian bài thải chúng rakhỏi cơ thể, đa số bài thải qua đường thận bằng cách khuếch tán thụ động Tuynhiên, có một số bị tái hấp thụ ở ống thận làm cho chúng duy trì lâu hơn trong cơ

+SAs bai thải chậm (10-12 giờ): sulfamethoxypyridazin, sulfadimethoxin,sulfadoxin

- SAs kháng khuẩn đường ruột: sulfaguanidin,phtalylsulfathiazon

- SAs tác động tại chỗ (thuốc nhỏ mắt): sulfacetamid,sulfadiazine bạc

- SAs trị cầu trùng (thường kết hợp với nhóm diaminopyrimidin):

sulfadimidin, solfaquinoxalin, sulfadimethoxin,sulfadoxin

1.1.3 Cấu tạo của SAs

Thay thế các gốc RI, R2, R3 khác nhau, sẽ cho các SAs

SAs Công thức lượng

STT en pK, Công thức cau tao

phan tir phân tử

NHHN

SSA QO

(SSA) \/ Ï N9 4 amino-N-(3/4- CuHisN3038 | 26730 | 483 SN SO

(SDM) o~4-amino-N-(2,6- Q p a \

10 dimethoxypyrimidin-4- CioHigNsOuS 310,33 6,21 Xu Sy AAG Z

: on

benzenesulfonamid HoN

đồng vị cua SDM: trong phân tử có

n Sulfadimethoxine-d4 | C,,H,D,N,O, 314 61 bến nguyên tử hidro 'H bị thay thé

(IS) S ; bởi bốn nguyên tử deuteri 7H, được

như một coenzyme trong sự tổng hợp purin và timin PGA cũng là một phan của

phân tử B12 có liên quan tới sự biến dưỡng acid amin và purin Do đó khi thiếu

15

PABA sẽ gây thiếu purin, acid nucleic Điều này cũng giải thích tại sao các vikhuẩn tự tổng hợp được PABA thì đề kháng với SAs và tại sao thymin, purin,methionin, và một số amin khác lại đối kháng hiệu quả với SAs Do đó vi khuẩn bịtiêu diệt trước sức đề kháng của cơ thể hoặc nhờ tác dụng của thuốc Chúng đượcsử dụng trong phòng và điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn, đái tháo đường, phù, tănghuyết áp, và bệnh gút Các sulfonamid có tác dụng kháng khuẩn cho hệ miễn dịchgiữ vai trò chủ yếu trong loại trừ tận gốc sự nhiễm trùng Sulfonamid có hiệu quảcao trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng cấp tính vì giai đoạn này vi khuẩn có mứcbiến dưỡng cao, dé kết hợp với Sulfonamid, thêm vào đó khả năng thực bào cònmạnh và sự khuếch tán của thuốc chưa bị cản trở bởi quá trình xơ hóa trong viêmmãn tính Chúng có khả năng kháng khuẩn trên vi khuân Gram dương, Gram âm,

Protozoa [9].

° Tác dụng phụ của SAs:

Các loại SAs được các nhà sản xuất đưa vào trong thức ăn gia súc, gia cầm,các thuốc chống mốc, thuốc chống oxy hóa giúp sinh vật tăng sức đề kháng, phòngtrị nhiễm khuẩn đồng thời giống như một chất kích thích tăng trưởng đem lại lợi íchcho người chăn nuôi Tuy nhiên những năm gần đây xảy ra hiện tượng kháng khángsinh và tồn dư kháng sinh trong thịt, cá, tôm do người nông dân sử dụng khôngđúng cách và quá nhiều thuốc kháng sinh và không đảm bảo thời gian ngưng sử

dụng trước khi thu hoạch, làm cho kháng sinh tích tụ trong thịt Khi người tiêu dùng

sử dụng thực phẩm có chứa dư lượng khang sinh SAs trong thịt, tôm, cá, trứng,sữa sau một thời gian dai sử dụng chúng sẽ tích lũy trong cơ thé, có thé gây hiệntượng khang kháng sinh ở người, làm mất đi cả vi khuan có lợi, ngoài ra SAs dé bịacetyl hóa ở gan thành N*- acetyl sulfonamid khó tan trong nước, đồng thời từ quảncầu thận tới ống dẫn tiêu, SA được làm đậm đặc 50 lần, sự bài tiết H+ vào ống thậnlàm nước tiểu càng acid hơn, giảm tính tan của sulfonamid từ đó trở thành tỉnh thểtrong ống thận, gây hiện tượng kết tỉnh ở đường tiết niệu gây viêm thận và sỏi thận,tiểu ra máu Sulfonamid có khả năng gây ra một loạt các phản ứng bất lợi, bao gồm

cả roi loạn đường tiệt niệu, rôi loan tạo máu , roi loạn chuyên hóa porphyrin, va

16

phan ứng quá mẫn cảm Khi sử dụng với liều lượng lớn, chúng có thé gây ra phản

ứng di ứng mạnh mẽ Hai hội chứng nghiêm trọng nhất là hội chứng

Stevens-Johnson và hoại tử biéu bì độc hại (cũng được gọi là hội chứng Lyell).

SAs hap thu tốt qua đường tiêu hóa, ngoại trừ các SAs có tác động tại chỗ.

1.1.5 Tình hình sử dụng khang sinh Sulfonamid

SAs là một trong những nhóm chất lâu đời nhất của các hợp chất khángkhuẩn Chúng được sử dụng lâm sàng trong 50 năm và lần đầu tiên được đăng kýtại Úc năm 1940 Tại nhiều quốc gia, việc sử dụng SAs trong chăn nuôi được xemxét trên nhiều khía cạnh như dư lượng còn lại trong thịt sau giết mồ, mức độ ảnhhưởng tới sức khỏe con người trở thành vấn đề khá nhạy cảm trong thương mại

quôc tê.

Tại Hoa Kỷ, trong suốt 25 năm, dư lượng SAs trong thịt gia súc, đặc biệt làtrong thịt lợn, thịt bê và thịt gia cầm rất cao là vấn đề được quan tâm bởi mức độtồn du vi phạm nhiều hơn bất cứ một loại thuốc kháng sinh nào khác Cục quan lýthuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) bắt đầu tiến hành điều tra các SAs trong đầunhững năm 1970, và tiến hành thủ tục thu hồi đối với sulfadimidine (SA được sử

dụng rộng rãi nhất), bởi nó đã được chứng minh gây ra khối u cho động vật Năm

2009 chương trình kiểm soát dư lượng Hoa Kỳ (viết tắt là U.S NRP) [25] tiến hànhkiểm tra 17.241 mẫu thịt gia súc, gia cầm phân tích 128 hợp chất thuốc thú y vathuốc trừ sâu thì mẫu có chứa SAs có tỉ lệ cao nhất, trong tổng số 2496 mẫu kiểmtra SAs có tới 0,24% mẫu vi phạm Kết quả phân tích trên gan các loài gia súc giacầm trong 101 mẫu gan lợn và 99 mau thịt lợn quay có hai mẫu vi phạm hàm lượngtrong khoảng 1,01-2,51 ppm, lấy 53 mẫu gan bê phân tích có một mẫu nhiễm hàm

lượng lên tới 0,31-0,5 ppm Một mẫu gan lợn nhiễm sulfamethazine lên tới 2,39ppm và một mẫu nhiễm sulfadimethoxine trong thịt bò là 0,38ppm.

Tại Việt Nam, kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi và nuôi

trồng thủy sản với mục đích kích thích tăng trưởng, phòng và điều trị bệnh Mớiđây, trên website của Cục Quản lý chất lượng nông lâm thủy sản, trong các báo cáo

17

Kết quả thực hiện chương trình kiểm soát dự lượng các chất độc hại hang thang [1]

cho thấy: trong tháng 2, tiến hành kiểm tra 250 mau phát hiện dư lượng nhóm

Sulfonamid có Sulfadimidine hàm lượng 4,18 ppb va Sulfadiazine là 4,16 ppb trên

1 mẫu cá lóc thương phẩm tai vùng nuôi Vị Thủy (Hậu Giang), kết qua phân tích

400 mẫu vào tháng 3 phát hiện dư lượng Sulfadimidine là 123,26 ppb và

Sulfadiazine có hàm lượng 15,26 ppb trên 1 mẫu cá rô đồng thương pham tai tinh

Hậu Giang.

Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi rất phô biến, khi dư lượngkháng sinh trong các sản phẩm thịt cao, thì hậu quả tất yếu là chất lượng thịt kém,không đáp ứng được yêu cầu của thị trường, điều này ảnh hưởng không nhỏ tới xuấtkhẩu.

1.1.6 Giới hạn tồn dư tối đa cho phép của SAs trong thực phẩm

Giới hạn tồn dư tối đa (MRL — Maximum Residue Limit ) của từng loạikháng sinh cho phép sử dụng đối với từng loại thực phâm có thể được qu_ y định ratkhác nhau ở các nước, căn cứ vào đặc diém sinh ly , sinh thái, nhất là đặc điểm dinhdưỡng, thói quen ăn uống của người dân từng nước Qua tham khảo một số tài liệu

[7, 11, 12] có mức MRL như bảng dưới đây.

Bảng 1.2: Giới hạn tồn dư tối đa cho phép đối với SAs tại một số thị trườngNước Đối tượng MRL (ng/kg)

Liên minh Châu Âu | Thịt, gan gia súc, gia cam 100

(EU) Thủy hải sản

Thịt, gan, thận

Hoa Kì 100Thủy hải sản

Thịt, gan, thận

Việt Nam 100Thủy hải sản

18

Thịt, gan , thận 20Nhật Bản

Sữa 10; Thit, gan, than

Han Quoc 10Thuy hai san

1.2 Cac phuong phap xac dinh SAs

Van dé tồn du kháng sinh SAs trong thực phẩm đã và dang được nhiều quốcgia trên thế giới quan tâm Rất nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu nhómkháng sinh này bằng nhiều phương pháp khác nhau trên các đối tượng như thịt, sữa,trứng, mật ong, nước thải Dưới đây là một số phương pháp phố biến đã được tiếnhành thực nghiệm và ban hành thành tiêu chuẩn.

1.2.1 Trong nước

Tổng Cục Tiêu chuẩn đo lường chất lượng đã ban hành TCVN 8345-2010[10] xác định 10 SAs (bao gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin,

sulfamethazin, sufamethoxypiridazin, sulfacloropyridazin, sulfadoxin,

sulfamethoxazol, sulfadimethoxin va sulfachinoxalin) trong thủy sản và sản phẩmthủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Các chất nhóm SAs có trong mẫusản phẩm thủy sản được chiết tách bằng hỗn hợp axetonitril và diclometan Dichchiết sau khi cô cạn cho tác dụng với dung dịch fluorescamin dé tạo dan xuất huỳnhquang Hàm lượng các dẫn xuất được xác định trên hệ thống HPLC pha đảo: cột

C18, pha động: dung dịch H3PO, 0,02 M, acetonitril, metanol theo chương trình

gradient, phát hiện và định lượng băng detector huỳnh quang tại bước sóng kích

thích E,: 405 nm và bước sóng phát xạ Ey: 495 nm Giới han phát hiện của phươngpháp nhỏ hơn 5 hg/kg

1.2.2 Thế giới

1.2.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV

19

Phương pháp sắc ký lỏng rất phù hợp cho việc xác định SAs nên nó được sửdụng rộng rãi Các tác giả nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng trên nhiều loạidetector khác nhau Trong đó detector UV là loại detector thông dụng nhất Chấtphân tích sau khi được tách khỏi cột sắc ký, dẫn vào flowcell đo được chiếu bởi mộtchùm tử ngoại Sự hấp thụ tia bức xạ bởi các chất tan tuân theo định luật Lambert-

Tác giả Rodrigo H.M.M Granja [20] và cộng sự đã phát triển phương phápsắc ký lỏng với detector UV dé xác định 3 SAs trong mật ong Các SAs được chiết

từ mật ong với diclometan sau khi được hòa tan với NaCl 30%, làm sạch qua cột

chiết pha rắn Florisil Dịch rửa giải được phân tích trên hệ thống HPLC: cột C18

(4umx3.9mmx150mm), pha động: Natri acetate 0,005mol/L, pH 4,5 (kênh A),metanol (kênh B), acetonitril (kênh C) theo chương trình gradient; detector UV tại

bước sóng 280nm Giới hạn phát hiện lần lượt là: sulfathiazole: 3ug/kg,sulfamethazine: 4ug/kg và sulfadimethoxine: 5ug/kg Hiệu suất thu hồi lần lượt là:

61% (sulfathiazole), 94,5% (sulfamethazine) và 86% (sulfadimethoxine).

Tác gia W Hela [24] và cộng sự đã phát triển phương pháp HPLC vớidetector DAD dé xác định 12 SAs trong thit, gan, than dong vat (lon, bd, ga) Mauduoc đồng nhất với acetonitril, loại béo với n-hexan, làm sạch qua cột chiết pha rắntrao đối cation OASIS MCX Dịch rửa giải được bơm vào hệ thống HPLC-DAD:

cột Phenomenex Luna C18 (250x2mm; 5uim) , pha động: amoni acetate 0,01M ; pH4,6 (kênh A) và acetonitril (kênh B) theo chương trình gradient Detector DAD tại

bước sóng 260nm Giới han phát hiện của phương pháp là 1ppb cho tat cả các SAs.Sử dụng bước sóng 270 nm phân tích trên đối tượng mẫu sữa bò tại HànQuốc nhóm nghiên cứu Hyun-Hee Chung, Jung-Bin Lee,Yun-Hee Chung [15] quakiểm tra 269 mẫu sữa phát hiện có 21 mẫu nhiễm kháng sinh SAs Trong đó

sulfamethazine lên tới 12ng/g vượt quá giới hạn cho phép.

Nhóm tác giả Nancy T Malintan [18] xác định 8 SAs trên đối tượng mẫu

nước tiểu của lợn tại Malaysian Mẫu được làm sạch, làm giàu bằng chiết qua cột

20

Oasis HLB, sau khi hoạt hóa cột bằng metanol, nước, tiễn hành nạp mẫu và rửa tạpbằng nước, cuối cùng rửa giải chất bằng hỗn hợp amoniac và metanol Phương phápphân tích có giới hạn định lượng 5 ppb Kết quả phân tích 300 mẫu có tới 103 mẫu

nhiễm kháng sinh chủ yếu là sulfanilamide lên tới 500ppb.

1.2.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng với detector huỳnh quang

Đề tăng độ nhạy và độ chọn lọc, nhiều nghiên cứu đã sử dụng detectorhuỳnh quang, bằng cách cho chất phân tích tạo dẫn xuất có khả năng phát huỳnhquang Đây là phương pháp rất phổ biến dé xác định các SAs trong giai đoạn trướcđây Dẫn xuất huỳnh quang thường được sử dụng là Fluorescamine.

Tác giả T.A Gehring và cộng sự [21] đã phát triển và thâm định phươngpháp xác định 14 SAs trong thịt cá trê, cá hồi và tôm Các SAs được tách ra khỏinền mẫu bang hỗn hợp dung dịch 0.2% acetic acid—metanol-acetonitril (85:10:5),chiết lỏng — lỏng với diclometan, làm sạch dịch chiết trên cột chiết pha rắn trao đôication mạnh SPE SCX Điều kiện sắc ký: Cột Symmetry C18, 3.5um,

150mmx4.6mm; pha động: 2% acetic acid—metanol-acetonitril với chương trình

gradient, dẫn xuất sau cột với fluorescamine và phát hiện với detector huỳnh quangtai A„„ = 400nm, rem = 495nm Hiệu suất thu hồi của các SAs năm trong khoảng tt

67 — 90%.

Tác gia G Stoev va cộng sự [13] đã phát triển phương pháp xác địnhđịnh lượng 10 SAs trong thực phẩm có nguồn gốc động vật bằng sắc ký lỏng vớidetector huỳnh quang Các SAs được tách ra khỏi nền mẫu bởi sự chiết lỏng-lỏng,lần 1 với etyl acetate, lần 2 với acetone, và làm sạch thêm bởi sự chiết lặp 3 lần vớinước-metylen clorid SAs được dẫn xuất trước cột với Fluorescamine, được tách

trên hệ HPLC: cột (ODS-2 RP18 (250 x 4 mm, 5um); pha động: kênh A (đệmphosphate 0,01M, pH 3,0), kênh B (acetonitril) với tỉ lệ 65/35 Detector huỳnh

quang tại À„„ = 405nm, À¿„ = 490nm Hiệu suất thu hồi trong khoảng 64-75%, giới

hạn phát hiện là Iug/kg cho sulfaquinoxaline và 0,5g/kg cho các SAs còn lại.1.2.2.3 Phương pháp điện di mao quan

21

Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất

không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp

chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường Do độ linh động điện di của các ionkhác nhau, chúng di chuyền với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

Tác giả Ming-Ren S Fuh [17] và cộng sự đã phát triển phương pháp điện dimao quản vùng CE kết hợp với chiết pha rắn đề chiết và định lượng 8 SAs trong thịt

lợn, bò, gà Mẫu được đồng nhất với acetonitril, làm sạch lần một qua cột chiết pharắn SPE Alumina, làm sạch lần hai qua cột chiết SPE HLB, dịch rửa giải được bayhơi, hòa cặn và xác định bằng điện di mao quan vùng: cột mao quan silica nung

chảy không phủ (80.5 cm x 50 um 1.d.; 72 cm to detector), pha động: đệm

phosphate 35mM, pH 6,5; thế: 25kV; detector UV tại 205nm Hiệu suất thu hồi từ

80 — 97% Giới hạn phát hiện cho mỗi SAs trong khoảng 5 - 10ug/kg Độ nhạy đáp

ứng yêu cầu về MRLs theo qui định của liên minh Châu Âu EC.

1.2.2.4 Phương pháp sắc ký khí kết nối với detector phát xạ nguyên tử (GC-AED)Các SAs được tách trên hệ thống sắc ký khí và phát hiện bằng phổ phátxạ nguyên tử Ứng dụng phương pháp này, tác giả B Chiavarino và cộng sự [11] đãphát triển phương pháp để xác định 9 SAs Các SAs được metyl hóa sử dụngdiazomethane Điều kiện sắc ký khí: cột mao quan silica nung chảy 12.5 m x 30.22

mm, chương trình nhiệt độ: 75°C trong 1 phút, tăng nhiệt độ lên 290°C, với bước

tăng 20°C/phút, duy trì ở 290°C trong 5 phút Nhiệt độ tiêm mẫu 300°C DetectorAED với việc lựa chọn các nguyên tố: C, S, N.

1.2.2.5 Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Hiện nay, ELISA được sử dung rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu nhưy học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượngcác sản phẩm sinh học Nguyên tắc chung đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữakháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme, thường

22

cho nitrophenol phosphate vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân thành một chất có

Tác giả Weilin L Shelver and Fernando M Rubio [23] đã kiểm tra SAs bằngphương pháp ELISA và khang định lại bằng LC-MS/MS, kết quả cho thay ELISA

là một phương pháp nhạy phát hiện sulfamethoxazole tại nồng độ 15ppt Tuy nhiên,

có sự nhiễm chéo giữa sulfamethoxypyridazine, sulfachloropyridazine và

sulfadimethoxine do bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường phản ứng và các phảnứng cạnh tranh có thể gây ra hiện tượng âm tính hoặc dương tính giả Do vậy việc

xác nhận lại các mẫu dương tính bang LC-MS là rat cần thiết.

1.2.2.6 Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phố LC/MS/MS

Đây là một phương pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thời các SAs Saukhi qua cột tách, chất phân tích được hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hoa bị ion

hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc âm, các

gốc tự do Sau đó, các ion duoc đưa sang bộ phận tách theo khối lượng Từ các tínhiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh1on phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hang dtr liệu các ion và mảnh ion,người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác.

Thomas S Thompson và Donald K Noot [22] đã ứng dụng và phát triểnphương pháp sắc ki lỏng khối phổ dé xác định dư lượng kháng sinh trong mật ong.

Quá trình chuẩn bị mẫu gồm có thủy phân acid để giải phóng liên kết đường vớisulfonamid, sau đó lọc qua mang lọc và đem phân tích LC-MS/MS Điều kiện chạy

máy pha động kênh A là acid formic 0,1% (v/v) trong nước, kênh B là acid formic0,1% (v/v) trong acetonitril (ACN) và kênh C là trifluoroacetic 2% (v/v) trongacetonitril (ACN) Phương pháp có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện (LOD)

0,5ug/kg, khoảng tuyến tinh từ 5-100ug/kg, độ thu hồi nằm trong khoảng cho phépcủa cấp hàm lượng phân tích, sự lặp lại trong ngày có độ thu hồi trong khoảng RSD

+ 12%, trong các ngày khác nhau có RSD + 17,2% Tính toán ham lượng của SAs

bằng phương pháp thêm chuẩn có sử dụng nội chuẩn sulfachloropyridazine Ngoài

23

định tính chất bằng thời gian lưu thì ưu điểm của phương pháp là xác nhận chínhxác chất bằng sự phân mảnh phổ, mảnh pic đặc trưng cho cấu trúc SAs là mảnh cóm/z 156 [NH;C¿H„SO;]* dùng dé định lượng.

Trong nghiên cứu nồng độ của dung dịch đệm, thành phan pha động, loại ionhóa dé tách và xác định SAs tồn dư trong thịt bò tác giả Dal-Ho Kim và Dai WoonLee [13] cũng dùng phương pháp LC-MS Tác giả khảo sát nguồn ion hóa hóa họcáp suất khí quyên (Atmospheric pressure chemical ionization APCI) và nguồn ion

hóa phun electron (Electrospray ionization-ESI) Khi dùng CH;COONH, làm đệm

thì ion hóa áp suất khí quyên cho phản ứng tốt hơn, theo tác giả nêu sử dụng dungdịch đệm là acid acetic thì dùng nguồn ESI thay thế APCI, chế độ ESI sự protonhóa các ion SAs dễ dàng xảy ra trong điều kiện dung dịch acid Mặt khác nguồn

APCI ion HO” va NH," có thé được tạo thành từ dung môi, dung dịch đệm va

cation nitrogen do sự phóng điện khí No, vì vậy mà ion HạO” và NH," trong pha khí

dễ dàng proton SAs, nồng độ của CH;COONH, lựa chọn là 0,05M có (pH 6-7)trong nước chứa 13-15% acetonitril Xác định hàm lượng SAs bằng phương phápthêm chuẩn cấp hàm lượng 75ng/g với nội chuẩn '°C,-sulfamethazine kết hợp chiếtlỏng-lỏng bằng acetonitril và chiết pha ran (Solid phase extraction SPE).

Tại bộ môn khoa học thực phẩm và dinh dưỡng trường đại hoc Zhejiang,Hangzhou, Trung Quốc tác giả Zengxuan Cai và cộng sự [26] đã sử dụng phươngpháp sắc kí lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ (Ultral performan liquid

chromatography tandem mass spectrometry UPLC-MS/MS) xác định kháng sinh

SAs trong thit Mau thit duoc chiét bang acetonitril va loai chat béo bang n-hexan,chiết long-long bang ethyl acetate, phương pháp đã tách 24 SAs trong 15 phút thôngqua theo dõi nguồn ion hóa phun electron ESI* Đường chuẩn được xây dựng trênnền mẫu thực dé loại trừ các ảnh hưởng nền mẫu trong quá trình ion hóa, phươngpháp có hệ số tương quan tuyến tính tốt R°= 0,991-0,999 và khoảng tuyến tính rộngtừ 0,2-50ng/g, độ thu hồi đạt 67,8-113,9% cho tất cả sulfonamid Trong phương

pháp này tác gia đã khảo sát và lựa chọn cột C¡s (2,1mm x 100mm x 1,7um), haikênh pha động sử dụng là acid formic 0,2% (v/v) trong nước và acid formic 0,2%

24

(v/v) trong metanol Hàm lượng acid formic trong pha động có thé cải thiện hiệuquả ion hóa, tuy nhiên lại ảnh hưởng tới phân tách sắc kí Kết quả phân tích 240mẫu thịt được mua từ các công ty, xác định tổng SAs trong thịt có hàm lượng lớnhơn 5ug/kg có 40 mẫu (xấp xi 15%), có 9 mẫu (xấp xỉ 3,75%) có chứa hàm lượngvượt giới hạn cho phép 100ug/kg Sulfamethazine có hàm lượng cao nhất được tìmthấy trong mau lên tới 774,9ug/kg, sulfanilamide có nồng độ 5,9ug/kg,

sulfamethoxazole 78,3Iig/kg, sulfamethazine 14,8ug/kg trong cùng một mẫu.

Năm 2011 tác giả Huan Yu và các cộng sự [16] đã nghiên cứu phương pháp

chiết lỏng-lỏng, 5g mẫu được chiết bằng acetonitril, dịch chiết được thối khô bằngkhí Na, hòa cặn bằng 10ml acid acetic 2% (v/v) trong nước, sau đó làm sạch bangchiết pha rắn dùng cột HLB, sử dụng metanol và nước dé hoạt hóa và rửa tạp, cuốicùng rửa giải bằng metanol, xác định 18 SAs bằng HPLC-UV tại bước sóng 285 nmtrong thời gian 60 phút, sau đó xác nhận lại trên sắc ky LC-MS/MS tứ cực vớichương trình gradient hai kênh pha động là acid formic trong nước và ACN, chế độion hóa phun điện tử ESI ở chế độ dương trong 30 phút Phương pháp có độ nhạycao, giới hạn phát hiện 3 ppb và giới hạn định lượng 10 ppb, độ thu hồi đạt 71,1%-

Bằng sự tương tác trực tiếp chiết pha rắn phân tán cột C18-Silica với sắc kylỏng khối phố chế độ bay tứ cực nhóm tac giả Yanbin Lu, Quing Shen [25] tiếnhành đồng nhất 0,6g C18 đã được hoạt hóa bằng 2ml ACN và làm khô chân khôngvới 0,2g mẫu sau đó làm khô tại nhiệt độ phòng, tat cả chuyển vào ống chiết và nútchặt, tiến hành chiết trực tiếp khuôn pha ran phân tán (MSPD-matrix solid-phasedispersion) dùng 5ml ACN/nước (v/v 1:1) để chiết SAs với tốc độ dòng 1ml/phúttrong 5 phút, dịch chiết được chuyên vào cột phân tách, chế độ rửa giải gradient baogồm acid acetic 0,1% (v/v) trong nước và acetonitril Phương pháp này đã xác định

được 13 SAs chỉ trong 7 phút với độ nhạy cao, LOQ từ 2-10 ppb, phương pháp đạt

độ thu hồi tốt RSD < 13% Phân tích trên mẫu cá trắm phát hiện 4 mẫu nhiễm vớitong SAs là 124,6ng/g, 6 mẫu nhiễm sulfamethazine, sulfameter với tổng là

25

Với mục tiêu hướng tới hóa học xanh, các phương pháp chiết lỏng — lỏng sửdụng lượng lớn dung môi đã dần được thay thế bởi những phương pháp đơn giản,sử dụng ít hóa chất, ít độc hại cho con người và môi trường, như: phương pháp chiết

pha răn SPE Trong những năm gần đây, kỹ thuật QuEChERS (Quick, Easy,

Cheap, Effective, Rugged and Safe) đang được phát triển mạnh dé xử lý mẫu, nhờnhững ưu điểm: phân tích đa dư lượng (lên tới vài trăm hóa chất bảo vệ thực vật,thuốc thú y ) Kỹ thuật: nhanh, dễ thực hiện, chi phí rẻ, hiệu quả, kết quả ồn địnhvà đặc biệt rất an toàn đối với con người và môi trường Trên thế giới đã có một số

công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này.

Tác giả George Stubbings và cộng sự [14] đã ứng dụng kỹ thuật QuEChERS

và phương pháp sắc ký lỏng khối phố dé phát triển và thâm định phương pháp phântích dư lượng 30 thuốc thú y (bao gồm các nhóm: nitroimidazoles, sulphonamides,

fluoroquinolones, quinolones, ionophores and dinitrocarbanilide) trong thịt gia súc,

gia cầm Các kháng sinh trong mau được chiết vào dung môi ACN chứa 1% acidacetic, loại nước với NaaSO¿ khan, ly tam Dich chiết được làm sạch trong ốngdSPE chứa 500mg chất hấp thụ NH; và định lượng trên hệ thống sắc ký lỏng khốiphô LC/MS/MS: cột sắc ký Synergi Fusion-RP Phenomenex (100mm x 2mm x

2.5um), pha động: kênh A (nước chứa 0,1% acid formic), kênh B (ACN chứa 0,1%acid formic), kênh C (metanol chứa 0,1% acid formic) theo chương trình gradient.

Tác giả đã thâm định phương pháp theo hướng dan tai Council Directive 96/23/ECvới các thông số: độ thu hồi, hệ số biến thiên CV%, CCa, CCB đạt yêu cầu theo qui

Cũng ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ và kỹ thuật chiếtQuEChERS, tác giả Renata Pereira Lopes và cộng sự [19] đã phát triển và thâmđịnh phương pháp phân tích 13 SAs trong thức ăn chăn nuôi Sau khi tìm được điềukiện chiết tối ưu (dung môi chiết acid acetic 1% trong ACN : MeOH = 75/25,200mg PSA), tác giả đã tiến hành thâm định phương pháp theo hướng dẫn tạiEuropean Commission Decision 2002/657/EC tại các cấp độ 25, 50, 75ug/kg Cáckết quả thâm định thu được như sau: độ tuyến tính (0,9864 < R”< 0,9993), giới hạn

26

phát hiện (50,4 pg/kg < CCa < 55,8 ug/kg), khả năng phát hiện (50,7 ug/kg <CCB

< 55,8 ug/kg), giới hạn định lượng (0,9 ug/kg < LOQ < 7,1 ug/kg), hiệu suất thu

hdi 86,0 — 106,8, độ lặp CV% 3,6 — 19,5%.

Các phương pháp: sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (detector UV, huỳnhquang); điện đi (CE); sắc ký khí GC thường khá phức tạp và kém chính xác do ảnhhưởng của nền mẫu Chúng tôi lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng khối phổLC/MS/MS để xác định các SAs trong thịt gia súc, gia cam Phương pháp có độ

nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao.

27

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Van đề tồn dư kháng sinh trong thực pham đang đặt ra cho cơ quan thanh tra,kiểm tra thực phẩm cần có phương pháp xác định nhanh, chính xác trên địa bản

rộng đảm bảo an toàn và sức khỏe người tiêu dùng Phù hợp với thực tiễn, chúng tôitiễn hành xác định dư lượng một sỐ kháng sinh nhóm SAs bao gồm (sulfisomidine-

SIM, sulfadiazine-SD sulfathiazole-SIZ, sulfapyridine-SP, sulfamerazine-SM,sulfamonomethoxine-SMM, sulfachloropyridazine-SCP, sulfamethoxazole-SMX,

sulfisoxazole-SSA, sulfadimethoxine-SDM, và sử dụng nội chuẩnsulfadimethoxine-d4) trong thịt gia súc gia cầm bang sắc ký lỏng ghép nối khối phố

s Mục tiêu tiến hành nghiên cứu của đề tài:

> Tối ưu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định các SAs> Khảo sát, tối ưu hóa quá trình xử lý mẫu.

> Tiến hành phân tích trên một số mẫu thực tế.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Nhóm SAs là hợp chất trong phân tử có chứa nhóm (-SO;NH;-) phân cựcnếu dùng phương pháp sắc ký khí thường píc sẽ bị kéo đuôi, chất phân tích cần phảiđược dẫn xuất hóa chuyên về dạng hop chat dé bay hơi và bên nhiệt, trang thiết bịđắt tiền, mặt khác nhóm kháng sinh này phủ hợp với tách bằng sắc ký lỏng Do vậy,chúng tôi tiến hành xác định dư lượng 10 khang sinh nhóm SAs trong thịt gia súcgia cam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phô (LC-MS/MS) Day là phương pháphiện đại, có độ nhạy và độ chính xác cao Cơ sở lý thuyết của phương pháp đượctóm tắt như sau.

2.2.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặcchất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng-lỏng) Mẫu phân tích

28

được chuyên lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chấtphân tích được phân bồ liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chấtphân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khảnăng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyên vớitốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [10].

2.2.1.1 Pha tinh trong sắc ký long [3]

Trong LC, pha tinh (stationary phase) chính là chat nhồi cột làm nhiệm vutách hỗn hợp chat phân tích Đó là những chat ran, xốp và kích thước hat rất nhỏ, từ3-7um Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kếtthường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC) Khi dùng chất nhồi cột có cỡ hạt nhỏ hơn đường kính hạt 1,7 um, chịuđược áp suất cao lên tới 700 atm làm tăng độ phân giải và giảm thời gian phân tíchđó là những ưu điểm của sắc ký lỏng UPLC (Ultra Performance Liquid

Loại thứ hai là các dung môi ít phân cực như cychlorpentan, penfan, heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CSz), CCly, toluene Tuy nhiên

n-pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người tathường phối hợp 2 hay 3 dung môi dé có được dung môi có độ phân cực từ thấp đếncao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra

theo thời gian, trường hợp này người ta gọi là chương trình rửa giải gradient.2.2.1.3 Detector trong HPLC [4]

29

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp Đốivới chất phân tích là các SAs trong cấu trúc phân tử hợp chất thơm, có các liên kếtbội giữa C, H, S, O do đó có khả năng hap thụ tia UV có thé dùng dé xác định nhómchất nay Dựa trên sự phát triển detector UV có thể so sánh phé và định danh phổ

người ta thường dung detector diod array có độ nhạy cao hơn Ngoài ra nhóm amin

bậc 1 trong phân tử có thé tao dẫn xuất với hợp chất flourescamine cho sản phamphát huỳnh quang nên có thé dùng detector huỳnh quang dé xác định.

Hiện nay, detector có thé cung cấp thông tin định tính, định lượng và cấutrúc của các chất phân tích là detector khối phô.

2.2.2 Detector khối phố ( Mass spectrometry - MS)2.2.2.1 Nguyén tac

Khối phổ (Mass spectrometry — MS) là dựa vào chất nghiên cứu được ionhóa trong pha khí hoặc pha ngưng tụ dưới chân không cao, tạo thành các ion có sốkhối khác nhau, các ion này được phân tách thành các mảnh theo tỉ số khối trên điện

tích (m/z) [6, 8] Các ion này có thé tạo ra bang cách thêm hay bớt điện tích nhưloại bỏ electron, proton hóa Các ion tạo thành theo tỉ sỐ m/z và phát hiện từ đócho thông tin về khối lượng hay cấu trúc phân tử của hợp chất.

Nạp mẫu Phõn toch | — yị Thu nhận

khối ion

Bơm chân không

Hình 2.1: Sơ đồ khối của khối phổ kế

Cấu tạo của thiết bị khối phố gồm 3 bộ phận chính: nguồn ion, thiết bị

phân tích va detector Cac mau được ion hóa trong nguôn ion sau đó đưa vào bộ

30

phận phân tích khối dé tách các ion theo tỉ số m/z, các tín hiệu thu được sẽ chuyển

vào máy tính xử lý và lưu trữ.

Ưu điểm của phương pháp là:

Y Giúp phát hiện hầu hết các chất tan

a) lon hóa bang dòng electron (Electron Ionization — El):

Trong phổ EI-MS, dong electron có năng lượng cao được phát ra từ sợi daycatot vonfram hoặc reni được đốt nóng sinh ra dòng electron chuyền động vuông gócvới mẫu về phía anot xảy ra sự va chạm biến các mẫu thành các ion phân tử hoặc ionmảnh Thông thường các hợp chất hữu cơ có thế ion hóa năm trong khoảng 8 eV đến

15 eV nhưng dé đạt được hiệu quả cao thường áp dụng dòng 70 eV ABC + e > ABC” + 2e (1) (ion phan tir)

ABC’* —¬ A*+BC° (2) (ion mảnh, gốc tự do, mảnh trung

ABC? ¬AT+B+C°

Ưu điểm: áp dụng cho phân tử nhỏ, cho cơ sở đữ liệu pho Tuy nhiên, một sé

hợp chất dé phân mảnh thi thời gian sống ngắn, nhiều mảnh nhỏ hay ít hoặc không thuđược ion phân tử và đòi hỏi hợp chất phải dé bay hơi.

31

b) Chế độ ion hóa phun điện tử (Electrospray lonization- ESI)

Nguyên tắc: biến đổi ion ở thé lỏng thành ion ở thé hoi, dung dịch mẫu đượcdẫn vào điện trường mạnh và duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV Tại đây, dung dịch mẫubị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện va được hút tinh điện tới lối vào của bộ phân

tích khối phổ Các giọt tích điện trước khi vào bộ phân tích khối phổ sẽ kết hợp vớidòng khí khô dé làm bay hơi hết dung môi.

Ưu điểm của ESI là có hai chế độ bắn phá: bắn phá chế độ ion dương và ionâm, ESI-MS thích hợp cho cả phân tử có phân tử khối nhỏ (khoảng 100-150 amu)cũng như phân tử khối lớn của các phân tử sinh học, các hợp chất khó bay hơi,không bền nhiệt, phân cực và không phân cực.

c) Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí quyển (Atmospheric Presure Chemical

Su ion hóa trong APCI phụ thuộc vào su va cham cua dong ion dương hay

âm với phan tử, mau bi ion hóa bởi phan ứng với các ion được tạo ra từ các chất khí

như methan (ở dạng CH;"), amoniac (ở dạng NH,’)

Khi sử dụng khí methan làm chất khí phản ứng ta có các quá trình ion hóa

CH;” + CH¿ —- C>H;* +H,

Quá trình 2: ion mảnh va chạm trực tiếp với phân tử mẫu.

CH;* + M > CH, + (MH)* (chuyền proton thành đương m/z = M+1)CạH;Ì + M — (MH)* + C;H¿ (chuyển proton thành dương m/z =

C;H;” + M — (MC;H;)” (thêm ái lực điện tử thành dang m/z = M+29)

CoH;* + M — (M-H)* (hydrua chuyên thành dang m/z = M-1)

Sự thay đổi chất khí trong phản ứng APCI-MS cho phép thay đổi tính chọn

lọc của sự ion hóa và mức độ phân mảnh Day là phương pháp có độ nhạy cao cho

phép phân tích định lượng ở mức picomol tới femtomol, thích hợp cho những chatcó phân tử khối 1000 đơn vị nhưng đòi hỏi chất phân tích phải dé dàng bay hơi.

2.2.2.3 Bộ phân tích khối phổ (analyser)

Bộ phân tích được coi là quả tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách các ioncó trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt Một số bộ phân tích khối phổ

thông thường

- Bộ phân tích tứ cực.

- Bộ phân tích thời gian bay.

a) Bộ phan tích tứ cực (Quadrupole analyser)

Nguyên tắc: tạo ra một trường tần số vô tuyến biến đổi (trường tứ cực).Bộphân tích tứ cực bao gồm 2 loại: Bộ phân tích tứ cực đơn, bộ phân tích tứ cực chập

" Bộ phân tích tứ cực don (Single focusing magnetic analyser): Có 4 cực

băng kim loại đặt song song và theo hướng của chùm ion Trường tĩnh điện đượctạo ra do thế một chiều (DC) và tần số radio (RF) được đặt vào các thanh Các tứ

cực như bộ lọc khói, khi có điện trường thì ion chuyền động trong nó sẽ dao động

33

phụ thuộc vào tỉ số m/z và từ trường RF Chỉ những ion phù hợp mới đi qua bộ lọc

7 Bộ phân tích tứ cực MS/MS (Triplequad mass spectometry): Bộ phan tích

khối bao gồm ba bộ tứ cực ghép nối với nhau Ion sinh ra được tập trung và gia tốcbằng hệ quang học ion dé đưa vào bộ phân tích khối Tại bộ phân tích khối, tứ cực

thứ nhất sẽ lọc ion mẹ có m/z xác định, các phân mảnh của ion này được tao ra tạibuồng va chạm (collision cell) nhờ tương tác với khí trơ và được phân tích bằng tứ

cực thứ ba Đây là kỹ thuật phân tích khối phổ hai lần (MS/MS).

QQQ Analyzer

Quad Mass Filter (Q1) Quad Mass Filter (Q3)

Hình 2.3: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực MS/MS

Kỹ thuật MS một lần có nhược điểm là không nghiên cứu được cơ chế phânmảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, chịu ảnh hưởng rõ rệt của nền mẫu chấtphân tích, trên phổ đồ chi cho thấy ion phân tử Kỹ thuật MS/MS không chỉ khắcphục được những nhược điểm trên mà còn tăng độ nhạy phân tích tới hàm lượngfemtogram, tăng độ chính xác của kết quả phân tích, loại bỏ ảnh hưởng của nềnmẫu Hệ MS/MS là hệ hai máy khối phổ độc lập được nối với nhau cách nhaubuồng va cham (Collision Cell).

b) Bộ phân tích thoi gian bay (Time of flight analyser — TOF)

Các ion ra khỏi buồng ion hoá được gia tốc nhờ thế 10-20 kV bay qua mộtống phân tích (không có trường điện từ) có chiều dài đến 2m với cùng động năng.Tuy nhiên, tùy thuộc vào tỉ số m/z mà các ion có tốc độ khác nhau tới detector Thờigian bay hết ống này đến detector tỷ lệ thuận với /m/z của các ion Các ion sẽ

34

được phát hiện ở các thời điểm khác nhau Bộ phân tách này cho phổ tuyến tính với

thang m/z.

2.2.3 Phân tích định tính và định lượng bằng LC/MS

Đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký là thời gian lưu của các chất do vậydựa vào thời gian lưu của chất phân tích và sự phân mảnh phổ có thé định tính từngchất trong hỗn hợp Dùng phương pháp đường chuẩn và thêm chuẩn đề định lượngchất phân tích trong mẫu, đồng thời kiểm soát độ thu hồi của phương pháp phân

- Cột sắc ky Agilent C18 (150mm x 2,1mm x 3,5um)- — Máy lắc ngang

- — Máy lắc vortex VELP.- May déng nhat mau.

- May ly tâm MIKRO 22R.

- Cân phân tích (có độ đọc 0,1mg va 0,01mg).- Cân ki thuật (có độ doc 0,01).

® Dụng cụ

- _ Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 200ml.- Ông dong dung tích 10, 100, 200ml.

- Pipetman, pipet nhựa, pipet pasteur 200w]; 1000ul; 5mI đầu côn.- Ong ly tâm 50ml, màng lọc 0,2um.

- Vial loai 1,8ml.

- Binh định mức loại A dung tích 10, 25, 50, 100 ml.

35

Ong nghiệm thủy tinh

Lo dSPE dung tích 2ml

2.3.2 Hóa chất, chất chuẩnChất chuẩn

Các chất chuân được cung cấp bởi hãng Sigma — Aldrich với độ tinh khiếtlần lượt: SIM (99,6%), SD (99,7%), STZ (99,9%), SP (99,7%), SM (99,9%),

SMM (99,8%), SCP (99,4%), SMX (%), SSA (99,9%), SDM (99,8%) d4 (1mg/lo)

SDM-Dung dich chuẩn gốc 100 pg/ml: cân chính xác 0,01g từng chất chuẩn trêncân phân tích có độ đọc 0,0001g, hoa tan và định mức 100ml băng metanol.Bảo quản trong tủ lạnh 4°C, sử dụng trong 1 năm.

Dung dịch chuẩn đơn trung gian (10 pg/ml): hút Iml dung dịch chuẩn gốcvào bình định mức 10ml, pha loãng và định mức đến vạch bang metanol.

Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (1000 ng/ml): hút 1ml mỗi chuẩn đơn

trung gian (10 ug/ml) vào bình định mức 10ml, pha loãng và định mức đếnvạch bằng metanol.

Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 1000 ng/ml trong metanol déthu được các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,5; 1; 2; 5; 10; 25; 50; 100;

200; 500 ng/ml.

Dung dich nội chuan (IS) gốc nồng độ 1000 pg/ml được chuẩn bị bằng cách

hút chính xác Iml metanol cho vào lọ chứa Img IS

Dung dịch nội chuẩn làm việc 1000 ng/ml: hút 100u1 IS gốc 1000 pg/ml vàobình định mức 100ml và định mức bằng metanol Bảo quản trong tủ lạnh

Các loại hóa chất, dung môi khác

Metanol (Merck 99,9%), Acetonitril (Merck 99,9%), acid formic (Merck98%), acid acetic bang (Merck)

Chuẩn bi pha động dé khảo sát là acid formic trong nước các nồng độ 0%;

0,05%; 0,1%; 0,15%; 0,2% (v/v).

36

2.4 Lay mẫu

LAL - Đối tượng mau: thịt lợn, thịt gà, thịt bò và một số

phủ tạng

1.L2 - Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên

1.13 - Địa điểm: một sô chợ trên địa bàn nội thành Hà nội1.14 - Khối lượng mẫu lấy: 100 — 500g/mẫu

1.15 - Báo quan: 0 — 2°C và xử lý mau trong vòng 24 giờ,

phần còn lại sau xử lý mẫu bảo quản ở -20°C

37

1.1.6 CHUONG 3: KET QUA VA THAO LUAN

3.1 Tối ưu điều kiện tách và xác định Sulfonamid trên thiết bịLC/MS/MS

3.1.1 Tối ưu các điều kiện của detector khối phố (MS)

Các chất thuộc nhóm sulfonamid có khối lượng phân tử và độ phân cựctrung bình Qua tham khảo một số tài liệu [25, 26], chúng tôi tiến hành khảo sát xácđịnh các SAs bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn pha ion dương.3.1.1.1 Ti wu hóa điều kiện phân mảnh của từng chat (Compound

Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dương, các ion

mẹ có dang (M+H) Detector được sử dung trong nghiên cứu này là khối phổ hai

lần, do đó dé phát hiện đúng chất phân tích thì việc chọn được 1on con là rất quan

trọng Với hệ thống Tripquards 5500, điều kiện phân mảnh của từng chất được tốiưu hóa tự động Có định các thông số của nguồn và khí như sau:

- Thế phun điện tử: 5,5 kV.

- Nhiệt độ đầu phun (IS): 5500°C.

- Nhiệt độ mao quản (TEM): 350°C

- Khí màn (CUR): 35 psi.

- Khí va chạm (CAD): 7 eV.

- Nguồn khí ion 1 (GS1): 25 psi.- Nguồn khí ion 2 (GS2): 10 psi.- Thế phân nhóm (DP): 80 eV.

- Thế đầu vào (Entrance Potential) (EP) 10 eV.

38

Dùng xilanh 500 uL, bơm từng chuan SAs 20 ng/ml trực tiếp vào detector

khối phổ, xác định các giá trị DP, CE, CXP va lựa chọn 2 ion con có cường độ tín

hiệu cao nhất dé định tính và định lượng

1.17 Bang 3.1: Các thông số toi ưu hóa điều kiện phân

CE | CXPSTT lon mẹ lon con DP (eV)

(eV) | (eV)

124 80 29 16

186 80 23 12156 80 21 20

92 80 31 16156 85 19 18

92 85 33 1492 85 31 10

156 85 28 12156 80 23 12

92 80 37 16

8 SMX - 254 156 80 21 18

39

có cường độ thấp hơn dùng dé xác nhận chat phân tích.

3.1.1.2 Toi uu hóa các điều kiện của nguon và khí (Source and gas108 80 31 16

156 80 19 16

9 SSA - 268

113 80 21 16156 80 27 20

10 | SDM-311

92 80 41 14156 80 29 20

11 IS - 315

96 80 39 14

Manh ion con m/z có cường độ lớn nhất dùng dé định lượng, mảnh con thứ 2

Tôi ưu các điêu kiện cho nguôn ion hóa, khí phun, khí va cham, chúng tôi

tiễn hành chọn chế độ khảo sát như sau:

Quét 2 mảnh cho cường độ tín hiệu cao nhất.

Thế phân nhóm (Declustering Potential-DP) trong khoảng từ 80 đến 110

(eV) với bước quét (step) là 5 (eV).

Khí va cham (CAD) trong khoảng từ 5 đến 10eV bước quét là eV.

Khí man (CUR) trong khoảng 15 psi đến 35 psi với bước quét là 5 psi.

Nhiệt độ mao quản (TEM) khảo sát từ 250°C đến 350°C với bước tăng50C.

Nhiệt độ đầu phun (IS) từ 4000°C đến 5500°C với bước tăng 500°CNguồn khí ion hóa 1 (GS1) từ 15 psi đến 30 psivới bước tăng 5 psi.Nguân khí ion hóa 2 (GS2) từ 0 psi đến 10 psi với bước tăng 5 psi.

Thể tích tiêm mẫu 10ul.

Tổng tốc độ dòng 0,5 ml/phút.

40