Luận văn thạc sĩ khoa học: Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV Một số tác giả đã sử dụng phương pháp sắc ký long với detector tử ngoại khảkiến HPLC-UV-VIS dé phân tích kháng sinh nhóm nitrofuran và các dẫn xuấ

_ ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀNỘỌI_

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRAN THỊ HONG

XÁC ĐỊNH DONG THỜI DU LƯỢNG KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG

MOT SO LOẠI THỰC PHẨM TƯƠI SÓNG TREN

LUAN VAN THAC Si KHOA HOC

Hà N6i— 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẢN THỊ HỎNG

XÁC ĐỊNH DONG THỜI DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG MỘT

SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƯƠI SÓNG TRÊN ĐỊA BÀN

HÀ NỘI BẰNG PHƯƠNG PHAP SAC KÝ LONG

MỤC LỤC

(910015 |CHƯƠNG 1: TONG QUANN 2-5252 SE2E2EEEEEEEEEEEE2E127171121121171 71.112 31.1 _ Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran -2-2s¿+s+2s++zx++zxzzxez 3

1.1.1 NhOm nitrofuran 0.101 a -‹- 3

1.1.2 Các chất nhóm nitrOfUran - 2-52 £+SE£EE‡2E2EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErkerrkrrkerrees 3

1.2 Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran ¬ eee ee eteeeeeeteeeeeee neeeees 61.3 Du lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phâm - + + 61.4.1 Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV - 2 2©cz+xe£xerxerxsrrrszreres 6

1.4.2 Phương pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent

assay-0179007 7

1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS ¿5-5552 s2 8CHUONG 2: DOI TUGNG VA PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU II2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2-2 + s+sz+zs+zx+zxzsz 11

2.1.1 Đối tượng, mục tiêu nghiên COU cee eeceeceescessessessessessessesssessessesseesessesseeseess 11

2.1.2 Nội dung nghiÊn CỨU - G213 83111911 191119131 111111511 1E E11 1g rret 11

2.2 Phương pháp nghiên CỨU - G1 2211189111111 1 91119 11 111111 E1 ng ng rry 12

2.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ - 2-2 5¿22+2++£x++zxzrxerxesree 12

2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu - 2-5 2S SE+S£SE£EE£E£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEkrkrrkrrerkee 18

2.3 Hóa chat và dụng cụ nghiên cứu -¿- 2 +¿©++2x++x+2Ex+zE+trxeerxrzrxerrecree 23

2.3.1 Dụng cụ, thiẾt bị -¿ 5c <+Sk ExEE22112112212112112112111121121111111 11 xe 23

2.3.2 Hóa chất, chất chuân -:-2++22 tt krttEkrttErrrtrirrrirrrrrirrree 242.3.3 Pha chế chất chuẩn .-: ++++t2E2xt2EEEttEEEvrtttktrrttrtrrrrrtrrrrrrrrrrrrree 25

CHƯƠNG 3: KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2- 2 k+S£+E++E££EerEerkerxerxree 273.1 Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS 27

3.1.1 Khảo sát các điều kiện khối phổ . + + ¿+5 £+E++E2E£zEerkerxerxrrsrree 27

3.1.2 Lựa chọn cột tách + 2< +1 2231111223111 2931 11220 1n vn ng 29 3.1.3 Khảo sát chương trình øradÌI€n{ - c2 32133121 3EEEErrrrrrrrree 30

3.1.4 Khảo sát quy trình chiết mẫu -2- 22 2 2©E+EE+2EE2EE+EEtEEEEErEkrrkrrkrrer 333.2 Thâm định phương pháp - 2-2 2 x£+E£+E+EE£EE£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEkrrkerkrrex 38

3.2.1 Tih ac HiQu 0 38

3.2.1 Khảo sát lập đường chuẩn -¿- ¿+ ©++2++2Ex+2EEtEE+SEE+SEErEEkerkesrkrrrrres 38

3.2.2 Giới han phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 43

3.2.3 Độ lặp lại và độ thu hồi ¿- 2 2S E2E2EE2EEEEEE2EEEEEEEEEEErrkrrrerkerrrree 4645000) 55

TÀI LIEU THAM KHẢO - 5-5-5 St E2 SESEE2EEEESEEEESEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEkrrkrree 56

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Nội dung Trang

Bảng 1.1 | Câu trúc hóa học của một sô chất nhóm nitrofuran 4

được xác định trong đề tai

Bảng 3.1 | Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI 27 Bảng 3.2 Kết quả bắn phá các ion mẹ 28

Năng lượng bắn phá và các ion con của các chất 29

Bảng 3.3 ,

chuyên hóa nitrofuran

Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng 35

Bảng 3.4 ,

chiét long — long

Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng 37

Bảng 3.5 us ,

chiét pha ranBảng 3.6 | So sánh độ thu hoi của 2 quá trình chiết 37 Bang 3.7 | Phương trình hồi quy 4 nitrofuran sử dụng nội chuân 41

Bang 3.8 | Phương trình hoi quy 4 nitrofuran không sử dụng nội 43

chuẩn

Bảng 3.9 | Giới hạn phát hiện của AOZ trên nền mẫu thịt 44

Bảng 3.10 | Giới hạn phát hiện của AMOZ trên nên mẫu thịt 45 Bảng 3.11 | Giới hạn phát hiện của AHD trên nên mẫu thịt 45

Bang 3.12 | Giới han phát hiện của SEM trên nên mẫu thịt 46

Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nên 47

Bảng 3.16 Kết quả phân tích trên mẫu thực 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Nội dung Trang

Hình 2.1 | Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phô 13

Hình 2.2 | Sơ đô phân tích khối phô 3 tứ cực l6

Hình 2.3 Các bước của quá trình chiết pha ran 19

Hình 3.1 | Sắc đồ hỗn hợp chuẩn khi chạy chế độ gradient 30

1 ở nồng đồ 20 ng/mlHình 3.2 Sac đồ hỗn hop chuẩn khi chạy chế độ gradient 31

Hình 3.7 Sắc đô mẫu thịt lợn thêm chuẩn hỗn hợp 38

nitrofuran tại mức nông độ 20 ng/ml sử dụngquy trình chiết pha rắn

Hình 3.8 Đường chuân AOZ sử dụng nội chuân 39

Hình 3.9 Đường chuân AMOZ sử dụng nội chuân 39

Hình 3.10 | Đường chuân SEM sử dụng nội chuan 40

Hình 3.11 | Đường chuẩn AHD sử dụng nội chuẩn 40

Hình 3.12 | Đường chuẩn AOZ không sử dụng nội chuân 41Hình 3.13 | Đường chuân AMOZ không sử dụng nội chuân 42Hình 3.14 | Đường chuân AHD không sử dụng nội chuẩn 42Hình 3.15 | Đường chuân SEM không sử dụng nội chuân 43

Hình 3.16 | Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn hỗn hợp 47

nitrofuran tại mức nông độ 1 ng/g

Hình 3.17 | Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn hỗn hợp 48

nitrofuran tai mức nông độ 1,5 ng/g

Hình 3.18 | Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn hỗn hợp 49

nitrofuran tại mức nồng độ 2 ng/g

DANH MỤC Ki HIỆU, CHỮ VIET TAT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

CAD Collision Gas Presure Ap suất khí mang trong tứ cực Q2

CE Collision Energy Thế áp vào tứ cực Q

CUR Curtain Gas Khí mang

CXP Collision Cell Exit Potential | Thế áp giữa tứ cực Q2 và Q3

DP Declustering Potential Thế đầu vào áp vào mản chắn

EP Entrance Potential Thế áp vào nguồn ion mẹ

ESI Electrospray lonization lon hóa phun điện tử

EU European Union Liên minh châu Âu

GS1 Ion Source Gas 1 Ap suất khí hai bên đầu phun

GS2 lon Source Gas 2 Áp suất của luồng khí nóng

High performance liquid ,

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao

chromatography

IP Identification point Điểm nhận dạng

IS lonSpray Voltage Thế ion hóa

LC-MS | aud chromatography lu lỏng khối phổ

mass spectrometry

LOD Limit of detection Gidi han phat hién

LOQ Limit of quality Giới hạn định lượng

MeOH Methanol Methanol

MRPL Minimum required Yêu cầu giới hạn hiệu năng nhỏ nhất

performance limit cua phuong phapRSD% Relative standard deviation | Độ lệch chuẩn tương đối

SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn

TEM Temperature Nhiệt độ của nguôn khí nóng thôi vào

MỞ ĐẦU

An toàn vệ sinh thực pham la van dé đang được cả xã hội quan tam, đặc biệt

là ở đô thị và các khu công nghiệp, khi ngày càng có nhiều tác nhân độc hại bị pháthiện trong thực phẩm khiến dư luận lo ngại Tuy nhiên trong lĩnh vực sản xuất kinhdoanh nói chung và trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nói riêng còn nhiều vấn đềđáng lo ngại, như việc quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo, tình trạng sửdụng các chất bổ trợ trong chăn nuôi khá tùy tiện Từ đó đã dé lại tồn dư các hóachất, kháng sinh trong sản pham chăn nuôi, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức

khỏe người tiêu dùng.

Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp thường được sử dụng cho vào

thức ăn gia súc dé kích thích tăng trưởng và là phương pháp điều trị dự phòng, điều

trị các bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa gây ra bởi Escherichia và Salmonella trong

chăn nuôi gia súc, gia cam Chúng cũng đã được sử dung dé điều trị nhiễm trùng do

vi khuẩn và sinh vật đơn bảo trong nuôi trồng thủy sản Vì vậy sự tồn dư của

chúng gây tác hại cho sức khỏe con người, đặc biệt là gây ung thư và đột biến ở

người Năm 2002 — 2003 phát hiện dư lượng chất chuyển hóa của nitrofuran trong

số lượng lớn các mẫu từ gia cầm và nuôi trồng thủy sản các sản phẩm nhập khâuvào Châu Âu từ một số khu vực Đông Nam Á và các nước Nam Mỹ Từ đó đã dẫnđến lệnh cam sử dung nitrofuran trong sản xuất thực phẩm động vật tại nhiều quốc

gia bao gồm Mỹ, Canada và EU Các nước này đã đặt lệnh cam trên tất cả các loại

thực phẩm nhập khẩu có chứa dư lượng nitrofuran Tháng 3 năm 2003 EU đã quy

định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phương pháp (MRPL) đối với các chấtchuyên hóa nhóm nitrofuran là 1 pg/kg [29] Năm 2002, ở Việt Nam, Bộ nôngnghiệp va phát trién nông thôn đã quyết định cắm sản xuất, nhập khâu, lưu thông và

sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh doanh TACN trong

đó có nitrofuran [9].

Hiện nay việc sử dụng dư lượng kháng sinh sai mục đích đang ở mức báo động

ảnh hưởng tới sức khỏe con người và động vật Vì vay với nhu câu bức thiệt vê van

dé đảm bảo VSATTP, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển phương pháp

“Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loạithực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phương pháp sắc ký long khốipho LC/MS/MS”

CHƯƠNG 1: TONG QUAN1.1 Giới thiệu về khang sinh nhóm nitrofuran

1.1.1 Nhóm nitrofuran là gi?

Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp có chứa nhóm 5-nitro, thườngđược sử dụng làm thức ăn gia súc kích thích sự tăng trưởng, chủ yếu đối với gia súc

(như gia cầm, lợn), nuôi trồng thủy sản (cá, tôm) và nuôi ong để điều trị các vi

khuan và sinh vật đơn bào nhiễm trùng như viêm ruột tiêu hóa gây ra bởi

Escherichia coli và Salmonella spp, gia cầm bệnh tả và bênh cầu trùng màu den đầu

[12].

1.1.2 Các chất nhóm nitrofuran

Các chất nhóm n itrofuran bao gồm Furazolidone, furaltadone, furazolidone,

nitrofurazone, khi đi vào cơ thé sinh vật nó tạo thành các chất chuyển hóa tương

ứng (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) liên kết trong các mô tổn tại trong nhiều tuần sau

khi sử dụng [12] Ví dụ như quá trình chuyên hóa của nitrofurazone như sau:

(a) le) lo)

Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học của một số chất nhóm nitrofuran được xác định trong đề tài

Khoi

„ lượng

Công thức os STT Cac chat nitrofuran phan Công thức cầu tạo

1.2 Tác dung của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran

McCracken và các cộng sự 1995, Nouws và Laurensen 1990 chỉ ra rằng các

hợp chất nhóm nitrofuran sau khi vào cơ thể tạo thành các chất chuyển hóa tương

ứng liên kết trong các mô

Về mặt cơ chế tác dụng, các chất chuyên hóa từ nitrofuran đã kìm hãm hoặc

pha hủy các hệ thống men điều hòa trao đôi chất ở vi khuẩn Do đó vi khuẩn không

phát triển và không sinh sản được nữa Tác dụng tốt với vi khuẩn gram âm và gram

dương Đồng thời còn tác dụng cả với nguyên sinh động vật, một số chất có tác

dụng tốt trong việc giệt trừ giun đũa [7]

Với nồng độ thấp, nitrofuran có tác dụng kháng sinh, nồng độ cao có tác

dụng diệt khuẩn.

Theo nhiều báo cáo, nitrofuran tác dụng rất tốt trong việc diệt khuẩn

salmonellosis, colisepticeamia Nitrofuran còn có tác dụng kích thích dinh dưỡng.

Trộn nitrofuran với thức ăn, theo tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho ga va lon còn tang trọng

nhanh.

Nitrofuran ảnh hưởng đến sức khỏe con người như gây ung thư và đột biến

[7] khi thực pham có tồn dư nitrofuran và các dẫn xuất của nó

Do đó hau hết các nước trên thế giới đã cam sử dụng kháng sinh nhóm

nitrofuran trong chăn nuôi Ở Việt Nam, bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã

quyết định cắm sử dụng ni trofuran cho vào trong thức ăn chăn nuôi [9] EU đã quy

định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phương pháp (MRPL) đối với các chấtchuyên hóa nhóm nitrofuran là 1 ug/kg [29].

1.3 Dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm

Từ năm 2002 — 2003 nitrofuran thường xuyên được phát hiện thấy trong thịtgia cầm và các sản phâm nuôi trồng thủy sản nhập khâu vào các nước EU từ Thái

Lan, Trung Quốc, Đài Loan, An Độ, Việt Nam, Ecuador và Brazil [25].

Hơn nữa, dư lượng nitrofuran cũng được tìm thấy trong sản pham gia súc và

gia cam ở Châu Âu như: Bồ Đào Nha, Y, Hy Lap, Romania va Bulgari Sau đó EU

đã kiểm tra và cho thấy nitrofuran 6 nhiễm trong các sản phẩm có nguồn gốc từ hơn

9 quốc gia trong năm 2007, tỷ lệ mắc cao nhất là từ Ấn Độ (37%), Trung Quốc(37%), Bangladesh (10%) và Thái Lan (5%) trong một loạt cá sản phâm bao gồm

tôm, mật ong và thịt hộp [25].

Từ tháng 10/2006 đến tháng 5/2007, FDA liên tục phát hiện thủy sản nhập

khẩu từ Trung Quốc có nhiễm nitrofuran Kết quả lấy trên các sản phẩm tôm, cá trê,

cá ba sa cho thấy, 22/89 mẫu (chiếm 22%) bị phát hiện có chất cắm nitrofuran

trong tôm [11].

Ở Việt Nam theo kết quả khảo sát của TS Nguyễn Quốc Ân , phó trưởngphòng quản lý thuốc, cục thú y vào năm 2007 đã phát hiện 5 mẫu thủy sản nuôi lẫy

tại ao nuôi nhiễm SEM (3 mau tôm, 1 mẫu cá và 1 mẫu cua lột) với hàm lượng từ 0

— 3,55 ng/g Năm 2008 phát hiện 1 mẫu tôm thẻ chân trang tại Phú Mỹ — Bình Dinhnhiễm AOZ với hàm lượng 12,6 ng/g; 2/754 mẫu cua lột tại Cần Guộc — Long An

nhiễm SEM với hàm lượng từ 2 — 2,2 ng/g [1].

1.4 Cac phương pháp xác định kháng sinh nhóm nitrofuran

Hiện nay có nhiều phương pháp dé xác định kháng sinh nhóm nitrofuran , baogồm: phương pháp sắc ký lỏngv ới detector UV , phương pháp vi sinh (kỹ thuật

Elisa), phương pháp sắc ký lỏng với detector MS/MS

1.4.1 Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV

Một số tác giả đã sử dụng phương pháp sắc ký long với detector tử ngoại khảkiến (HPLC-UV-VIS) dé phân tích kháng sinh nhóm nitrofuran và các dẫn xuất của

nó trong một số đối tượng thực phẩm Horne và cộng sự, đã xây dựng phương pháp

xác định AOZ, AMOZ trong gan lợn sử dụng HPLC — UV Phương pháp dựa trên

sự dẫn xuất các nitrofuran với 2-nitrobenzaldehyde, sau đó chiết với ethyl acetate,

làm sạch bằng n-hexan và phân tích bằng HPLC-UV sử dụng cột C18 kết hợp với

detector UV ở bước sóng 275nm Giới han phát hiện của phương pháp là 5 và 10

ug/kg tương ứng cho AOZ và AMOZ với độ thu hồi trong khoảng 71-101% [18]

Tac gia Cooper và cộng sự cũng giới thiệu phương pháp xác định AOZ,

AMOZ, AHD, SEM trong gan và thận của lợn dùng HPLC-UV đã tách được 4 chất

chuyền hóa nhóm nitrofuran Giới hạn phát hiện của phương pháp là từ 2 - 5 ug/kg

[21].

Phương pháp HPLC -UV có ưu điểm là dé thực hiện , và có thé ứng dung

phân tích rộng rãi Tuy nhiên phương pháp lại không đáp ứng được yêu cau về độ

nhạy dé phân tích các nitrofuran trong thực phẩm vì hiện nay giới hạn cần phải đạ ttới (MRPL) là 1 pg/kg.

1.4.2 Phuong phap phan tich vi sinh (enzyme-linked immunosorbent

assay-ELISA)

Hiện nay, ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như

y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượngcác sản phẩm sinh học Nguyên tắc chung đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữakháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme, enzyme

sẽ thủy phân thành một chất có màu

Phòng thí nghiệm randox của Anh đã nghiên cứu xác định các chất chuyểnhóa nhóm nitrofuran sử dụng phương pháp Elisa: mẫu được đồng nhất, thủy phân

và dẫn xuất bằng o-NBA trong môi trường axit HCl , trung hòa axit bằng NaOH,chiết và làm sạch mẫu bang ethyl acetate va n-hexane Giới han phát hiện của

phương pháp từ 0,2 — 0,6 ng/g [28].

Vass và cộng sự (2008) sử dụng kỹ thuật Elisa trực tiếp sử dụng kháng théđặc hiệu cho NPSEM, khang thé được gắn 1 enzym HRP xác định SEM trong trứngvới quy trình xử lý mẫu: mẫu được đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng o-NBA

trong môi trường axit HCl , sau do trung hòa bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu

bang ethyl acetate và n-hexane Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,13 ug/kg,

CC, = 0,3 ug/kg [25].

Diblikova và cộng sự (2005) giới thiệu kỹ thuật Elisa trực tiếp, sử dụngkháng thể đặc hiệu cho NPAOZ, kháng thể được gan 1 enzym HRP xac dinh AOZtrong tôm, thịt gà, thịt lợn, thịt bò với CC, là 0,4 g/kg, độ thu hồi từ 66 — 119%

[20].

Lui và cộng sự (2007) giới thiệu kỹ thuật Elisa gián tiếp, sử dung khang théNFT, kháng thể được gắn 1 enzym HRP xác định AHD trong nước Giới hạn pháthiện là 0,2 ug/1, độ thu hồi từ 88 — 103% [31]

Tương tự Chang và cộng sự (2008) xác định trong gan lợn, gan gà va cá với

giới hạn phát hiện lần lượt là 0,19; 0,24; 0,18 ng/kg [15]

Phương pháp Elisa dap ứng được yêu cau về độ nhạy , đơn giản dễ thực hiện,

tuy nhiên độ đặc hiệu bị giới hạn vì phải đánh dấu cho từng kháng thé chuyên biệt

cho từng đối tượng

1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối pho LC/MS/MS

Đây là một phương pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thời dư lượngnitrofuran Sau khi qua cột tach, chất phân tích được hóa hơi, các hợp chất hữu cơ

trung hoa bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện

dương hoặc âm, các gốc tự do Sau đó, các ion duoc đưa sang bộ phận tach theo

khối lượng Từ các tín hiệu thu được, dựa vào khối lượng 1on phân tử, dựa vào đồng

vị, dựa vào các mảnh 1on phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ

liệu các ion và mảnh ion, người ta định tinh và định lượng được chất phân tích một

cách chính xác.

Ở Việt Nam năm 2004, Bộ Thủy sản (nay là Bộ Nông nghiệp và phát triểnnông thôn) đã ban hành TCN 194:2004 xác định các chất chuyền hóa thuộc nhóm

nitrofuran trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng khối

phố phân tích dư lượng liên kết với mô của các chất chuyên hóa nhóm nitrofurantrong sản phẩm thủy sản được thủy phân bằng axit clohydric loãng dé thu được

mạch nhánh của các chất nhóm nitrofuran Các mạch nhánh này được dẫn xuất bằng2-nitrobenzaldehyde, sau đó đưa pH đến 7 và được chiết bằng ethyl axetat Dịch

chiết được thôi khô băng N> đến cạn, hòa tan cặn, sau đó đo dung dich mẫu nay

bang hệ thống LC/MS/MS với pha động kênh A là axit acetic , kênh B là acetonitril

Giới han phát hiện của phương pháp là 1 pg/kg [10].

Năm 2002 phòng thử nghiệm thức ăn chăn nuôi của Thái Lan đưa ra quy

trình phân tích 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran (AOZ, AMOZ, AHD, SEM)bằng LC/MS/MS giới hạn phát hiện lần lượt của từng chất là AHD 0,1 ug/kg; AOZ

0,04 ng/kg; SEM 0,15 pg/kg; AMOZ 0,02 pg/kg [29].

Tác gia Pascal Mottier và cộng sự, xác định 4 chất chuyên hóa nhómnitrofuran trong thịt bằng LC/MS/MS với pha động kênh A là axit acetic 0,025%,kênh B là acetonitril , sử dụng quy trình làm sạch bằng cột chiết pha rắn polymerictrước khi phân tích bằng LC/MS/MS và thu được CC, từ 0,11 - 0,21 pg/kg, CƠ; từ

0,19 — 0,36 pg/kg [26].

Trong tài liệu [25] của tac giả M.Vass, tac giả Boket và cộng sự (2007) xácđịnh các chất chuyên hóa nitrofuran trong trứng bằng LC/MS/MS, CC, lần lượt củatừng chat AOZ, AMOZ, AHD, SEM là 0,03; 0,05; 0,22; 0,2 Độ thu hồi từ 95,2 —

102,1 %.

Leitner và cộng sự xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt

gia súc, gia cầm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS với pha độngkênh A là amoniacetat 10mM, kênh B là methanol, sử dụng quá trình làm sạch bằngcột chiết pha rắn SPE với chất hấp thụ polystyrene được kết hợp bằng cách thủyphân các chất chuyên hóa hình thành liên kết trong các mô và được dẫn xuất bằng

2-nitrobenzaldehyde Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,5 — 5 ng/g; giới han

định lượng từ 2,5 — 10 ng/g [12].

Verdon và cộng sự năm 2007 cũng giới thiệu phương pháp xác định các

chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt lợn băng LC/MS/MS với cột C 18, phađộng kênh A là amonifomiat 1mM, kênh B là methanol, sử dụng phương pháp chiết

lỏng — lỏng thu được CC, = 0,08 — 0,54 pg/kg và CCs = 0,10 — 0,66 pg/kg [19].

Tác giả C.Bock và cộng sự đã thâm định phương pháp xác định dư lượng 4chất chuyền hóa nhóm nitrofuran trong trứng bằng LC/MS/MS với CC, từ 0,03 —

0,22 ug/kg [14].

Các tác giả Chung-Wei Tsai, Chuan-ho Tang và Wei-Hsien Wang đã xác

định các chất chuyên hóa nitrofuran trên LC/MS/MS với pha động kênh A làamoniacetat 20mM, kênh B là methanol có giới hạn định lượng 1 ug/kg với CC, =

0,19 — 0,43 ug/kg Khoảng tuyến tính từ 1 — 10 g/kg [16]

Tác giả Lech Rodziewicz (2008), xác định các chất chuyên hóa nitrofurantrong sữa bang LC/MS/MS với pha động kênh A là amoniacet at 0,5mM, kênh B làmethanol Phương pháp có hệ số biến thiên nhỏ hơn 9,3%, độ tái lập nội bộ nhỏ hơn

0,36 pg/kg, CC; từ 0,12 — 0,61 ug/kg [13].

Tóm lại: Các phương pháp (phương pháp sắc ký long với detector UV -VIS, phươngpháp hóa sinh Elisa , phương pháp s ắc ký lỏng với detector MS /MS) đều có điểmchung 1a thủy phân dé đưa các chất chuyển hóa nitrofuran liên kết trong các môthành dang tự do sau đó sử dung 2-nitrobenzaldehyde dé chuyên nitrofuran thànhcác dẫn xuất tương ứng Các dẫn xuất này sau đó được chiết lỏng lỏng hoặc chiếtpha ran và phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Phương pháp này có

ưu điểm là có độ nhạy rất tốt, thường từ 0,1 ug/kg có độ chọn lọc cao và có độchính xác đáp ứng để xác định nitrofuran trong thực phẩm Do đó trong nghiên cứu

đề tài chúng tôi thống nhất lựa chọn phương pháp LC-MS/MS với quá trình thủyphân bang axit clohydric và dẫn xuất với 2-nitrobenzaldehyde dé xác định các chất

chuyên hóa của nitrofuran.

10

CHƯƠNG 2: DOI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng, mục tiêu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các chất chuyền hóa của nitrofuran, bao gồm: AOZ,

AMOZ, SEM và AHD.

Vật liệu nghiên cứu là sản phẩm thực phẩm tươi sống bao gồm thịt và gan

của gia súc gia cầm

Mục tiêu chung của đề tài là nghiên cứu xây dựng phương pháp xác địnhđồng thời 4 chất chuyên hóa nhóm nitrofuran: AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong thựcphẩm tươi sống bang kỹ thuật sắc ký long khối phổ LC/MS/MS Các mục tiêu cụ

thể như sau:

- Xây dựng phương pháp xác định đồng thời 4 chất chuyền hóa của nitrofuran trong

thực pham tươi sống bằng LC-MS/MS

- Ung dụng phương pháp dé xác định các chất chuyên hóa của nitrofuran trong thực

phẩm tươi sống cụ thé trong thịt lợn, thịt bò, thịt gà, gan

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

2.1.2.1 Xây dựng phương pháp

s* Khảo sát phương pháp bao gồm:

> Điều kiện và thông số vận hành may LC/MS/MS,

> Điều kiện tách chiết lấy chất phân tích.

11

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp sắc ký long khối phố

2.2.1.1 Nguyên tắc chung về phương pháp sắc kí long HPLC

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất răn vàpha động là chất lỏng (sắc ký lỏng — rắn) Mẫu phân tích được chuyên lên cột táchdưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phan tích được phân bốliên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúcphân tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác củachúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độkhác nhau và tách ra khỏi nhau thành từng lớp của mỗi chất

2.2.1.2 Pha tinh trong HPLC [8]

Trong LC, pha tinh (stationary phase) chinh 1a chat nhồi cột làm nhiệm vutách hỗn hợp chat phân tích Đó là những chat ran, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ3-7um Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kếtthường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC) Khi dùng chất nhồi cột có cỡ hạt nhỏ hơn đường kính hạt 1,7 pm, chịuđược áp suất cao lên tới 700 atm làm tăng độ phân giải và giảm thời gian phân tích

đó là những ưu điểm của sắc ký lỏng UPLC (Ultra Performance Liquid

Loại thứ hai là các dung môi it phân cực như cychlorpentan, pentan,

n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CC, toluene Tuy nhiên

pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta

12

thường phối hợp 2 hay 3 dung môi dé có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến

cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phan pha động đôi khi diễn ra

theo thời gian, trường hợp này người ta gọi là chương trình rửa giải gradient.

2.2.1.4 Detector trong HPLC [5]

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp Đối

với các chất chuyên hóa nhóm nitrofuran có khối lượng phân tử thấp không có khả

năng hấp thụ tia UV , có thé tạo dẫn xuất với 2-nitrobenzaldehyde tạo sản phẩm có

khả năng hấp thụ tia UV và được xác định bằng detector HPLC-UV

Hiện nay, detector có thé cung cấp thông tin định tính, định lượng và cau trúccủa các chất phân tích là detector khối phô

2.2.1.5 Hệ thống detector khối phé (Mass Spectrometry)

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của

các hợp chất hóa học băng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng

và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích

của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành này được tách theo

tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thé cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân

tử của hợp chất

Bộ phân Bộ phận Bộ phận

Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ

Cấu tạo của một thiết bị khối phô bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị

phân tích khối và bộ phận phát hiện Trước hết, các mẫu được ion hóa trong nguồnion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối dé tách các ion theo tỉ số m/z Các tínhiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính đề xử lí và lưu trữ

Ưu điểm của phương pháp là:

Y Giúp phát hiện hầu hết các chất tan

13

Y Độ nhạy cao

Y Có thé giúp xác định được các chất tan ngay khi độ phân giải chưa tốt

* Hữu hiệu cho nghiên cứu các hợp chất

Cung cấp day đủ thông tin về cấu trúc và khối lượng

2.2.1.5.1 Bộ nguồn 1on (lon sources)

Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký ở dạng lỏng, khó khăn lớn nhất ở đây làphải chuyên chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi Theo kỹ thuật ion hoá củaLC/MS, năng lượng của máy trực tiếp tác động vào pha lỏng hoặc rắn dé tạo thànhion ở thé hơi Trong máy khối phổ, có rất nhiều cách dé ion hoá phân tử và nguyên

tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi Sau đây là một số kỹ thuật thường dùng:

a) lon hóa bằng dòng electron (Electron Ionization — El):

Trong phô EI-MS, dong electron có năng lượng cao được phát ra từ sợi day

catot vonfram hoặc reni được đốt nóng sinh ra dòng electron chuyên động vuônggóc với mẫu về phía anot xảy ra sự va chạm biến các mẫu thành các ion phân tử

hoặc ion mảnh Thông thường các hợp chất hữu cơ có thế ion hóa nằm trong khoảng

8 eV đến 15 eV nhưng dé đạt được hiệu quả cao thường áp dụng dòng 70 eV

ABC +e—> ABC ”®+2e_ (1) (ion phân tử)

ABC” — A!+ BC° (2) (ion mảnh, gốc tự do, mảnh trung hòa)

ABC” — A*+B+C°

Uu diém: áp dung cho phân tử nhỏ, cho cơ sở dir liệu phô Tuy nhiên, một sỐ

hợp chat dễ phân mảnh thì thời gian sống ngắn, nhiều mảnh nhỏ hay ít hoặc khôngthu được ion phân tử và đòi hỏi hợp chất phải dé bay hơi

b) Chế độ ion hóa phun điện tử (Electrospray lonizaton- ESI)

Nguyên tắc: biến đổi ion ở thé lỏng thành ion ở thé hơi, dung dịch mẫu được

dẫn vào điện trường mạnh và duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV Tại đây, dung dịch

mẫu bị chuyền thành các giọt nhỏ tích điện và được hút tĩnh điện tới lối vào của bộ

14

phân tích khối phổ Các giọt tích điện trước khi vào bộ phân tích khối phổ sẽ kếthợp với dòng khí khô dé làm bay hơi hết dung môi.

Ưu điểm của ESI là có hai chế độ bắn phá: bắn phá chế độ ion dương và ion

âm, ESI-MS thích hợp cho cả phân tử có phân tử khối nhỏ (khoảng 100-150 amu)cũng như phân tử khối lớn của các phân tử sinh học, các hợp chất khó bay hơi,không bền nhiệt, phân cực và không phân cực

c) Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí quyển (Atmospheric Presure Chemical

Tonization-APCI)

Su ion hóa trong APCI phụ thuộc vào sự va cham của dong ion dương hay

âm với phân tử, mẫu bi ion hóa bởi phan ứng với các ion được tạo ra từ các chất khí

như methan (ở dạng CH:”), amoniac (ở dạng NH,’)

Khi sử dụng khí methan làm chất khí phản ứng ta có các quá trình ion hóa

Quá trình 2: ion mảnh va chạm trực tiếp với phân tử mau

CH;* +M — CH, + (MH)” (chuyền proton thành dương m/z = M+1)CạH¿* + M > (MH)* + C,H, (chuyên proton thành dương m/z = M+1)

C.H;* + M — (MC;H;)” (thêm ái lực điện tử thành dang m/z = M+29)

CạH¿* + M > (M-H)” (hydrua chuyên thành dang m/z = M-1)

Sự thay đổi chất khí trong phan ứng APCI-MS cho phép thay đổi tính chọn

lọc của sự lon hóa và mức độ phân mảnh Đây là phương pháp có độ nhạy cao cho

15

phép phân tích định lượng ở mức picomol tới femtomol, thích hợp cho những chat

có phân tử khối 1000 đơn vị nhưng đòi hỏi chất phân tích phải dé dang bay hơi

2.2.1.5.2 Bộ phận phân giải khối

Sau khi được ion hóa, chất phân tích được đưa vào bộ phan phân giải khối

Tai đây, các ion được tách ra khỏi nhau theo tỉ số m/z Bộ phận phân tích khối được

chia thành 4 loại: bộ phân tích từ, bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích bẫy ion tứ cực

và bộ phân tích thời gian bay Trong đó bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)

và bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole lon-Trap Mass Analyser) được sử dụng

phô biến

a) Bộ phân giải tứ cực (Quadrupole Analyser)

Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảngtrống dé các ion bay qua Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòngmột chiều (DC) và điện thé tần số radio (RF) Các tứ cực được đóng vai trò như một

bộ lọc khối Khi một trường điện từ được áp vao, các ion chuyền động trong nó sẽ

dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trường RF Chỉ những ion có tỉ số m/z

phù hợp mới có thé có thé đi qua được bộ lọc này

Bộ phân giải tứ cực được phát triển và cho ra đời bộ phận phân giải khối phố

ba tứ cực (Triple Quadrupole).

Quad Mass Filter (Q1) Quad Mass Filter (03)

Rough -_~ĂẮ m— — fe

Pump | Single 3-stage turbopump |

Hình 2.2: Sơ đồ bộ phân giải khối pho ba tik cực

16

Bộ phân tích khối phé ba tứ cực gồm một buồng va chạm (collision cell,

được xem là tứ cực thứ hai Q2) đặt ở giữa 2 tt cực (Q1 và Q3).

e© Ở buồng Q1: Các ion được tách

s O buồng Q2: Với áp suất cao, các ion bị phân ly do va chạm với khí trơ

có mặt như nitơ, argon, heli nên chúng bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion

nhỏ hon (ion con).

° O buồng Q3: Làm nhiệm vụ tách các ion con

b) Bộ phân giải bay ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)

Loai thiét bi nay bao gom một điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện

cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dưới Trái vớilại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy 1on theo một đường cong éndinh duoc bay lại cho đến khi một điện áp RF được đặt trên điện cực vòng Các ionkhác nhau m/z sau đó trở nên không ôn định và sẽ có hướng đi về phía detector Do

điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu được một phô khối lượng đầy đủ

Các ion tổn tại trong bay có thé được chọn riêng và phân tích theo sự khác

nhau về m/z, đồng thời có thé chọn riêng và thực hiện quá trình bắn phá dé thu được

các mảnh ion con từ đó thực hiện phân tích theo m/z của ion con (khối phô 2 lần).

Về nguyên tắc các ion con có thé tồn tại trong bay thời gian đủ lâu dé có thể thựchiện đến MS n lần, tuy nhiên trong thực tế thường chỉ có khả năng thực hiện đếnkhối phô 3 lần

2.2.1.5.3 Bộ phận phát hiện

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân giải khối lượng, các ion được đưa tới phần

cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận phát hiện cho phép khốiphố tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được

khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyền Có hai loại bộ phận phát

hiện phô biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang

Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phố biến nhất,

có độ nhạy cao Các ion đập vào bê mặt dinot làm bật ra các electron Các electron

17

thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều

hơn nữa, tạo thành dòng electron.

Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ionban đầu đập vào một dinot tao ra dong electron Khác với detector nhân electron,các electron sau đó sẽ đập vào một màn chắn photpho và giải phóng ra các photon.Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân

electron Ưu điểm của phương pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân

không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm ban

2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu

2.2.2.1 Xử lý mẫu bằng chiết lỏng lỏng [8]

Chiết lỏng — lỏng là kỹ thuật dựa trên sự phân bố khác nhau của chất tan vào

2 pha không trộn lẫn, từ đó tách chiết chất phân tích ra khỏi nền hoặc tách các tạpchất ra khỏi chất phân tích Cho nên, nguyên tắc của kỹ thuật chiết này là cho chấttan (chất phân tích) ưu tiên tan vào một trong hai pha lỏng không trộn lẫn, còn tạpchất hay các chất khác ở lại trong pha kia

Dé có được kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đảmbảo được các yêu cầu nhất định sau đây:

- Dung môi chiết và dịch chất mẫu cần chiết gọi tắt là hai pha không đượctrộn lẫn vào nhau, trong đó dung môi chiết phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo

không làm nhiễm ban chat phân tích.

Koa Kp,

- Hé sô tach a= #1 và hiên nhiên là a càng khác 1 càng tot Điêu

kiện tối ưu là Kpa Kpg = I

- _ Cân bằng chiết đạt được nhanh và thuận nghịch, sự phân lớp phải rõ ràng

dé tách hai pha được tốt

- Phải chọn được điều kiện chiết tối ưu bao gồm: pH của dung dịch mau,

nông độ tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia

2.2.2.2 Xử lý mẫu bằng chiết pha rắn [8]

18

Chiết pha ran là một phương pháp chuẩn bị mẫu dé tách làm giàu và làm

sạch mẫu phân tích từ dung dịch mẫu bằng cách hấp phụ lên cột chiết pha rắn Sau

đó chất phân tích được rửa giải bằng một lượng nhỏ dung môi thích hợp Các chất

ảnh hưởng được loại bỏ.

Cột SPE được nhồi chặt bang những vat liệu xốp, hạt nhỏ có các nhóm chức

khác nhau Chất lỏng qua cột đưới tác dụng của áp suất hoặc chân không

Các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn:

Hình 2.3: Các bước của quá trình chiết pha ran

1 Hoạt hóa chất hấp phụ pha rắn

> Làm ướt vật liệu nhi, solvat hóa các nhóm chức của chat hấp phụ

> Loại không khí trong các khoảng trống trong lớp chất hấp phụ,

> Không được dé chất hấp phụ bị khô

1 Mẫu và chất phân tích được chảy qua cột

> Chất phân tích được làm giàu trên chất hap phụ,

> Một vài thành phần ảnh hưởng khác cũng có thé bị giữ lại,

19

> Các thành phần không bị hấp phụ bị loại ra làm sạch chất phân tích.

2 Loại bỏ các chất gây anh hưởng ra khỏi cột

> Giữ lại chất phân tích,

> Nếu mẫu là dung dịch nước, sử dụng dung dịch đệm hoặc hỗn hợp

nước-dung môi hữu cơ,

> Nếu mẫu bị hòa tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa cột có thể sử dụng

chính dung môi hữu cơ.

3 Giải hấp chất phân tích bằng dung môi thích hợp

> Dung môi được chọn đặc trưng đê phá vỡ tương tác giữa chất phân tích

và chất hấp phụ với mục đích rửa giải được chất phân tích với hiệu quả

cao,

> Dung môi sử dung rửa giải đồng thời càng ít chat gây ảnh hưởng tới phép

phân tích càng tốt

Chất hấp phụ chiết pha rắn thường được sử dụng gồm các loại:

- Chat hấp thụ pha thường: Các silica trung tính, oxit nhôm,

- Chat hấp phụ pha ngược: Các silica đã được ankyl hóa nhóm OH,

- Chat có khả năng trao đổi ion,

- Chat ray hay sang loc phân tử theo độ lớn, kích thước,

- Chat hấp phụ pha khi-ran,

Hiện nay, phương pháp chiết pha rắn ngày càng được sử dụng rộng rãi và phố

biến do những ưu điểm vượt trội sau:

- _ Hiệu suất thu hồi cao,

- Khả năng làm giàu, làm sạch các chất phân tích lớn,

- _ Giảm lượng dung môi sử dung,

- _ Có khả năng kết hợp các phương pháp phân tích,

- An toàn, đơn giản, dé sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt,

Oasis HLB (hydrophilic-lipophilic balance) là một chất hấp phụ kết hợp cơchế tương tác pha đảo và tương tác ưa nước Pha tĩnh này được trùng hợp từ haimonomer có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidone có tính ưa nước và divinylbenzen

20

có tính ky nước Chất hap phụ Oasis có cấu trúc không gian lớn (thé tích lỗ rỗng là

1.3 cm’/g), có diện tích bề mặt trên một đơn vị khối lượng pha tĩnh cao (810 m’/g).

Các nhóm chức phân cực của monomer N-vinylpyrolidone đã tạo ra các hốc phân

cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lưu giữ tốt đối với các chất phân tích phân cực đồng

thời có khả năng làm việc trong khoảng pH rộng.

2.2.3 Thắm định phương pháp

2.2.3.1 Tính đặc hiệu

Sử dụng các p hương pháp xác nhận (confirmation method) là một cách rất

tốt dé đảm bảo tính đặc hiệu của phương pháp _ Hội đồng châu Âu quy định cáchtính điểm IP (điểm nhận dạng — identification point) đối với các phương pháp khácnhau dé khang định chắc chắn sự có mặt của các chat Cách tính điểm IP được chi

ra ở phụ lục 3.

2.2.3.2 Khoảng tuyến tính

Tiến hành thực nghiệm: Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn của chất phân tích Xác

định các giá trị đo được y theo nồng độ x Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có

khoảng khảo sát đường biểu diễn là một phương trình:

y=ax+b

và hệ sô tương quan:

pe —X)Cy, —Y)

IS Oe, — XP SIO, — YD

Nếu 0,995 <r’ <1 : Có tương quan tuyến tính

Khi đã xác định được khoảng tuyến tính, có thể xây dựng phương trình hồi quy của

khoảng này, tức là xác định hệ số a và b Trên đường hồi quy, lấy đoạn tuyến tínhlàm khoảng xác định (kế cả hai điểm đầu và cuối)

2.2.3.3 LOD, LOQ

Tính LOD và LOQ theo biéu thức:

21

Tính giá trị trung bình x , và độ lệch chuẩn SD

LOD =3 x SD LOQ = 10 x SD

Đánh gia LOD đã tính được: tính R = x /LOD là hệ số đánh giá LOD

e Nếu 4<R<10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD

tính được là đáng tin cậy.

se Nếu R<4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm

một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và

tính lại R.

e Nếu R> 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng

dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R.

2.2.3.4 Độ lặp lại, độ thu hồi

Độ thu hồi và độ lặp lại được xác định theo các đại lượng SD và RSD như

công thức dưới đây:

RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (%)

Độ thu hồi của phương pháp theo công thức sau :

22

(Cine Cn) 5-499

C H% =

Trong đó: Cie: nồng độ nitrofuran xác định được trong mẫu có thêm chuẩn (ng/g).C„: nồng độ nitrofuran có trong mau (ng/g)

C: nồng độ chuan nitrofuran được thêm vào (ng/g)

H: độ thu hồi (%)

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả phân tích trên LC-MS/MS được tính toán và xử lý bằng phần mềm

Analyst, Excel, origin 6.0.

Các công thức thống kê tính độ lặp lại, độ thu hồi, tính LOD, LOQ

2.3 Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

2.3.1 Dụng cụ và thiết bị

2.3.1.1 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phố LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL củaShimadzu và khối phố ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem: bộ phận bơm dungmôi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt

- Cột sắc ky Agilent C¡; (150mm x 2,1mm x 3,5um)

- Cột chiết pha rắn SPE (Oasis HLB)

- Máy lắc vortex VELP

- Ong đong dung tích 10, 100, 200 ml

- Pipetman, pipet nhựa, pipet pasteur 200 ul; 1000 pl; 5 mI đầu côn

23

- AOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- AMOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiét 99%

- AHD.HCI (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- SEM.HCI (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99,5%

- dy-AOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- ds-AMOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- d-AHD.HCI 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 99%

- 8C!N,-SEM.HCI 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 98%

2.3.2.2 Hóa chat

- Methanol (Merck hoặc tương đương, độ tỉnh khiết 99,9%)

- Amoni acetate (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 98%)

- 2-NBA (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99%)

- K;ẴHPO¿.3H;O (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99%)

- NaOH (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99,9%)

- HCI 37% (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99,9%)

- HCl 0,2M: Hút 17 ml HCl 37% vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạchbằng nước cat

- 2-NBA 1000 mg/l: cân 100 mg 2-NBA hòa tan và định mức vào bình 10 ml bằngmethanol Dung dịch chuẩn bị hằng ngày

- K,HPO, 0,2 M: cân 45,7 mg K;HPO/.3H;O hòa tan và định mức vào bình 1000

ml bằng nước cất 2 lần.

24

- NaOH 2 M: cân 8 g NaOH hòa tan và định mức vào bình định mức 1000 ml bằng

- Chuan AHD 10 mg/l: hút 100 wl chuẩn AHD 1000 mg/1 định mức bang methanol

vào bình định mức 10 ml Bảo quan ở - 20°C sử dụng được trong 6 thang

- Chuan SEM 1000 mg/l: cân 14,9 mg + 0,1 mg chuân SEM.HCI hòa tan và địnhmức bang methanol vào bình định mức 10 ml

- Chuan SEM 10 mg/l: hút 100 pl chuẩn SEM 1000 mg/1 định mức bang methanol

vào bình định mức 10 ml Bảo quan ở - 20°C sử dụng được trong 6 thang

- Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 1 mg/I: hút lần lượt 1 ml chuẩnAOZ 10 mg/l, AMOZ 10 mg/l, AHD 10 mg/l, SEM 10 mg/l định mức bang

methanol vào bình định mức 10 ml Bao quan ở - 20°C su dụng được trong 3 tháng

- Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 20 ng/1: hút 200 pl hỗn hopchuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) định mức bang methanol vào bình định

mức 10 ml Bảo quản ở - 20°C sử dụng được trong | tháng

- dy-AOZ 1000 mg/l: Cân 10 mg + 0,1 mg d¿-AOZ định mức bang methanol vào

bình định mức 10 ml Bảo quản ở - 20°C sử dụng được trong 6 tháng

- dy-AOZ 10 mg/l: hút 100 pl dy-AOZ 1000 mg/1 định mức bang methanol vào bình

định mức 10 ml Bao quản ở - 20°C sử dụng được trong 6 tháng

- ds-AMOZ 1000 mg/l : Cân 10 mg + 0,1 mg ds-AMOZ định mức bằng methanol

vào bình định mức 10 ml Bao quản ở - 20°C sử dụng được trong 6 tháng

- ds-AMOZ 10 mg/l: Hút 100 pl ds-AMOZ 1000 mg/l định mức bang methanol vào

bình định mức 10 ml Bao quan ở - 20°C sử dụng được trong 6 tháng

25

- Hỗn hợp nội chuẩn (dy-AOZ, ds-AMOZ, d;-AHD.HCI, '?C'N;-SEM.HC)) 1 mg/l:hút lần lượt 1 ml chuẩn dy-AOZ 10 mg/l, ds-AMOZ 10 mg/l, d;-AHD.HCI 10 mg/l

và ''CÌN;-SEM.HCI 10 mg/l định mức bang methanol vào bình định mức 10 ml.Bảo quản ở - 20°C sử dụng được trong 3 tháng

- Hỗn hợp nội chuẩn (dy-AOZ, d;-AMOZ, d;-AHD.HCI, °C'N;-SEM.HC]) 20 ug/l:hút lần lượt 200 pl hỗn hợp nội chuẩn (dy-AOZ, ds-AMOZ, d;-AHD.HCI, '°C'°N>-

SEM.HC!) 1 mg/l vào bình định mức 10 ml Bảo quản ở - 20°C sử dụng được trong

1 thang.

26

CHƯƠNG 3: KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS

Phân tích dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran dựa trên việc phân tích các

chất chuyển hóa của nhóm nitrofuran Các chất chuyền hóa của nitrofuran có khốilượng phân tử thấp gây nhiễu phổ nền cao, hiệu quả ion hóa thấp và không đặc hiệucho sự phân mảnh (chủ yêu là mất nước, NHạ, CO;), độ nhạy phát hiện bằng MS

tương đối thấp Vì vậy sử dụng 2-nitrobezaldehyte để dẫn xuất các chất chuyên hóa

nhóm nitrofuran dé có được các hợp chất dẫn xuất (NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD,NPSEM) với nhiều đặc tính thuận lợi

3.1.1 Khảo sát các điều kiện đo phố khối

3.1.1.1 Khảo sát ion mẹ

Các chất NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM có khối lượng phân tử nhỏ

và phân cực Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23,

26], chúng tôi tiến hành khảo sát xác định NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEMbang kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chệ độ bắn phá ion dương Dé tối ưuhóa điều kiện khối phổ, dùng xylanh 500 pl bơm từng chuẩn AOZ, AMOZ, AHD,SEM 500 ng/ml đã được dẫn xuất băng 2-nitrobenzaldehyte , sau đó đưa vào

detector để khảo sát Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất, tối ưu hóa

từng ion me, thu được điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Diéu kiện chạy nguồn ion hóa ESI

Khí màn (CUR) 20 psi Khi va cham (CAD) 8 psi

Thé ion hóa (IS) 5000 V

Nhiệt độ mao quản (TEM) 400°C

Ap suat khi 2 bén dau phun (GS1) 50 psi

Ap suất của luồng khí nóng (GS2) 40 psi

27

Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dương, các ion

mẹ có dạng (MH)* với số khối m = (M+1) theo phan ứng:

8C."N, SEM.HCI 211 212

D;-AHD.HCI 250 251

3.1.1.2 Khảo sát điều kiện bắn phá ion mẹ để thu được ion con

Detector sử dụng trong nghiên cứu nay là hệ khối phổ 2 lần, do đó để phát

hiện đúng chất phân tích thì việc lựa chọn được 1on con là rất quan trọng lon con

phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion me Dé thu được mảnh ion con có tinhiệu cao cần phải chọn được mức năng lượng ban phá thích hợp Dùng xylanh 500

ul bơm từng chuẩn đã được dẫn xuất vào detector khối phô và lựa chọn 2 ion con

đặc trưng có cường độ tín hiệu cao nhất dé định tính và định lượng Manh ion con

m/z có cường độ lớn nhất dùng dé định lượng, mảnh ion con thứ 2 có cường độ thấphơn dùng dé xác nhận chất phân tích Đối với các chất nội chuẩn, lựa chọn 1 ioncon đặc trưng có cường độ cao nhất Kết quả thu được ở bảng 3.3

28

Bang 3.3: Năng lượng bắn phá và các ion con của các chất chuyển hóa nitrofuranChuyến hóa

lon mẹ nhóm + lon con DP (V) CE (eV) CXP (V)

(M+H) nitrofuran

134 80 15 10

NPAOZ 236

104 80 27 14

291 80 15 16 NPAMOZ 335

262 80 21 16

192 80 11 18 NPSEM 209

Theo qui định của Châu Âu 2002/657/EC, số điểm nhận dang (IP) được tính đối với

kỹ thuật LC/MS/M, tương ứng với 1 ion mẹ và 2 ion con, số điểm nhận dạng (IP) là

4 Như vậy phương pháp đã đáp ứng được yêu cầu của Châu Âu [phụ lục 4] Phù

hợp với các nghiên cứu khác của một số tac giả như tác gia Leitner , tác giả D.Tyler

của phòng thí nghiệm của Anh

3.1.2 Lựa chọn cột tách

Các chất nhóm nitrofuran là các chất phân cực, đồng thời theo khuyến cáocủa nhà sản xuất thiết bị khối phô thì hệ pha động sử dụng an toàn với thiết bị là các

dung môi phân cực va phân cực trung bình như methanol, acetonitrile, nước, acid

formic (0 đến 1%, amoni acetate (0 tới 1%) cột tách nên sử dụng là cột tách pha

dao Do đó chúng tôi lựa chọn cột tách pha đảo C18 với các thông số dưới đây chocác nghiên cứu tiếp theo:

- _ Cột C18 cua Agilent có:

29