Luận văn thạc sĩ khoa học: Nghiên cứu phân tích một số hợp chất hữu cơ vòng bé bằng phương pháp HPLC-MS và NMR

Vì vậy trong luận văn này, chúng tôi tập trung vào việc phân tích cấu trúc và xác định độ chọn lọc lập thể của các hợp chất Ø-lactams, thu được từ phản ứng tông hợp theo phương pháp Stau

ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NỘI VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VIEN HOA HỌC

ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NỘI VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VIỆN HOÁ HỌC

LUAN VAN THAC Si KHOA HOC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS NGUYEN VAN TUYỂN

Hà Nội - năm 2012

MỤC LỤC

DANH MỤC CAC CÁC HÌNH -22222+c21221111 E111 re i

DANH MỤC CAC SO ĐÔ - 2-52 St 1 1111111111111 1111111111 1101111211211211111211 2111k ñ

MO DAU 0 1

0›I019)I€88019).619)0 2

1.1 BETA LACTAM 0 2

1.2 TONG HOP BETA LACTAM.W cccscsssesssssssessssesssesssesssessscasscssscssesssesssecssecsueessecssessseeseeess 3

1.2.1 Phan ứng Staudinger ec eecceesesscesceecneeseeseeessesseeeceesseesessseecsessesaseesessesseeeeate 3

1.2.2 Cơ chế phan ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thê -2- 22 5¿+sz+zx+>s2 4 1.3 PHAN TÍCH CÁC DONG PHAN DOI QUANG - 5c kề E2 EE2E2Ex2EEesxe2 7

1.3.1 Phương pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym - 2-2 25+: 7 1.3 2 Tach các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ - -: 8

1.3.3 Tach đồng phân đối quang bằng các phương pháp hóa lý hiện đại - 8

1.3.4 Phân tích các đối quang nhờ phương pháp NMR sccsscesssesssesssesssecsteeseesseesseeeseeess 9 1.4 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NANG CAO (HPLC) ssssscssssssussssssssssecssecssecssecssecssecasecsseesees 17

In 9.0 17 1.4.2 Pharr loai 8 Ra 17

1.4.3 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo :- 5: 2 Ss2x2EEEEE2EEE21231221271211221 2122 tre 17 1.4.4 Pha động trong sắc ký pha đảO -¿-2¿- 2 t2 2EE9EE2E12E121121111211211 1121 xe 18

I "P200 29/9).09 000C 19

IE 950 7019).0 510107 20

CHƯƠNG 2 THUC NGHIỆM 52222222 21221212212212112121111211212112112111121.11 1.1 22

2.1 Phương pháp nghiên cứu và trang thiết bị ¿- 2: +¿22++22+t2EEtEEEtEEEtrxrrrreerreee 22

2.1.1 Các phương pháp tổng hợp hữu cơ -¿-2¿ 52 22E22EE£EE2E2EEEEEEEerkrrkrrrrrrei 22 2.1.2 Dụng cụ và hóa a 5 - s11 12112112112112112112112111111.11 11111111 1e ye 22 2.1.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc kí lớp mỏng.23 2.1.4 Các phương pháp phân tích cấu trúc -¿- 2 +¿+2+2++2E+2E++Extzkzzrxerxrrrrred 23

2.2 Tổng hợp các hợp chất /-lactam - +: + + s+SE£SE£EEEEEEEEEEEEEEEE122121121121121121 21.21 xe 25

2.2.1 Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic - 2 + s22E+£xt£EzEerxerrsered 25 2.2.2 Tổng hợp dẫn xuất imine 2-2-2 st+S+EE9EE2E1EEE231221711211271711221 21.2 re 26 2.2.3 Tổng hop các dẫn xuất /- lactam -¿- 2: +¿22+2E+t2EE2EEt2EE2EE2EEEEEerrrerkree 27

2.3 Phd cộng hưởng từ hạt nhân !H va °C của các hợp chất 9a, 9b, 9c, 9d, 9e, 9f 28

CHƯƠNG 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2- 55s E‡EE‡EE2EE2E12E121121121121121121 11 xe 31

3.1 TONG HỢP CÁC HỢP CHAT /-LACTAM 2-52-5522 EESEE2EEEEEE2E2EEEEErrrree 31 3.2 PHAN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHÁTc¡s-Ø-LACTAM 22-52 55c25222<c2tzzscred 32

3.2.1 Phân tích phổ 'H-NMR của hợp chất 9a - 2-52 St SeEE2E2EEEE2ExEEErkrrei 32 3.2.2 Phân tích phô 'H -NMR của hợp chất 9b 2:©2+¿+2+++22+2tEEEe2rxersrxerrr 33 3.2.3 Phân tích phố 'H-NMR của hợp chất 9e 2: 5c s+SxeEE2E2EEEE2EEEEkrrrrred 33 3.2.4 Phân tích phô 'H-NMR của hợp chat 9d 2 5¿+2E+2+2EEt2EEt2EEtzrxrrrrrrred 34

3.2.5 Phân tích phô 'H-NMR của hợp chất 9e ¿- 2¿©2+¿22+2EEt22xt2zxrzrxrzrrrrred 35

3.2.6 Phân tích phố 'H-NMR của hợp chất 9e 2-52 s+SkeEE2E2EEEE2EEEEErrrrred 35

3.3 XÁC ĐỊNH Ti LỆ CAC DONG PHAN LAP THE BẰNG HPLC-MS 37

3.3.1 Khảo sát bước sóng hap thụ đối với các chất nghiên cứu . . -s- 37 3.3.2 Khảo sát phổ MS -¿- 22-222 212 2212221127112712271127112112112112211211 211 1 re 40 3.3.3 Khảo sát chương trình dung môi cho quá trình sắc ký -. -2:©5¿55z 5+2 41 3.4.4 Kết quả và thảo luận quá trình phân tích sắc ký -2- 2 s¿z+cs+zxz+zz+zx2 43

TÀI LIEU THAM KHẢO c5 S ESEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE10111111211211211211111 1111 11x11 re 49

PHU LUC 925 51

DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Câu trúc cơ sở B-lactam c.ccsscsssessessesssessessessssssessessesssesseesessesssessessessessseeses 3 Hình 1.2 Phô 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và

(R)-1-J001919410117-110 EU Cai 10

Hình 1.3 Phô 'H-NMR của este Mosher (R)-I-phenylbutan-1-ol và (S)-1-19041)07106090002720202757 10

Hình 1.4 Phô 'H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA 12

Hình 1.5 Tín hiệu 'H-NMR của CH; trong một số trường hợp - 13

Hình 1.6 Cặp tín hiệu Fiedel s¿- 5c 5+2 eExcSEE2312211271211 211011 1121 crree 14 Hình 1.7 Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích cau trúc bằng phương pháp X-Ray 14

Hình 1.8 PhO CD của hợp chất A và B -¿- 55c 2cc22t2Ex 222 EEEerkrrrrrrrree l6 Hình 1.9 Câu trúc của cột ODS 2 2222 E2 E2E12211271211711 211.11 eree 18 Hình 1.10 Sơ đồ nguyên lý hệ diot quang . 2-©2¿55c2cx2zerxeerxrsrxerrre 19 Hình 1.11 Các biện pháp cải tiễn tăng độ nhạy của detector (cải tiễn flowcell) 20

Hình 3.1 Phô `H của hợp chất 9a - 5-5 s2 12 1221121121111 111211211 cre 32 Hình 3.2 Phô 'H của hợp chất 9b 5: 222S22x2212211271221211221 22121 re 33 Hình 3.3 Phô `H của hợp chất 9c 5c 22 2x 22x2212211271221 211221122121 re 33 Hình 3.4 Phô `H của hợp chất 9d - ¿5s tt E2 2 1271121121111 111211 211 cre 34 Hình 3.5 Phô `H của hợp chất 9e ¿5s St E2E12E12712211211211211 111211211 Excre 35 Hình 3.6 Phé 'H của hợp chất 9f ¿5s St ctEE2127121121211211 2111121 xetxee 35 Hình 3.7 Pho hap thụ electron của hợp chất 9a -2¿©2s2c++cx++zxsrxerseees 37 Hình 3.8 Pho hap thụ electron của hợp chất 9b -¿ 5¿©c++csz2cxzzxccseees 38 Hình 3.9 Phô hap thụ electron của hợp chất Ø€ -¿- s+5z+xckerkerkerkerssrerree 38 Hình 3.10 Pho hap thụ electron của hợp chất 9d - 2s secx+zzzzrszcee 38 Hình 3.11 Phé MS của hợp chat 9e khi dé chế độ Positive - -: - 40

Hình 3.12 Phé MS của hợp chất 9e khi dé chế độ Negative -. - 40

Hình 3.13 Sắc ký đồ của hợp chất 9e khi chạy với pha động Gradient 1 42

Hình 3.14 Sắc ky đồ của hợp chất 9e khi chạy với pha động Gradient 2 42

Hình 3.15 Sắc ky đồ của hợp chất 9e khi chạy với pha động Gradient 3 42 Hình 3.16 Sắc ký đồ của hợp chất 9a 5¿-5cc 2c 2x22 2E 2E crkrrrrree 43

Hình 3.17 Phé MS của pic 1 (hợp chất 9a) -2-©522czcc2ccrxerxerxerea 44

Hình 3.18 Phé MS của pic 2 (hợp chất 9a) 2-©5225ccc2zcrxerxerkeree 44

Hình 3.19 Sắc ký đồ của hợp chất 9b ¿52 s22 2 E221 erree 45 Hình 3.20 Sắc ky đồ của hợp chất 9e ¿5c c2 2221212112111 cre 46

Hình 3.21 Sắc ký đồ của hợp chất 9d -¿©56c 2c 2k 2222222 EEErrrrrerree 41

Phản ứng Staudinger 5 G13 E199 ng ng ướt 3

Cơ chế phan ứng Staudinger 2-5 5sS2+E£2E2EeEEeEEEEEeEkeExrrerkrred 4

Con đường hình thành —lactam - - 5c 3221323 +EEseresrrsrresxes 5

Sử dụng muối (12) tổng hợp ƒ-lactam -2¿-++©++cx++zxsrxrrseee 6 Sorbyl clorua (16) tổng hợp P-lactam - : -:©2©5¿22x+2z++2s+scszze 6 Tổng hợp j-lactam từ imine và vinylketene - s- 2c s+ce+se¿ 7 Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua aXetiC -s-©5¿5s2cs+cx+c+s 26 Tổng hợp dẫn xuất imin - 2 2© S+SE£EE+EE£EE2EE2EEEEeEEEEEeEkrrkrrree 26 Tổng hợp dẫn xuất cis lactam . -2- 2 2 2+Eczxe£xeEeEzrszreee 27 Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua aXetiC -. ¿5c scs+cs+sz+: 31

Cơ chế hình thành chất 5a,b 2: s s+SE+EE2E2E£EEEEEEEEEkerxerkrkee 32

li

BANG KÝ HIỆU CÁC CHU VIET TAT

MỞ ĐẦU

Với sự biến đổi không ngừng của vi khuẩn, hàng loạt thuốc kháng sinhkhông còn sử dụng được hoặc phé tác dụng hẹp lại do kha năng kháng thuốc của

vi khuẩn Làm giảm hiệu quả điều trị bệnh và gây ra những biến chứng không

mong muôn cho người bệnh.

Azetidin-2-ones (f-lactams) đại diện cho nhóm thuốc kháng sinh quan trọng [9] va ứng dụng làm các synthon trong tổng hợp hữu co [13] Để tạo ra những loại thuốc mới, có hiệu lực điều trị cao và chưa bị vi khuẩn kháng lai, thì việc tong hợp và bán tổng hợp Ø-lactam mới là một việc làm rat quan trọng.

Mặt khác, như ta đã biết hoạt tính sinh học của các đồng phân quang học

(đồng phân đối quang hoặc đồng phân lập thé không đối quang) là rất khác nhau

và việc tách các đồng phân đó thì rất tốn kém, tốn rất nhiều thời gian Vì vậy việc tong hợp chọn lọc lập thé các đồng phân quang học là rất quang trọng, làm giảm chi phí cho thực hiện quá trình tach, tăng hiệu quả điều trị.

Vì vậy trong luận văn này, chúng tôi tập trung vào việc phân tích cấu trúc

và xác định độ chọn lọc lập thể của các hợp chất Ø-lactams, thu được từ phản

ứng tông hợp theo phương pháp Staudinger, bang các phương pháp hiện đại như

HPLC-MS và NMR.

CHƯƠNG 1 TONG QUAN

1.1 BETA LACTAM

Ø-lactam được phan loại dựa theo cau trúc vòng cơ sở và được chia thành

4 nhóm:

« _ Ø-lactam kết hop với vòng 5 cạnh bão hòa

o Ø-lactam có chứa vòng thiazolidine được gọi tên là penams (A)

o Ø-lactam có chứa vòng pyrrolidine được gọi tên là carbapenams (B)

o Ø-lactam hợp nhất dé oxazolidine vòng được gọi tên là oxapenams

hoặc clavams (C)

‹ _ Ø-lactam kết hợp với vòng năm cạnh không bão hòa:

o Ø-lactam có chứa vòng thiazol 2,3-dihydro được gọi tên là penems

(D)

o -lactam có chứa vòng 2,3-dihydro-IH-pyrrole được gọi tên là

carbapenems (EF)

+ _ Ø-lactam kết hợp với vòng 6 cạnh chưa bão hòa:

o Ø-lactam có chứa vòng 3,6-dihydro-2H-1,3-thiazine được gọi tên là

1% J} HệCOOH COOH COOH

rR#.0O rat © a ©

nO FO J

le \ loi \ leCOOH COOH

73.9 : ;

HO FO XOCOOH COOH COOH

Hình 1.1 Cau trúc cơ sở B-lactam

Hop chất chứa vòng Ø-lactam được ứng dụng chủ yếu trong thực tế là làm thuốc kháng sinh.

1.2 TONG HỢP BETA LACTAM

A7Zetidin-2-ones(Ø-lactams) đại diện cho một nhóm các hợp chất rất quantrọng do hoạt tính sinh học nổi tiếng của chúng [9] và là hợp chất trung giantrong tong hợp hữu cơ [13] Nhiều phương pháp tổng hợp f-lactam đã được pháttriển như: phản ứng cộng vòng [2+2], phản ứng tạo vòng, phản ứng gắn thêm

carbene, và phản ứng sắp xếp lại các hợp chất dị vòng [14],[9].

1.2.1 Phản ứng Staudinger

Phản ứng Staudinger, phan ứng của ketene với các hợp chất chứa chức

imine, là phương pháp tổng hợp quan trọng nhất điều chế /-lactam Ké từ khi

được phát hiện ra bởi Staudinger [15], phản ứng này từ lâu đã được nghiên cứu

thực nghiệm và lý thuyết dé hiểu cơ chế của nó và là cơ sở cho việc chọn lọc lập

thé Nó được áp dụng dé tổng hợp một loạt các cấu trúc f-lactam (Sơ đồ 1.1).

Hiện nay phản ứng này vẫn là một trong những phương pháp tốt nhất cho quátrình tổng hợp / -lactam [14]

Sơ đồ 1.1 Phản ứng Staudinger

3

1.2.2 Cơ chế phản ứng và điều khiến độ chọn lọc lập thể

Cơ chế của phản ứng Staudinger được đưa ra bởi Hegedus là cơ chế mô tảtốt nhất [15] Imine, tác nhân nucleophile tấn công orbital nguyên tử trống(LUMO) của nhóm đồng phăng carbonyl ketene tạo ketene thế Quá trình tấncông xảy ra ở bên phía ít cản trở (cách tiếp cận exo), với mặt phăng của iminevuông góc với ketene, tạo ra các trung gian zwitterion (5) (sơ đồ 1.2)

Sơ đồ 1.2 Cơ ché phan ứng Staudinger

Hợp chất trung gian này đã được phát hiện và đặc trưng bởi quang phô IR

[22] Chuyển động quay của các imine đi vào mặt phang của ketene xảy ra đồngthời với việc đóng vòng conrotatory tạo ra sản phẩm / —lactam (6) trong đónhóm imine R` và nhóm L của ketene là cis Khi nhóm thế trên carbon sp“ củaimine (R' trong sơ đồ) ổn định điện tích đương, hợp chất trung gian zwitterioncóthé bị đồng phân hóa tạo thành dang cis của liên kết iminium vatao ra sản phẩmtrans lactam (9) Tỷ lệ tương đối của các quá trình sẽ xác định sản phẩm hóahọc lập thê của phản ứng ketene/imine

Tính toán ab initio xác định sự có mặt của hợp chất trung gian zwitterion

và đóng vòng conrotatory [25] Nghiên cứu tiếp theo [9] khang định bản chat hai bước của quá trình và chứng minh một số điểm tương đồng với mô hình đề

xuất bởi Houk cho phan ứng conrotatory của cyclobutenes [18]

Gần đây, nghiên cứu mới của nhóm Xu [9] dé xuất một cơ sởđể giải thích

kết quả lập thé của phản ứng, xem xét lại mô hình được mô tả bởi Hegedus và

chỉ ra nguôn gôc động hoc của tỷ lệ cis/trans của sản pham / -lactam Con

đường được dé xuất cho sự hình thành Ø -lactam được mô tả dưới đây (Sơ đồ

So đồ 1.3 Con đường hình thành / -lactam

Khi sử dung ketene dẫn xuất một lần thế thường cho tấn công exo là ưu

thé Sản phâm hóa học lập thể cuối cùng chịu ảnh hưởng bởi bản chất của các ketene và các hợp chất chức imine, vì nó là kết quả của sự cạnh tranh phản ứng

đóng vòng (k¡) và phan ứng đồng phân hóa imine (k;) Tỷ lệ k¡/k; xác định tỷ lệ

cis/trans của sản pham Ø -lactam Các tác giả đề xuất [9], bước đóng vòng có thé xảy ra dé dang hơn khi thêm vào một tác nhân nucleophile của một enolate

nhóm chức của imine hon là quá trình electrocyclic Tăng mật độ điện tử cho

ketene thế và giảm mật độ điện tử cho imine thế làm tăng phản ứng đóng vòng

(tăng k,), dẫn đến hình thành chủ yếu cis- 6 —lactam Mặt khác, làm giảm mật độelectron của ketene thé và làm tăng mật độ electron imine sẽ làm giảm giá trị kị

và có lợi cho phản ứng đồng phân hóa, dẫn đến hình thành chủ yếu trans- Ø —

lactam Các hiệu ứng điện tử của các nhóm thé trên đồng phân là một yếu tố nhỏtrong chọn lọc lập thé Cuối cùng, sau khi so sánh các phan ứng tương tự thựchiện trong các điều kiện khác nhau, các tác giả cũng thừa nhận rằng không cóảnh hưởng của sóng viba [15] hoặc anh sáng trong độ chọn lọc lập thé của phản

ứng Staudinge [21].

Độ chọn lọc lập thể cũng chịu ảnh hưởng bởi tính chất của dung môi, các

dung môi không phân cực có lợi cho sự hình thành cis- Ø —lactam, trong khi dung môi phân cực thuận lợi cho sự hình thành trans Ngoài ra, cách ketene

5

được hình thành và thứ tự của b6 sung các tác nhân, cũng ảnh hưởng đến độ

chọn lọc lập thể của sản phẩm [27] Sự xuất hiện của các orbital liên hợp giữa

ketene va tác nhân imine ảnh hưởng đến độ chọn lọc lập thé của sản phâm tương

tự như nhiệt độ [19].

Một phương pháp rất hiệu qua dé thu được trans- Ø -lactam được pháttriển bởi Lectka và đồng nghiệp bang cách sử dụng muối (12) như một anionxúc tác ái nhân (Sơ đồ 1.4) Trên thực tế, biện pháp này không hiệu quả với acyl

Lao Groton, ° (13) 7 O14) T

toluene, O0°C without catalyst 1:1

with 10% of (8) 37:1 (50% yield)

SOx *NRy N“*N^

~ “ta

R = hepty|

So đồ 1.4 Sử dung muối 12 tông hop B-lactam

Việc sử dung sorbyl clorua (16) như một một tiền chất của butadienylketene thu được một số kết quả thú vị liên quan đến đồng phân lập thê

không đối quang Khi phản ứng Staudinger được thực hiện với N-aryl imine, thu

được chủ yếu là sản phẩm trans, trong khi sử dụng N-akyl imine thu được chủ

yếu là cis- / lactam (So đồ 1.5)[24]

RỈ = c-Hex R2 = Ph > 95:5 R! = c-Hex R2=4-MeCgH, > 95 : 5

Sơ đồ 1.5 Sorbyl clorua (16)tông hợp Ø-lactam

Việc chọn loc trans cũng thu được trong phan ứng Staudinger gitra imine

và vinylketene chứa một y — heteroatom Cấu hình Z của nhánh vinyl của đồngđồng phân lập thé có tác dung ôn định vinylketene và sản phẩm chính là trans-3-vinyl - Ø -lactam (Sơ đồ 1.6) [23]

Phân tích các đồng phân đối quang là tách một hỗn hop raxemic bang các

phương pháp vật lý và hóa học Thông thường, sự tách được thực hiện sau khi

chuyển từ đồng phân đối quang sang đồng phân “dia”; do các đồng phân đối

quang có các tính chất vật lý và hóa học giống nhau nên chúng không thê tách

bang cách trực tiếp Trong khi đó, các đồng phân “dia” có thé tách được bang các phương pháp kết tinh chọn lọc, phương pháp sắc ký hoặc phương pháp

NMR.

1.3.1 Phương pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym

Hầu hết các enzym có tính đặc hiệu với một loại cơ chất nhất định Dựa

vào tính chất này, người ta đã sử dụng các enzym dé chuyển hóa chon lọc mộttrong hai đối quang trong hỗn hợp Ví dụ phản ứng thủy phân hỗn hợp raxemiccủa este bằng enzym pig liver estease Dưới tác dụng của enzym này, chỉ có

đồng phan S được thủy phân Nhờ đó mà người ta tach được hai đồng phân này

ra khỏi nhau.

1.3 2 Tach các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bat đối bỗ trợ

Hỗn hợp raxemic hoặc hai đồng phân của các hợp chất đối quang có mộttâm bat đối thường không thé tách ra khỏi nhau Tuy nhiên, khi tham gia phanứng với các chất bô trợ chiral có từ một hoặc nhiều tâm bat đối, tạo thành sảnphẩm có từ hai tâm bat đối trở lên, có thé tách được bằng các phương pháp hóa

lý khác nhau Dựa vào tính chất quan trong này năm 1953, Pasteur đã tách đượcđôi đồng phân đối quang của axit tactaric nhờ sự tạo muối “dia” của hỗn hợp haiđối quang với (+)-cinchotoxin, có độ tan khác nhau nên có thé tách ra khỏi nhaubăng phương pháp kết tinh Phương pháp này vẫn được sử dụng hiệu quả đểtách hỗn hợp hai đồng phân đối quang ra khỏi nhau

Ngoài ra, có thể chuyển hóa các đối quang của các hợp chất có một tâm

bất đối thành các đồng phân “dia” nhờ phản ứng với tác nhân bat đối bé trợ khác Các đồng phân “dia” nhận được có thé tách ra bằng các phương pháp hóa

lý khác nhau Cuối cùng các tác nhân bat đối bé trợ được loại bỏ, thu được các

đồng phân đối quang tinh khiết

1.3.3 Tách đồng phân đối quang bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

Các đối quang có thể được tách nhờ các phương pháp sắc ký khí (GC),

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có sử dụng các cột chiral Bản chất của các phương pháp này là các hỗn hợp đối quang tương tác với pha tĩnh (tâm bất đối trên cột chiral), nghĩa là chỉ một trong các đối quang có tương tác mạnh hơn với

8

tâm bất đối của cột Đối quang có tương tác yêu sẽ được rửa giải nhanh nhờ phađộng, kết quả là hai đối quang được tách ra khỏi nhau Phương pháp này thường

được sử dụng để xác định độ chọn lọc đối quang trong của các phản ứng Nếu

phản ứng nhận được hỗn hợp có hai đồng phân đối quang A và B

(ee=enantiomer excess, de=diasteroisomer excess), độ chon lọc đối quang được

1.3.4 Phân tích các đối quang nhờ phương pháp NMR

Dé xác định tỉ lệ các đồng phân lập thê có thé sử dụng nhiều phương pháp

khác nhau, nhưng phố NMR là một phương pháp hữu ích và phổ biến, vì nó

không làm thay đổi tỉ lệ của các đồng phân trong hỗn hợp và chỉ cần lượng nhỏhỗn hợp hai đồng phân đối quang Các đồng phân khác nhau được xác định nhờ

độ dịch chuyên hóa học và hăng số tương tác spin-spin của những nguyên tử

hydro trong từ trường.

Trong pho NMR, phan lớn hạt nhân của 'H và °C của hai đồng phân

“dia” sẽ có tín hiệu chuyên dịch hóa học khác nhau Tỉ lệ của các đồng phân cómặt trong hỗn hợp có thể tính toán được bằng sự phân tích các tín hiệu này Nếutrong hỗn hợp có nhiều hơn hai đồng phân “dia” thì việc xác định tỉ lệ các đồngphân bằng phố NMR sẽ gặp khó khăn hơn, đặc biệt là các đồng phân chiếm tỉ lệ

nhỏ.

a) Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dich (Shift reagent) Mosher

Đối với các hợp chất có một tâm bat đối thì hai cấu hình của chúng sé

không phân biệt được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, do tín hiệu của chúng không được phân tách trong từ trường Dé phân biệt được hai cấu hình của các hợp chất có một tâm bất đối, người ta phải chuyển hợp chất nghiên cứu thành đồng phân dia Cơ sở của phương pháp Mosher là chuyên hợp chất có một tâm bat đối thành đồng phan dia bằng cách thực hiện phản ứng của

hợp chất nghiên cứu với axit R-Mosher dé tạo thành este hoặc thành amit Sau

đó, nghiên cứu cấu hình của các hợp chat dia này sẽ đưa ra được cấu hình của

chất ban đầu Ví dụ, dé xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất

1-phenylbutan-9

1-ol có một tâm bat đối, Mosher đã tổng hợp este của nó với axit R-Mosher détạo ra hai đồng phân dia như mô tả trong sơ đồ dưới đây.

Hai đồng phân dia này sẽ được phân biệt rõ trên phố cộng hưởng từ hạtnhân proton Tín hiệu của proton bậc ba tại trung tâm bất đối của dẫn xuất este

Mosher của (R)-1-phenylbutan-1-ol sẽ dich chuyên về phía trường cao, trong khi

tín hiệu proton bậc ba tại tâm bất đối của dẫn xuất (S)-1-phenylbutan-1-ol sédịch chuyển về phía trường thấp Như vậy, người ta có thé xác định được cấuhình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan-1-ol ban dau

Hình 1.2 Phỗ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và

Ngoài axit R-Mosher, hiện nay người ta đang nghiên cứu sử dụng một sốtác nhân bồ trợ khác dé xác định cau hình tuyệt đối của một số hợp chất ancol,

amin và axit cacboxylic có một tâm bat đôi, ví dụ như các tác nhân bô trợ sau.

b) Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Chiral Pirkle ancol (CSA)

Chiral aryltrifluorometyl carbinol (chiralPirkle ancol) là những tác nhân

hữu dụng nhất, cho phép xác định nhanh ty lệ của các đồng phân lập thé Khi có

mặt của chất này, các đối quang của lacton, amin và ancol trong từ trường tạo ra

phổ không tương đương Có thé là do ca hydroxyl và các hydro cacbinyl của chất CSA tạo ra các tương tác với các tâm bazơ Ưu điểm của của phương pháp

nay là không cần phải thực hiện các phản ứng chuyển hóa thành các dẫn xuấtvới tác nhân bé trợ nên hạn chế được quá trình raxemar hóa, đặc biệt là có thé sử

dụng dé xác định câu hình của các chat có hàm lượng nhỏ.

Ví dụ, để nghiên cứu cấu hình của hai đối quang oxaziridin nhờ tác nhân

bổ trợ CSA, kết qua do tương tác cầu hydro của oxazirindin với CSA tạo thành

phức dia, dẫn đến một số tín hiệu của hai đối quang được tách biệt trong từ

trường Nghiên cứu của phố 'H-NMR cua hỗn hợp hai đồng phân (-)-oxaziridin

khi không có tác nhân chuyên dịch CSA thì các tín hiệu proton không phân biệt

được trong từ trường, nhưng khi cho kết hợp với (S)-(+)-CSA thì các tín hiệu

của metyl, metin được tách ra Dựa vào phô này, người ta có thể xác định được

tỷ lệ hai đồng phân đối quang của oxaziridin.

11

Hình 1.4 Pho 'H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA

c) Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Eu(hfc)3)

Tác nhân Eu(hfc); là phức của kim loại thuận từ với ligand hữu cơ có tâm

bất đối Khi tác nhân Eu(hfc); kết hợp với nhóm chức (NH;, OH, SH ) trong

phân tử có một trung tâm bat đối sẽ tạo thành đồng phân “dia” Phức dia tạo thành có một số proton được tách ra trong từ trường và chuyên về trường thấp.

Sự tách biệt và độ chuyên dịch về phía trường thấp của một số proton phụ thuộc

vào nồng độ của tác nhân phức Eu(fc)a.

Ví dụ, nghiên cứu phổ 'H-NMR của hỗn hợp hai đối quang axetyl-1-phenylbutan, các tín hiệu proton của hai đối quang không phân biệt

(R,S)-1-được trong từ trường Tuy nhiên, khi (R,S)-1-được tạo phức với tác nhân chuyển dich

Eu(hfc); thì có sự tách tín hiệu Nhóm metyl (triplet) được tách thành hai triplet

có cường độ tương đương nhau Sự tách tín hiệu của proton trong từ trường phụ thuộc vao ban chat của chat nghiên cứu và nông độ cua tác nhân chuyên dich.

Qua ví dụ trên ta thấy, tín hiệu proton ở nhóm CH; của hỗn hợp

(R,S)-1-axetyl-I-phenylbutan khi tạo phức với Eu(hfc); đều được tách ra và có độ

12

chuyên dịch hóa học chuyên về phía trường thấp Sự tách tín hiệu và độ chuyềndịch hóa học proton ở nhóm CH; của hai đối quang có sự khác biệt rõ ràng Đốivới (R)-1-axetyl-I-phenylbutan, tín hiệu proton của nhóm CH; được chuyển

dịch về phía trường cao so với (S)-1-axetyl-1-phenylbutan Như vậy, có thé phân

biệt và xác định được tỷ lệ hai đồng phân (R)-1-axetyl-1-phenylbutan và axetyl-1-phenylbutan nhờ 'H-NMR của chúng khi tạo phức với tác nhân chuyên

(S)-1-dịch Eu(hfc)s (xem hình 5).

'CH3 của raxemic 'CH3 của raxemic

CH3 của raxemic (S}(-}1-axetyl-I-phenylbutan (R)-(+)}-1-axetyl-1-phenylbutan l-axetyl-1-phenylbutan (82% ee) với Eu(hfc)3 (87% ee) với Eu(hfc)3

a Giới thiệu chung

Phương pháp X-ray phân tử là phương pháp hiện đại nhất dé xác định cấutrúc phân tử của một hợp chất hữu cơ Từ phương trình Bragg, người ta tính toán

độ dài của các cạnh tế bào cơ sở (a,b,c), chỉ số Miler (h,k,]), góc giữa các trục tinh thé (œ,Ø,y), thể tích tế bào tinh thé cơ sở (V) và số lượng phân tử (n) xây

dựng nên tê bao cơ sở.

Phương trình Bragg: 2d.sin(9) = na

Thẻ tích tế bao cơ sở: V = abc(1-cosˆ“œ-cos”-cos”y+2cosœcosØcosy) '?

Số lượng phân tử trong một tế bào cơ sở n = V.d.6,023.10”Ì (d: tỷ trọng g/cm? )

Mặt khác, khi chiếu bức xa tia X vào phân tử, ở mỗi trung tâm liên kết sẽ

phát ra một cặp tín hiệu Friedel phản xạ theo hai hướng (h,k,l) và hướng ngược

lại (-h,-k,-l) Cường độ của tín hiệu Friedel (Fig, En vị) được tính toán nhờ

cường độ của tín hiệu nhiễu xa (Ing) (IFhkll = (IhkI)'”).

13

Mật độ electron tại một điểm trong tế bào cơ bản sẽ được tính toán băng

công thức:

p(x.VY;Z) = [ Ln Fan exp{-2p(hx + ky + 1z)}]/V

Bang cách đo cường độ cua tất cả các tín hiệu nhiễu xa I, theo mặt h,k,]

khi đã biết được các thông số cơ bản của tế bào cơ sở theo phương trình Bragg ở

trên, người ta sẽ tính toán được mật độ electron tại mọi điểm trong không giancủa tế bào cơ sở, từ đó có thé xây dựng được bản đồ mật độ điện tích của phân

tử.Từ dữ liệu bản đồ mật độ electron, chương trình máy tính sẽ dựng được cầu

trúc không gian ba chiều của phân tử Quá trình xác định cấu trúc của hợp chất

hữu cơ băng phương pháp X-ray phân tử có thể được tóm tắt như sau:

J Be nhiéu xa X-ray

Bon tinh thé

tinh toán

(=> we

nếu mô hình chưa đúng phải tính toán lại

Hình 1.7 Sơ đồ tom tắt quá trình phân tích cấu trúc bằng phương pháp X-Ray

b Xác định cấu hình tuyệt đối

Phương pháp X-ray tinh thé có khả năng xác định chính xác cau hình

tuyệt đối của một phân tử, nếu trong phân tử có nguyên tử có tán xạ tia X bất thường Dé xác định cấu hình tuyệt đối của phân tử bằng phương pháp X-ray

tinh thé người ta sử dụng phương pháp của Bijvoet và phương pháp so sánh chỉ

sô R.

14

Phương pháp Bijvoet: Do mỗi trung tâm bất đối khi được chiếu bức xạ tia

X sẽ phát ra một cặp tín hiệu bất thường Friedel, lợi dụng nguyên tắc nàyBljvoet đã so sánh tín hiệu tan xạ của một nguyên tử đánh dấu với tín hiệu của

cặp bức xa Friedel ở trung tâm bat đối phan xạ theo hướng (h,k]) và hướng

ngược lại (-h,-k,-I), dé xác định cấu hình tuyệt đối

Phương pháp so sánh chỉ số R: Chỉ số R được xây dựng trên cơ sở hàmthống kê Hamilton từ toàn bộ dữ liệu của các cặp đồng phân đối quang và được

so sánh với các tính toán Bijvoet để xác định kiểu đồng phân đối quang Nếu giátrị của chỉ số R có sự sai khác, dù rất nhỏ (+0,1%) thì phải đánh giá lại các giátrị này bằng phương pháp thống kê

Như vậy, cả hai phương pháp này chỉ dựa vào tia phản xạ đặc biệt có

cường độ cao do ảnh hưởng của cấu trúc ở những trung tâm bắt đối của phân tử

mà chưa so sánh được những tia tan xạ yêu Những yếu tố tán xạ yếu chỉ được

sử dụng khi dit liệu X-ray có số lượng lớn Phương pháp X-ray tinh có thé sửdụng hữu hiệu nhất đối với các hợp chất không chứa nguyên tử nặng hơn oxi

Với những chất quang hoạt không tôn tại ở dang đơn tinh thé, người ta có

thé xác định cấu hình tuyệt đối của chúng bằng cách cho chúng phản ứng với một chất khác có chứa một hay nhiều trung tâm bat đối đã biết cấu hình tuyệt

đối Các hợp chất có cau hình tuyệt đối đã biết được chọn dé nghiên cứu trongphương pháp này là những chất có khả năng dễ kết tinh để nhận được dạng đơntinh thé Việc xác định cấu hình tuyệt đối của các hợp chất quang hoạt bangphân tích X-ray được thực hiện dựa vào phần cấu hình tuyệt đối của chất gắn kếtvới chất nghiên cứu Ngoài ra, việc đưa nhóm nguyên tử nặng như halogen (Cl,

Br, I) vào phân tử hợp chất quang hoạt cũng cho phép xác định cấu hình tuyệtđối của chất đó nhờ phương pháp Bijvoet ở trên

Vi dụ hidroxy lacton chưa biết cau hình tuyệt đối được chuyền thành estevới axit Mosher dé tạo thành đồng phan dia Trong trường hợp chat tạo thànhthu được đưới dạng don tinh thể, cấu hình tuyệt đối của hydroxy lacton được

15

xác định thông qua cấu hình tuyệt đối đã biết của phần tác nhân Mosher thôngqua phân tích phổ X-ray.

1.3.6 Phổ CD

Phương pháp phổ CD cũng dựa trên nguyên tắc cơ bản của hiệu ứng Cotton, cơ sở của phương pháp nay là nghiên cứu bước chuyền ở trung tâm bat đối (circular dichroism) hay còn gọi là phổ nhị sắc tròn Việc xác định phổ CD rất phức tạp, vì nó phụ thuộc vào bản chất của hợp chất nghiên cứu, chỉ có những hợp chất có bước chuyên n >mr* và m >r* (có nhóm mang màu) mới

đo được hiệu ứng Cotton Trong trường hợp chat cần nghiên cứu không có bước chuyền n >#* và ø >m* cần phải gắn thêm một nhóm mang màu vào phân

tử Xác định cau hình tuyệt đối của một hợp chất hữu cơ được thực hiện nhờ sosánh hiệu ứng Cotton của nó với hiệu ứng Cotton của chất có cau trúc tương tự

đã biết về cau hình tuyệt đối Như vậy, cần phải có nhiều hợp chất có cau trúc

tương đồng đã biết để so sánh và xác định cấu hình tuyệt đối của chất cần

nghiên cứu.

Vi dụ, khi muốn xác định cau hình của flavan mới, người ta phải so sánh

hiệu ứng Cotton của hợp chất cần nghiên cứu với hiệu ứng Cotton flavan đã biết trước cau hình tuyệt đối Hợp chất flavan B đã biết cầu hình tuyệt đối, hợp chat

flavan A chưa biết cấu hình tuyệt đối, hiệu ứng Cotton của A và B trên phổ CD

là tương tự nhau nhưng có chiều ngược nhau, nên cấu hình tuyệt đối của A là

ngược so với B.

250 270 290 310

(A, nm)

Hình 1.8 Phé CD của hop chat A và B

Ngoài ra, với các phan tử hữu co quang hoạt có chứa các phan mang mau

đã biết việc phân tích phé CD cho phép xác định được cấu hình tuyệt đối của

cacbon bat đối trong phan mang màu này

16

1.4 SAC KÝ LONG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

1.4.1 Khái niệm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968

trên cơ sở phát triển va cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột

là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiêu phân hoặc một chat lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với

các nhóm chức hữu cơ Phương pháp nay ngày càng được sử dụng rộng rãi va

phô biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dé phân hủy nhiệt.

Pham vi ứng dung của phương pháp HPLC rất rong, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường

1.4.2 Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta

chia HPLC thành 4 loại:

‹ Sac ký hấp phụ hay sắc ký long rắn (adsorption/liquid chromatography).

« Sac ký phân bố (partition chromatography).

« Sac ký ion (ion chromatography)

‹Ổ Sắc ky ray phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

Riêng SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường — SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo — SKPD (reversed phase chromatography).

Trong đó, sắc ký pha đảođược sử dung nhiều hơn cả.

1.4.3 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hop chất hữu co được

gan lên chat mang ran silica hoặc câu thành từ silica theo hai kiêu:

+ Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật ly >

sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography)

17

‹ Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền > sắc ký pha liên kết (bonded

phase chromatography)

Trong quá trình sử dung, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều

ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dé bị hòa tan bởi pha động nên

dé bị mat mát pha tinh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đốivới hợp chất phân tích

o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dé tan trong pha động nên người

ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết

và phan lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc

dạng này.

Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực

hoặc ít phân cực Đó là các ankyl mạch dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl)

còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra

con có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm

alkyl Người ta nhận thấy các alkyl mạch dài cho kết quả tách ổn định hơn các

loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất.

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

„ Hoa tan mẫu phân tích

+ Phu hợp với đầu đò.

e Khong hòa tan hay làm mòn pha tinh.

‹ _ Có độ nhớt thấp dé tránh áp suất đội lại cao.

« Tinh khiết dùng cho sắc ký

18

Trong sắc ký pha đảo , dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý

thuyết chúng ta có thé sử dung khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế

cho thấy nước, methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran là đạt yêu cầu nhất Trong

đó nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ dé giảm kha năng

rua giải.

Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích

và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid hoặc tính base

của dung môi Do đó độ phân cực và độ rửa giải của dung môi có tác động lớn

lên khả năng phân tách của sắc ký

Thông thường pha động trong SKPD bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong

nước.

Thanh phan pha động có thé có định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế

độ isocratic) hoặc được thay đôi theo một chương trình đã định sẵn (chương

trình gradien dung môi) dé có hiệu quả tách tốt hon.

1.4.5 DETECTOR DAD

Trung tâm của thiết bị là một dãy diot hàng trăm chiếc (những máy hiệnnay có thé lắp 1024 diot) được sắp xếp cạnh nhau liên tục thành dãy trên tamsilicon tinh khiết, kích thước 1-6 cm, độ rộng của mỗi diot riêng là 0,0015 —

0,050 mm.

Hình 1.10 Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang

Trên mỗi tam silicon còn có một tụ điện, một công tắc cho mỗi diot Hệthống được điều khiển bằng computer luôn ngắt mỗi công tắc làm cho tụ điệnđược tích — 5V Khi bức xạ chiếu vào mặt diot làm đóng mạch điện và tụ điệnphóng điện Sự nạp điện lại được tiếp tục ở chu kỳ tiếp theo Kết quả là dòngđiện tỷ lệ với lượng bức xạ chiếu vào, khuếch đại, số hóa và ghi lại vào bộ nhớ

19

Đĩa polyme Detector @) ©) 6 Nguôn (e) 7

a) duong quang chit Z, b) đường quang bong bóng,

c) đường quang phản xạ nhiễu lan Hình 1.11 Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiễn flowcell).

1.4.6 DETECTOR MS

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên

cứu các chất băng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó

dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong điện

trường hoặc từ trường nhất định Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnhhưởng rất lớn đối với chuyền động này của ion Nếu biết được điện tích của ion

thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của 1on đó.

Do quá trình phân tích với đầu do MS doi hỏi mức độ chân không cao _, nhiệt độ cao , các chất khảo sát phải ở trạng thái khí _, vận tốc dòng chảy nhỏ ; trong khi hệ thống LC lại hoạt động ởáp — suất cao với một lượng dung môi

tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp , các chất phân tích ở thé long Điều này gây rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa

hệ thống sắc ký long và đầu dò khối phỏ

Đề khắc phục những khó khăn trên , cần phải có một kỹ thuật trung gian gọi la giao điện Rất nhiều kỹ thuật giao điện (interface technology) như chùm

tia hạt (FB), bắn phá nguyên tử nhanh dong liên tục — (CF-FAB), đã được

nghiên cứu và ứng dụng , nhưng mãi cho đến cudi thập nhiên 80, mới có sự đột phá thật sự với kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyền (Atmospheric Pressure

Ionization — API).

Ưu điểm nỗi bat của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyên

ngay trong buông ion hóa Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng

trước đó cho LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục

(continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt

(thermospray — TS) đều đòi hỏi áp suất thấp Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích

20

nhờ đó thu được khối phé của ion phân tử Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta

có thé điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích.

Có ba kiêu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:

* Phun mù điện tử (ESI).

* Ion hóa hóa học tai ap suất khí quyền (APCT).

* lon hóa bang photon tại áp suất khí quyền (APPI)

Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều

hơn cả.

c Các loại đầu dò khối phố

Có các loại tổng quát sau:

* Sự uấn cong nhờ từ trường (Magnetic field deflection)

- Máy khối phổ đơn giản sử dụng từ trường (a single focussing magnetic sector mass spectrometer): máy có độ phân giải thấp.

- Máy khối phổ nhị tiêu (double focussing mass spectrometer): sự uốn

cong nhờ từ trường và điện trường, máy có độ phân giải cao.

* Máy khối phô tứ cực (quadrupole mass spectrometer)

- Máy khối phô tứ cực (quadrupole mass filter)

- Bẫy ion (quadrupole ion storage; ion trap)

* Máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay (time of flight mass

spectrometry)

* Máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-ion, sử dung phép biến đổi Fourier

(Fourier transform-ion cyclotron resonance mass spectrometry: FTMS).

Trong đó, Máy khối phổ tứ cực; máy khối phé sử dung kỹ thuật thời gian

bay; máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi

Fourierduge sử dụng nhiêu hơn cả

21

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Phương pháp nghiên cứu và trang thiết bị.

2.1.1 Các phương pháp tong hợp hữu cơ

Sử dụng phản ứng đóng vòng Staudinger và một số phương pháp khác tại

phòng thí nghiệm Hoá dược- Viện Hoá học- Viện Khoa học & Công nghệ Việt

Nam.

2.1.2 Dụng cụ và hóa chất.

Nguyên ligud au: phenol, m-clophenol, este 2-brom metylaxetat,

benzylamin, p-brom benzandehit

Dung môi: axeton, metanol, etanol, n-hexan, diclometan, etyl axetat, nước.

Dung dịch hiện màu: dragendoff, ceri sunfat/ axit sunfuric đặc.

Các chât xúc tác và dung môi khác cho các phản ứng được mua của hãng

Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ).

Bột silica gel cho sắc kí cột kích thước 0,01+0,02 mm (Merck), bông y tếdùng nhdi cột

Bản mỏng sắc ki silica gel đế nhôm tráng sẵn Art 5554 DC — Alufolien

Kiesel 60 Fas¿, dày 0,2 mm, kích thước 20 x 20 cm (Merck).

Cột sắc kí thuỷ tinh, giá ống nghiệm, ống capila, bình triển khai sắc kí bản

2.1.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tỉnh khiết của dẫn xuất bằng sắc

kí lớp mỏng.

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính chất đầu và sản

phẩm Thông thường chat đầu và sản phẩm với giá trị Ry khác nhau, màu sắc và

sự phát quang khác nhau Dùng sắc kí lớp mỏng dé biết được phản ứng xảy

ra, không xảy ra, kết thúc phản ứng dựa vào các vết trên bản mỏng, cùng các giá tri Ry tương ứng Giá tri Ry của các chất phụ thuộc vào ban chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thé tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi dé các chat tách ra xa khỏi nhau (Ry khác xa

nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết dé tinh chế các chất

Cho bản mỏng đã chấm vào bình sắc kí, bản mỏng được đặt nghiêng một góc 15° Bình sắc kí phải để yên trong suốt quá trình triển khai Khi tiền tuyến dung môi cách mép trên 0,3 cm thì lấy ban mỏng ra Làm khô bản mỏng, sau đó

hiện sac phô dưới đèn tử ngoại roi băng thuộc hiện.

2.1.4 Các phương pháp phân tích cấu trúc.

Đề xác định cau trúc các chất hữu cơ tong hợp được, chúng tôi tiến hành

các phương pháp sau:

23

là chất chuẩn, tại phòng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân - Viện Hoá Học - Viện

Khoa học & Công nghệ Việt Nam.

- MAY HPLC + Hóa chat, thiết bi dùng cho may HPLC

Dung môi: Kênh A: H;O (PA); Kênh B: Metanol (PA)

Pha tĩnh: Cột thép không gi (25 em x 4,6 mm) được nhéi octadecylsilayl

- Source: ESI - Dry Gas: 5,0 l/min - Cap Exit: 200.0V

- Capilary: 3000V; 17nA - Dry Temp: 325 °C - Polarity: Positive

- End Plate Offset: 500V; 435nA | - Skimmer: 40.0V

Flow: 0,25 ml/min Stop time: 30 min

24

Thể tích tiêm: 20 — 50 ul (tùy vào lượng mẫu)

2.2 Tong hợp các hợp chat Ø-lactam

2.2.1 Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic

Hỗn hợp cua phenol (5,1 mmol) 1a, DMF (3 ml) va Na;COa (5,1 mmol)

được đun hồi lưu ở 140°C, trong thời gian 10 phút Sau đó thêm este 2-brommetyl axetat (4,6 mmol) và tiếp tục đun hồi lưu ở 140°C, trong khoảng 4h Honhợp sau phản ứng được cho thêm dung dịch HCI 10% đến môi trường axit, sau

đó thêm dung dịch NaHCO; đến môi trường trung tính và được chiết ba lần bang CHCl) Dịch chiết CHCl, được làm khô bang Na;SO¿ và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được sản phẩm thô 2a, sau đó thêm 8 ml NaOH IN và 8

ml MeOH/H,0 (1:1), tiếp tục đun hồi lưu ở 140°C trong 24h Hỗn hợp sau phảnứng được chiết bằng CH;Cl;, dịch chiết được làm khô bằng NazSO¿ và loại bỏ

dung môi ở áp suất thấp thu được sản phẩm thô Sản phẩm thô được làm sạch

bằng sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/EtOAc (9:1) thu được axit3a hiệu suất 70% Axit 3a là các chat ran màu trăng có điểm chảy là 98-100°C

Dung dịch của hỗn hợp gomaxit 3a (0,36 mmol), (COCTI)›(1,8 mmol) va

0,1 ml DMF trong 5ml CHCl, được khuấy ở nhiệt độ thường trong 24h Kếtthúc phản ứng, loại bỏ dung môi CH;Cl;ở áp suất thấp thu được sản phâm 2-

phenoxy clorua axetat 4a.

25

Dẫn xuất 2-(m-clo phenoxy) clorua axetat 4b được tổng hợp tương tự như 4a Nguyên liệu đầu là zm-clophenol 1b, thu được axit 3b với hiệu xuất 50%, điểm nóng chảy tương ứng là 108-110°C.

Sơ đồ 2.1 Tông hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic

2.2.2 Tổng hợp dẫn xuất imine

Dung dịch cua benzylamin(18,7 mmol) 6a, p-brom benzandehit (18,7

mmol) 7a và Na;SO¿ (37,4 mmol) được đun hồi lưu ở 50-60°C trong dung môi

CH;Cl;, trong thời gian 4h Hỗn hop sau phản ứng được chiết hai lần bangCHCl, làm khan bằng NazSO¿ và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được các

dẫn xuất imine 8a, được sử dụng ngay cho phan ứng tiếp theo.

Dẫn xuất imine 8b được tổng hợp tương tự như 8a Nguyên liệu đầu là 6a

và dẫn xuất p-metoxy benzandehit 7b.

Dẫn xuất imine 8e được tổng hợp tương tự như 8a Nguyên liệu đầu là 6b

và dẫn xuất p-metoxy benzanđehit 7b.

Sơ đô 2.2 Tông hợp dẫn xuất imine

26

2.2.3 Tổng hợp các dẫn xuất Ø- lactam

Hợp chất 4a (0,75 mmol) được hòa tan vào 5 ml toluen sau đó dung môi

toluen được cất loại ở ap suat thap dé loại bỏ (COC), con dư, tiép theo lam lanh

và thêm EtạN (1,125 mmol) thu được dẫn xuất ketene 5a, sau đó cho thêm chất8a (0,75 mmol)và dung môi CH,Cl,(5 ml), dun hồi lưu ở 55°C trong 24h Hỗnhợp sau phản ứng được chiết hai lần bằng CH;C];, làm khan bằng Na;SO/¿ và

loại bỏ dung môi ở áp suất thấp Sau đó làm sạch bằng cột silica gel với hệ dung

môi hexan va EtOAc (9:1) thu được dẫn xuất 9a với hiệu suất 73%

Dẫn xuất 9b được tông hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là 4b và 8a, thu được với hiệu suất 67%.

Dẫn xuất 9ccũng được tông hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là

4b và 8b, thu được với hiệu suất 69%.

Dẫn xuất 9dcũng được tổng hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là4a và 8b, thu được với hiệu suất 71%

Dẫn xuất 9e được tổng hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là 4b và 8c, thu được với hiệu suất 68%.

Dẫn xuất 9f cũng được tông hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là4a và 8e, thu được với hiệu suất 65%

Sơ đồ 2.3 Tổng hợp dẫn xuất c¡s lactam

27

2.3 Phố cộng hưởng từ hạt nhân 'H và “°C của các hợp chat 9a, 9b, 9c, 9d,

9e, 9ƒ

Các chất sau khi được tổng hợp, được đo phổ cộng hưởng từ proton

'H-NMR (500 MHz) và cacbon '°C-'H-NMR (125 MHz) được đo trên may cộng

hưởng từ hat nhân Avance 500 (Bruker, CHLB Đức).

a) Hợp chat 9a: là chat ran màu trang có nhiệt độ nóng chảy: t°C: 105-106°C

4H NMR (CDCI:, 500 MHz)6 ppm: 7,41 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’, H-5');

7,31-7,34 (3H, m, H-4’’, H-2’”’, H-6’”’); 7,11-7,15 (6H, m, H-2”’, H-3”’, H-5”,

H-6”, H-3’”, H-5’”’); 6,89 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-4’’’); 6,72 (2H, d, J = 8,0 Hz,

H-2’, H-6'); 5,40 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-3); 4,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5a); 4,70 (1H, d, J = 4,5Hz, H-4); 3,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5b).

%C NMR (CDCl, 125 MHz)d ppm: 165,42 (C=O); 156,82 (C-1’”);

134,53 (C-1’); 131,51(C-3'); 130,30 (C-5’); 129,30 (C-3°”'); 128,94 (C-6"”); 128,68 (C-2”’); 128,11 (C-6”’); 122,84 (C-4”); 122,21 (C-4’”); 115,53 (C-2””, C-6’”’); 82,10 (C-3); 60,91 (C-4); 44,4 (C-5)

b) Hop chat 9b: 1a chat long

1H NMR (CDCI:, 500 MHz)6 ppm: 7,43 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’, H-5');

7,31-7,33 (3H, m, 3’’, 5”’, 4’”’); 7,12-7,15 (4H, m, 2’, 6’, 2”’, 6”); 7,05 (1H, t, J = 8,5 Hz, H-5’”’); 6,88 (1H, dd, J = 1,5; 8,0 Hz, H-4’’”); 6,71

H-(1H, t, J = 1,5 Hz, H-2’”’); 6, 65 H-(1H, dd, J = 1,0; 7,5 Hz, H-6’”’); 5,36 H-(1H, d, J

= 4,5 Hz, H-3); 4,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5a); 4,71 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-4); 3,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5b).

%C NMR (CDCl, 125 MHz)ỏ ppm: 164,79 (C=O); 157,32 (C-1’”);

134,66 (C-1’); 134,34 (C-1'”); 131,58 (C-3’””); 131,61 (2C, C-3’, C-5’); 130,19 (2C, C-3'', C-5'); 130,13 (C-5’”’); 128,97 (2C, C-2’, C-6’); 128,67 (2C, C-2”; C-6’’); 128,17 (C-4’”); 123,03 (C-4”); 122,45 (C-4’”’); 115,97 (C-2?”'); 113,86 (C-6””’); 81,92 (C-3); 60,61 (C-4); 44,44 (C-5).

28

c) Hop chat 9c: là chất rắn màu trắng có nhiệt độ nóng chảy: t°C: 110-111°C

d) Hop chat 9d: là chat ran màu trang có nhiệt độ nóng chảy: t°C: 81-81,5°C

'H NMR (CDCI;, 500 MHz)6 ppm: 7,29-7,32 (3H, m, 2’’’, 6’”’,

4”) 7,20 (2H, d, J = 8,0 Hz, 3’, 5’); 7,17 (2H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz, 2’, 6”); 7,11 (2H, t, J = 8,0 Hz, H-3’’’, H-5’’’); 6,86 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-4’’’); 6,81 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2'', H-6’’); 6, 72 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’’, H-5’’); 5,37

H-(1H, d, J = 4,5 Hz, H-3); 4,87 H-(1H, d, J = 14,5 Hz, H-5a); 4,71 H-(1H, d, J = 4,5

Hz, H-4); 3,84 (1H, d, J = 15,0 Hz, H-5b); 3,77 (3H, s, OCHS).

%C NMR (CDCl, 125 MHz)d ppm: 165,64 (C=O); 159,91 (C-4”);

157,02 (C-1°”’); 134,86 (C-1’); 129,98 (2C, C-3”””, C-5''); 129,18 (2C, C-2”, C-6’’); 128,85 (2C, C-3’, C-5'); 128,67 (2C, C-2?, C-6’); 124,51(C-4'); 121,93 (C-4'°'); 115,58 (2C, C-2’”, C-6'); 113,79 (2C, C-3”, C-5'); 82,17 (C-3); 61,05 (C-4); 55,22 (OCHạ); 44,04 (C-5).

e) Hợp chất 9e: là chất lỏng

'H NMR (CDCI;, 500 MHz)6 ppm: 7,23-7,27 (3H, m, 4’”’, 3””’,

H-5°’): 7,15 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-6°, H-2'); 6,89 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-3’, H-5’); 6,87 (2H, d, J = 2,5 Hz, H-2”’, H-5''); 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2””, H-6’”); 6,77 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’, H-5’); 6,73 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-4’’, H-6’’); 5,40

129, 12 (2C, C-3''', C-5''”); 124,45 (C-6'); 121,86 (C-2’); 121,05 (C-4’”’);

120,81 (C-6’’); 115,50 (C-6’”’); 114,42 (C-2''”); 114,04 (C-5’); 113,91 (C-3'); 113,71(C-4'°; 113,47 (C-2””); 82,08 (C-3); 61,03 (C-4); 55,18 (1C, OCH3);

BC NMR (CDCI, 125 MHz)d ppm: 164,94 (C=O); 159,93 (C-3’’);

159,89 (C-4’); 157,41 (C-1’”’); 136,05 (C-1””); 134,39 (C-3’’’); 129,91 (C-5”””); 129,83 (C-1'); 129,80 (C-2’, C-6’); 124,02 (C-5””); 122,05 (C-4’’’); 120,76 (C- 6°’); 115,98 (C-2’’); 114,03 (C-4’’); 113,76 (C-3’, C-5’); 113,73 (C-6””); 113,46 (C-2’’); 81,87 (C-3); 60,74 (C-4); 55,12 (C-OCH3); 43,98 (C-5).

30

CHUONG 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 TONG HOP CAC HOP CHAT Ø-LACTAM

Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic

Phản ứng ete hóa các dẫn chất của phenol với este 2-brom metyl axetat trong môi trường Na;CO; và DMF ở 140°C Phản ứng được tiễn hành ở nhiệt độ này trong thời gian 4h Tiếp theo, thực hiện phản ứng thủy phân trong môi

trường NaOH 1N và dung môi là MeOH/HO, ở nhiệt độ sôi trong thời gian 12

h nhận được các axit 3a, 3b với hiệu suất 70%, 50% Hợp chất 3a, b được clo

hóa bởi tác nhân (COCI), trong dung môi CH;C]; và xúc tac DMF, thu được hợp

benzandehit 7a-b trong môi trường CH;C]; và một đương lượng của Na;SO¿.

Phản ứng được đun hồi lưu trong thời gian 4h nhận được sản phẩm imine 8a-b (sơ đồ 2.2)

Tổng hợp các dẫn xuất cis-Ø- lactam

Phản ứng tổng hợp hợp f-lactam được tiến hành khi cho imine 8a-e phảnứng với các hợpchất ketene 5a-b, nhận được insitu khi các clorua axit phản ứng

với 1,5đương lương Et;N, thu được dẫn xuất Ø-lactam (cơ chế phản ứng tao thành ketene từ clorua axit được nêu trong sơ đồ 3.2) [15].

31

Sơ đồ 3.2 Cơ chế hình thành chất 5a,b

3.2 PHAN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHATcis-f-LACTAM

Cấu trúc của các hợp chất cis-Ø-lactam đã được nghiên cứu bằng các

(2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’, H-5’) và 6,72 ppm (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2’, H-6’) đặc

trưng cho nhân thom thế brom ở vị trí para Hai nhân thơm còn lại có các tín

hiệu cộng hưởng tại 7,31-7,34 ppm (3H,m, H-4’’, H-2’’’, H-6’’’); 7,11-7,15

ppm (6H, m, H-2’’, H-3’’, H-5’’, H-6’’, H-3’’’, H-5’’’) và 6,89 ppm (1H, t, J =

7,0 Hz, H-4’’’ Ngoài ra trong phổ 'H NMR của dan chất 9a có tín hiệu cộng hưởng các proton của vòng lactam: H-3 (5,40 ppm) là doublet có hằng số tương

32

tác J = 4,5 Hz, tín hiệu cộng hưởng doublet của proton H-4 (4,70 ppm) với hang