nghiên cứu xây dựng mô hình sàng lọc ảo các chất ức chế bơm ngược mrp4 được mã hóa bởi gen abcc4

Nghiên cứu hồi cứu về tương tác giữa NSAID –các thuốc có khả năng ức chế bơm MRP4 với tenofovir trên bệnh nhân nhiễm HIVcho thấy các NSAID ảnh hưởng đến quá trình bài tiết tenofovir gây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN VŨ THỤY VY

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH SÀNG LỌC ẢO CÁC CHẤT ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC MRP4 ĐƯỢC MÃ HOÁ

BỞI GEN ABCC4

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN VŨ THỤY VY

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH SÀNG LỌC ẢO CÁC CHẤT ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC MRP4 ĐƯỢC MÃ HOÁ

BỞI GEN ABCC4

NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC

MÃ SỐ: 8720202

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS.TS THÁI KHẮC MINH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học – Năm học 2020 – 2022

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH SÀNG LỌC ẢO CÁC CHẤT ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC MRP4 ĐƯỢC MÃ HOÁ BỞI GEN ABCC4

Nguyễn Vũ Thuỵ VyThầy hướng dẫn: GS.TS Thái Khắc Minh

Đặt vấn đề

Bơm ngược MRP4 là protein đa kháng thuốc thuộc họ ABC biểu hiện cao ở tiểu cầu vàmột số tế bào ung thư MRP4 có khả năng vận chuyển một loạt các cơ chất nội sinh vàngoại sinh gây ảnh hưởng đến hiệu quả của thuốc điều trị cũng như liên quan đến một sốtrường hợp tương tác thuốc trên lâm sàng Mục tiêu nghiên cứu là xây dựng mô hình cókhả năng dự đoán các ức chế bơm MRP4, từ đó tiến hành sàng lọc trên các ngân hàng

dữ liệu DrugBank và ngân hàng dữ liệu các bài thuốc cổ truyền Trung Hoa (TCM)

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Dựa trên cơ sở dữ liệu gồm 206 chất thu thập từ 18 bài báo khoa học xây dựng được môhình sàng lọc 3D – pharmacophore và hai mô hình 2D – QSAR dự đoán hoạt tính ức chếbơm ngược MRP4 trên cơ chất nội sinh và ngoại sinh Từ cấu trúc bơm ngược MRP4(8I4A) xác định khoang gắn kết gồm các acid amin thân nước và kỵ nước Sau khi tiếnhành sàng lọc qua mô hình pharmacophore, QSAR và docking, các chất ức chế tiềm năngđược tiến hành mô phỏng động lực học phân tử (MD) ở 100 ns, tính toán năng lượng liênkết tự do và dự đoán ADMET

Kết quả và bàn luận

Sau quá trình sàng lọc ảo và mô phỏng MD, tìm thấy DB12204 và DB02651 là nhữngchất ức chế tiềm năng với Gbind là tương ứng là -22,28 kcal/mol và -31,48 kcal/mol

Kết luận

Từ hai ngân hàng dữ liệu DrugBank và TCM, tiến hành sàng lọc qua các mô hình in

silico, kết quả tìm thấy hai chất ức chế bơm MRP4 tiềm năng Nghiên cứu kiến nghị tiến

hành thử nghiệm in vitro để đánh giá khả năng ức chế bơm ngược.

Từ khoá: MRP4, in silico, QSAR, pharmacophore, bơm ngược

Final thesis for degree of Master Pharm – Academic year 2020 – 2022

VIRTUAL SCREENING MODELS OF MRP4 EFFLUX PUMP INHIBITORS

ENCODE BY THE ABCC4 GEN

Vu-Thuy-Vy NguyenSupervisor: Prof Khac-Minh Thai

Introduction

The MRP4 efflux pump is a member of the ATP-binding cassette transporter family,which is highly expressed in platelets and some cancer cells It has been shown totransport a variety of endogenous and exogenous substrates, which can affect theeffectiveness of therapeutic drugs and be involved in some cases of clinical druginteractions

Material and method

A database of 206 substances collected from 18 scientific articles was used to build a3D - pharmacophore and two 2D - QSAR models to predict MRP4 efflux pumpinhibitory activity on endogenous and exogenous substrates From the MRP4 (8I4A)efflux pump structure, the binding cavity consisting of hydrophilic and hydrophobicresidues was also determined After screening through pharmacophore, QSAR anddocking models, potential inhibitors were subjected to molecular dynamics simulation at

100 ns and ADMET evaluation

Result and discussion

The results found that DB12204 and DB02651 are potential inhibitors with ∆Gbind values

of -20.23 and -31.48 kcal/mol, respectively

Conclusion

The DrugBank and TCM databank were screened through in silico models The results

identified two potential MRP4 pump inhibitors were DB12204 and DB02651 The study

recommends conducting in vitro tests to evaluate the inhibitory of potential candidates.

Keywords: MRP4, in silico, QSAR, pharmacophore, efflux pump

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi, các kết quả nghiêncứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được công

bố ở bất kỳ nơi nào khác

Tác giả luận văn

Nguyễn Vũ Thuỵ Vy

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bơm đa kháng thuốc MRP4 được mã hoá bởi gen ABCC4 3

1.1.1 Họ bơm ngược ABC (ATP-Binding Cassette) 3

1.1.2 Cấu trúc và vị trí phân bố của bơm ngược MRP4 3

1.1.3 Cơ chế vận chuyển của bơm ngược MRP4 6

1.2 Cơ chất và tác động của bơm ngược MRP4 trên lâm sàng 8

1.2.1 Phương pháp xác định cơ chất và chất ức chế bơm ngược in vitro 8

1.2.2 Cơ chất của bơm ngược MRP4 10

1.2.3 Tác động của bơm ngược MRP4 trên lâm sàng 11

1.3 Khám phá thuốc dưới sự hỗ trợ của máy tính 12

1.3.1 Khám phá thuốc dựa trên cấu trúc mục tiêu 12

1.3.2 Khám phá thuốc dựa trên phối tử 13

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước các chất ức chế bơm MRP4 15

1.4.1 Các chất ức chế bơm ngược MRP4 15

1.4.2 Các nghiên cứu in silico tìm kiếm các chất ức chế bơm ngược MRP4 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Thiết kế nghiên cứu 20

2.2 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2.1 Cơ sở dữ liệu xây dựng mô hình sàng lọc dựa trên phối tử 20

2.2.2 Cấu trúc bơm ngược MRP4 21

2.2.3 Ngân hàng dữ liệu sử dụng để sàng lọc 22

2.2.4 Các phần mềm máy tính sử dụng trong nghiên cứu 22

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 23

2.4 Quy trình nghiên cứu 23

2.5 Phương pháp nghiên cứu, công cụ đo lường và thu thập số liệu 24

2.5.1 Chuẩn bị cơ sở dữ liệu 24

2.5.2 Xây dựng mô hình pharmacophore 24

2.5.3 Quy trình xây dựng mô hình 2D – QSAR 26

2.5.4 Phương pháp xây dựng mô hình docking phân tử 30

2.5.5 Ứng dụng sàng lọc ảo và mô phỏng động lực học phân tử 33

2.5.6 Mô phỏng động lực học phân tử (MD) 33

2.5.7 Dự đoán ADMET 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 37

3.1 Kết quả mô hình 3D – pharmacophore 37

3.2 Kết quả mô hình 2D – QSAR 40

3.2.1 Kết quả mô hình 2D – QSAR dự đoán hoạt tính ức chế bơm ngược MRP4 trên cơ chất ngoại sinh 40

3.2.2 Kết quả mô hình 2D – QSAR dự đoán hoạt tính ức chế bơm ngược MRP4 trên cơ chất nội sinh 42

3.3 Kết quả mô hình docking phân tử 47

3.3.1 Đánh giá cấu trúc bơm ngược MRP4 47

3.3.2 Kết quả re – docking và chọn khoang gắn kết 49

3.3.3 Kết quả mô hình docking phân tử 50

3.3.4 Đánh giá mô hình docking 52

3.4 Kết quả sàng lọc qua mô hình pharmacophore, 2D – QSAR và docking phân tử các chất ức chế bơm ngược MRP4 53

3.5 Kết quả mô phỏng động lực học phân tử và dự đoán ADMET các chất ức chế bơm ngược MRP4 tiềm năng 54

3.5.1 Kết quả mô phỏng động lực học phân tử các chất ức chế bơm ngược MRP4 tiềm năng 54

3.5.2 Dự đoán ADMET các chất ức chế bơm MRP4 tiềm năng sau sàng lọc ảo 59

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 60

4.1 Các mô hình sàng lọc ảo tìm kiếm các chất ức chế trên bơm ngược MRP4 60

4.2 Sàng lọc ảo các chất ức chế bơm MRP4 tiềm năng 64

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71

5.1 Kết luận 71

5.2 Kiến nghị 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ viết đầy đủ bằng tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

ABC ATP-Binding Cassette transporter

family

Họ vận chuyển sử dụng nănglượng ATP

ABCC4 ATP-Binding Cassette sub-family

C member 4

Bơm vận chuyển sử dụng nănglượng ATP thứ 4 thuốc phân họ CABCG2 ATP-Binding Cassette sub-family

G member 2

Bơm vận chuyển sử dụng nănglượng ATP thứ 2 thuốc phân họ G

ADMET Absorption, Distribution,

Metabolism, Excretion, andToxicity

Hấp thu, phân bố, chuyển hoá,thải trừ và độc tính

cAMP Cyclic adenosine monophosphate Adenosin monophosphat vòngCADD Computer aided drug design Khám phá thuốc dưới sự hỗ trợ

của máy tínhCCC Concordance Correlation

EG Estradiol-17β-ᴅ-glucuronide Estradiol-17β-ᴅ-glucuronid

HEK Human Embryonic Kidney cell Dòng tế bào phôi thận ngườiHIV Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch ở

ngườiHTS Hight throughput screening Sàng lọc hiệu năng cao

Chữ viết tắt Từ viết đầy đủ bằng tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

IC50 50% inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu 50%

MRP1 Multidrug resistance protein 1 Protein đa kháng thuốc 1

MRP4 Multidrug resistance protein 4 Protein đa kháng thuốc 4

MOE Molecular Operating Environment

-NBD Nucleotide binding domain Vùng liên kết nucleotide

NSAID Nonsteroidal anti-inflammatory

drug

Thuốc kháng viêm không steroid

QSAR Quantitative Structure Activity

Relationship

Mối quan hệ định lượng cấu trúc

và tác dụngROC Receiver operating characteristic Đặc trưng của bộ thu nhận

RMSD Root-Mean-Square Deviation Căn bậc hai trung bình bình

phương độ lệchRMSF Root-Mean-Square Fluctuation Căn bậc hai trung bình bình

phương độ dao độngSASA Solvent Accessible Surface Area Diện tích bề mặt tiếp cận dung

môiTCM Traditional Chinese Medicine Ngân hàng dữ liệu các bài thuốc

cổ truyền Trung Hoa

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp xác định cơ chất và chất ức

chế bơm ngược in vitro23 9

Bảng 1.2 Các cơ chất nội và ngoại sinh của bơm ngược MRP42 10

Bảng 1.3 Một số phần mềm hỗ trợ thường dùng trong docking28 13

Bảng 1.4 Một số điểm khác biệt giữa khám phá thuốc dựa trên cấu trúc mục tiêu và khám phá thuốc dựa trên phối tử28 14

Bảng 1.5 So sánh IC50 trên các cơ chất và các tế bào khác nhau 17

Bảng 1.6 Tóm tắt các mô hình docking chất ức chế bơm ngược MRP4 công bố trong nghiên cứu trước đó 19

Bảng 2.1 Các phần mềm sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 3.1 Năm chất sử dụng để xây dựng mô hình 3D – pharmacophore 37

Bảng 3.2 Thông số đánh giá và yếu tố tạo thành của sáu truy vấn pharmacophore 38 Bảng 3.3 Kết quả đánh giá truy vấn pharmacophore trên tập có hoạt tính ức chế mạnh và không có hoạt tính 38

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá truy vấn trên tập có hoạt tính yếu 39

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá toàn tập 15 mô hình 2D – QSAR trên cơ chất ngoại sinh 40

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá hai mô hình 2D – QSAR tốt nhất dự đoán hoạt tính ức chế cơ chất ngoại sinh 41

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá toàn tập 31 mô hình 2D – QSAR trên tập Endo_1 43

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá mô hình 2D – QSAR dự đoán hoạt tính ức chế tốt nhất trên tập Endo_1 44

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá toàn tập 31 mô hình 2D – QSAR trên tập Endo_2 45

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá ba mô hình 2D – QSAR dự đoán hoạt tính ức chế tốt nhất trên tập Endo_2 46

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá cấu trúc bơm MRP4 bằng đồ thị Ramachandran 48

Bảng 3.12 Kết quả re – dock cấu dạng của dipyridamol với khoang gắn kết 49

Bảng 3.13 Tần suất liên kết của các acid amin với các chất ức chế MRP4 51

Bảng 3.14 Giá trị trung bình RMSDphối tử, giá trị RMSDprotein, RMSF, SASA và Rg 55

Bảng 3.15 Các giá trị năng lượng thành phần của năng lượng liên kết tự do

MM/GMSA từ dữ liệu mô phỏng MD 100 ns của phức hợp phối tử – MRP4 57

Bảng 4.1 Tóm tắt các mô hình 3D – pharmacophore chất ức chế bơm ngược MRP4

công bố trong nghiên cứu trước và nghiên cứu này 60

Bảng 4.3 Thông tin về các chất ức chế bơm ngược MRP4 tiềm năng trên cơ chất nội

sinh và ngoại sinh 64

Bảng 4.4 Các khung cấu trúc phổ biến của các chất ức chế bơm ngược MRP4 trên

cơ chất ngoại sinh 67

Bảng 4.5 Các khung cấu trúc phổ biến của các chất ức chế bơm ngược MRP4 trên

cơ chất nội sinh 68

DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Cấu trúc bơm ngược MRP419 5

Hình 1.2 Mô hình công tắc của các bơm ngược thuộc họ ABC12 7

Hình 1.3 Mô hình tiếp xúc liên tục của các bơm ABC11 7

Hình 1.4 Mô hình trao đổi của bơm ABC12 8

Hình 1.5 Một số chất ức chế bơm ngược MRP4 16

Hình 2.1 Quy trình thực hiện nghiên cứu 23

Hình 2.2 Quy trình xây dựng mô hình 3D – pharmacophore trên các chất ức chế bơm MRP4 25

Hình 2.3 Quy trình xây dựng mô hình 2D-QSAR trên các chất ức chế bơm MRP4 26

Hình 2.4 Quy trình xây dựng mô hình docking 32

Hình 2.5 Quy trình mô phỏng động lực học phân tử 34

Hình 3.1 Truy vấn RHHa_3 các chất ức chế bơm MRP4: (A) Các khoảng cách và góc (B) Các chất ức chế bơm ngược MRP4 dùng để xây dựng mô hình 39

Hình 3.2 Đồ thị tương quan giữa giá trị pIC50 dự đoán và thực nghiệm của hai mô hình 2D – QSAR dự đoán hoạt tính ức chế trên cơ chất ngoại sinh 42

Hình 3.3 Đồ thị tương quan giữa giá trị pIC50 dự đoán và thực nghiệm của mô hình 2D – QSAR dự đoán hoạt tính ức chế trên tập Endo_1 44

Hình 3.4 Đồ thị tương quan giữa giá trị pIC50 dự đoán và thực nghiệm của ba mô hình 2D – QSAR dự đoán hoạt tính ức chế trên tập Endo_2 47

Hình 3.5 Đồ thị Ramachandran của bốn mô hình bơm ngược MRP4_1 (A), MRP4_2 (B), MRP4_3 (C), MRP4_4 (D) 48

Hình 3.6 Cấu dạng dipyridamol trong các khoang gắn kết có bán kính khác nhau 50 Hình 3.7 Biểu đồ thống kê điểm số docking của các chất trên MRP4 51

Hình 3.8 10 chất có điểm số docking tốt nhất tại khoang gắn kết (A) Vị trí gắn kết của 10 chất (B) Tương tác ADMET_2016_4_302_Tozasertib và các acid amin 52

Hình 3.9 Đánh giá mô hình docking các chất ức chế đã biết trên MRP4 (A) Diện tích dưới đường cong, (B) đường cong dự đoán 52

Hình 3.10 Sơ đồ kết quả sàng lọc các chất ức chế trên cơ chất nội sinh và ngoại sinh

từ ngân hàng dữ liệu 53

Hình 3.11 Cấu trúc các chất được tiến hành mô phỏng động lực học phân tử 54 Hình 3.12 Đường biểu diễn giá trị RMSDprotein (A) và giá trị RMSDphối tử (B) củaphức hợp phối tử – MRP4 trong mô phỏng 100 ns 55

Hình 3.13 Đường biểu diễn giá trị RMSF của các acid amin trong mô phỏng 100 ns

56

Hình 3.14 Đường biểu diễn giá trị Rg (A) và giá trị SASA (B) của phức hợp phối tử

- MRP4 trong mô phỏng 100 ns 56

Hình 3.15 Năng lượng liên kết tự do MM/GBSA của phức hợp phối tử - MRP4 được

tính từ dữ liệu 100 ns của quá trình mô phỏng 57

Hình 3.16 Sự tương tác của các phối tử với acid amin tại khoang gắn kết của bơm

MỞ ĐẦU

Bơm ngược MRP4 được mã hoá bởi gen ABCC4 là protein đa kháng thuốc thuộc

họ ABC được tìm thấy lần đầu tiên ở tế bào lympho T của người vào năm 1999 Bơmgồm 1325 acid amin, phân bố ở màng đỉnh của tế bào ống lượn gần, nội mô maomạch não, màng đáy của tế bào tuyến tiền liệt, tế bào gan và đám rối màng mạch.MRP4 vận chuyển nhiều cơ chất nội sinh và ngoại sinh ra ngoài tế bào, đồng thởiđóng vai trò quan trọng trong việc cân bằng nội sinh của một số các phân tử tín hiệu.1Các cơ chất nội sinh của bơm ngược MRP4 bao gồm các phân tử tín hiệu nhưprostaglandin E2, leukotrien B4, thromboxan B2 (TXB2), chất truyền tin thứ cấp nhưcAMP và cGMP, các acid mật, steroid liên hợp và acid folic Ngoài ra, MRP4 cũng

có khả năng vận chuyển một loạt các cơ chất ngoại sinh là thuốc như các thuốc chốngung thư, kháng sinh, thuốc kháng virus và thuốc tim mạch ra khỏi tế bào, gây ra tìnhtrạng đa kháng thuốc thường gặp trong điều trị các bệnh HIV, ung thư và tim mạch.2Một số nghiên cứu đã chứng minh bơm ngược MRP4 biểu hiện quá mức trong các tếbào ung thư tuyến tiền liệt,3 u nguyên bào thần kinh4 và dòng tế bào bệnh bạch cầunguyên bào lympho T5 gây ảnh hưởng đến hiệu quả của thuốc điều trị

Những dữ liệu lâm sàng còn cho biết bơm MRP4 có liên quan đến một số trườnghợp tương tác thuốc trên lâm sàng Nghiên cứu hồi cứu về tương tác giữa NSAID –các thuốc có khả năng ức chế bơm MRP4 với tenofovir trên bệnh nhân nhiễm HIVcho thấy các NSAID ảnh hưởng đến quá trình bài tiết tenofovir gây viêm kẽ thậncấp.6 Các NSAID còn ức chế quá trình vận chuyển methotrexat bởi bơm ngược MRP2

và MRP4 ở thận, gây ảnh hưởng đến sự đào thải của methotrexat ra khỏi cơ thể.7 Vìvậy, bơm MRP4 và các chất ức chế có tiềm năng trở thành một trong những mục tiêunghiên cứu về tương tác thuốc trong tương lai

Tuy nhiên việc nghiên cứu về bơm ngược MRP4 vẫn gặp một số trở ngại,tháng 6 năm 2023, cấu trúc bơm được chụp bằng kính hiển vi nghiệm lạnh mới đượccông bố, nhưng một số acid amin ở vùng linh động của bơm vẫn chưa được làm rõ.Các nghiên cứu về cấu trúc MRP4 trước đó chủ yếu sử dụng các mô hình tương đồnghoặc phương pháp đột biến điểm định hướng nhằm xác định các acid amin quan trọng

liên quan đến quá trình gắn kết và vận chuyển cơ chất.8, 9 Giống như các bơm ngượckhác thuộc họ ABC, MRP4 được giả định có nhiều hơn một vị trí gắn kết với cơ chất

và cơ chế vận chuyển cơ chất vẫn đang được dự đoán thông qua các mô hình in silico.10-12 Việc xây dựng các mô hình pharmacophore, QSAR, docking có thể giúp

bổ sung một số thông tin về cấu trúc của bơm, mối liên hệ định lượng giữa cấu trúc– tác động ức chế, khảo sát khả năng gắn kết của chất ức chế vào mục tiêu tác động

Đồng thời, các mô hình in silico được ứng dụng để sàng lọc các chất ức chế bơm từ

các ngân hàng dữ liệu sẵn có cũng như dự đoán khả năng ức chế và tương tác thuốc

có thể xảy ra trong tương lai

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu xây dựng mô hình in silico có khả năng dự đoán

các chất ức chế bơm ngược MRP4 ở người MRP4 có khả năng đào thải một loạt cácthuốc điều trị ung thư, HIV, tim mạch và gây tương tác thuốc trên lâm sàng

Ức chế MRP4 có thể làm tăng nồng độ thuốc điều trị trong nội bào, từ đó khôi phụchiệu lực và làm giảm tình đa kháng thuốc xảy ra ở một số bệnh nhân.13 Để đạt đượcmục tiêu chung đã đặt ra, cần thực hiện các mục tiêu cụ thể như sau:

1 Xây dựng mô hình 3D – pharmacophore dựa trên phối tử để sàng lọc nhanhcác chất có khả năng ức chế bơm ngược MRP4

2 Xây dựng mô hình QSAR nhằm dự đoán hoạt tính các chất ức chế bơm MRP4

3 Thu thập và đánh giá cấu trúc bơm ngược MRP4, nghiên cứu mô hình dockingphân tử nhằm nghiên cứu tương tác và khả năng gắn kết của các chất ức chếbơm ngược

4 Ứng dụng sàng lọc trên các tập cơ sở dữ liệu DrugBank và ngân hàng dữ liệucác bài thuốc cổ truyền Trung Hoa (TCM) nhằm tìm ra các hợp chất có khảnăng ức chế bơm ngược MRP4

5 Nghiên cứu mô phỏng động lực học phân tử (MD) dự đoán dược động học vàđộc tính (ADMET) của các chất có khả năng ức chế MRP4 tiềm năng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bơm đa kháng thuốc MRP4 được mã hoá bởi gen ABCC4

1.1.1 Họ bơm ngược ABC (ATP-Binding Cassette)

Họ bơm ABC được xem là một trong những họ protein xuyên màng lớn nhất baogồm 49 protein vận chuyển được chia thành 7 phân họ khác nhau, ký hiệu từ A đến

G, dựa trên sự tương đồng về trình tự Họ bơm này được tìm thấy ở tất cả các sinhvật và ở tế bào người.1 Ở vi sinh vật, các bơm thuộc họ này có khả năng đẩy cáckháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn, góp phần gia tăng tình trạng đề kháng kháng sinh

Ở người, họ bơm ABC thường có mặt ở các tế bào ung thư, sử dụng năng lượng ATPđào thải một loạt các thuốc điều trị ung thư ngược với gradient nồng độ ra môi trường

ngoài Một số bơm ngược như P-glycoprotein (ABCB1/P-gp), protein đa kháng thuốc 1 (ABCC1/MRP1) và protein kháng ung thư vú (ABCG2/BCRP) đều cho thấy

các bơm vận chuyển thuộc họ ABC đóng vai trò quan trọng trong việc đề kháng thuốc

ở bệnh nhân ung thư.14

Phân họ ABCC gồm 12 protein vận chuyển, trong đó có 9 protein là các bơmngược đa kháng thuốc Các nghiên cứu về đặc điểm, vị trí phân bố và khả năng saochép cho thấy, 9 protein này là các bơm ngược phụ thuộc ATP vận chuyển các cơchất nội sinh và ngoại sinh đa dạng về cấu trúc ra khỏi tế bào Cấu trúc của họ bơmABCC thường chứa bốn thành phần thiết yếu, gồm hai vùng liên kết nucleotid(Nucleotide binding domain – NBD) và hai vùng xuyên màng (Transmembranedomain – TMD) Phân họ ABCC được chia thành hai nhóm, nhóm protein đa khángthuốc ngắn gồm các bơm MRP4, MRP5, MRP11, MRP3 và nhóm protein đa khángthuốc dài, có thêm vùng xuyên màng bổ sung gồm MRP1, MRP2, MRP3, MRP6.1

1.1.2 Cấu trúc và vị trí phân bố của bơm ngược MRP4

Bơm ngược MRP4 được mã hoá bởi gen ABCC4 nằm trên nhiễm sắc thể 13q32.1.

Bơm gồm 1325 acid amin, là bơm ngược ngắn nhất trong phân họ ABCC MRP4được mô tả lần đầu vào năm 1999 trên tế bào lympho T ở người cho thấy khả nănglàm giảm hiệu quả trị liệu của thuốc kháng virus có cấu trúc tương tự nucleosid.15

MRP4 là bơm ngược duy nhất của phân họ bơm ABCC có vị trí nằm ở màng képcủa tế bào phân cực Bơm ngược này phân bố ở màng đáy của các tế bào biểu môtuyến tiền liệt, tế bào gan và đám rối màng mạch Ở tế bào ống lượn gần và nội mômao mạch não, MRP4 khu trú ở màng đỉnh Ngoài ra, MRP4 còn được tìm thấy trong

tế bào tinh hoàn, buồng trứng, tuyến thượng thận và tế bào máu.15

MRP4 có cấu trúc điển hình của các bơm ngược thuộc phân họ ABCC, gồm haivùng xuyên màng (TMD1 và TMD2), mỗi vùng gồm sáu chuỗi protein xuyên màng(TMH1-12) và hai vùng liên kết nucleotid (NBD1 và NBD2) có chức năng thuỷ phânATP để cung cấp năng lượng cho quá trình vận chuyển cơ chất.16 Chuỗi protein xuyênmàng TMH4, TMH5 của TMD1 và TMH10, TMH11 của TMD2 được hoán đổi vị trívới nhau.17

So với các protein MRP5, MRP8, MRP9 cùng nhóm, đầu N của bơm MRP4 ngắnhơn 87 – 255 acid amin và chứa trình tự acid amin đặc trưng Đầu C của MRP4 lạidài hơn 40 acid amin và chứa trình tự acid amin được bảo tồn.15 Trong nghiên cứugần đây, trình tự acid amin bảo tồn ở đầu C được xác định là đóng vai trò quan trọngảnh hưởng đến chức năng truyền tín hiệu protein kinase A của MRP4 trong bệnh bạchcầu cấp dòng tuỷ.18 Ngoài ra, chuỗi TMH6 của bơm MRP4 chứa hai acid aminphenylalanin ở vị trí 368, 369 đặc trưng và không có ở protein đa kháng thuốc khác.15Chuỗi TMH7 là một chuỗi xoắn dài hơn so với các chuỗi xoắn còn lại nên có mộtphần cấu trúc mở rộng đến vùng ngoại bào.19 Cấu trúc của bơm ngược MRP4 được

mô tả ở Hình 1.1

Ngày 24/05/2023, một số cấu trúc của bơm ngược MRP4 được chụp bằng kínhhiển vi nghiệm lạnh đã được công bố.19-21 Cấu trúc bơm ngược MRP4 (mã ProteinData Bank – PDB 8I4A) được chụp cùng với phối tử đồng kết tinh là dipyridamol,một chất ức chế bơm ngược có IC50 là 2,1 µM và hằng số phân ly Kd là 23 µM.20Trong báo cáo này, phần lớn cấu trúc và khoang gắn kết của bơm MRP4 đã được xácđịnh, ngoại trừ vùng acid amin linh động gồm 8 acid amin đầu N, 27 acid amin đầu

C, 63 acid amin của dây nối hai nửa cấu trúc của protein và 9 acid amin thuộc chuỗiTMH7 ở vùng ngoại bào.20 Khoang gắn kết của bơm được tạo thành bởi các acid

amin kỵ nước Phe 211 của chuỗi TMH3, Phe 324 của chuỗi TMH5, Leu 367, Phe

368, Arg 375 chuỗi TMH6 và Tryp 995, Arg 998 của chuỗi TMH12 Trong đó Arg

375, Arg 998 là hai acid amin thân nước có khả năng cho hai cặp liên kết hydro.20

Hình 1.1 Cấu trúc bơm ngược MRP419

ABCC4 là một gen có tính đa hình cao Năm 2008, trong nghiên cứu của Nada Abla và cộng sự cho thấy một số kiểu đa hình của gen ABCC4 ảnh hưởng đến quá

trình vận chuyển cơ chất, đặc biệt là các thuốc điều trị ung thư và kháng virus bằngcách tác động đến vị trí và biểu hiện của MRP4, từ đó ảnh hưởng đến dược động họccủa các loại thuốc này.22

Để tìm hiểu về cách thức vận chuyển cơ chất ra khỏi tế bào, bằng phương phápđột biến điểm định hướng (Site-Directed Mutagenesis), El-Sheikh và cộng sự đã xácđịnh Phe 368, Phe 369, Glu 374, Arg 375, Glu 378 ở chuỗi TMH6 và Arg 998 ở chuỗiTMH12 ảnh hưởng đến chức năng vận chuyển cơ chất của bơm MRP4 Ngoài ra,thay thế Arg 375 bằng serin không làm ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển cơ chất

cGMP nhưng lại làm giảm đáng kể ái lực của bơm với cơ chất methotrexat, từ đó chothấy Arg 375 tham gia vào quá trình vận chuyển của methotrexat.8

Năm 2012, khi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của Phe 368 ở chuỗi TMH6,Trp 995 và Arg 998 của chuỗi TMH12 lên khả năng vận chuyển cơ chất của bơm,Wittgen và các cộng sự thấy rằng, thay thế Phe 368 ở chuỗi TMH6 bằng tryptophan

đã làm tăng khả năng đào thải estradiol-17β-ᴅ-glucuronid (EG) nhưng làm mất chứcnăng vận chuyển methotrexat Phe 368 và Trp 995 không liên quan đến quá trình hìnhthành liên kết ban đầu với cơ chất, tuy nhiên, hai acid amin này có thể tạo tương tácvới cơ chất trong quá trình sắp xếp lại các chuỗi xoắn để chuyển vị và đồng thời đẩy

cơ chất ra ngoài tế bào.9

1.1.3 Cơ chế vận chuyển của bơm ngược MRP4

Giống như các bơm ngược khác thuộc họ ABC, quá trình vận chuyển các cơ chấtcủa bơm MPR4 dựa trên sự kết hợp của quá trình thuỷ phân ATP tại NBD và chuyển

vị của 2 TMD Bên cạnh đó, một số các nghiên cứu cho rằng, MRP4 có nhiều hơnmột vị trí liên kết cơ chất, điều này làm đa dạng hoá các phản ứng kết hợp giữa cơchất và chất ức chế.10 Cho đến thời điểm hiện tại, có ba mô hình giải thích cho quátrình vận chuyển cơ chất của bơm bao gồm mô hình công tắc,11 mô hình tiếp xúc liêntục11 và mô hình trao đổi.12

Mô hình công tắc (Switch model) được Higgin và Linton đề cập vào năm 2004,

là mô hình đầu tiên được đề xuất nhằm giải thích cách thức vận chuyển cơ chất củacác bơm thuộc họ ABC Mô hình công tắc được trình bày ở Hình 1.2, giả định rằnghai NBD có thể chuyển đổi giữa trạng thái monomer và dimer Ở điều kiện bìnhthường như giai đoạn 1, TMD1 và TMD2 tồn tại ở dạng hướng vào trong nội bào,NBD tồn tại ở trạng thái monomer Giai đoạn 2, bắt đầu có sự xuất hiện của cơ chất

và hình thành liên kết giữa hai phân tử ATP với NBD Giai đoạn 3, NBD sẽ chuyển

từ trạng thái monomer thành dimer đồng thời hướng hai TMD ra môi trường ngoài,đẩy cơ chất ra khỏi tế bào Ở các giai đoạn còn lại, sau quá trình thuỷ phân ATP,NBD ở dạng dimer sẽ được phân tách thành các monomer và chuyển các TMD trở

về trạng thái ở điều kiện bình thường.11

Hình 1.2 Mô hình công tắc của các bơm ngược thuộc họ ABC12Không giống như mô hình công tắc, mô hình tiếp xúc liên tục (Constant contactmodel) ở Hình 1.3 cho rằng quá trình thuỷ phân ATP xảy ra tuần tự ở hai vị trí liênkết với NBD Khi một phân tử ATP mới liên kết với NBD, NBD này sẽ đóng lạichuẩn bị cho quá trình thuỷ phân trong khi NBD còn lại sẽ mở ra để giải phóng ADP

và Pi Quá trình này được lặp lại và là kết quả của sự thuỷ phân mỗi phân tử ATP, tạo

ra sự đóng mở của TMD, vận chuyển cơ chất ra môi trường ngoài.11

Hình 1.3 Mô hình tiếp xúc liên tục của các bơm ABC11

Mô hình trao đổi (Reciprocating model) là mô hình ở dạng phức tạp hơn nhưngphù hợp với các dữ liệu thực nghiệm Mô hình này giả định sự phân ly của các ATPtại NBD xảy ra luân phiên, mỗi cơ chất sẽ gắn vào vị trí có ái lực cao tương ứng vàđược vận chuyển ra môi trường ngoài Quy trình được mô tả ở Hình 1.4

Hình 1.4 Mô hình trao đổi của bơm ABC12

• Giai đoạn 1, kênh 2 mở vị trí gắn kết có ái lực cao với cơ chất trong nội bào

• Giai đoạn 2, cơ chất gắn vào vị trí gắn kết ở kênh 2, cơ chất ở kênh 1 giải phóng

ra ngoại bào

• Giai đoạn 3, ADP được giải phóng khỏi kênh 2, tạo thành cấu trúc có ái lực thấp(T), ngăn cơ chất khác bên trong nội bào gắn vào vị trí này, cơ chất ở kênh 2được vận chuyển về phía màng ngoài tế bào

• Giai đoạn 4, kênh 1 xảy ra quá trình thuỷ phân ATP tạo ADP, Pi và chuẩn bị vịtrí gắn kết có ái lực cao (C)

• Giai đoạn 5, ATP gắn vào kênh 2, mở vị trí gắn kết ở kênh 1 và giải phóng cơchất ở kênh 2 ra ngoại bào

• Giai đoạn 6 đến 8 lặp lại quy trình từ giai đoạn 1 đến 3.12

1.2.Cơ chất và tác động của bơm ngược MRP4 trên lâm sàng

1.2.1 Phương pháp xác định cơ chất và chất ức chế bơm ngược in vitro

Hiện nay, có nhiều phương pháp được dùng để đánh giá các chất là cơ chất haychất ức chế bơm như phương pháp vận chuyển qua màng túi (vesicular transportassay), phương pháp hoạt hoá ATPase (ATPase activity), phương pháp gây độc tếbào (cytotoxicity activity), phương pháp hấp thu (uptake assay).23 Ưu nhược điểmcủa các phương pháp được tóm tắt trong Bảng 1.1.23

Bảng 1.1 So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp xác định cơ chất và chất ức

chế bơm ngược in vitro23

Hoạt hoá ATPase

(ATPase activity)

Chất ứcchế

Không cần phươngpháp phát hiện hợpchất đặc hiệu

- Khả năng dự đoán cơ chấthoặc chất ức chế yếu

- Kết quả phụ thuộc nhiều vàođiều kiện thử nghiệm

- Khó khăn cho các bơmngược do hoạt hoá ATPase

ở môi trường nền caoVận chuyển qua

màng túi

(Vesicular

transport)

Cơ chất vàchất ứcchế

- Xác định cơ chất

- Có thông số độnghọc km, ki, IC50

- Có hiệu năng cao

- Kết quả âm tính giả với các

cơ chất có tính thấm thụđộng cao hoặc liên kếtkhông đặc hiệu với bơmĐộc tế bào

(Cytotoxicity

assay)

Cơ chất vàchất ứcchế

- Không cần phươngpháp phát hiện hợpchất đặc hiệu

- Chỉ có các chất gây độc tếbào mới được xem là cơ chất

- Khả năng gây độc tính khácnhau giữa các tế bào

Phương pháp hấp

thu

(Uptake transport)

Cơ chất vàchất ứcchế

- Xác định cơ chất

- Có thông số độnghọc km và ki

- Có hiệu năng cao

- Các chất có tính thấm thấp

có xu hướng bị bỏ qua

- Kết quả âm tính giả với các

cơ chất có tính thấm thụđộng cao

Bên cạnh đó, cũng có một số dòng tế bào thường dùng trong các thử nghiệm hoạt

tính in vitro thường là dòng tế bào phôi thận người 293 (HEK293), dòng tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda (Sf9) hoặc tế bào chuột hamster V79 Trung Quốc được

tăng biểu hiện bơm MRP4.2

Ngoài ra đột biến một số acid amin của bơm MRP4 khi thử nghiệm hoạt tính in vitro có thể tìm thấy acid amin quan trọng trong quá trình gắn kết cơ chất với bơm

hoặc trong các giai đoạn khác của quá trình vận chuyển cơ chất ra môi trường ngoài.8,9

1.2.2 Cơ chất của bơm ngược MRP4

Trong các bơm ngược thuộc phân họ ABCC, MRP4 nổi bật với khả năng vậnchuyển một loạt các cơ chất nội sinh đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyềntín hiệu tế bào, bao gồm các chất truyền tin cAMP, cGMP, ADP, eicosanoid, urat vàcác hormon steroid Ngoài ra, nó còn có khả năng vận chuyển các cơ chất sinh lýkhác như folat, acid mật, glutathion và các chất đồng vận chuyển với acid mật MRP4cũng tham gia vào quá trình hấp thu, phân bố và bài tiết nhiều loại thuốc như thuốckháng virus, kháng sinh nhóm cephalosporin, thuốc điều trị các bệnh tim mạch và cáctác nhân độc tế bào dùng trong điều trị ung thư.2 Một số hợp chất polyphenol trong

tự nhiên cũng là cơ chất của bơm như resveratrol và quercetin.24 Các cơ chất của bơmMRP4 được thể hiện trong Bảng 1.2.2

Bảng 1.2 Các cơ chất nội và ngoại sinh của bơm ngược MRP42

Cyclic và ADP nucleotid:

Cyclic adenosine monophosphat (cAMP),

Cyclic guanosine monophosphat (cGMP),

ADP

Các chất tương tự purin: Urat

Các eicosanoid:

Leukotrien B4, leukotrien C4, prostaglandin E1,

prostaglandin E2 (PGE2), prostaglandin F2α,

EG, dehydroepiandrosteron sulphat (DHEAS)

Thuốc chống ung thư:

Topotecan, 6-thioguanin nucleotid,

methotrexat, 6-mercaptopurin,troxacitabin, cytarabin, dasatinib,leucovorin

1.2.3 Tác động của bơm ngược MRP4 trên lâm sàng

Sự hiện diện của bơm ngược MRP4 trong tế bào ung thư là một trong những yếu

tố then chốt quyết định hiệu quả trị liệu của các thuốc này

Một nghiên cứu vào năm 2007 được thực hiện trên các dòng tế bào bệnh bạchcầu nguyên bào lympho T ở người đã chứng minh biểu hiện quá mức của bơm ngượcMRP4 làm giảm nồng độ 6 – mercaptopurin (6 – MP) và các chất chuyển hoá trongnội bào Các kết quả cho thấy điều hoà cảm ứng bơm ngược MRP4 và các proteinvận chuyển vào nội bào đóng vai trò quan trọng đề kháng thuốc 6 – MP.5 Năm 2017,

Ho và cộng sự đã nhận thấy sự biểu hiện quá mức của bơm ngược MRP4 trong các

tế bào ung thư tuyến tiền liệt C4 – 2/D kháng docetaxel ở bệnh nhân ung thư tiền liệttuyến kháng hormon testosterol.3

Ngoài ra một số dữ liệu lâm sàng còn cho thấy biểu hiện quá mức của bơm MRP4

và MRP1 có liên quan đến các tiên lượng xấu trong chẩn đoán u nguyên bào thầnkinh.4 MRP4 cũng điều chỉnh nồng độ cAMP trong các tế bào bệnh bạch cầu cấp tínhdòng tuỷ ở người, ức chế MRP4 gây gia tăng cAMP nội bào, làm kết thúc quá trìnhtăng sinh và thúc đẩy biệt hoá các tế bào trên.25

Bơm MRP4 xuất hiện trong màng tiểu cầu dưới dạng các hạt dày đặc và biểu hiệncao ở bệnh nhân phẫu thuật bắc cầu động mạch vành, gây ra tình trạng đề khángaspirin và làm tăng nguy cơ biến chứng tim mạch.26 Ngoài ra một số giả thuyết chothấy TXA2 – một chất chủ vận gây kết tập tiểu cầu có thể được vận chuyển tích cựcbởi bơm MRP4 Vì vậy, ức chế bơm ngược MRP4 vận chuyển các chất gây kết tậptiểu cầu có thể trở thành mục tiêu đầy hứa hẹn trong điều trị các bệnh về tim mạch.20Bên cạnh đó MRP4 còn liên quan đến một số trường hợp tương tác thuốc trênlâm sàng Kết quả nghiên cứu của Clemete vào năm 2009 cho thấy khi ức chế MRP4bằng các NSAID như ibuprofen và indomethacin trên các tế bào lympho T nhiễmHIV – 1 dẫn đến sự gia tăng đáng kể nồng độ các thuốc ức chế men sao chép ngượcnucleotid như zidovudin, abacavir, lamivudin và tenofovir.27 Tuy nhiên đối với bệnhnhân nhiễm HIV-1 điều trị bằng tenofovir trong thời gian dài, sử dụng NSAID khôngchỉ làm thay đổi độ lọc cầu thận mà còn ảnh hưởng đến quá trình bài tiết tenofovir

qua các bơm MRP4 phân bố ở ống lượn gần, làm tăng độc tính trên thận và gây viêm

kẽ thận cấp.6

Trong một nghiên cứu về tác động của các NSAID đối với quá trình đào thảimethotrexat bởi các bơm ngược MRP2 và MRP4 bằng thử nghiệm vận chuyển quamàng túi cho thấy methotrexat được vận chuyển qua bơm với giá trị Km lần lượt là

480 ± 90 µM và 220 ± 70 µM Hoạt tính ức chế của NSAID trên bơm MRP4 vậnchuyển methotrexat cao hơn bơm MRP2 Kết quả này cho thấy ức chế bơm ngượcMRP2 và MRP4 vận chuyển methotrexat ở thận có thể làm giảm tình trạng đề khángmethotrexat trong tương lai.7

1.3 Khám phá thuốc dưới sự hỗ trợ của máy tính

Quá trình khám phá và phát triển thuốc bao gồm một loạt các bước bao gồm lựachọn bệnh lý và xác định mục tiêu của thuốc, tìm kiếm và tối ưu hoá chất khởi nguồn,tiến hành các thử nghiệm tiền lâm sàng và độc tính của thuốc Các công cụ khám pháthuốc dưới sự hỗ trợ của máy tính (Computer aided drug design – CADD) có thểđược sử dụng với mục đích tự động hoá, tiết kiệm thời gian đồng thời làm giảm chiphí và rủi ro trong quá trình nghiên cứu Ngày nay, CADD đã trở thành một công cụthiết yếu trong quá trình phát triển thuốc, nó cung cấp một lượng đáng kể các nguồnthông tin dữ liệu như cấu trúc sinh học của mục tiêu tác động, cơ sở dữ liệu của cácphối tử, các thông số mô tả phân tử liên quan và các công cụ tính toán có thể được sửdụng trong các giai đoạn khác nhau của quá trình phát triển thuốc Nhìn chung,CADD có thể được chia làm hai phương pháp: khám phá thuốc dựa trên cấu trúc mụctiêu và dựa vào phối tử.28

1.3.1 Khám phá thuốc dựa trên cấu trúc mục tiêu

Khám phá thuốc dựa trên cấu trúc mục tiêu phụ thuộc vào các tài liệu nghiên cứutrước đó về cấu trúc protein mục tiêu đã được xác định bằng các phương pháp thựcnghiệm như chụp bằng khối phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), chụp tinh thể nhiễu

xạ tia X, chụp kính hiển vi nghiệm lạnh (CryO – EM) hoặc được xây dựng bằng kỹthuật protein tương đồng (homology) trên máy tính Phương pháp này dự đoán khá

chính xác về vị trí gắn kết tiềm năng giữa phối tử và đích tác động (phương phápdocking) đồng thời có thể ước tính ái lực gắn kết giữa 2 yếu tố này (scoring).

Docking là phương pháp dùng để dự đoán khả năng gắn kết hoặc tương tác giữa

2 cấu tử bằng máy tính, trong đó cấu tử lớn là thụ thể còn cấu tử nhỏ là các phối tửđược xem như một chất tương tác với thụ thể Thông thường, ái lực gắn kết mạnh làyếu tố tiên quyết giúp cho phối tử có hoạt tính trên cấu trúc mục tiêu, các lực tương

tác này có thể là các liên kết ion, liên kết hydro và liên kết van der Waals… Vì vậy,

phương pháp này có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm ra các nhóm cấu trúc ảnhhưởng đến hoạt tính, từ đó định hướng tổng hợp các chất có hoạt tính tốt trên mụctiêu tác động Thêm vào đó, docking còn được ứng dụng trong việc sàng lọc ảo, nhằmtìm kiếm các chất có khả năng liên kết với điểm tác động của các mục tiêu nghiêncứu từ một số ngân hàng dữ liệu lớn sẵn có như DrugBank, ZINC… Một số phầnmềm dùng trong thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc được liệt kê trong Bảng 1.3.28

Bảng 1.3 Một số phần mềm hỗ trợ thường dùng trong docking28

Dự đoán vị trí gắn kết tối ưu FINDSITE, Pocket – Finder, Site – hound,

3DligandSite, CASTp, POOL, Meta Pocket…

Docking AutoDock Vina, Dock Blaster, Schrondinger,

GOLD, Libdock, FlexX, Glide, Fred, ICM, PyRx…Động lực học phân tử GROMACS, Amber, CHARM, ADF, Desmond,

NWChem…

1.3.2 Khám phá thuốc dựa trên phối tử

Khám phá thuốc dựa trên phối tử cần phải có một tập hợp đã biết các phối tử cócấu trúc đa dạng và hoạt tính sinh học trên mục tiêu tác động Tiếp đó các mô hình

có khả năng dự đoán hoạt tính được xây dựng dựa trên tập dữ liệu khai thác từ các

tập phối tử này Các mô hình này có thể là mô hình pharmacophore hoặc mô hình2D-QSAR và 3D-QSAR Sau khi đánh giá mô hình bằng các phương pháp khác nhau,một phối tử mới có thể được áp dụng lên mô hình để dự đoán hoạt tính của nó trên

mục tiêu tác động Một số điểm khác biệt giữa hai phương pháp khám phá thuốc in silico dựa trên cấu trúc mục tiêu và phối tử được trình bày trong Bảng 1.4.28

Bảng 1.4 Một số điểm khác biệt giữa khám phá thuốc dựa trên cấu trúc mục tiêu và

khám phá thuốc dựa trên phối tử28

Yếu tố Khám phá thuốc dựa trên cấu

Xác định được cấu trúc mục tiêu để

có thể tính toán năng lượng tươngtác

Có cấu trúc và hoạt tính phối tử

và hoạt tính sinh học để xây dựng

mô hình dự đoán hoạt tính

Mục

tiêu

Thiết kế hoặc tìm kiếm được cácchất có ái lực tốt với mục tiêu tácđộng

Sàng lọc trên các tập dữ liệu phối

tử có sẵn

Kỹ

thuật

Docking, động lực học phân tử, thiết

kế de novo, mô hình pharmacophore

Mô hình QSAR, sàng lọc hiệunăng cao (HTS) và mô hìnhpharmacophore

Mô hình QSAR là một mô hình toán học rút ra từ mối tương quan giữa các thông

số mô tả phân tử và hoạt tính sinh học của một nhóm chất được xác định bằng cácphương pháp thực nghiệm Mô hình QSAR lần đầu tiên được đề xuất bởi Hansch vàFujita vào năm 1964 cùng với công bố mối tương quan giữa hoạt tính sinh học và cấutrúc tác dụng Mô hình 1D và 2D – QSAR được gọi là phương pháp QSAR cổ điển,trong đó 1D – QSAR thể hiện mối tương quan giữa hoạt tính sinh học và các đặc tínhphân tử như pKa và logP Mô hình 2D – QSAR cho thấy mối tương quan giữa hoạt

tính sinh học bộ thông số mô tả phân tử dựa trên cấu trúc 2D 3D – QSAR tính toán

sự biểu diễn trong không gian ba chiều của các phân tử, chẳng hạn như các cấu dạng

và đồng phân hoá học của các cấu trúc Mục tiêu chính của mô hình 3D – QSAR làcho thấy mối tương quan giữa tác dụng và tính chất trong không gian của phân tử, vìvậy chất lượng cơ sở dữ liệu và sự đa dạng về cấu trúc là những yếu tố quan trọng để

có thể xây dựng mô hình 3D – QSAR có khả năng dự đoán tốt.29

Mô hình pharmacophore dựa trên phối tử được xây dựng dựa vào các cấu dạngtrong không gian của các hợp chất có hoạt tính Các cấu dạng này sẽ được gióng hàng

và tìm ra các yếu tố để tạo thành mô hình pharmacophore Sáu yếu tố thường gặp của

mô hình pharmacophore là nhóm nhận liên kết hydro, nhóm cho liên kết hydro, vòngthơm, nhóm kỵ nước, ion âm và ion dương Kỹ thuật gióng hàng được chia thành haiphương pháp là phương pháp gióng hàng dựa trên điểm và phương pháp gióng hàngdựa trên đặc tính Trong phương pháp gióng hàng dựa trên điểm, các nguyên tử, mảnhhoặc khoảng cách điểm đặc trưng được giảm thiểu và xếp chồng lên nhau bằng cáchgiảm thiểu khoảng cách Một số ví dụ về các phần mềm ứng dụng phương pháp giónghàng dựa trên điểm bao gồm HipHop, Phase và Galahad Ngược lại, các phương phápgióng hàng dựa trên đặc tính (ví dụ: MOE) tạo ra sự sắp xếp dựa trên các bộ mô tảtrường phân tử, chẳng hạn như mật độ electron, thế tĩnh điện, hình dạng và thể tíchphân tử…29

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước các chất ức chế bơm MRP4 1.4.1 Các chất ức chế bơm ngược MRP4

MRP4 được chứng minh là có khả năng vận chuyển nhiều nhóm cơ chất khácnhau, và bơm có nhiều hơn một vị trí gắn kết với cơ chất,10 chính vì vậy việc thiết kếmột chất ức chế bơm ngược chọn lọc có hoạt tính tốt trên MRP4 được xem là mộtchất ức chế lý tưởng Tuy nhiên cho đến thời điểm hiện tại, vẫn chưa có bất kỳ mộtchất nào có thể đạt được mục tiêu lý tưởng này được thử nghiệm trên lâm sàng.MK571 là một chất ức chế bơm ngược không chọn lọc, ngoài tác động ức chếtrên bơm MRP4, MK571 còn có thể ức chế một loạt các bơm ngược khác từ MRP1đến MRP5 và enzym phosphodiesterase Một số các thuốc có mặt trên thị trường như

indomethacin, dipiridamol, sildenafil, benzbromaron, montelukast và pranlukastcũng được xem là những thuốc có khả năng ức chế bơm MRP4, nhưng có hoạt tínhthấp và không chọn lọc.7,30-33

Năm 2014, bằng thử nghiệm sàng lọc hiệu năng cao (High-throughput screening– HTS) trên một thư viện nội bộ các hợp chất thiên nhiên đa dạng, Cheung và cộng

sự đã xác định được ceefourin 1 và ceefourin 2 có khả năng ức chế vận chuyển một

loạt cơ chất của bơm MRP4 in vitro, hai chất này có hoạt tính chọn lọc trên bơm

MRP4 hơn so với các bơm ngược khác thuộc họ ABC Ngoài ra, ceefourin 1 và 2 còn

có hoạt tính ức chế mạnh MRP4 mạnh, độc tính thấp trên tế bào và ổn định trong môitrường có nồng độ acid và microsom cao.34 Cùng với phương pháp HTS, sàng lọc ảo

là một trong những phương pháp hiệu quả áp dụng trên cơ sở dữ liệu lớn để tìm kiếmcác chất ức chế MRP4, từ đó thu thập thông tin về mối tương quan về cấu trúc – tácdụng ức chế

Hình 1.5 Một số chất ức chế bơm ngược MRP4

Ngoài ra khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính in vitro, tuỳ thuộc vào cơ chất, một

chất có thể ức chế sự vận chuyển của cơ chất này nhưng chưa chắc đã ức chế được

sự vận chuyển của cơ chất khác Giá trị IC50 của các chất ức chế trên cơ chất khácnhau được trình bày trong Bảng 1.5.

Bảng 1.5 So sánh IC50 trên các cơ chất và các tế bào khác nhau

Hợp chất Phương

µM

Tài liệu tham khảo

MK-571 Vận chuyển

qua màng túi

EG 30 µM, 60nCi HEK293 2,1

Csandl, 201630PGE2 5µM HEK293 7,0

PMEA 1 µM HEK293 10 Reid, 200333DHEAS 2 µM HEK293 2,04 Hardwick, 201635

1.4.2 Các nghiên cứu in silico tìm kiếm các chất ức chế bơm ngược MRP4

Những năm gần đây, các công cụ khám phá thuốc dưới sự hỗ trợ của máy tính đãđược áp dụng nhằm tìm kiếm các chất ức chế bơm MRP4 Tuy nhiên ở Việt Nam,vẫn chưa có nghiên cứu nào được thực hiện trên bơm MRP4 Trên thế giới đã có một

số nghiên cứu in silico được thực hiện trên cấu trúc và các chất ức chế MRP4, trong

đó chủ yếu là các mô hình 3D-pharmacophore và docking

Bằng phương pháp sàng lọc ảo dựa trên phối tử, năm 2013, Fukuda và cộng sự

đã tiến hành xây dựng mô hình 3D-pharmacophore trên 10 chất ức chế MRP4 có giátrị hoạt tính sinh học là IC50 bằng phần mềm Discovery Studio và thuật toánCAESAR, mô hình này tiếp tục được áp dụng để sàng lọc qua tập cơ sở dữ liệu SCUT

để tìm ra các chất tiềm năng nhất.37 Năm 2015, bằng phần mềm LigandScout và thuậttoán mạng Bayesian, Matthew và cộng sự đã xây dựng được 4 mô hình 3D-pharmacophore dựa trên tập dữ liệu gồm 86 chất có khả năng ức chế trên 21% cơ chất

DHEAS của bơm MRP4 Kết quả mô hình được ứng dụng để sàng lọc 1510 thuốcđược FDA chấp thuận trên thư viện DrugBank.38

So với phương pháp sàng lọc dựa trên phối tử, các mô hình in silico dựa trên cấu

trúc MRP4 nhận được nhiều sự quan tâm hơn Tuy nhiên do sự hạn chế về cấu trúctinh thể nhiễu xạ tia X của bơm, các cấu trúc MRP4 chủ yếu được xây dựng bằng các

mô hình homology dựa trên khuôn mẫu là cấu trúc tinh thể bơm ngược Sav1866

hướng ngoại bào của vi khuẩn Staphylococcus aureus,39 cấu trúc bơm

P – glycoprotein từ Caenorhabditis elegans và vùng NDB1 của MRP1 từ người,40,41

và mô hình tương đồng xây dựng bằng server I – TASSER với trình tự acid aminMRP4 tải từ trang Uniprot.42,43 Khoang gắn kết được xác định dựa vào vị trí các acidamin quan trọng ảnh hưởng đến chức năng vận chuyển của bơm42 hoặc bằng phươngpháp docking mù.41 Năm 2018, Chen và cộng sự đã áp dụng phương pháp dockingphân tử trên mô hình homology của MRP4 nhằm tìm kiếm các chất ức chế bơm trên

cơ chất 6-MP từ thư viện SPECS và thực hiện các thử nghiệm in vitro để xác định

hoạt tính của các chất tiềm năng.40 Năm 2021, nghiên cứu về tương tác của các cơchất nội sinh, ngoại sinh và các chất ức chế trên dòng tế bào MRP4 hoang dại và cácbiến thể bằng phương pháp docking và động lực học phân tử được thực hiện bởiBeccera và cộng sự Mục đích của nghiên cứu này nhằm xác định sự khác biệt trong

tương tác giữa các phân tử và ái lực của đa hình đơn nucleotid có trong gen ABCC4,

các đa hình đơn nucleotic không đồng nghĩa này có thể thúc đẩy sự thay đổi trongcấu trúc và chức năng của MRP4.42 Tóm tắt các mô hình docking chất ức chế bơmngược MRP4 của nghiên cứu trước và nghiên cứu này được trình bày trong Bảng 1.6.Năm 2023, cấu trúc bơm ngược MRP4 có độ phân giải cao đã được xác định.19,20Cấu trúc MRP4 được chụp ở những trạng thái khác nhau như trạng thái đơn lẻ(apo-protein), trạng thái hướng vào trong và mở ra ngoài khi có sự liên kết với ATP.Ngoài ra, cấu trúc phức hợp MRP4 – cơ chất và MRP4 – chất ức chế cũng được công

bố góp phần làm sáng tỏ cơ chế ức chế bơm ngược là do sự cạnh tranh của chất ứcchế và cơ chất tại khoang gắn kết.19

Bảng 1.6 Tóm tắt các mô hình docking chất ức chế bơm ngược MRP4 công bố

trong nghiên cứu trước đó

Nghiên cứu Các acid amin tại vị

352 -356, 358-360, 362 -366, 716, 719-723, 726-727, 730, 780 -788, 842-849, 948 -960, 980- 997

MRP4 tương đồng, khuôn mẫu

là cấu trúc tinh thể Sav1866 hướng ngoại bào

Phần mềm ICM 3.4

Glu 103, Ser 328, Gly

359, Arg 362, Val 726, Leu 987

Chen và

cộng sự,

2018 40

103, 105-106, 110-109, 213-214, 221, 328, 359, 361-362, 726, 875-876, 963-967, 987

MRP4 tương đồng từ server

I – TASSER, khuôn mẫu P – glycoprotein và MRP1

Autodock Vina, toạ độ

26 x 26 x 26

Å 3

Gln 109, Arg 362, Gln

221, Phe 875, Ile 876, Ile 962, Phe 965, Ser 967

Autodock Vina toạ độ

29 x 29 x 29

Å 3

Khoang 1: Arg 998 Khoang 2: 207, 951,

881, 886, 894, 896, 897

Khoang 2: Arg 951, Arg 887, Arg 897 Khoang 3: 262, 265,

272, 303, 314, 317

Khoang 3: Arg 272, Arg 303, Arg 317 Khoang 4: 106, 221,

MRP4 tương đồng từ server

I – TASSER, khuôn mẫu MRP1 (5UJ9)

Autodock 4.3.6 toạ độ 22,5 x 22,5 x 22,5 Å 3

Cơ chất nội sinh: Lys

106, Gln 251, Lys 329, Glu 374, Phe 698, Lys

702, Thr 839, Glu 1002

Cơ chất ngoại sinh: Arg

312, Lys 329, Phe 698, Lys 702, Arg 946, Thr

994, Arg 998 Chất ức chế: Gln 251, Leu 247, Arg 362, Thr

366, Pro 867, Arg 951, Phe 993

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết kế nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu xây dựng mô hình in silico có khả năng dự đoán

các chất ức chế bơm ngược MRP4 ở người Sàng lọc trên ngân hàng DrugBank vàTCM nhằm tìm ra các hợp chất ức chế bơm ngược MRP4 tiềm năng, giúp làm tăngnồng độ thuốc điều trị ung thư trong nội bào, từ đó làm giảm tình đa kháng thuốc ởmột số bệnh nhân ung thư

Dựa vào tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước, có rất ít mô hìnhpharmacophore dựa trên phối tử thực hiện trên bơm MRP4 và chưa có nghiên cứunào về mô hình 2D-QSAR trên các chất ức chế được công bố Với các chất ức chế cógiá trị hoạt tính là IC50 trên các cơ chất khác nhau, nghiên cứu tiến hành xây dựng môhình pharmacophore và mô hình 2D-QSAR giúp sàng lọc nhanh và dự đoán hoạt tínhcủa các chất ức chế tiềm năng

Trước đây, mô hình docking phân tử với cấu trúc MRP4 được xây dựng chủ yếu

là các mô hình tương đồng bởi các server khác nhau Tuy nhiên gần đây, cấu trúcbơm ngược ABCC4 được chụp bằng phương pháp CryO – EM (8I4A) có độ phângiải cao là 3,40 Å đã được công bố Vì vậy trong nghiên cứu này, cấu trúc mới 8I4Acũng được thu thập và đánh giá để xây dựng mô hình docking Cuối cùng, mô phỏng

MD và dự đoán ADMET được tiến hành trên các chất ức chế bơm ngược MRP4 tiềmnăng nhất

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Cơ sở dữ liệu xây dựng mô hình sàng lọc dựa trên phối tử

Tổng cộng 206 chất có hoặc không có hoạt tính ức chế bơm ngược MRP4 thuộccác nhóm cấu trúc khác nhau được thu thập từ 18 bài báo khoa học.7,24,30,31,33-36,44-53Trong đó, 142 chất ức chế có giá trị hoạt tính sinh học là IC50 (µM) (Bảng Phụ lục 1)được sử dụng để xây dựng các mô hình sàng lọc ảo dựa trên phối tử 64 chất không

có hoạt tính ức chế được trình bày trong Bảng Phụ lục 2 Khả năng ức chế bơm ngượcMRP4 của các chất được xác định bằng phương pháp vận chuyển qua màng túi Cơ

sỡ dữ liệu được kiểm tra và điều chỉnh để sử dụng xây dựng mô hình sàng lọc ảo

• Cơ sở dữ liệu xây dựng mô hình 3D – pharmacophore:

˗ Tập xây dựng mô hình pharmacophore được lựa chọn là các chất có hoạt tính

ức chế mạnh (IC50 ≤ 5 µM) và đại diện cho các nhóm cấu trúc khác nhau

˗ Tập kiểm tra mô hình pharmacophore được chia thành 3 nhóm, nhóm có hoạttính mạnh gồm 30 chất có IC50 ≤ 5 µM, nhóm 112 chất có hoạt tính yếu(IC50 > 5 µM) và nhóm 64 chất không có hoạt tính

• Cơ sở dữ liệu xây dựng mô hình QSAR:

˗ Tập ức chế cơ chất ngoại sinh: 32 chất ức chế sự vận chuyển cơ chất là cácchất ngoại sinh là thuốc và chất phát quang như 6-thioguanin,ρ-methoxyethylamphetamin, methotrexat và D-luciferin thu thập từ 5 bàibáo.7,33,34,45,52

˗ Tập ức chế cơ chất nội sinh là hormon và các chất truyền tín hiệu

o Tập Endo_1 gồm 89 chất ức chế sự vận chuyển cơ chất EG thu thập từ 2bài báo.36,49

o Tập Endo_2 gồm 38 chất ức chế sự vận chuyển cơ chất nội sinh khác ngoạitrừ EG như DHEAS, cAMP, urat, acid uric, PGE2 và F-S1P thu thập từ 8bài báo.24,30-32,35,50,51,53

2.2.2 Cấu trúc bơm ngược MRP4

Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2021, nghiên cứu tiến hành thu thập cấu trúcMRP4 được xây dựng từ các nguồn dữ liệu khác nhau như I – TASSER và Alphafold.Cấu trúc CryO – EM của MRP4 (ngày đăng tải 24/05/2023) (PDB: 8I4A) vẫn khó cóthể sử dụng do thiếu 107 acid amin ở vùng linh động và đặc trưng của bơm gồm 8acid amin (Met 1 đến Val 8) đầu N, 63 acid amin (Asp 634 đến Val 696) của dây liênkết, 9 acid amin (Val 747 đến Val 755) vùng ngoại bào và 27 acid amin (His 1299đến Leu 1325) đầu C Nghiên cứu tiến hành đánh giá để lựa chọn cấu trúc phù hợpnhất để tiến hành docking Đối với các cấu trúc tương đồng được xây dựng bằngserver Alphafold và I – TASSER, trình tự acid amin của bơm ngược MRP4 được tải

từ trang web https://www.uniprot.org/, mã Uniprot O15439 (Phụ lục 1) Các cấu trúcMRP4 thu thập được bao gồm:

• MRP4_1: Cấu trúc MRP4 được chụp CryO – EM (PDB: 8I4A) từ PDB(https://www.rcsb.org/), đăng tải ngày 24/05/2023.20

• MRP4_2: Cấu trúc MRP4 tương đồng xây dựng bằng server AlphaFold(https://alphafold.ebi.ac.uk/)

• MRP4_3: Cấu trúc MRP4 tương đồng xây dựng bằng server tự động I-TASSER(https://zhanggroup.org/I-TASSER/) không sử dụng khuôn mẫu

• MRP4_4: Cấu trúc MRP4 xây dựng bằng server I-TASSER từ khuôn 8I4A

2.2.3 Ngân hàng dữ liệu sử dụng để sàng lọc

Ngân hàng dữ liệu DrugBank (https://go.DrugBank.com/, ngày truy cập10/09/2023) gồm 11.586 chất Ngân hàng các hợp chất tự nhiên từ các bài thuốc cổtruyền Trung Hoa (TCM) gồm 57.423 chất, trong đó có 18.435 chất thoả luật nămcủa Lipinski.54

2.2.4 Các phần mềm máy tính sử dụng trong nghiên cứu

Phần mềm sử dụng trong đề tài được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các phần mềm sử dụng trong nghiên cứu

ChemDraw

Group

pharmacophore, QSAR, tính toánthông số mô tả phân tử, bổ sungacid amin, phân tích tương tác từkết quả docking và MD

RapidMiner

Studio 9.10 Mở RapidMiner GmbH Lọc thông số mô tả phân tử

Phần mềm Bản quyền Nhà sản xuất Chức năng

bị phối tử

Open Babel

O'Boyle N., BanckM., James C., MorleyC., VandermeerschT., Hutchison R G

Chuyển định dạng tệp

GROMACS

tương tác protein – phối tửMicrosoft

Tính toán miền ứng dụng, thống

kê kết quả

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài tiến hành tại phòng máy Bộ môn Hoá Dược – Khoa Dược – Đại học YDược Thành phố Hồ Chí Minh (41 Đinh Tiên Hoàng, quận 1, thành phố Hồ ChíMinh) và máy tính cá nhân từ tháng 10/2021 đến 10/2023

2.4 Quy trình nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu được mô tả trong Hình 2.1

Hình 2.1 Quy trình thực hiện nghiên cứu

Quy trình cụ thể gồm các bước như sau:

(i) Tiến hành thu thập, xử lý cơ sở dữ liệu gồm các chất ức chế và cấu trúc của

bơm ngược MRP4;

(ii) Xây dựng, đánh giá mô hình sàng lọc ảo dựa trên phối tử (mô hình

pharmacophore và 2D – QSAR) và mô hình sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc(mô hình docking);

(iii) Tiến hành sàng lọc ảo ngân hàng dữ liệu DrugBank và TCM qua các mô

hình tốt nhất đã được xây dựng để tìm ra các các chất ức chế tiềm năngnhất;

(iv) Mô phỏng động lực học phân tử, thống kê tương tác và tính toán năng

lượng liên kết tự do của các chất tiềm năng;

(v) Dự đoán ADMET cho các chất tiềm năng nhất

2.5 Phương pháp nghiên cứu, công cụ đo lường và thu thập số liệu

2.5.1 Chuẩn bị cơ sở dữ liệu

Cấu trúc các chất ức chế được vẽ bằng phần mềm MOE 2022.0255 lưu dưới dạng

Giá trị hoạt tính IC50 (M) được chuyển thành giá trị pIC50 = -logIC50

Tập decoy được tạo bằng công cụ DUD.E decoy (https://dude.docking.org/) Tậpdecoy được tiến hành tối thiểu hoá năng lượng theo quy trình giống như trên

2.5.2 Xây dựng mô hình pharmacophore

Mô hình pharmacophore được xây dựng dựa trên các chất ức chế có hoạt tính đãbiết bằng phần mềm MOE 2022.02.55 Quy trình xây dựng mô hình pharmacophoređược trình bày trong Hình 2.2

Hình 2.2 Quy trình xây dựng mô hình 3D – pharmacophore trên các chất ức chế

bơm MRP4Các bước xây dựng mô hình pharmacophore được tiến hành như sau:

Chuẩn bị cơ sở dữ liệu: Các chất ức chế được tạo cấu dạng bằng công cụ

Conformations Import với các thông số được điều chỉnh như sau: Giới hạn cấu hình sàng lọc (Refinement Conformation Limit) là 10.000, Giới hạn lỗi tìm kiếm ngẫu nhiên (Stochastic Search Failure Limit) là 1.000, Giới hạn lặp lại tối thiểu hoá năng lượng (Energy Minimization Iteration Limit) là 1.000, Giới hạn độ dốc tối thiểu hoá năng lượng (Energy Minimization Gradient Limit) là 0,0001 Các thông số còn lại để

mặc định

Tạo truy vấn pharmacophore: Truy vấn (queries) được tạo bằng công cụ

Pharmacophore Elucidator Các thông số của các truy vấn gồm: độ bao phủ (cover);

độ chồng phủ (overlap) và độ đúng (accuracy)

Các truy vấn tạo thành sẽ được đánh giá trên tập có hoạt tính mạnh, tập có hoạt

tính yếu và tập không có hoạt tính bằng công cụ Pharmacophore Search bởi các giá

trị dựa trên bốn đại lượng là số chất dương tính thật (true positives – TP), số chấtdương tính giả (false positives – FP), số chất âm tính thật (true negatives –TN), sốchất âm tính giả (false negatives – FN)56:

• Độ đúng trên các chất có hoạt tính (độ nhạy)56: là tỷ lệ các kết quả dự đoán dươngtính thật trong tất cả các chất có hoạt tính

Độ đúng trên các chất có hoạt tính = TP

TP + FN

• Độ chính xác trên các chất có hoạt tính56: là tỷ lệ các kết quả dự đoán dương tínhthật trong tất cả các chất dương tính do công cụ xác định:

Điểm số GH của các chất có hoạt tính: = TP×[(TP+FN)+(TP+FP)]

2×(TP+FN)×(TP+FP)

Điểm số GH của các chất không có hoạt tính = TN×[(FP+TN)+(TN+FN)]

2×(FP+TN)×(TN+FN)

2.5.3 Quy trình xây dựng mô hình 2D – QSAR

Mô hình 2D-QSAR được xây dựng từ các chất có giá trị IC50 bằng phương phápbình phương tối thiểu từng phần (Partial Least Square – PLS) Quy trình tổng quátxây dựng mô hình QSAR được mô tả ở Hình 2.3

Hình 2.3 Quy trình xây dựng mô hình 2D-QSAR trên các chất ức chế bơm MRP4