thiết kế sàng lọc và tổng hợp các dẫn xuất chalcon có tác động kháng enzym α amylase và α glucosidase đã chỉnh sửa theo kết luận của hội đồng nghiệm thu ngày 14

chất có khả năng ức chế amylase và α-glucosidaseα-Bảng cơ sở dữliệu rõ ràng, độtin cậy cao,đầy đủ số liệuBảng cơ sở dữliệu rõ ràng, độtin cậy cao,đầy đủ số liệu;trong đó có 12chất ức chế

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng của nghiên cứu in silico

- Cấu trúc tinh thể của α-amylase (mã PDB: 4GQR) với phối tử đồng kết tinh myricetin được tải về dưới dạng *.pdb từ Protein Data Bank.[69]

- Cấu trúc tinh thể của α-glucosidase (mã PDB: 2QMJ) với phối tử đồng kết tinh acarbose được tải về dưới dạng *.pdb từ Protein Data Bank.[70]

- Tập dữ liệu các dẫn chất flavonoid ức chế -amylase và -glucosidase được thu thập từ các bài báo khoa học để sử dụng cho nghiên cứu SAR và QSAR.

- Cơ sở dữ liệu bao gồm 378 dẫn chất flavonoid tổng hợp được thu thập từ các bài nghiên cứu khoa học, khóa luận tốt nghiệp, luận văn cao học, luận án tiến sĩ trong thư viện nội bộ của Bộ môn Hóa Dược – Khoa Dược – Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.

2.1.2 Đối tượng của thử nghiệm ức chế hoạt tính α-amylase và α-glucosidase in vitro

Dựa trên kết quả gắn kết phân tử và phân tích mối liên quan cấu trúc–tác dụng(SAR và QSAR) từ các chất có hoạt tính ức chế enzym, nghiên cứu sẽ tiến hành chọn ra các dẫn chất tiềm năng trên α-amylase và α-glucosidase để tiến hành khảo sát khả năng ức chế enzym in vitro.

Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Phần mềm sử dụng trong mô hình sàng lọc ảo

Bảng 2.1 Các phần mềm sử dụng trong mô hình sàng lọc ảo STT Chương trình sử dụng Ứng dụng

1 ChemDraw 19.0[71] Vẽ công thức hóa học 2D của các hợp chất 2

Tối thiểu hóa năng lượng

3 AutoDock Tools–1.5.6rc1[73] Chuẩn bị protein và ligand cho mô hình gắn kết phân tử

4 Open Babel GUI[74] Chuẩn bị ligand cho quá trình docking phân tử

5 AutoDock Vina version 1.2.3[75] Gắn kết phân tử (docking)

Profiler (PLIP)[76] Phân tích tương tác

7 PyMOL 2.4.0[77] Xuất và tạo hình ảnh động cho các cấu trúc 3D

8 GROMACS 2020.2[65] Mô phỏng động lực học phân tử và đánh giá kết quả

Xác định tần suất liên kết hydro và số liên kết hydro tạo thành theo thời gian giữa protein và ligand

10 SONNIA Xây dựng mô hình QSAR sử dụng mạng nơ-ron nhân tạo

2.2.2 Nguyên vật liệu, trang thiết bị cho thử nghiệm in vitro

2.2.2.1 Hóa chất và dung môi sử dụng trong tổng hợp

Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng trong tổng hợp

STT Tên hóa chất Hàm lượng Nhà cung cấp

14 Acid hydrocloric đậm đặc 36-38% Trung Quốc

2.2.2.2 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng trong kiểm tra độ tinh khiết và tinh chế

Bảng 2.3 Hóa chất trong kiểm tra độ tinh khiết và tinh chế

Tên hóa chất Xuất xứ Hàm lượng

Aceton Trung Quốc >99,5% n–Hexan Trung Quốc >97,0%

Bản mỏng silicagel GF254 của Merck, silicagel để khai triển sắc ký cột, ống mao quản để kiểm tra nhiệt độ nóng chảy.

2.2.2.3 Nguyên vật liệu, thiết bị sử dụng trong thử nghiệm hoạt tính

Bảng 2.4 Dung môi và hóa chất trong thử hoạt sinh học ức chế α-glucosidase

STT Dung môi, hóa chất Nhà cung cấp Xuất xứ

1 α-glucosidase từ nấm Saccharomyces cerevisiea G5003–100UN Sigma−Aldrich Mỹ

2 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid Sigma−Aldrich Mỹ

5 K2HPO4 3H2O Scharlau Tây Ban Nha

7 Nước khử khoáng Bộ môn Hóa phân tích - Kiểm nghiệm

Bảng 2.5 Trang thiết bị và dụng cụ sử dụng trong thử hoạt tính sinh học

STT Tên thiết bị Thương hiệu Xuất xứ

1 Cân phân tích Kern Abs 220–4 Sartorius Đức

3 Máy đo UV Ao Absorbance

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu tổng quan hệ thống

Tổng cộng tìm được 207 bài báo từ 4 cơ sở dữ liệu PubMed, Google Scholar, VHL (Virtual Health Library) và GHL (Global Health Library), thông qua quá trình chọn lọc, có 29 bài báo được dùng để trích xuất dữ liệu Hình 1 tóm tắt quá trình chọn lọc các bài báo Từ khóa tìm kiếm là “(glucosidase OR maltase OR sucrase OR amylase) AND (chalcone OR chalcones OR diphenylprop OR chalkone OR benzylideneacetophenone OR (phenyl styryl ketone))”

Hình 2.1 Lưu đồ quá trình chọn lọc các bài báo

Tìm kiếm trên 4 cơ sở dữ liệu (n = 84): PubMed (n = 4): WHO GHL (n = 89): VHL (n = 30): Google Scholar

Kết quả tìm kiếm (n = 207) Đọc tiêu đề và tóm tắt (n = 162)

Bài báo được loại (n = 79) Đọc toàn văn (n = 83)

Nghiên cứu đưa vào bài tổng quan

Không có toàn văn (n = 11) Trùng lặp (n = 1) Không báo cáo hoạt tính của dẫn xuất chalcon (n = 42) by EndNote X8.1

2.3.2 Mô hình gắn kết phân tử

Quá trình xây dựng mô hình gắn kết phân tử và sàng lọc ảo với sự trợ giúp của 2 phần mềm là MOE 2015.10 và AutoDock Vina 1.2.3 được thực hiện theo trình tự 5 bước như Hình 2.13 dưới đây.

Hình 2.2 Quy trình sàng lọc chất ức chế α-amylase và α-glucosidase bằng mô hình gắn kết phân tử

2.3.2.1 Chuẩn bị cấu trúc protein

Cấu trúc tinh thể của α-amylase (mã PDB: 4GQR) với phối tử đồng kết tinh myricetin và cấu trúc tinh thể của α-glucosidase (mã PDB: 2QMJ) với phối tử đồng kết tinh acarbose, được tải về từ ngân hàng Protein Data Bank dưới dạng *.pdb Sử dụng phần mềm AutoDock Tools 1.5.6rcl, protein được kiểm tra tính toàn vẹn, đảm bảo cấu trúc α-amylase đủ 496 acid amin và cấu trúc α-glucosidase đủ 870 acid amin Sau đó protein được loại bỏ nước, các dung môi và các chất kết tinh khác không nằm trong khoang gắn kết Riêng đối với cấu trúc tinh thể của enzym α- amylase giữ lại 2 ion quan trọng là Cl – và Ca 2+ Cuối cùng, chuỗi protein được thêm các hydro phân cực, thêm điện tích mô hình Kollman – Gasteiger và được lưu dưới dạng *.pdbqt.

2.3.2.2 Chuẩn bị cơ sở dữ liệu các chất để sàng lọc qua mô hình gắn kết phân tử

Phần mềm ChemDraw được sử dụng để vẽ cấu trúc 2D của các chất Các cấu trúc này được tập hợp lại thành một tệp trong phần mềm MOE 2015.10 và lưu dưới dạng *.sdf để chuẩn bị cho quá trình 3D hóa và tối thiểu hóa năng lượng Quá trình này giúp cho các chất được chuyển về cấu dạng bền nhất với năng lượng tự do thấp nhất Trong phần mềm MOE 2015.10, sử dụng công cụ Energy Minimize để tối thiểu hóa năng lượng với giá trị thông số Gradient được chọn là 0,0001 kcal/mol. Sau đó, tất cả các chất sẽ được lưu lại dưới dạng *.pdb Sử dụng phần mềm Open Babel để tạo tệp ligand dạng *.pdbqt cho các flavonoid, chuẩn bị cho quá trình sàng lọc ảo.

2.3.2.3 Xây dựng và đánh giá mô hình docking bằng phương pháp tái gắn kết Chuẩn bị ligand đồng kết tinh

Phần mềm AutoDock Tools 1.5.6rcl được sử dụng để tách phối tử đồng kết tinh myricetin ra khỏi cấu trúc tinh thể của enzym α-amylase (PDB ID: 4GQR) và acarbose ra khỏi cấu trúc tinh thể của enzym α-glucosidase (PDB ID: 2QMJ) Sau đó, thêm đầy đủ các hydro và được lưu dưới dạng *.pdbqt chuẩn bị cho quá trình tái gắn kết phân tử (redocking).

Xác định các thông số khoang gắn kết

Cấu trúc protein và phối tử đồng kết tinh đã lưu dưới dạng *.pdbqt được mở trong phần mềm AutoDock Tools 1.5.6rc1 Xác định khoang gắn kết bằng Grid box. Đối với cấu trúc α-amylase, dựa trên vị trí của phối tử đồng kết tinh myricetin, các thông số được thiết lập sao cho kích thước Grid box bao phủ hoàn toàn myricetin và các acid amin quan trọng quyết định hoạt tính của α-amylase (Asp197, Glu233, Asp300, Trp59 và Tyr62) Đối với cấu trúc α-glucosidase, dựa trên vị trí của phối tử đồng kết tinh acarbose, các thông số được thiết lập sao cho kích thước hộp Grid box bao phủ hoàn toàn acarbose và các acid amin quan trọng quyết định hoạt tính của enzym (Asp327, Asp542, His600, Arg526, Asp443 và Asp203). Đánh giá mô hình bằng phương pháp tái gắn kết (redocking)

Quy trình tái gắn kết bằng phần mềm AutoDock Vina 1.2.3 được tiến hành với:

− Cơ sở dữ liệu là các file protein và ligand đồng kết tinh đã chuẩn bị dưới dạng

*.pdbqt và file conf.txt chứa các thông số hộp grid box đã được xác định.

− Phần mềm Command Prompt được dùng để khởi động AutoDock Vina để tiến hành docking.

− Phân tích tương tác và đánh giá kết quả tái gắn kết bằng công cụ PLIP.

Phối tử đồng kết tinh myricetin được gắn kết lại vào khoang gắn kết của enzym α- amylase; acarbose được gắn kết lại vào khoang gắn kết của enzym α-glucosidase với các thông số đã được xác định trong file conf.txt.

Kết quả redocking sẽ bao gồm: điểm số docking (kcal/mol), các liên kết tương tác giữa phối tử với enzym và giá trị RMSD của từng cấu dạng phối tử RMSD là sự đo lường khoảng cách trung bình giữa các nguyên tử thuộc mạch chính của protein khi được xếp chồng lên nhau một cách tối ưu RMSD cũng có thể được áp dụng cho các phân tử nhỏ để đánh giá chất lượng của kết quả re-docking.[79]

Kết quả redocking được cho là tin cậy khi các liên kết tương tác giữa phối tử đồng kết tinh với enzym trước và sau khi redocking không có khác biệt đáng kể[80] và giá trị RMSD của cấu dạng sau khi tái gắn kết so với ban đầu tốt nhất khi nhỏ hơn hoặc bằng 2 Å.[81] Đánh giá mô hình docking bằng diện tích dưới đường cong ROC

ROC là đường cong thể hiện khả năng phân biệt của hệ thống Đường biểu diễn càng lệch về phía trên, bên trái thì sự phân biệt càng rõ.[82] Độ chính xác(accuracy) được đo lường bằng diện tích dưới đường cong ROC kí hiệu là AUC,là thước đo hiệu quả của một mô hình Nếu diện tích bằng 1 là mô hình xây dựng rất tốt, nếu bằng 0,5 thì mô hình không có giá trị.[83] Bên cạnh đó, để đánh giá mô hình người ta kết hợp thêm giá trị TG Giá trị này thống kê lại sự phân biệt của các tập hợp chất có hoạt tính và không hoạt tính, có thể ảnh hưởng đến sự thay đổi của mô hình xây dựng.[84]

Giá trị TG > 0,25 kết hợp với ROC/AUC > 0,5 mô hình có khả năng phân biệt hai tập chất hoạt tính và không hoạt tính, có thể được ứng dụng trong sàng lọc ảo. Giá trị TG cao > 0,4 kết hợp với ROC/AUC > 0,5 mô hình có khả năng phân biệt hai tập chất hoạt tính và không hoạt tính tốt Mô hình sàng lọc hoạt động tốt, có khả năng tái lặp cao trong các điều kiện tương tự.[85]

Hai tập chất hoạt tính và không hoạt tính được dock vào khoang gắn kết, kết quả docking được phân tích và đánh giá thông qua trang web http://stats.drugdesign.fr.[86]

2.3.2.4 Sàng lọc ảo qua mô hình gắn kết phân tử

Các phối tử cần nghiên cứu đã được chuẩn bị được dock vào khoang gắn kết của enzym α-amylase và α-glucosidase với các thông số đã xác định trong file conf.txt.

2.3.2.5 Phân tích kết quả Đánh giá kết quả docking sẽ bao gồm:

– Đánh giá điểm số docking (kcal/mol) của chất cần nghiên cứu so với phối tử đồng kết tinh Điểm số docking càng âm thể hiện khả năng gắn kết của phối tử vào khoang gắn kết của enzym càng tốt.

– Các liên kết tạo thành giữa phối tử và protein bao gồm liên kết ion, liên kết hydro, liên kết Van der Waals, liên kết π–π,… được thể hiện qua điểm số docking (kJ/ Kcal) Kết quả docking cho biết ái lực gắn kết của phối tử với protein và tương tác giữa acid amin xung quanh với phối tử.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Nghiên cứu tổng quan hệ thống

Bằng cách tiếp cận tổng quan hệ thống theo hướng dẫn của PRISMA, đề tài đã thu được kết quả tổng quan các nhóm cấu trúc chalcon và hoạt tính kháng α-amylase và α-glucosidase như sau:

Các hợp chất chalcone 7, 6 và 5 được thử nghiệm và cho các giá trị IC50 lần lượt là 270,2, 389,6 và 423,8 μM Dihydrochalcone 5 ít hoạt động nhất cho thấy tác động của liên kết đôi vị trí 7 đối với hoạt tính Chalcone 7 hoạt động mạnh hơn 6, cho thấy rằng mô hình oxy hóa cao hơn có thể tăng cường hoạt động [104]

Chalcone 4 (butein) với hai nhóm hydroxy ở C-2 ′, C-4 ′ của vòng A và ở C-3, C-4 của vòng B thể hiện hoạt tính ức chế α-amylase cao nhất Chalcone 2 chỉ với một nhóm 2'-hydroxy ở vòng A cũng cho thấy hoạt tính nhẹ, nhưng sự hiện diện của nhóm thế này ở C-4 ′ hydroxy lại làm mất tác dụng Hợp chất 21 cấu tạo bởi nhóm 2'- hydroxy ở vòng A và nhóm C-4 nitro ở vòng B, cho thấy hiệu quả cao nhất là 25 ± 3%, ở 100 μM Hầu hết các chalcones có nhóm thế chloro đem lại tác dụng ức chế α- amylase thấp Trong các hợp chất chloro chalcone được thử nghiệm, chỉ có chalcone

24 với nhóm 2'-hydroxy ở vòng A và 3-chloro ở vòng B thể hiện hoạt tính trên 20%

Các chất ức chế α-glucosidase mạnh nhất là chalcone 4 (butein), chalcone 21, chalcone 26 với giá trị IC50 lần lượt là 21 ± 2 μM, 53 ± 1 μM, 87 ± 3 μM Chalcone 4 (butein) là hợp chất hoạt động mạnh nhất với giá trị IC50 thấp hơn gần mười bảy lần so với giá trị IC50 của acarbose tiêu chuẩn (IC50 = 357 ± 25 μM) Chalcone 9 mang nhóm 2'-hydroxy ở vòng A, nhóm thế 3-metoxy, và nhóm 4-hydroxy ở vòng B cho thấy hoạt tính ức chế nhẹ 34 ± 4% ở 150 μM [105]

Bauhinia pulla, một loài thực vật thuộc họ Đậu (Fabaceae) phân bố chủ yếu ở Thái Lan, được sử dụng làm thuốc điều trị rối loạn kinh nguyệt và bổ máu theo y học cổ truyền Bên trong thành phần của Bauhinia pulla có chứa các hoạt chất trị bệnh tiểu đường, gồm 3, 2’, 4’-trihydroxy-4-methoxychalcone và 4-methyl ether isoliquiritigenin Hoạt độ của 3, 2’, 4’-trihydroxy-4-methoxychalcone thấp hơn 4- methyl ether isoliquiritigenin khoảng 6 lần dù 3, 2’, 4’-trihydroxy-4-methoxychalcone có nhiều nhóm hydroxy hơn Cả hai giá trị IC50 của hai hợp chất đều cho thấy hiệu quả ức chế kộm khi so với chất chuẩn acarbose (124.11 àg/mL) [106]

Các hợp chất 1c, 1e, 1f bị ảnh hưởng bởi số nhóm MeO nên hiệu quả ức chế kém khi so giỏ trị IC50 với acarbose (21,3 ± 8,7àM) Ngược lại, vị trớ cỏc nhúm hydroxyl trong chalcone là một yếu tố quan trọng ức chế α-glucosidase Theo cấu trúc được thể hiện ở Hình 1, vòng A chứa nhóm 4-hydroxyl sẽ mạnh hơn nhóm 3-hydroxyl trong việc tăng cường tỏc dụng ức chế, với giỏ trị IC50 là 2c (13,4 ± 2,7 àM) so với 2d (42,0 ± 6,0 àM) Tuy nhiờn, việc đưa thờm một nhúm hydroxyl vào vũng A ở vị trớ C3 của 2b

(35,2 ± 0,2 àM) dẫn đến khả năng ức chế α-glucosidase của 2f (15,6 ± 2,8 àM) mạnh hơn Ngoài ra, vòng B mang 2’-hydroxyl có hiệu quả hơn 3’-hydroxyl trong cải thiện hoạt tính ức chế của chalcones (2b và 2c) [107]

Hợp chất 2a với các nhóm 2 ’, 4’, 6’-trihydroxyl ở vòng B, có hoạt tính yếu hơn nhiều so với hợp chất 2c, có nhóm 2 ’, 4’-dihydroxyl ở vòng B; trong khi 2c với nhóm 4- hydroxyl trong vòng A, thể hiện hoạt động gần như giống nhau đối với 2e với nhóm

Hợp chất 3 và 4 là các dẫn xuất chalcone sulfonamide gần đây được phát hiện như là chất ức chế α-glucosidase mạnh với giỏ trị IC50 tương ứng là 0,4 và 0,98 àM [108]

Hình 3.2 Cấu trúc chalcon hợp chất 3 và 4

Các chalcone tổng hợp 1 - 13 đã được sàng lọc in vitro về hoạt động ức chế α- amylase Tất cả các hợp chất đều chứng minh hoạt động ức chế α-amylase tốt trong khoảng IC50 = 1,25 ± 1,05 - 2,40 ± 0,09 àM so với acarbose tiờu chuẩn (IC50 = 1,04 ± 0,3 àM) Nổi bật nhất là cỏc hợp chất 4 và 10 Mối quan hệ cấu trỳc-hoạt lực (SAR) đề xuất rằng các nhóm thế SMe và OMe đóng vai trò quan trọng trong hoạt động ức chế của các chalcone [109]

Xanthohumol cho thấy sự ức chế α-glucosidase theo cách thuận nghịch và không cạnh tranh với giỏ trị IC50 là 8,8 àM và ức chế sự giải phúng glucose từ maltose ở mặt đỉnh của đơn lớp tế bào caco-2 [110]

Sự hiện diện của nhóm sulfonamido trên 5 '- (3-fluorostyryl)-chalcone của hợp chất 2a

- d dẫn đến tác dụng ức chế trung bình đối với α-glucosidase khi so với acarbose (IC50

= 0,95 ± 0,28 μM) Hoạt động chống lại enzym này càng giảm khi kích thước nhóm thế trên vị trí para vòng B càng tăng và xu hướng như sau: 2a (IC50 = 4,2 ± 0,21 μM) > 2b (IC50 = 5,4 ± 0,10 μM) > 2c ( IC50 = 6,1 ± 0,56 μM) > 2d (IC50 = 8,1 ± 0,61 μM)

Các hợp chất 2a - d cũng được đánh giá khả năng ức chế α-amylase Nhìn chung sự hiện diện của nhóm sulfonamido làm giảm hoạt tính của các hợp chất trong việc ức chế [111]

Nghiên cứu tổng hợp 6 chalcones có giá trị IC50 trên tác dụng ức chế α-glucosidase rõ rệt Nhưng trong số đó chỉ có chalcone 34 (2'-Hydroxychalcone) và chalcone 35 (4- amino-4'-methoxychalcone) cho thấy hứa hẹn ứng dụng điều trị đái tháo đường với

IC50 lần lượt 15,0 và 20,2 khi với chất đối chứng Deoxynojirimycin (IC50 3,49) [112]

2 ′, 4′-Dihydroxy-6′-methoxy-3 ′, 5′-dimethylchalcone (DMC), một hợp chất được phân lập và tinh chế từ nụ hoa khô của cây Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry (Myrtaceae), đã được nghiên cứu in vitro về lợi ích trong kiểm soát đường huyết DMC cho thấy sự ức chế không cạnh tranh đáng kể (IC50 = 43 μM) đối với α-amylase tuyến tụy [113]

Hình 3.5 Cấu trúc 2 ′, 4′-Dihydroxy-6′-methoxy-3 ′, 5′-dimethylchalcone (DMC)

Nhìn chung, geranyl flavonoid 2 thể hiện hoạt động ức chế kép chống lại α-glucosidase và α-amylase 3′- Geranylchalconaringenin (2) cho thấy hoạt động ức chế α- glucosidase (IC50 = 1,08 μM) cao hơn 50 lần so với acarbose (IC50 = 51,30 μM) và hiển thị hoạt động ức chế vừa phải chống lại α-amylase (IC50 = 20, 46 μM) Trong khi đó, hợp chất 3′-prenylchalconaringenin (1) và chalconaringenin (5) có tác dụng kém hơn hợp chất 2 khoảng 20 lần nhưng vẫn hiệu quả hơn acarbose khi ức chế α- glucosidase Nhưng khi so tác động ức chế α-amylase thì cả hợp chất 3 và 5 đều kém hơn đối chứng [114]

Mô hình docking phân tử

3.2.1 Mô hình docking phân tử các chất ức chế enzym α-amylase

3.2.1.1 Xác định vị trí khoang gắn kết

Cấu trúc α-amylase đủ 496 acid amin Khoang gắn kết được xây dựng đảm bảo bao phủ ligand đồng kết tinh và các acid amin quan trọng quyết định hoạt tính của α- amylase Asp197, Glu233, Asp300, Trp59 và Tyr62

− Tọa độ x = 12,166; tọa độ y = 19,236; tọa độ z = 42,288

− Độ gắng sức (exhaustiveness): 8

3.2.1.2 Kết quả tái gắn kết ligand đồng kết tinh

Quy trình docking phân tử cần được đánh giá bằng cách tách và tái gắn kết ligand đồng kết tinh myricetin vào khoang gắn kết bằng phần mềm Autodock Vina 1.2.3

Hình 3.14 mô tả cấu dạng của phối tử sau redocking so với cấu dạng của phối tử trong cấu trúc tinh thể 4GQR:

- Ligand đồng kết tinh nằm gọn trong khoang gắn kết

- Điểm số redocking: –8,1 kcal/mol

- Cấu dạng có giá trị RMSD so với trước khi docking là 1,6797 Å

- Cấu dạng của ligand đồng kết tinh myricetin ban đầu (màu hồng) tạo được liên kết hydro với acid amin Asp197, Ala198, His101 và liên kết kỵ nước với Leu165, Trp59, Tyr62 Kết quả redock cho thấy cấu dạng của ligand đồng kết tinh tái tạo (màu vàng) tạo được liên kết hydro với Asp197 và liên kết kỵ nước với các acid amin Tyr62, Trp58, Trp59 được thể hiện ở Hình 3.14

Kết quả thu nhận được có giá trị RMSD > 2 Å biểu thị mô hình có thể không tái lặp tốt cấu trúc thực nghiệm Tuy nhiên, giá trị RMSD vẫn nằm trong khoảng 2,0 - 3,0 Å chứng tỏ mô hình vẫn có thể chấp nhận được Để khẳng định mô hình docking của α-amylase đủ tin cậy và phù hợp với nghiên cứu lần này Đề tài tiếp tục đánh giá thông qua việc tính toán các giá trị của diện tích dưới đường cong ROC

Hình 3.18 Kết quả redocking của myricetin trong khoang gắn kết của α-amylase c) Hình biểu diễn tương tác giữa myricetin với các acid amin trước redocking d) Hình biểu diễn tương tác giữa myricetin với các acid amin sau redocking

3.2.1.3 Đánh giá mô hình bằng diện tích dưới đường cong ROC

Dựa trên 69 chất có hoạt tính ức chế α-amylase thu thập được ở Mục 3.3.1

Xây dựng tập chất không hoạt tính bằng phần mềm DUD–E decoy được 2549 chất Hai tập chất này được dock vào khoang gắn kết của α-amylase, để đánh giá khả năng phân loại chất có hoạt tính và không có hoạt tính của mô hình docking đã xây dựng Kết quả phân loại dựa trên diện tích dưới đường cong (ROC/ AUC) với giá trị ROC/ AUC = 0,770 (>0,5) và TG = 0,309 (>0,25) cho thấy mô hình có khả năng phân biệt hai tập chất hoạt tính và không hoạt tính Từ kết quả đánh giá trên, cho thấy mô hình docking được xây dựng là tin cậy và có thể được ứng dụng để sàng lọc ảo các bước tiếp theo

Hình 3.19 Kết quả đánh giá ROC của mô hình docking α-amylase

3.2.2 Mô hình docking phân tử các chất ức chế enzym α-glucosidase

3.2.2.1 Xác định vị trí khoang gắn kết

Cấu trúc α-glucosidase đủ 870 acid amin Khoang gắn kết được xây dựng đảm bảo bao phủ ligand đồng kết tinh và các acid amin quan trọng quyết định hoạt tính là Asp327, Asp542, His600, Arg526, Asp443 và Asp203

− Tọa độ x = –21,957; tọa độ y = –3,267; tọa độ z = –7,522

− Độ gắng sức (exhaustiveness): 8

3.2.2.2 Kết quả tái gắn kết ligand đồng kết tinh

Quy trình docking phân tử cần được đánh giá bằng cách tách và tái gắn kết ligand đồng kết tinh acarbose vào khoang gắn kết bằng phần mềm Autodock Vina 1.2.3

Hình 3.16 mô tả cấu dạng của phối tử sau redocking so với cấu dạng của phối tử trong cấu trúc tinh thể 2QMJ:

- Ligand đồng kết tinh nằm gọn trong khoang gắn kết

- Điểm số redocking: –8,1 kcal/mol

- Cấu dạng có giá trị RMSD so với trước khi docking là 1,778 Å (< 2 Å)

- Cấu dạng của ligand đồng kết tinh acarbose ban đầu (màu xanh) tạo được liên kết hydro với acid amin Asp203, Arg526, Asp443, Asp542, Thr544, Asn207 và liên kết kỵ nước với Phe575, Tyr299, Trp406 Kết quả redock cho thấy cấu dạng của ligand đồng kết tinh tái tạo (màu vàng) tạo được các liên kết hydro và liên kết kỵ nước tương đồng khoảng 80% so với kết quả thực nghiệm ban đầu

Kết quả thu nhận được cho thấy mô hình docking phân tử được xây dựng đáng tin cậy và có thể được ứng dụng cho sàng lọc ảo

Hình 3.20 Kết quả redocking của acarbose trong khoang gắn kết của α-glucosidase c) Hình biểu diễn tương tác giữa acarbose với các acid amin trước redocking d) Hình biểu diễn tương tác giữa acarbose với các acid amin sau redocking

3.2.2.3 Đánh giá mô hình bằng diện tích dưới đường cong ROC

Dựa trên 51 chất có hoạt tính ức chế α-glucosidase thu thập được ở Mục 3.3.2 Xây dựng tập chất không hoạt tính bằng phần mềm DUD–E decoy được 2750 chất Hai tập chất này được dock vào khoang gắn kết của α-glucosidase, để đánh giá khả năng phân loại chất có hoạt tính và không có hoạt tính của mô hình docking đã xây dựng Kết quả phân loại dựa trên diện tích dưới đường cong (ROC/AUC) với giá trị ROC/AUC = 0,690 (>0,5) và TG = 0,255 (>0,25) cho thấy mô hình có khả năng phân biệt hai tập chất hoạt tính và không hoạt tính Từ kết quả đánh giá trên, cho thấy mô hình docking được xây dựng là tin cậy và có thể được ứng dụng để sàng lọc ảo các bước tiếp theo.

Kết quả sàng lọc ảo qua mô hình docking phân tử

378 chất được tiến hành dock vào khoang gắn kết của enzym α-amylase và α- glucosidase, 100% các chất đều dock thành công trên cả hai khoang gắn kết Tên các hợp chất, cấu trúc hóa học và điểm số docking, được liệt kê chi tiết tại PHỤ LỤC 1

3.3.1 Kết quả sàng lọc các chất ức chế enzym α–amylase

Hình 3.18 cho thấy phần lớn các chất dock thành công có điểm số dao động trong vùng từ –8 đến –7 kcal/mol (54%) cho thấy khả năng gắn kết khá tốt vào khoang Những chất có điểm số docking từ –7 đến –6 kcal/mol thể hiện khả năng gắn kết vừa phải, chiếm tỉ lệ 20% Các chất thể hiện khả năng gắn kết tốt hơn chiếm tỉ lệ 25% có điểm số docking từ –9 đến –8 kcal/mol và đặc biệt có 6 chất (chiếm tỉ lệ 2%) đạt điểm số docking nhỏ hơn –9 kcal/mol

Hình 3.22 Tỉ lệ số chất dock thành công trên α-amylase theo khoảng điểm số docking.

Các chất dock thành công tiếp tục được phân tích bằng công cụ phân tích vân tay tương tác giữa protein và ligand Protein–Ligand Interaction Fingerprints (PLIF)

Hình 3.19 thể hiện tần suất tạo tương tác của các chất với acid amin trong khoang gắn kết của α-amylase Tần suất tương tác của bộ ba acid amin quan trọng trong cấu trúc của α-amylase gồm Asp197 (36,02%), Glu233 (29,38%) và Asp300 (10,90%) chiếm tỉ lệ cao hơn so với các acid amin khác Xét về tần suất tạo liên kết hydro bộ ba acid amin quan trọng đều được liên kết này Hai acid amin Trp59 và Tyr62 tạo được liên kết kỵ nước với tỉ lệ là 9% và 8,06% Nhìn chung, bộ ba acid amin quan trọng có khả năng tương tác và tạo được liên kết hydro tốt hơn so với các aicd amin khác trong khoang gắn kết

Hình 3.23 Biểu đồ tần suất tạo tương tác với các acid amin, tạo liên kết hydro, tạo liên kết kỵ nước với các acid amin của α-amylase

Liên kết với acid amin

Trp 59 G ln 63 Th r16 3 A rg 195 A sp 197 A la198 H is 201 G lu 233 H is 299 A sp 300 H is 305

Trp 59 Tyr62 G ln 63 G ly104 Le u 162 Th r16 3 Le u 165 A rg 195

3.3.2 Kết quả sàng lọc ảo các chất ức chế enzym α-glucosidase

Hình 3.20 cho thấy phần lớn các chất dock thành công có điểm số dao động trong vùng từ –7 đến –5 kcal/mol (45%) cho thấy khả năng gắn kết ở mức độ vừa phải vào khoang Những chất có điểm số docking từ –8 đến –7 kcal/mol thể hiện khả năng gắn kết tốt, chiếm tỉ lệ 44% Các chất thể hiện khả năng gắn kết tốt hơn chiếm tỉ lệ 21% có điểm số docking nhỏ hơn –8 kcal/mol và đặc biệt có 4 chất (chiếm tỉ lệ 1%) đạt điểm số docking nhỏ hơn –9 kcal/mol

Hình 3.24 Sự phân bố tỉ lệ số chất dock thành công trên α-glucosidase theo khoảng điểm số docking Các chất dock thành công tiếp tục được phân tích bằng công cụ PLIF Trong Hình

3.21 tần suất tạo tương tác với acid amin quan trọng trong cấu trúc của α- glucosiase gồm Asp542 (24,8%), Trp406 (17,79%), Arg526 (12,67%), His600 (11,86%) chiếm tỉ lệ cao hơn so với các acid amin khác Xét về tần suất tạo liên kết hydro các acid amin quan trọng đều được liên kết này Acid amin Trp406 tạo được liên kết kỵ nước với tỉ lệ cao nhất (17,79%) so với các acid amin khác Nhìn chung, các chất đều có khả năng tạo tương tác với các acid amin quan trọng, tạo được liên kết hydro, liên kết kỵ nước tốt trong khoang gắn kết của α-glucosidase

Hình 3.25 Biểu đồ tần suất tạo tương tác với các acid amin, tạo liên kết hydro, tạo liên kết kỵ nước với các acid amin của α-glucosidase

3.3.3 Xác định các chất tiềm năng ức chế đồng thời enzym α-amylase và enzym α-glucosidase qua kết quả sàng lọc ảo

Từ kết quả sàng lọc ảo gắn kết phân tử trên hai đích tác động α-amylase, α- glucosidase và điểm số docking của kết quả tái gắn kết myricetin trên enzym α- amylase, acarbose trên enzym α-glucosidase Nghiên cứu xác định được 36 chất có điểm số docking < –8 kcal/mol, điểm số docking của 36 chất này được thể hiện trong Hình 3.22 Tên 36 hợp chất, cấu trúc hóa học, điểm số docking, tương tác acid amin với α-amylase và α-glucosidase được liệt kê chi tiết tại PHỤ LỤC 2

Liên kết với acid amin

Phân tích mối liên quan cấu trúc – tác dụng ức chế -amylase và -glucosidase (SAR) dựa trên các dẫn chất flavonoid đã xác định IC 50

AMYLASE VÀ -GLUCOSIDASE (SAR) DỰA TRÊN CÁC DẪN

CHẤT FLAVONOID ĐÃ XÁC ĐỊNH IC 50

Xây dựng mô hình SAR trên hai enzym α-amylase và α-glucosidase, đề tài tiến hành thu thập các dẫn chất flavonoid đã xác định IC50 trong các bài báo khoa học

Vì các giá trị IC50 của acarbose trong các bài báo có giá trị khác nhau Nên để đồng nhất việc so sánh và phân chia các tập dữ liệu, giá trị IC50 của các hợp chất ức chế α-amylase và α-glucosidase được quy đổi theo giá trị IC50 của một acarbose chuẩn Đối với α-amylase, tập dữ liệu thu thập được 69 chất ức chế trong các bài báo.[57,

Giá trị acarbose chuẩn quy đổi IC50 = 18,08 μM Đối với α-glucosidase, tập dữ liệu thu thập được tổng cộng 51 chất ức chế trong các bài báo.[140-146] Giá trị acarbose chuẩn quy đổi IC50 = 607 μM Cấu trúc các chất ức chế, giá trị IC50 quy đổi, điểm số docking và tương tác acid amin được trình bày cụ thể trong PHỤ LỤC 3

3.4.1 Mô hình SAR trên α–amylase

Vòng thơm trong cấu trúc chalcon đóng vai trò quan trọng trong sự ức chế hoạt tính α-amylase Tuy nhiên, hoạt tính mạnh hay yếu phụ thuộc vào các nhóm thế khác nhau gắn trên vòng thơm này Khoang gắn kết của α-amylase có hình chữ “V” nên các ligand có thể đi vào sâu, nằm gọn trong khoang hình thành được liên kết hydro với bộ ba acid amin quan trọng trong khoang gắn kết là Asp197, Glu233, Asp300 Đồng thời, các tương tác kỵ nước (π–π) cũng được hình thành giữa nhân thơm của ligand khảo sát với các acid amin Tyr59, Tyr62

F310 F314 F319 F349 F307 F329 F363 F320 F376 F300 F298 F353 F341 F336 F308 F311 F337 F378 Điể m số d o cki n g (kcal/mo l)

Hình 3.27 Sự ảnh hưởng của các nhóm thế khác nhau trong nhóm dẫn chất chalcon đến tác dụng ức chế enzym α-amylase Khi thay đổi các nhóm thế trên khung chalcon IC50 dao động từ 21–40 μM, điểm số docking từ –8,5 đến –7,1 kcal/mol Trên vòng B, ở vị trí para, hoạt tính ức chế giảm dần khi thay đổi các nhóm –SCH3 > –Cl > –OCH3 > –Br > –C6H5 Nhóm –SCH3 và –OCH3 đóng vai trò quan trọng trong hoạt động ức chế α-amylase vì nguyên tử lưu huỳnh giúp định hướng gắn kết, tạo được nhiều tương tác với vị trí hoạt động của enzym Nhóm thế benzyloxy làm cấu trúc cồng kềnh hơn, cấu dạng trải dài trong khoang, tăng khả năng gắn kết, điểm số docking < –8 kcal/mol Tuy nhiên, IC50 của nhóm chất này chỉ ở mức ức chế trung bình

Nhóm thế halogen, alkyl halogen cho điểm số docking tốt do hình thành được liên kết kỵ nước (π–alkyl) giữa nguyên tử halogen (–Cl, –F) với các acid amin Trp59, Trp406, Phe575

Khi R1 là nhóm phenyl, ở vị trí para trên vòng B nhóm –OCH3 cho hoạt tính ức chế tốt hơn nhóm –CH3

R1 được thế bằng nhóm 2–pyridyl có hoạt tính tốt hơn nhóm 3–pyridyl Điểm số docking của 2 nhóm này từ –7,5 đến –6,8 kcal/mol Hoạt tính giảm dần khi thêm các nhóm thế –OCH3, –F, –Cl, –NO2, –Br trên vòng B Khi thế nhóm –Br ở bất kỳ vị trí nào trên vòng B, hoạt tính đều giảm Nhóm –NO2 thế ở vị trí meta (27,57 μM) hoạt tính ức chế tốt hơn vị trí para (51,94 μM) Đặc biệt khi R1 là nhóm benzimidazol sulfonamid cho hoạt tính ức chế mạnh, điểm số docking từ –8,3 đến –7,4 kcal/mol Nhóm này tạo được liên kết hydro với bộ ba acid amin quan trọng Asp197, Glu233, Asp300 và tạo được liên kết kỵ nước với Trp59, Tyr62

Hình 3.28 Sự ảnh hưởng của các nhóm thế khác nhau trong nhóm dẫn chất flavon đến tác dụng ức chế enzym α–amylase.

Khi thay đổi nhóm thế trên khung flavon IC50 dao động từ 18,25–871 μM, điểm số docking từ –8,5 đến –7 kcal/mol Trên vòng A, thêm cả 3 nhóm OH ở vị trí 1, 2, 3 hoặc 2 nhóm ở vị trí 1,3 làm tăng hoạt tính khi vòng B là vòng benzyl Thay nhóm –OH ở vị trí 2 bằng nhóm –OCH3,hoạt tính enzym từ 22 μM giảm xuống 871 μM Trên vòng B, nhóm –OH (R’1) cho hoạt tính ức chế tốt nhất, tuy nhiên khi thế 2 nhóm –OH (R’2, R’3) làm hoạt tính giảm mạnh đến 20 lần Hoạt tính giảm dần khi thêm các nhóm thế –Cl, –F, –NO2, –Br trên vòng B

3.4.2 Mô hình SAR trên α-glucosidase

Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase không chỉ phụ thuộc vào việc thay đổi các nhóm thế, mà còn phụ thuộc vào cấu trúc khung đơn giản hay cồng kềnh Vì khoang gắn kết của α-glucosidase là một khoang nông, hẹp nên phần lớn ligand hình thành các liên kết ở vùng viền của khoang, khó tạo được liên kết với các acid amin quan trọng trong khoang gắn kết Một số ligand cho điểm số docking và hoạt tính ức chế tốt do đi sâu vào trong khoang, gắn kết tốt và hình thành được liên kết hydro với các acid amin quan trọng như Asp542, Asp443, Asp203 và Arg526 trong khoang xúc tác Đồng thời, các chất này cũng tạo các liên kết kỵ nước với các acid amin như Trp406 và Tyr299

Hình 3.29 Sự ảnh hưởng của các nhóm thế khác nhau trong nhóm dẫn chất chalcon đến tác dụng ức chế enzym α-glucosidase

Các cấu trúc chalcon cho điểm số docking từ –8,3 đến –7,4 kcal/mol, IC50 (9,8 –

409 μM) Trên vòng B, nhóm –OH thế ở vị trí para, meta cho hoạt tính ức chế tốt, vì tạo được tương tác hydro với các acid amin quan trọng có vai trò xúc tác nucleophilic và xúc tác acid/ base là Asp443, Asp542 Để tăng khả năng gắn kết vào khoang, hầu như các nghiên cứu tập trung phát triển các nhóm thế ở vòng A Nhóm thế sulfonamid cho hoạt tính ức chế mạnh nhất, đặc biệt khi thế ở vị trí R2

(IC50 < 10 μM) Tuy nhiên, khi thế bằng các nhóm thế –NH2, –OH, –Cl, –F, –NO2, –Br thì hoạt tính giảm, chỉ ở mức ức chế trung bình

Hình 3.30 Sự ảnh hưởng của các nhóm thế khác nhau trong nhóm dẫn chất flavon, flavanon đến tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Các cấu trúc thuộc nhóm flavanon, flavon có điểm số docking –9,4 đến –7,2 kcal/mol Vòng B, thế nhóm –OH cho khả năng ức chế tốt hơn những nhóm thế còn lại Giống như chalcon, flavanon và flavon cũng tập trung mở rộng cấu trúc ở vòng

A Việc gắn thêm nhóm sulfonamid, khung chalcon trên vòng A, cho hoạt tính ức chế rất tốt (IC50 < 2 μM) Gắn thêm khung đường hay nhóm 7–hydroxy–chromen– 2–on trên vòng A ở các vị trí khác nhau, đều cho hoạt tính ức chế glucosidase tốt so với chuẩn acarbose

Tuy nhiên, khi gắn các nhóm thế alkyl cồng kềnh lên vòng A/ vòng B thì hoạt tính ức chế enzyme giảm đi rõ rệt (IC50 > 2500 μM).

Mô hình QSAR cho các chất ức chế enzym α-amylase và enzym α-glucosidase

3.5.1 Mô hình QSAR trên α–amylase

3.5.1.1 Lựa chọn thông số mô tả

206 thông số mô tả được tính toán bằng phần mềm MOE 2015.10 từ cơ sở dữ liệu bao gồm 96 chất ức chế enzym α-amylase, sau đó qua các bước: lọc thô bằng MS Excel 365; loại bỏ các thông số mô tả không có ý nghĩa, các thông số mô tả có tương quan trên 90% và chia tỉ lệ thông số mô tả bằng phần mềm RapidMiner 5.2; chọn lựa các thông số mô tả quan trọng nhất bằng phần mềm Weka 3.8, thu được 6 thông số mô tả Tuy nhiên, thông số mô tả lip_druglike (sàng lọc khả năng làm thuốc theo luật 5 Lipinski) được loại bỏ, 5 thông số mô tả còn lại dùng để xây dựng mô hình 2D-QSAR được trình bày trong Bảng 3.10

Bảng 3.10 Ý nghĩa các thông số mô tả để xây dựng mô hình 2D-QSAR

Thông số mô tả phân tử Ý nghĩa a_nH Số lượng nguyên tử hydro

BCUT_PEOE_1 Điện tích riêng phần PEOE theo BCUT

(1/3) BCUT_SLOGP_2 Log của hệ số phân bố octanol/nước theo

BCUT (2/3) KierA3 Chỉ số hình dạng sửa đổi alpha thứ 3

PEOE_VSA+1 Tổng diện tích bề mặt van der Waals có điện tích +1

5 thông số mô tả trên được kiểm tra lại mức độ tương quan với nhau và với giá trị pIC50 bằng lệnh Compute → Analysis → Correlation Matrix trong phần mềm MOE 2015.10 Kết quả được trình bày trong Bảng 3.11 Kết quả cho thấy giữa các giá trị đều có mức độ tương quan nhỏ hơn 90%

Bảng 3.11 Mức độ tương quan giữa các thông số mô tả với nhau và với pIC50

Thông số pIC50 a_nH BCUT_

3.5.1.2 Loại các chất gây nhiễu

Sau khi lựa chọn các thông số mô tả để xây dựng mô hình, cơ sở dữ liệu sẽ được phân tích để loại bỏ các chất gây nhiễu thông qua đánh giá điểm số Z-score Kết quả thu được có 7 chất có điểm số Z-score ≥ 2,0 bị loại bỏ được trình bày trong Bảng 3.12

Bảng 3.12 7 chất bị loại bỏ khỏi cơ sở dữ liệu để xây dựng mô hình 2D-QSAR

Tên gọi Điểm số Z-score pIC50 thực nghiệm pIC50 dự đoán

Sau khi loại bỏ các chất gây nhiễu, mô hình 2D-QSAR được xây dựng trên cơ sở dữ liệu 89 chất bằng hai phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS) và mạng neuron nhiều lớp ngược hướng (CPG-NN)

3.5.1.3 Mô hình 2D-QSAR được xây dựng bằng phương pháp bình bình phương tối thiểu từng phần (PLS)

Phương trình hồi qui của mô hình 2D-QSAR được xây dựng bằng phương pháp PLS: pIC50 = 4,16224

+ 0,12543 * PEOE_VSA+1 Đánh giá mô hình

Mô hình được xây dựng có mức độ tương quan giữa giá trị hoạt tính sinh học thực nghiệm và dự đoán đạt yêu cầu với R 2 = 0,53 > 0,50; giá trị RMSE = 0,27 < 0,50 thể hiện sai số nhỏ và đa số các giá trị sinh học dự đoán đều nằm trong khoảng tin cậy 95% của mô hình, được thể hiện qua Hình 3.31

Hình 3.31 Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa giá trị pIC50 thực nghiệm và dự đoán của mô hình được xây dựng bằng phương pháp PLS

Cơ sở dữ liệu được phân chia ngẫu nhiên 5 lần thành tập huấn luyện (80%) để xây dựng mô hình và tập kiểm tra (20%) để đánh giá mô hình nhằm đánh giá tính thống nhất của mô hình Kết quả các giá trị đánh giá được trình bày trong Bảng 3.13

Bảng 3.13 Kết quả đánh giá mô hình được xây dựng bằng phương pháp PLS

HL KT HL KT HL KT HL KT HL KT HL KT

Theo kết quả đánh giá mô hình trong bảng trên, đa số các giá trị của phương pháp đánh giá LOO là Q 2 , R 2 pred và RMSE của các tập huấn luyện và tập kiểm tra đều đạt yêu cầu Tuy nhiên, các giá trị của phương pháp đánh giá Roy là r m 2 và ∆r m 2 và giá trị CCC đều không đạt

Do đó, mô hình 2D-QSAR được xây dựng bằng phương pháp PLS không tốt nên không được ứng dụng để dự đoán hoạt tính sinh học của các chất cần nghiên cứu

3.5.1.4 Mô hình 2D-QSAR được xây dựng bằng phương pháp mạng neuron nhiều lớp ngược hướng (CPG-NN)

Mô hình 2D-QSAR được xây dựng bằng phương pháp CPG-NN là một mô hình mạng neuron có kích thước mạng = 9  9 neuron (kết quả của √N, với N = 72 là số lượng chất của tập huấn luyện), thông số huấn huấn luyện mạng được đặt ở các giá trị: Epochs = 100; Span(x) = Span(y) = N/2 = 4,5; Step(x) = Step(y) = Span/epochs

= 0,045; Rate = 0,5 và Rate Factor = 0,995 Bản đồ tự tổ chức được thể hiện trong Hình 3.32

Hình 3.32 Bản đồ tự tổ chức của cơ sở dữ liệu ở mô hình 2D-QSAR

(Những vùng màu tím thể hiện nhóm chất có hoạt tính mạnh, màu xanh là trung bình và màu đỏ là hoạt tính kém) Đánh giá mô hình

Mô hình được xây dựng bằng phương pháp CPG-NN có mức độ tương quan giữa giá trị hoạt tính sinh học thực nghiệm và dự đoán rất tốt với R 2 = 0,87, giá trị RMSE

= 0,18 cũng thể hiện mức độ sai số nhỏ Phần lớn các giá trị dự đoán cũng đều nằm trong khoảng tin cậy 95% của mô hình, được thể hiện qua Hình 3.33

Hình 3.33 Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa giá trị pIC50 thực nghiệm và dự đoán của mô hình được xây dựng bằng phương pháp CPG-NN

Các mô hình được xây dựng từ 5 tập huấn luyện đều có Q 2 > 0,80 thể hiện mức độ tương quan giữa giá trị thực nghiệm và dự đoán rất tốt, RMSE < 0,20 thể hiện sai số nhỏ, các giá trị 𝑟 𝑚 2 và ∆r m 2 đều đạt yêu cầu Đối với 5 tập kiểm tra, hầu hết các giá trị

R 2 pred, RMSE và ∆r m 2 đều đạt yêu cầu, chỉ có giá trị 𝑟 𝑚 2 của tập kiểm tra ngẫu nhiên thứ 2 đạt yêu cầu (𝑟 𝑚 2 = 0,51 > 0,50) nhưng ở các tập còn lại cũng không quá thấp, và giá trị CCC ở tập kiểm tra ngẫu nhiên thứ 2 cũng là giá trị CCC tốt nhất và gần đạt với yêu cầu Đánh giá Y ngẫu nhiên được thực hiện và kết quả hiệu giữa R 2 ở mô hình đã được xây dựng so với R 2 trung bình của 10 lần Y ngẫu nhiên là 0,26, lớn hơn 0,20 chứng minh được giá trị dự đoán từ mô hình không phải do ngẫu nhiên mà có Kết quả chi tiết được thể hiện ở Bảng 3.14

Bảng 3.14 Kết quả đánh giá mô hình được xây dựng bằng phương pháp CPG-NN

HL KT HL KT HL KT HL KT HL KT HL KT

Tóm lại, mô hình 2D-QSAR được xây dựng bằng phương pháp CPG-NN có mức độ tương quan giữa giá trị hoạt tính sinh học thực nghiệm và dự đoán rất tốt, hầu hết các giá trị dự đoán đều nằm trong khoảng tin cậy 95%, các giá trị đánh giá đều ở mức tốt, do đó mô hình 2D-QSAR này là một mô hình tương đối tốt và được ứng dụng để dự đoán hoạt tính sinh học của các chất được nghiên cứu

3.5.2 Mô hình QSAR trên α–glucosidase

Từ cơ sở dữ liệu gồm 53 chất với 206 thông số mô tả 2D được tính toán bằng MOE

2015.10 thông qua các phần mềm Microsoft Excel 365, RapidMiner Studio 5.2,

Weka 3.8 tiến hành loại bỏ các thông số mô tả không quan trọng và thu được 7 thông số mô tả được chọn để xây dựng mô hình 2D − QSAR (Bảng 3.9)

Bảng 3.9 Thông số mô tả được chọn xây dựng mô hình 2D − QSAR ứng dụng trong dự đoán hoạt tính ức chế α−glucosidase

STT Thông số mô tả Ý nghĩa

1 apol Tổng độ phân cực của nguyên tử

2 BCUT_SLOGP_3 Chỉ số liên kết ma trận liền kề với phân bố octanol/nước ở mức 3/3

Thông số mô tả GCUT sử dụng sự đóng góp của nguyên tử tới hệ số kỵ nước LogP thay vì tích điện từng phần (sử dụng phương pháp SlogP Wildman & Crippen)

4 h_logD Hệ số phân bố octanol/nước (pH=7)

5 PEOE_VSA+0 Tổng diện tích bề mặt van der Waals với chỉ số tích điện từng phần trong khoảng [0.00,0.05)

6 SlogP_VSA8 Điện tích có LogP(o/w) trong khoảng (0.3,0.4]

Tổng diện tích bề mặt van der Waals với sự đóng góp vào độ phân cực của nguyên tử trong khoảng

Lựa chọn và tổng hợp chất cho thử nghiệm ức chế đồng thời hai enzym α-

ĐỒNG THỜI HAI ENZYM α-AMYLASE VÀ ENZYM α- GLUCOSIDASE

3.6.1 Các chất tiềm năng ức chế đồng thời hai enzym

Dựa vào điểm số docking từ kết quả sàng lọc ảo các chất tiềm năng ức chế đồng thời α-amylase và α-glucosidase ở Mục 3.2.3 Kết hợp với kết quả phân tích SAR ở

Mục 3.3 Nghiên cứu lựa chọn 12 chất tiềm năng nhất, dự đoán ức chế được đồng thời cả hai enzym Mười hai chất được phân tích sâu hơn về khả năng tạo tương tác, tạo liên kết hydro, kỵ nước với các acid amin quan trọng trong cấu trúc của từng enzym, được thể hiện cụ thể trong Bảng 3.7 Nhìn chung, 12 chất này có vị trí gắn kết nằm sâu bên trong khoang của α-amylase Ngược lại, vị trí gắn kết của chúng có phần nông hơn trong khoang của α-glucosidase Các chất này chủ yếu tạo được liên kết hydro là nhờ gốc amin bậc 2 –NH– và liên kết kỵ nước nhờ nhân thơm trong cấu trúc

Tương tác 3D của 12 chất với từng enzym được trình bày trong PHỤ LỤC 4

Bảng 3.16 Các chất tiềm năng ức chế đồng thời hai enzym α-amylase và α-glucosidase

Chất Cấu trúc 2D Gắn kết với

G = –8,9 kcal/mol Asp197, Trp58, Trp59, Tyr62

G = –8,3 kcal/mol Asp542, Arg526, Phe450, Trp406

G = –9,1 kcal/mol Asp197, Glu233, Trp58, Trp59, Tyr62

G = –8,3 kcal/mol Asp542, Arg526, Phe450, Trp406, Phe575

G = –8,8 kcal/mol Asp197, Glu233, Ala198, Trp58, Trp59, Tyr62

G = –8,5 kcal/mol Asp542, Arg526, Phe450, Trp406, Trp441

G = –8,4 kcal/mol Asp197, Glu233, Trp58, Tyr62

G = –8,1 kcal/mol Asp542, Arg526, Phe450, Trp406, Trp441, Phe575

G = –8,6 kcal/mol Asp197, Trp58, Trp59, Tyr62

G = –8,1 kcal/mol Asp542, Arg526, Phe450, Trp406

G = –9,2 kcal/mol Asp197, Glu233 Trp58, Trp59, Tyr62

G = –8,5 kcal/mol Arg526, Asp542, Phe450, Trp441

G = –8,7 kcal/mol Asp197, Glu233 Trp58, Tyr62

G = –8,7 kcal/mol Asp542, Arg526, Phe450, Trp406

G = –8,5 kcal/mol Asp197, Trp58, Tyr62

G = –8,1 kcal/mol Asp542, Phe575, Phe450

G = –8,8 kcal/mol Asp197, Trp58, Trp59, Tyr62

G = –8,3 kcal/mol Asp542, Asp327, Phe450, Phe575

G = –9,1 kcal/mol Asp197, Trp58, Tyr62

G = –8,4 kcal/mol Asp542, Arg526, Phe450, Trp406

G = –8,9 kcal/mol Asp197,Trp58, Tyr62, Leu165

G = –8,3 kcal/mol Asp542, Arg526, Phe450, Trp406

G = –8,2 kcal/mol Asp197,Trp59, Tyr62

G = –8,0 kcal/mol Asp542, Phe450, Phe575

3.6.2 Tổng hợp các dẫn chất chalcon

Các chalcon đã chứng minh các hoạt động tiềm năng ức chế cả -glucosidase và - amylase bằng các sàng lọc in silico bao gồm F336, F337, F341, F342, F347, F352, F353, F364, F368, F369, F370, và F378 Chúng được tổng hợp với độ tinh khiết cao thông qua quá trình ngưng tụ Claisen–Schmidt (hơn 96%, được thực hiện bởi HPLC) Quá trình này tạo ra các chalcon mong muốn với năng suất trung bình là 45–85% Phổ 1 H-NMR của chalcone tổng hợp hiển thị hai cặp đôi ở δ 6,2–8,0 ppm với hằng số ghép đặc trưng (J) là 15–16Hz, xác nhận sự hình thành của chalcone (sở hữu một xeton carbonyl không bão hòa α,β) Giá trị hằng số liên kết cao hơn này cho thấy tất cả các hợp chất tổng hợp đều tinh khiết về mặt hình học và chỉ là các đồng phân trans (E) Thông tin từ 1 H-NMR, 13 C-NMR, HPLC và MS của tất cả các chalcone tổng hợp được đính kèm với PHỤ LỤC 5

Mười hai chất thử hoạt tính sẽ được kiểm tra về cảm quan, tính chất vật lý, nhiệt độ nóng chảy và độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng trên 3 hệ dung môi khai triển khác nhau Kết quả tất cả các chất này được ghi cụ thể ở PHỤ LỤC 6 đều đạt các yêu cầu về màu sắc, nhiệt độ nóng chảy, bản sắc kí chỉ có một vết duy nhất của mẫu thử với các Rf khác nhau Do đó, phù hợp cho bước nghiên cứu in vitro tiếp theo.

Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học ức chế enzym α- amylase và α-glucosidase của các dẫn chất chalcon

AMYLASE VÀ α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC DẪN CHẤT CHALCON

Thử nghiệm in vitro được thực hiện với 12 chalcon tiềm năng nhất Dựa vào nguồn nguyên liệu, hóa chất và enzym có sẵn tại Khoa Dược Đề tài tiến hành khảo sát hoạt tính sinh học của 12 chalcon này trên enzym α-glucosidase và α-amylase

3.7.1 Kết quả thử hoạt tính trên α-glucosidase

Khảo sát khả năng ức chế hoạt tính α-glucosidase nấm men 0,5 U/mL của acarbose Mẫu acarbose được chuẩn bị theo Mục 2.3.4 trong phương pháp nghiên cứu Kết quả phần trăm ức chế α-glucosidase nấm men của acarbose được trình bày trong

Hình 3.34 Mối tương quan giữa logCacarbose và I%α-glucosidase.

Bảng 3.17 Phần trăm ức chế enzym α-glucosidase theo nồng độ của acarbose

Phần trăm ức chế α-glucosidase

Từ phương trình hồi quy tuyến tính y = 0,4763x – 0,8316 được xây dựng từ logCacarbose với I%α-glucosidase Kết quả tính toán: IC50 acarbose = 624,76 μM

Kết quả khảo sát khoảng ức chế α-glucosidase của các dẫn chất chalcon

Kết quả phần trăm ức chế hoạt tính α-glucosidase của 12 dẫn chất chalcon và chất đối chiếu acarbose ở các nồng độ xác định được trình bày chi tiết ở PHỤ LỤC 7

Hình 3.28 dưới đây là kết quả phần trăm ức chế hoạt tính α-glucosidase ở nồng độ

250 μM Ở nồng độ này, cả 12 chất đều ức chế được hoạt tính enzym mạnh hơn chất đối chiếu acarbose

Trong đó, có 3 chất F341, F342, F352 ức chế khoảng 50% hoạt tính hoạt tính enzym; 2 chất F336 và F353 ức chế đến 70% hoạt tính α-glucosidase so với acarbose chỉ ức chế 29,70% ở cùng nồng độ 250 μM

Kết quả IC50 và pIC50 của 12 dẫn chất chalcon đối với α-glucosidase được thể hiện trong PHỤ LỤC 8 và Hình 3.29 cho thấy so với chất đối chiếu thì 12 dẫn chất chalcon cho hoạt tính ức chế tốt hơn Trong đó, chất F353 (IC50 = 34,28 μM) và F336 (IC50 = 65,85 μM) lần lượt gấp 18,22 lần và 9,49 lần so với chuẩn đối chiếu acarbose (IC50 = 624,77 μM) cho thấy tiềm năng của 2 chalcon này rất cao Ba chất F341, F342, F352 đều có IC50 < 161 μM có hoạt tính ức chế gấp 4 lần Bảy chalcon còn lại có IC50 nằm trong khoảng từ 250–555 μM cho hoạt tính ức chế trung bình Ngược lại với IC50 thì pIC50 càng cao cho biết hoạt tính ức chế enzym càng mạnh

Hình 3.35 Phần trăm ức chế enzym α-glucosidase của các dẫn chất chalcon và chuẩn acarbose ở nồng độ 250 μM

Hình 3.36 Kết quả IC50 của các dẫn chất chalcon đối với α-glucosidase

Ph ần tră m ức ch ế (% )

3.7.2 Kết quả thử hoạt tính trên α-amylase

Tương tự như đối với α-glucosidase, hoạt tính sinh học của các chalcon thử nghiệm trên α-amylase được trình bày trong Bảng 3.18

Bảng 3.18 Kết quả thử hoạt tính ức chế α-amylase

Chalcon Hoạt tính ức chế -amylase

Bằng các phương pháp sàng lọc in silico, cùng với phân tích SAR, nghiên cứu đã có thể tìm ra các hợp chất nổi bật để tiếp tục nghiên cứu cho điều trị ĐTĐ tuýp 2 Từ dữ liệu hiện tại, chúng tôi đã xác định được 5 dẫn xuất chalcon mới có tác dụng ức chế kép đối với α-glucosidase và α-amylase với giá trị IC50 xác định, bao gồm hợp chất F337, F347, F369, F370 và F378 Các hợp chất này ức chế α-glucosidase mạnh hơn khoảng 2 lần so với acarbose và α-amylase mạnh hơn khoảng 2-14 lần so với acarbose Các hợ chất sẽ được sử dụng để MDS nhằm mô phỏng sự tương tác giữa cấu trúc phân tử nhỏ của chúng và các enzym để hiểu cơ chế ức chế của các hợp chất này

Tuy nhiên, một điểm hạn chế của đề tài là sử dụng enzym -glucosidase từ nấm men Các chất tiềm năng trong nghiên cứu có tác động ức chế tốt enzym này hơn cả thuốc acarbose Dù không được thử nghiệm trực tiếp trên enzym người, nhưng khi kết hợp kết quả in vitro và in silico (sàng lọc trên protein có mã PDB đúng của người) hoàn toàn có thể gợi ý tiềm năng của các chalcon trong việc ức chế enzym

Kết quả mô phỏng động lực học phân tử

Thuật toán docking bán linh động của phần mềm Autodock Vina chỉ coi các phối tử là linh hoạt, trong khi các chuỗi bên protein được giữ cứng Mặc dù các thuật toán hoàn toàn linh động cũng đã được phát triển trong chương trình docking này, nhưng tính linh hoạt của nó vẫn giới hạn ở một số acid amin nhất định xung quanh các phối tử Do đó, nghiên cứu đã mô phỏng động lực học phân tử (MDS) 100 nano giây (ns) để hiểu rõ hơn về cơ chế ức chế của các hợp chất được nghiên cứu

3.8.1 Tính ổn định của phức hợp protein-phối tử Độ ổn định của các phức hợp được đánh giá bằng cách sử dụng các giá trị RMSD, SASA và Rgyr của xương sống protein trong giai đoạn MDS Giá trị trung bình của các giá trị này trong quỹ đạo MDS được thể hiện trong Bảng 3.19

Bảng 3.19 Các thông số ổn định của xương sống protein trong quá trình mô phỏng MD

Phức hợp với α-glucosidase Phức hợp với α-amylase RMSD (nm) SASA (nm 2 ) R gyr (nm) RMSD (nm) SASA (nm 2 ) R gyr (nm)

Về phức hợp α-glucosidase, như có thể thấy trong Bảng 3.19, không có sự khác biệt đáng kể giữa phức hợp chalcon-protein và phức hợp acarbose-protein Giá trị RMSD chi tiết trong khoảng thời gian 100 ns (Hình 3.37) cũng cho thấy rằng tất cả các phức hợp có thể đạt đến trạng thái cân bằng trong 1 ns đầu tiên, cho thấy tính ổn định cao của phức hợp phối tử protein trong quá trình mô phỏng MD Các giá trị diễn giải khác, chẳng hạn như SASA và Rgyr, cũng phù hợp với quan sát này Xét về các phức hợp α-amylase, mặc dù có sự khác biệt có thể quan sát được giữa giá trị RMSD của phức hợp acarbose-protein và của hợp chất F347, F369, F370 và F378, tuy nhiên, giá trị chi tiết dọc theo quỹ đạo MD cho thấy sự ổn định của cấu trúc protein, vì hầu hết chúng vẫn có thể đạt đến trạng thái cân bằng trong vòng 40 ns của MDS Tuy nhiên, đây không phải là trường hợp của hợp chất F378, mặc dù đã đạt đến trạng thái cân bằng trong 50 ns đầu tiên, giá trị RMSD tăng vọt lên 0,20 nm, trước khi ổn định trở lại 0,13 nm trong 20 ns cuối cùng Điều này có thể được giải thích bằng sự biến động cao của vòng lặp bao gồm Asn350, cách xa khoang liên kết được nhắm mục tiêu và có thể được bỏ qua Hình 3.37

Hình 3.37 Phân tích mô phỏng động lực học phân tử sử dụng quỹ đạo 100 ns

3.8.2 Tính ổn định của các hợp chất flavonoid được khảo sát trong MDS

Với mục đích so sánh, các cấu dạng gắn kết của acarbose bên trong các khoang liên kết của hai enzym quan tâm đã được trích xuất Giai đoạn ban đầu của acarbose bên trong túi liên kết của α-amylase được tạo ra bằng cách sử dụng giao thức lắp ghép được mô tả trước đó với cấu trúc acarbose được trích xuất từ phức hợp đồng kết tinh α-glucosidase được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi Giai đoạn ban đầu được đánh giá là tương đương với cấu trúc tinh thể của α-glucosidase-acarbose có sẵn trên PDB (ID PDB: 1XCX) trước khi trải qua MDS 100 ns Sự phù hợp liên kết của acarbose trong phức hợp với α-glucosidase và α-amylase có sẵn trong Hình 3.38

Hình 3.38 Cấu dạng gắn kết của acarbose với (A) α-glucosidase và (B) α-amylase trong quá trình mô phỏng động lực học phân tử 100 nano giây

Về mô phỏng α-glucosidase, như đã mô tả trước đây, do bản chất nông của khoang liên kết của enzyme, hầu hết các chalcon không thể thâm nhập sâu để tiếp xúc với dư lượng xúc tác Điều này cũng được thể hiện rõ ràng trong kết quả MDS của chúng tôi (Hình 3.39) Ngoài hợp chất F369, hầu hết các chalcon đều trải qua các biến đổi trong quá trình mô phỏng MD để phù hợp với túi liên kết nhưng chỉ có thể tương tác với phần còn lại của người gác cổng của khoang, ngoại trừ phối tử F378 Đặc biệt, phân tử nhỏ này không thể ổn định trong khoang liên kết được neo, vì nó quay đáng chú ý xung quanh vị trí liên kết trước khi di chuyển tự do trong hộp solvat hóa Điều này có thể được giải thích là do sự thiếu hụt các nguyên tử cho và nhận liên kết hydro trong cấu trúc của phối tử F378 Mặc dù không được ổn định trong túi liên kết dự kiến, nhưng hầu hết các phân tử nhỏ của chúng tôi có thể hoạt động tốt hơn acarbose, xét về giá trị IC50 của chúng so với α-glucosidase Sự không ổn định của các phối tử trong MDS cho thấy rằng cơ chế ức chế của các phối tử được nghiên cứu của chúng tôi đối với α-glucosidase có thể thông qua cách không cạnh tranh, không cạnh tranh hoặc hỗn hợp

Mặt khác, chalcon của chúng tôi có thể liên kết nhất quán với vị trí hoạt động của α- amylase tuyến tụy của con người, được tiết lộ bởi kết quả MDS Như có thể thấy trong Hình 3.40, mặc dù các chalcon cũng cần phải trải qua một số biến đổi, nhưng chúng đã cố gắng ổn định bên trong túi liên kết dự kiến Khả năng liên kết của các chalcone có thể được giải thích bằng khoang sâu hơn của enzym, do đó làm tăng khả năng các chalcon tương tác với dư lượng xúc tác bên trong túi Kết quả từ MDS của chúng tôi cho thấy rằng các chalcone của chúng tôi có thể ức chế cạnh tranh với α-amylase Tuy nhiên, các đánh giá thử nghiệm tiếp theo cần được tiến hành để xác nhận giả thuyết

Hình 3.39 Cấu dạng gắn kết của (a) F337; (b) F347; (c) F369; (đ) F370; và (e) F378 với α-glucosidase Các màu phối tử khác nhau biểu thị khung thời gian khác nhau, với 0 ns (màu vàng); 25 ns (cá hồi); 50 giây (màu xanh); 75 ns (trắng); 100 ns (màu xanh lá cây)

Hình 3.40 Cấu dạng gắn kết của hợp chất (a) F337; (b) F347; (c) F369; (đ) F370; và (e)

F378 với α-amylase Các màu phối tử khác nhau biểu thị khung thời gian khác nhau, với 0 ns (màu vàng); 25 ns (cá hồi); 50 giây (màu xanh); 75 ns (trắng); 100 ns (màu xanh lá cây)

Về khả năng ức chế α-glucosidase, mặc dù có thể đạt được kết quả in vitro vượt trội, kết quả MDS của chúng tôi cho thấy hầu hết các hợp chất không thể liên kết ổn định ở vị trí liên kết mong muốn Điều này chỉ ra rằng các hợp chất được nghiên cứu của chúng tôi có thể không ức chế enzym này thông qua cơ chế cạnh tranh Điều này không có gì lạ vì nhiều nghiên cứu trong tài liệu đã báo cáo rằng chalcoe có thể ức chế α-glucosidase thông qua ức chế cạnh tranh [147], không cạnh tranh

[148] hoặc ức chế kiểu hỗn hợp [149] Trong cùng một nghiên cứu, ngay cả việc đưa nhóm -OH cũng có thể chuyển cơ chế ức chế từ không cạnh tranh sang cạnh tranh

[150] Do đó, nên tiến hành đánh giá cơ chế ức chế theo từng trường hợp cụ thể để xác nhận giả thuyết

Liên quan đến sự ức chế α-amylase, tính ổn định của các phối tử bên trong khoang liên kết của α-amylase cho thấy rằng các hợp chất này có thể ức chế cạnh tranh các enzym Giả thuyết này phù hợp với cấu trúc đồng kết tinh của α-amylase với myricetin (cũng là cấu trúc flavonoid) [151] và phần lớn các nghiên cứu trong tài liệu [147, 150, 152].

Kết quả dự đoán dược động học – độc tính

Công cụ ADMETLab 2.0 đã dự đoán thông tin chi tiết về các đặc tính hóa dược, dược động học và độc tính của 5 chất ức chế đồng thời tiềm năng trên α-glucosidase và α-amylase Các đặc tính hóa lý của chúng cũng được minh họa trong Hình 3.41

F378 Hình 3.41 Tính chất lý hóa của 5 chalcon tiềm năng

Theo cơ chế ức chế quá trình thủy phân và tiêu hóa chuỗi polysaccharid để điều trị đái tháo đường týp 2, một danh sách rút gọn các đặc tính ADMET được trình bày trong Bảng 3.20 Kết quả dự đoán của ADMETlab 2.0 cho thấy 5 chalcon này được chấp nhận bởi quy tắc Lipinski và quy tắc Tam giác vàng (Golden Triangle) Các chất tuân theo quy tắc Golden Triangle được cho là có những đặc tính ADMET thuận lợi hơn để phát triển thành thuốc Tất cả các hợp chất đều có khả dụng sinh học tốt qua đường uống, như được biểu thị bằng xác suất Hấp thụ qua đường ruột của con người (HIA) Chúng không phải là cơ chất của P-glycoprotein nhưng có thể là chất ức chế protein vận chuyển này (ngoại trừ hợp chất F337) Khả năng xuyên qua hàng rào máu não của các hợp chất này cũng không cao (ngoại trừ hợp chất F370) Ngoài ra, những chalcon này được dự đoán là không có độc tính cấp tính Nói chung, chúng không có độc tính nghiêm trọng đối với tim mạch (như dự đoán theo phân loại thuốc chẹn hERG) Bốn trong số năm hợp chất được dự đoán là có liên quan đến mức độ gây ung thư khác nhau, nhưng không có hợp chất nào đạt đến mức dự đoán cao nhất (+++) Đặc tính này cần được xem xét để tối ưu hóa trong các giai đoạn phát triển thuốc tiếp theo Cuối cùng, đối với gan, những chất này có khả năng gây độc cho gan ở người thấp và tổn thương gan do thuốc

Bảng 3.20 Một số đặc tính ADMET được dự đoán quan trọng của các dẫn xuất flavonoid như là chất ức chế kép tiềm năng chống lại α-glucosidase và α-amylase

Tính chất dược động học – độc tinh

Chất nhận Quy tắc Tam giác vàng

Chất nhận Độ hấp thu qua ruột Xuất sắc Xuất sắc Xuất sắc Xuất sắc Xuất sắc Ức chế P-glycoprotein - +++ + + ++

Khả năng đi qua hàng rào máu não + Độc tính cấp 0 0 0 0 0 Ức chế hERG - - ++ - Độc tính trên gen + ++ ++ + Độc tính đối với gan ++ - -

Tổn thương gan do thuốc - - -